CN105431738B - 胃癌的预后预测模型的建立方法 - Google Patents

胃癌的预后预测模型的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能够预测胃癌的预后的新型预后预测模型的建立方法，更具体地，本发明涉及通过基因突变比较分析来预测经过胃切除术后的临床结果的预测模型。

Description

胃癌的预后预测模型的建立方法
技术领域
本发明涉及通过基因突变的比较分析来可预测胃癌的预后的新型预后预测模型的建立方法。
背景技术
在2000年造成700,349名死亡的原因中，胃腺癌(Gastric adeno-carcinoma)是第二大死因，是世界上最常诊断出来的第四大癌症。胃腺癌被视为具有几种流行病学和组织病理学特征的单一的异质性疾病。胃癌的治疗主要依据临床参数如TNM(肿瘤、淋巴结、转移)分期，TNM分期用于决定能否仅通过手术或通过手术和化疗法来进行治疗。与乳腺癌和大肠癌不同，胃癌会根据TNM分期系统的I期至IV期具有明显差异。亦即，I期的五年生存率为90％或以上，而IV期的五年生存率小于20％，可见差异巨大。由此可知，TNM分期系统具有优异的预后预测能力(参考文献、7th edition of the AJCC cancer staging Manual:stomach.Ann Surg Oncol2010；17:3077-3079)。基于TNM分期系统，胃癌通常被分为早期胃癌(Early Gastric Cancer)、局部晚期胃癌(Locally Advanced Gastric Cancer)、局部晚期浸润性胃癌(Locally Advanced Invasive Gastric Cancer)和转移性胃癌(MetastaticGastric Cancer)等。
尽管手术是可实施的胃癌的主要治疗方法，然而晚期胃癌的复发率比较高。为了预防复发并提高胃癌患者的预后，导入了包括化疗和化放疗的综合治疗方法。然而，这种治疗方法虽能改善患者的常规临床结果，然而肿瘤的临床病理学的异质性和处于相同分期内患者的不同结果对预测辅助性化疗的任务上能力有限，从而不能足以最佳地接近个别患者。
最近虽也有一些进展，然而为了靶向发病原因不同的肿瘤种类的特异性治疗养生法且最终使成果最大化，在使肿瘤治疗成为个体化的癌症治疗上还存留着一些具挑战性的难题。因此，需要一种试验来同时提供患者对各种治疗选择项目作出的反应相关的预测信息。
发明内容
技术领域
本发明在于提供基于胃癌患者的基因突变的新型预后预测模型的建立方法。
技术方案
为了上述目的，本发明提供从获得胃癌诊断的受试者中建立预后预测模型的方法，该方法包括如下步骤：在包括从受试者采集的癌细胞的生物学样本中测定选自KRAS、MET和PIK3CA中的一个或多个基因中是否有单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism)的表达；及根据所述单核苷酸多态性的表达频率，确定具有统计显著性的设定值范围，然后根据所述设定值范围，从总生存(Overall Survival,OS)的角度上分类良好预后组和不良预后组。
所述预后预测模型可以预测与TNM分期无关的整体胃癌经过切除术后的临床结果。
有益效果
本发明是通过靶向与TNM分期无关的整体胃癌的患者组并根据分子特性的基因突变的表达频率将具统计显著性的值设为设定值，来提供可从总生存的角度上分类良好预后组和不良预后组的预后预测模型，从而预测经过胃癌切除术后的临床结果。
附图说明
图1展示了肿瘤组织的mRNA微阵列的结果及其组合分类。
图2展示了各组合的Kaplan-Meir Plot。
图3～5为通过组合2与突变之间关系的交叉分析和chi-square分析结果来进行展示。
具体实施方式
下面，具体说明本发明的结构。
本发明提供一种从获得胃癌诊断的受试者中建立预后预测模型的方法，该方法包括如下步骤：在包括从受试者采集的癌细胞的生物学样本中，测定选自KRAS、MET和PIK3CA中的一个或多个基因中是否存在单核苷酸多态性的表达；及根据所述单核苷酸多态性的表达频率，确定具统计显著性的设定值范围，然后从总生存(Overall Survival,OS)的角度上分类良好预后组和不良预后组。
根据本发明的一个具体实施例，通过选择可显示与胃癌相关的mRNA差异表达的预后相关基因组，分类成mRNA高表达组和mRNA低表达组，而后用所述分类组中具有显著高的突变率的基因选出KRAS,MET和/或PIK3CA，然后将所述基因作为目标测定是否有一个或多个单核苷酸多态性的表达，结果可以确认，所述基因的单核苷酸多态性的表达频率在mRNA高表达组和mRNA低表达组中显示具有统计显著性但互不相同，从而可用作在总生存的角度上分类良好预后组和不良预后组的分类标准。
因此，在本发明的方法中，预后预测模型的特征在于，从获得胃癌诊断的受试者中，将KRAS,MET和/或PIK3CA基因的单核苷酸多态性的表达频率用作分类标准，来分类成良好预后组和不良预后组，且这种分类具有统计显著性的值。
用于显示所述mRNA差异表达的预后相关基因组可根据基于PCR或阵列的方法来实施。
用于显示所述mRNA差异表达的预后相关基因组的分类可通过使用公知的各种统计工具来进行确定。mRNA高表达组和mRNA低表达组可根据具有统计显著性的值，即具有约1.5倍或以上、约2倍或以上、约4倍或以上、约6倍或以上、约10倍或以上的差异的组为目标进行分类。
癌是通过基因组中的遗传性和后天性突变的累积而诱发出来的。一个或两个碱基的变化可诱导氨基酸的置换，从而改变蛋白质的活性。单核苷酸多态性的存在与癌的诊断和预后有关联。因此，本发明将KRAS,MET和/或PIK3CA基因的一个或多个单核苷酸多态性的表达频率使用在预后预测模型的建立上。
所述KRAS的单核苷酸多态性可以为选自A146PT_g436ca、G10R_g28a、G12DAV_g35act、G12SRC_g34act、G13DAV_g38act、G13SRC_g37act、Q61EK_c181ga、Q61HHE_a183ctg和Q61LPR_a182tct中的一种或多种。在确定设定值时，将这些突变仅计数成一种突变而用在设定值上。
其中，大写字母表示氨基酸首字母符号，小写字母表示碱基，数字表示碱基或氨基酸残基的位置。例如，A146PT_g436ca可表示，在基因的第436位上g可被置换成c或a，借此位于146位的氨基酸的丙氨酸(A)可被置换成脯氨酸(P)或苏氨酸(T)。下面，MET和PIK3CA的突变示例也表示类似的意义。
所述MET的突变可以为选自H1112L_a3335t、H1112Y_c3334t、M1268T_t3803c、N375S_a1124g、R988C_c2962t、T1010I_c3029t、Y1248HD_t3742cg和Y1253D_t3757g中的一种或多种。在确定设定值时，将这些突变仅计数成一种突变而用在设定值上。
所述PIK3CA的突变可以为选自A1046V_c3137t、C420R_t1258c、E110K_g328a、E418K_g1252a、E453K_g1357a、E542KQ_g1624ac、E542VG_a1625tg、E545AGV_a1634cgt、E545D_g1635ct、E545KQ_g1633ac、F909L_c2727g、G1049R_g3145c、H1047RL_a3140gt、H1047RL_a3140gt、H1047RL_a3140gt、H1047Y_c3139t、H701P_a2102c、K111N_g333c、M1043I_g3129atc、M1043V_a3127g、N345K_t1035a、P539R_c1616g、Q060K_c178a、Q546EK_c1636ga、Q546LPR_a1637tcg、R088Q_g263a、S405F_c1214t、T1025SA_a3073tg、Y1021C_a3062g和Y1021HN_t3061ca中的一种或多种。在确定设定值时，将这些突变仅计数成一种突变而用在设定值上。
用于测定所述单核苷酸多态性的方法不受特别限制，可以使用MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸/电离飞行时间的质谱)法。
在用于测定所述单核苷酸多态性的方法中，将单核苷酸多态性的表达频率用作分类良好预后组和不良预后组的标准，根据单核苷酸多态性的表达频率确定具统计显著性的设定值范围，然后基于所述设定值范围，从总生存的角度上分类成良好预后组和不良预后组。
通过将相对于总目标的单核苷酸多态性的表达与否计算成百分比，所述设定值范围可确定为约7％、约5％、约3％，但不限于此。
例如，根据本发明的一个具体实施例，当KRAS或PIK3CA基因的单核苷酸多态性的表达频率分别小于3％时可分类成不良预后组，而当KRAS或PIK3CA基因的单核苷酸多态性的表达频率分别大于3％时可分类成良好预后组。
根据本发明的另一具体实施例，当MET基因的单核苷酸多态性的表达频率小于7％时可分类成良好预后组，而当MET基因的单核苷酸多态性的表达频率大于7％时可分类成不良预后组。
在本发明的预后预测模型的建立方法中，良好预后组表示3年或以上、6年或以上、10年或以上期间的总生存会高，而不良预后组表示3年或以上、6年或以上、10年或以上期间的总生存会低。术语“良好预后”可表示为临床结果的积极临床结果的可能性的提高，术语“不良预后”可表示为临床结果的积极临床结果的可能性的降低。
根据本发明的方法的预后预测模型可有助于预测与TNM无关的整体胃癌经过切除术后的临床结果。
如没有其他定义，本文中使用的技术和科学术语与本领域的技术人员的通常理解具有相同的意义。本发明不会受任何方式的说明方法和材料的限制。为了本发明的目的，在下面定义以下术语。
术语“多核苷酸”通常指任一的多核糖核苷酸(polyribonucleotide)或多聚脱氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide)，例如，可指修饰的或非修饰的RNA或DNA。在本发明中，“多核苷酸”具体包括cDNA。
术语“寡核苷酸”是指，不受限制地包括单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA:DNA杂交及双链DNA的较短的多核苷酸。寡核苷酸，例如，单链DNA寡核苷酸探针一般如通过使用可购买的寡核苷酸自动合成仪的化学方法来合成。然而，寡核苷酸可以通过包括试管中DNA介导的重组技术在内的各种不同方法及细胞与有机体内的DNA表达来进行制备。
术语“差异表达基因”或“差异基因表达”是指，与正常或对照用靶的表达相比，在患有胃癌等癌的患者体内得到更高或更低水平的活化的基因。此外，“差异表达基因”或“差异基因表达”包括相同疾病的不同分期内得到更高或更低水平的活化的基因。差异表达基因还可以在核酸或蛋白质水平上被活化或受抑制，或经过其他剪接而生成不同的多肽产物。这种差异可通过如多肽的mRNA水平、表面显示、分泌或其他分配上的变化而得以证明。从本发明的目的出发，将“差异基因表达”视为从正常的或患有疾病的受试者中，或从患有疾病的受试者的各分期中的取得的基因的表达之间存在1.5倍或以上、约4倍或以上、约6倍或以上、约10倍或以上的差异时存在的现象。
与基因转录本或基因表达的产物相关的术语“归一化”是指与标准基因集的转录本/产物的平均水平相比时的转录本或基因表达产物的水平，其中内参基因是通过患者、组织或治疗并基于这些基因的最低变化来进行选择(“管家基因(housekeeping gene)”)，或内参基因是指被测试的整体基因。当指后者时，通常被称为“整体归一化(globalnormalization)”，关键点在于所测基因的总数要较大，优选为超过50。具体地，与RNA转录本相关的术语“归一化”是指与标准基因集的平均转录水平相比时的转录水平。
术语“表达阈值”可与“被定义的表达阈值”相混用，此时，“表达阈值”可指将基因或基因产物用作对患者反应的预测标记时的相应基因或基因产物的水平。阈值是一般在临床研究中通过实验方式进行定义。表达阈值可被选作最大敏感性、或最大选择性(如，仅选择对一种药物有反应的患者)、或最小误差。
术语“基因扩增”是指，在特定细胞或细胞株中形成基因或基因片段的多个拷贝的过程。复制区域(扩增的DNA长度)通常被称为“扩增子”。通常，生成的mRNA的量，即基因表达水平还与特异基因的拷贝数成比例增加。
在本发明中，“预后”用来预测本发明的因癌死亡或如胃癌等肿瘤性疾病的进展(包括复发、转移性扩散及耐药性)的可能性。术语“预后”用来说明本发明的患者在经过主要肿瘤的切除术后无癌症复发下生存特定期间的可能性。这种预测是通过对任一特定患者选择最适宜的疗法而在临床上可用来确定治疗。这种预测可在患者对治疗养生，例如能否易于对手术做出积极反应，或患者在手术结束后能否长期存活的判断成为宝贵的工具。
如没有其他说明，可使用现有的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学及生物化学的技术来实施本发明。
1.基因表达谱的制作(Profiling)
基因表达谱的制作方法可包括基于多核苷酸的杂交分析的方法、基于多核苷酸序列的方法及基于蛋白组学的方法。例如，mRNA表达的定量方法包括：northern blotting和原位杂交；RNAse保护检测试验；和基于PCR的方法，如反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等。又或，可以使用用来识别包括DNA双链、RNA双链和DNA-RNA杂交双链或DNA-蛋白质双链在内的特异双链的抗体。基于序列的基因表达分析中具代表性的方法包括，基因表达系列分析(SAGE)和根据大规模平行信号测序(MPSS)的基因表达分析。
2.基于PCR的基因表达谱的制作方法
a.反转录酶PCR(RT-PCR)
最敏感、最具弹性的定量PCR基因表达谱的制作方法之一就是RT-PCR，它可以在与药物治疗一起或没有药物治疗的正常组织和肿瘤组织的不同样本集中对mRNA水平进行比较来使基因表达模式进行特性化，对紧密相关的mRNA进行辨别，从而分析RNA结构。
第一步，从目标样本提取mRNA。例如，mRNA可以从冷冻或保存的石蜡包埋及固定(如，用福尔马林固定)的组织样本中提取。
用于提取mRNA的常用方法已被本领域的技术人员所知，而从石蜡包埋组织中提取mRNA的方法已在文献([Rupp and Locker,Lab Invest.56:A67(1987)][De Andres etal.,BioTechniques 18:42044(1995)])等中有公开。尤其，RNA提取可通过利用来自制造商如Qiagen的纯化试剂盒、缓冲剂组合及蛋白酶，并按照制造商的说明书来实施。其他可购买的RNA提取试剂盒包括MasterPureTM的完整DNA和RNA纯化试剂盒(威斯康星州麦迪逊市)及Paraffin Block RNA提取试剂盒(Ambion公司)。
组织样本中的总RNA可利用RNA Stat-60(Tel-Test)来提取。从肿瘤制备的RNA可通过如氯化铯密度梯度离心法来提取。
由于RNA可用作PCR的模板，根据RT-PCR的基因表达谱的制作的第一步为，RNA模板通过反转录成cDNA，随后为了进行PCR反应而进行指数式扩增。反转录酶主要使用鸟类成髓细胞性白细胞病毒反转录酶(AMV-RT)和莫罗尼(Moloney)鼠类白血病病毒反转录酶(MMLV-RT)。通常，反转录过程是根据表达谱制作的环境和目标，并通过使用特定的引物、随机六聚体或oligo(dT)引物来启动。例如，提取的RNA是按照制造商的说明书通过使用GeneAmp RNAPCR试剂盒(Perkin Elmer，美国加州)来进行反转录。诱导出的cDNA在后续的PCR反应中可用作模板。
虽然，在PCR过程中可以使用各种具有热稳定性的依赖DNA的DNA聚合酶，通常该依赖DNA的DNA聚合酶会使用Taq DNA聚合酶，且Taq DNA聚合酶具有5'－3'外切酶活性，然而3'－5'校正(proofreading)核酸内切酶活性却不足。因此， PCR通常会使用能使与Taq或Tth聚合酶的目标扩增子相结合的杂交探针发生杂交的5'外切酶活性，但可能会使用具有5'外切酶活性的任一种酶。通过使用两个寡核苷酸引物，形成PCR反应的具代表性的扩增子。在两个PCR引物之间设计第3个寡核苷酸或探针，以用来检测核苷酸序列。探针经过Taq DNA聚合酶的处理后具有非延伸性，且用报告基团(Reporter)荧光染料和淬灭基团(Quencher)荧光染料剂型对该探针做标记。从报告基团染料中的任一经激光诱导发射的信号在两种染料离得近时，例如它们同时在探针上时，会被淬灭基团吸收。在进行扩增反应的期间，Taq DNA聚合酶是通过依赖模板的方式切断探针。所形成的探针片段在溶液中发生解离，从报告基团染料发射的信号不具有对第二荧光团的消除效果。当测出由报告基团染料的分子合成的新的分子中分别发射但没被吸收的报告基团染料时，对数据定量分析提供了标准。
RT-PCR可通过使用可购买的设备，如ABI PRISM 7700TM序列检测系统TM(Perkin-Elmer-Applied Biosystems)、或Lightcycler(Roche MolecularBiochemicals)来实施。
5'外切酶检测试验数据在初始时展现为Ct或循环阈值。在每个循环周期内记录荧光数值，表示用扩增反应进行扩增达到那一点时的扩增产物的量。当荧光信号被记录为第一次具有统计显著性时到达的点为循环阈值(Ct)。
为了最大程度减少样本之间的变化效果和误差，RT-PCR通常使用标准RNA(理想的情况是在不同组织内以一定水平进行表达)来进行，不受实验治疗的影响。在基因表达模式归一化中最常用的RNA为管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPD，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和β-actin(ACTB)的mRNA。
此外，新的实时定量PCR为用于测量通过双重标识的荧光源性探针(即，探针)的PCR产物的积累的技术，可均与使用定量竞争性PCR(其中，在归一化中使用每个靶序列的内部竞争物)、及样本所包含的归一化基因或RT-PCR的管家基因的定量比较用PCR进行配合来使用。
b.MassARRAY系统
由Sequenom公司开发的MassARRAY的基因表达谱的制作方法中，通过使用合成DNA分子(竞争物)(除单个核苷酸的所有位置与归一化cDNA区相一致)对经过RNA提取和反转录而获得的cDNA进行点样(spike)处理，并用作内部标准。cDNA/竞争物的混合物通过PCR进行扩增，然后进行通过后续PCR的虾碱性磷酸酶(SAP)的酶处理，诱导对剩余核苷酸的去磷酸化(dephosphorylation)。使碱性磷酸酶失活后，对竞争物和cDNA的PCR产物进行引物延伸，借此生成分别对源自竞争物和源自cDNA的PCR产物的质量信号。经过纯化后，将所述产物计量分配于芯片阵列上，所述芯片阵列可使用基质辅助激光解解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析法且载有分析所需要的成分。通过对紧接着形成的质谱中的峰面积比进行分析，来对反应中存在的cDNA定量。
c.其他基于PCR的方法
其他基于PCR的方法包括差异显示；扩增片段长度多态性；BeadArray TM技术(Illumina，加利福尼亚州圣迭戈市)；基因对基因表达的迅速鉴定试验中使用可购买的Luminex 100LabMAP系统及多色编码的微球(Luminex公司)的用于检测基因表达的株阵列(BeadsArray for Detection of Gene Expression,BADGE)；和高通量基因表达谱制作(HiCEP)分析。
3.微阵列
从新鲜的或石蜡包埋的肿瘤组织中测定癌相关基因的表达谱。在该方法中，将受关注的序列(包括cDNA和寡核苷酸)平铺或排列于微芯片的基片上。然后，将排列的序列与受关注的细胞或组织中的特异DNA探针进行杂交。与RT-PCR法相同，mRNA的典型来源为从人的肿瘤或肿瘤细胞株、和相应的正常组织或细胞株中提取出来的总RNA。因此，RNA可以从各种主要肿瘤或肿瘤细胞中进行提取。微阵列技术能将cNDA克隆的PCR扩增的插入物以密集阵列形式提供在基片上。优选地，在基片上添加10,000或以上的核苷酸序列。在严格条件下，将10,000个元件适于分别地与在微芯片上进行固定并微排列的基因进行杂交。作荧光标记的cDNA探针是根据从受关注的组织中提取的RNA的反转录而通过掺入荧光素核苷酸来形成的。添加于芯片中的标记cDNA探针与阵列上的DNA各点进行特异性杂交。为了去除非特异性结合的探针，进行严格清洗，并通过激光共聚焦显微镜或其他检测方法如CCD相机对芯片进行扫描。通过对排列的每个元件的杂交进行定量化，可以评估相应mRNA的过量表达。当所述荧光为双色荧光时，从两个RNA来源生成并经过分别标记的cDNA探针在阵列上进行成对杂交。因此，能同时确定与所明示的基因分别对应的两个来源中的转录本的相对过量的表达。通过小规模杂交即可对为数众多的基因的表达模式进行方便且迅速的评价。这种方法具有所需的敏感性，从而能检测稀有转录本(其以细胞为单位表达成少量拷贝数)，以及在表达水平上具有至少约2倍的差异而能够实施可再现的检测。微阵列分析可利用可购买的仪器并根据制造商的规定，如通过使用Affymetrix GenChip技术或Incyte's微阵列技术来实施。
4.关于mRNA提取、纯化及扩增的一般说明
下面，说明通过使用石蜡包埋的组织的基因表达谱的制作技术。通过分析最终获得的数据，基于所观察到的肿瘤样品中所能确认的特异基因的表达模式，辨别出可用于患者的最佳治疗选择项目。
本发明的关键在于，通过利用癌组织的特异基因的特异表达来提供预后信息。为此，必须对经过校准测试的RNA的量、所用的RNA质量的变化及其他因素，如仪器和操作人的差距上的差异，进行校准处理(归一化)。因此，校准测试通常是测定标准RNA的使用并进行掺入，该标准RNA包含从公知管家基因如GAPD和ACTB转录的产物。此外，归一化是将经过校准测试的基因或它们的众多子集总体的平均值或中间信号(Ct)设定为标准值(全归一化接近法)。在下面的实施例所说明的研究中使用了被称为中心归一化的策略，为了进行归一化处理，该策略使用基于与临床成果的相关性的缺乏来选取的经过筛选的基因子集。
实施例
下面，根据实施例具体说明本发明。然而，以下实施例仅用作说明为目的，本发明的内容不限于以下实施例。
【实施例1】预后预测目标的选择和实验设计
本发明的发明人是利用桑格研究院(Sanger Institut)所保存的各种癌种类中对需要鉴定的体细胞突变的数据库来研发用于检测那些存在于很多不同癌中且更普遍发生的单核苷酸多态性(SNP)的存在的分析法。
为此，用肿瘤组织样本537个、正常组织样本129个、FFPE肿瘤样本125个(1999年至2006年为止在延世大学校SEVERANCE医院作为一线治疗接受过胃切除术的胃腺癌患者)及FFPE正常组织样本123个作为目标，选出AKT1、BRAF、CTNNB1、FBWX7、GNAS、IDH1、JAK2、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PDPK1、PHLPP2、PIK3CA和PIK3R1，对从中出现的159种突变进行研究。
使用Sequenom公司的MALDI TOF MassArray系统(基质辅助激光解吸/电离飞行时间的质谱)来检测单核苷酸多态性。该方法是，通过第一次PCR对DNA附近所选出的SNP进行扩增，然后进行引物延伸反应，从而检测潜在SNP碱基。PCR引物和延伸引物均使用SequenomAssay设计软件来设计。该软件的每个孔中可以反应最多29个不同SNP。初期PCR反应可以按照制造商的说明书在384孔板中进行，然后利用Sequenom公司的EXO-SAP来结束PCR。引物延伸反应可利用Sequenom公司的IPLEX化学并结合他们的规则进行。然后，IPLEX反应是利用Sequenom公司的Clean Resin进行脱盐处理，然后利用Samsung Nanodispenser在Spectrochip矩阵芯片上进行点样。然后，所述芯片进行Sequenom MassArray。分析Sequenom Typer软件分析所形成的质谱，基于期望质量来报告SNP。形成的所有质谱重复进行两遍，并用肉眼检查。
其结果在表1中展示，对每个基因中发生的一种或多种的突变仅计成一次突变，然后计算。
【表1】
如表1所示，与正常组织相比，可见肿瘤中出现更多的KRAS、MET、PIK3CA突变。
根据KRAS、MET和PIK3CA突变的单核苷酸多态性的突变种类如表2中展示。
【表2】
基于上述结果，用在延世大学校SEVERANCE医院中所保存的肿瘤组织样本545个和正常组织样本129个作为目标进行chi-square分析的结果可知，KRAS、MET和PIK3CA的p值小于0.001。亦即，可见正常组织和肿瘤组织之间确实存在有无突变的区分。
在所述样本中，用350个肿瘤组织作为目标实施mRNA微阵列，在mRNA组合中研究是否存在与相应预后相关的突变。为此，对350个mRNA进行聚类分析，并分组，然后进行Kaplan-Mei Plot和log rank检验，从而确定预后相关的组合。亦即，将350个样本抽取为原始数据，然后分位数归一化处理并进行以2为底的对数转换，随后实施median centering。通过分散过滤法，对预后相关基因进行分组，最后与中位数进行比较，通过使用显示出1.5倍或以上增幅或减少的15个探针来提取5432个基因，然后利用Cluster和Treeview(http://rana.lbl.gov/EigenSoftware.htm)进行聚类分析。
将在上述组合中具有KRAS、MET和PIK3CA突变的样本进行排列，通过chi-square分析法，研究组合间与对应突变的关联性。肿瘤组织的mRNA微阵列的结果在图1中展示。
图1和表3中记录了当分成两组时(CL1、CL2)，当分成三组时(CL1、CL2、CL3)、当分成四组时(CL1、CL2、CL3、CL4)、当分成五组时(CL1、CL2、CL3、CL4、CL5)的P值。例如，组合2被分为两个组(CL1、CL2)，可以知道各组中是否存在KRAS、MET和PIK3CA的突变。
【表3】
CHI-SQUARE KRAS MET PIK3CA
组合2 0.046 0.064 0.015
组合3 0.003 0.180 0.002
组合4 0.008 0.314 0.005
组合5 0.016 0.181 0.007
图2展示了各组的Kaplan-Meir Plot。
图3～5展示了组合2与突变的关系的交叉分析及chi-square分析的结果。
如图3～5所示，良好预后类2中的KRAS和PIK3CA基因的突变频率高，不良预后类1中的KRAS和PIK3CA基因的突变频率低。此外，良好预后类2中的MET基因的突变频率低，不良预后类1中的MET基因的突变频率高。
工业应用性
本发明可以在胃癌复发预后预测领域中作为诊断试剂盒来使用。

Claims (1)

1.一种用于提供信息，以建立用于被诊断为胃癌的受试者的预后预测模型的方法，该方法包括如下步骤：
选择可显示与胃癌相关的mRNA差异表达的预后相关基因组，然后分类成mRNA高表达组和mRNA低表达组，与包含从受试者收集的癌细胞的生物样品中的mRNA表达的中位数相比，mRNA高表达组显示出1.5倍以上的增加的差异，mRNA低表达组显示出1.5倍以上的减少的差异，然后测量单核苷酸多态性是否在人KRAS、MET和PIK3CA基因中表达；和
通过将所述单核苷酸多态性的表达频率转化为百分比，以获得3％或7％，来确定统计显著性的设定值范围，然后根据所述设定值范围，从总生存(OS)的角度上分类良好预后组和不良预后组，其中，
当人KRAS和PIK3CA基因的单核苷酸多态性的所述表达频率超过3％，且MET基因的单核苷酸多态性的所述表达频率等于或小于7％时，可以将其分类为良好预后组，和
当人KRAS和PIK3CA基因的单核苷酸多态性的所述表达频率等于或小于3％，且MET基因的单核苷酸多态性的所述表达频率超过7％时，可将其分类为不良预后组，其中
所述良好预后组具有与TNM分期无关的整体胃切除术后对于总生存(OS)增加的5至10年时期的积极临床结果的可能性，所述不良预后组具有与TNM分期无关的整体胃切除术后对于总生存(OS)减少的5至10年时期的积极临床结果的可能性，和
人KRAS的单核苷酸多态性为选自A146PT_g436ca、G10R_g28a、G12DAV_g35act、G12SRC_g34act、G13DAV_g38act、G13SRC_g37act、Q61EK_c181ga、Q61HHE_a183ctg和Q61LPR_a182tct中的至少一种；
人MET的单核苷酸多态性为选自H1112L_a3335t、H1112Y_c3334t、M1268T_t3803c、N375S_a1124g、R988C_c2962t、T1010I_c3029t、Y1248HD_t3742cg和Y1253D_t3757g中的至少一种；和
人PIK3CA的单核苷酸多态性为选自A1046V_c3137t、C420R_t1258c、E110K_g328a、E418K_g1252a、E453K_g1357a、E542KQ_g1624ac、E542VG_a1625tg、E545AGV_a1634cgt、E545D_g1635ct、E545KQ_g1633ac、F909L_c2727g、G1049R_g3145c、H1047RL_a3140gt、H1047RL_a3140gt、H1047RL_a3140gt、H1047Y_c3139t、H701P_a2102c、K111N_g333c、M1043I_g3129atc、M1043V_a3127g、N345K_t1035a、P539R_c1616g、Q60K_c178a、Q546EK_c1636ga、Q546LPR_a1637tcg、R88Q_g263a、S405F_c1214t、T1025SA_a3073tg、Y1021C_a3062g和Y1021HN_t3061ca中的至少一种，
其中，大写字母表示氨基酸首字母符号，小写字母表示碱基，数字表示碱基或氨基酸残基的位置。
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