CN106714809A - 对治疗或预防肝脏疾病或障碍和促进体重减轻有用的新型组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括预防或治疗对象比如哺乳动物中的毒性肝脏疾病或障碍的方法，所述毒性肝脏疾病或障碍比如但不限于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和其它毒性肝脏病症。本发明还包括在对象比如哺乳动物中促进体重减轻的方法。本发明包括给对象施用治疗有效剂量的至少一种强心苷或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物。

Description

对治疗或预防肝脏疾病或障碍和促进体重减轻有用的新型组 合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请以35U.S.C.§119(e)要求2014年8月20日提交的美国临时申请号62/039,619的优先权，其所有由此通过引用以其全部并入。

关于联邦资助的研究或研发的声明

本发明在由美国国立卫生研究院授予的批准号R01DK076674-01A2下利用政府支持完成。政府在本发明中享有某些权利。

背景技术

脂肪性肝炎(steatohepatitis)(又称为脂肪肝疾病)是一种类型的肝脏疾病，其表征为肝脏中具有并发的脂肪积聚的肝脏炎症。作为酒精性肝脏疾病的一部分典型地见于嗜酒者，脂肪性肝炎还在患有糖尿病和肥胖的人中被频繁地发现并且与代谢综合征相关。

当不与过量的酒精摄入相关联时，它被称为非酒精性脂肪性肝炎(又称为“NASH”)，并且是相对良性的非酒精性脂肪肝疾病的进展形式。任一种病因学的脂肪性肝炎可以进展至肝硬变，并且NASH现在被认为是原因不明的肝硬变的常见原因。NASH还与溶酶体酸性脂酶缺乏相关联。

脂肪性肝炎通过显微镜表征为肝脏脂肪积聚(脂肪变性)、混合型小叶炎症(mixedlobular inflammation)、肝细胞的气球样变性(有时伴有可辨别的马洛里小体)、糖生成(glycogenated)肝细胞核、和细胞周围纤维化(pericellular fibrosis)。细胞周围纤维化的“铁丝网格(chicken wire)”图案——其仅在后期继发性地影响门管区——是非常有特性的并且在三色染色上被鉴定。

NASH通常与代谢综合征(肥胖、血脂代谢障碍(dyslipidemia)和胰岛素耐受性)相关联。疾病的进一步进展可能由慢性炎症和活性氧种类形成引起。代谢诱发的肝脏炎症募集额外的炎性组分(中性粒细胞，AP-1途径)并且引起NASH。回顾性队列研究推断肝衰竭是NASH相关肝硬变中发病率和死亡率的主要原因。还没有治疗作为NASH的“金标准”出现。

地高辛是纯化的强心苷，其与从洋地黄植物毛花洋地黄(Digitalis lanata)提取的洋地黄毒甙类似。地高辛被广泛地用于治疗多种心脏病症，即心房颤动、心房扑动，并且有时用于治疗不能通过其它药物控制的心力衰竭。在这样的疾病中，高的心室率导致不充足的舒张期充盈时间。通过减慢房室(AV)结中的传导和增加其不应期，地高辛可以降低心室率。心律不齐自身不受影响，但是心脏的泵送功能由于提高的充盈被改进。

地高辛是充当正性肌力药的强心苷；它通过结合至变构部位减少Na⁺/K⁺ATPase通道的活动。正常地，3×Na⁺移出心肌细胞，并且2×K⁺移入心肌细胞。结果，肌细胞中的Na⁺浓度增加并且使NCX反向转运体蛋白失活，其中Na⁺不再被泵送入肌细胞。另一方面，NCX的失活引起Ca²⁺浓度在细胞内增加，这是由于Ca²⁺不能被泵送出。Ca²⁺浓度的增加因而帮助收缩心脏。地高辛还充当迷走神经激动剂，其具有减小的心率的继发效应。地高辛毒性的特点是房性心动过速(由于异位)和房室传导阻滞(由于其迷走神经刺激性质)。地高辛进一步降低某些种类的癌症的风险，但是不在用于治疗心脏疾病的治疗性浓度下。

在本领域中存在鉴定可以用于治疗或预防哺乳动物中的非酒精性脂肪性肝炎(又称为NASH)的新型治疗性处理的需要。在本领域中还存在鉴定可以用于治疗或预防哺乳动物中其它肝脏疾病或障碍的新型治疗性处理的需要，其它肝脏疾病或障碍比如但不限于与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症。在本领域中还存在鉴定可以用于促进哺乳动物中体重减轻的新型治疗性处理的需要。本发明解决并且满足这些需要。

发明内容

本发明提供了在有需要的哺乳动物中治疗或预防肝脏疾病或障碍的方法，所述肝脏疾病或障碍选自非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症。本发明进一步提供了在有需要的哺乳动物中促进体重减轻的方法。本发明进一步提供了套药包(kit)，其包括至少一种强心苷、施用器、和其使用说明材料。本发明进一步提供了药物组合物，其包括至少一种强心苷，或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，其中至少一种强心苷包括地高辛，由此施用组合物至哺乳动物给予哺乳动物中等于或低于大约0.8ng/ml的地高辛血浆水平。本发明进一步提供了药物组合物，其包括至少一种强心苷(或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物)和至少一种另外的药剂(或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物)，其治疗、预防或减少肝脏疾病或障碍的症状，所述肝脏疾病或障碍选自NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症。本发明进一步提供了药物组合物，其包括至少一种强心苷(或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物)和促进体重减轻的至少一种另外的药剂(或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物)。

在某些实施方式中，方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的至少一种强心苷。在其它实施方式中，给哺乳动物施用至少一种强心苷给予哺乳动物中如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗或预防遭受心脏疾病的哺乳动物中的心脏疾病需要的强心苷血浆水平。在还其它实施方式中，给哺乳动物施用组合物和/或至少一种强心苷给予哺乳动物中如下的强心苷血浆水平：其低于治疗或预防遭受心脏疾病的哺乳动物中的心脏疾病需要的强心苷血浆水平。

在某些实施方式中，强心苷减少哺乳动物中的脂肪诱发的肥胖。在其它实施方式中，哺乳动物不经历食物摄入的显著减少。在还其它实施方式中，给哺乳动物进一步施用促进体重减轻的至少一种另外的药剂。在还其它实施方式中，给哺乳动物施用至少一种强心苷不在哺乳动物中引起临床上显著的心脏影响(cardiac effect)。在还其它实施方式中，临床上显著的心脏影响包括选自发生房性心动过速、发生房室传导阻滞、房室结传导降低、和房室结内有效不应期增加中的至少一种。在还其它实施方式中，强心苷抑制哺乳动物的肝脏中的HIF-1α合成。在还其它实施方式中，强心苷抑制哺乳动物的肝脏中的炎症。在还其它实施方式中，强心苷抑制哺乳动物中的肝脏脂肪变性。在还其它实施方式中，强心苷在哺乳动物中减少选自肝脏损害和糖酵解的至少一种病症。在还其它实施方式中，强心苷减少哺乳动物中的脂肪诱发的肥胖。在还其它实施方式中，强心苷提高哺乳动物中的葡萄糖耐受性。在还其它实施方式中，强心苷减少哺乳动物中的一种或多种糖尿病症状和/或并发症。

在某些实施方式中，至少一种强心苷是选自乙酰洋地黄毒甙、蟾蜍灵、华蟾毒配基(cinobufagerin)、铃兰毒甙、磁麻甙、洋地黄毒苷配基、地高辛素(digotoxin)、异羟洋地黄毒苷配基(digoxigerin)、地高辛、羟基洋地黄毒苷配基、羟基洋地黄毒甙、海蟾蜍毒素(marinobufagenin)、黄夹次甙B(nerifolin)、夹竹桃甙、苦毒毛旋花子甙、萝藦苦甙、甲黄次甙、原海葱苷A、毒毛旋花子甙K、和UNBS1450的至少一种。

在某些实施方式中，至少一种强心苷包括地高辛。在其它实施方式中，至少一种强心苷包括地高辛，并且给哺乳动物施用至少一种强心苷给予等于或低于大约0.8ng/ml的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，至少一种强心苷包括地高辛，并且给哺乳动物施用至少一种强心苷给予选自如下的地高辛血浆水平：大约0.02至大约0.05ng/ml；大约0.05至大约0.1ng/ml；大约0.05至大约0.15ng/ml；大约0.05至大约0.2ng/ml；大约0.05至大约0.25ng/ml；大约0.05至大约0.3ng/ml；大约0.05至大约0.35ng/ml；大约0.05至大约0.4ng/ml；大约0.05至大约0.45ng/ml；大约0.05至大约0.5ng/ml；大约0.05至大约0.55ng/ml；大约0.05至大约0.6ng/ml；大约0.05至大约0.65ng/ml；大约0.05至大约0.7ng/ml；大约0.05至大约0.75ng/ml；和大约0.05至大约0.8ng/ml。

在某些实施方式中，大约每天一次、大约每隔一天、大约每隔两天、大约每隔三天、大约每隔四天、大约每隔五天或大约每周一次给哺乳动物施用至少一种强心苷。

在某些实施方式中，哺乳动物被进一步施用至少一种另外的药剂，其减少肝脏疾病或障碍的症状，治疗或预防肝脏疾病或障碍，所述肝脏疾病或障碍选自NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症。在其它实施方式中，至少一种另外的药剂包括抗糖尿病药或奥贝胆酸(abeticholic acid)。在还其它实施方式中，至少一种强心苷通过选自如下的至少一种途径施用至哺乳动物：鼻部、吸入、外部、口服、含服、直肠、胸膜、腹膜、阴道、肌肉内、皮下、经皮、硬膜外、气管内、耳部、眼内、鞘内和静脉内。在还其它实施方式中，哺乳动物是人。

在某些实施方式中，说明材料包括用于在哺乳动物中预防或治疗肝脏疾病或障碍的说明，所述肝脏疾病或障碍选自NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症。在其它实施方式中，套药包进一步包括至少一种另外的药剂，其治疗、预防或减少肝脏疾病或障碍的症状，所述肝脏疾病或障碍选自NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症。在还其它实施方式中，至少一种另外的药剂包括抗糖尿病药或奥贝胆酸。在还其它实施方式中，说明材料包括用于在哺乳动物中促进体重减轻的说明。在还其它实施方式中，套药包进一步包括促进体重减轻的至少一种另外的药剂。在还其它实施方式中，给哺乳动物施用在说明材料中描述的至少一种强心苷量给予哺乳动物中如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗或预防遭受心脏疾病的哺乳动物中的心脏疾病需要的强心苷血浆水平。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的具体实施方式的下列详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中显示了具体实施方式。然而，应当理解本发明不限于在附图中显示的实施方式的精确布置和手段。

图1A-1J图解了腺苷以NLRP3炎性小体(inflammasome)依赖性方式刺激IL-1β产生的发现。从野生型(WT)小鼠(图1A-1D，1F-1I)、Il1r-/-(图1E)或Nlrp3-/-、ASC-/-、P2xr7-/-、或胱天蛋白酶-1(Caspase-1,Casp-1)-/-小鼠(图1J)获得鼠腹膜巨噬细胞(PEC)并且使用LPS致敏(prime)16小时。图1A：接着是使用腺苷(Ad，100μM)、腺苷脱氨酶抑制剂(EHNA，10μM)、腺苷脱氨酶(ADA，10U ml^-1)、ATP二磷酸水解酶(腺苷三磷酸双磷酸酶，10Uml^-1)、或赤(erythro)-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA，10μM)(图1B，1F-1J)处理1小时。全(pan)腺苷激动剂(NECA，1μM，10μM)(图1C，1E)，或(图1D，1I)通过NECA处理持续1和6小时，并且然后脉冲给药(pulsed)ATP持续20min。在脉冲给药ATP持续5小时(图1A，1C-1E，1J)或指示的时间过程(图1B，1G-1I)后，在细胞上清液中测量IL-1β、TNF-α、IL-10和IFN-γ分泌的酶联免疫吸附试验(ELISA)。在脉冲给药ATP指定的时间过程后，进行LDH试验(图1F)。来自至少三个独立实验的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图2A-2H图解了如下发现：腺苷经由A_2A受体介导IL-1β的增加并且增大信号1和信号2途径。图2A：在存在或不存在三种不同的腺苷受体拮抗剂A₁(DPCPX，10nM)、A_2A(ZM241385，10μM)、A_2B(MRS1706，10nM)、A₃(MRS1523，5μM)，或其组合的情况下，使用NECA(10μM)处理LPS致敏的PEC持续1小时，并且脉冲给药ATP持续20min。图2A-2B：A_2A受体特异性激动剂(CGS21680)和拮抗剂ZM 241385分别增加和阻断IL-1β产量。图2C：如从图2A抽样的，在存在或不存在ZM 241385的情况下，PEC中的LDH释放不显示差异。图2D：来自A_2A受体缺陷细胞的PEC具有低的IL-1β产生，其不通过NECA和CGS 21680增加。图2E：CGS21680增加Il1b mRNA表达的诱导，并且这在A_2A受体缺陷细胞中降低。图2F：巨噬细胞中A_2A受体的失去导致响应于LPS的非常更低水平的Il1b蛋白A表达。图2G：CGS21680和ZM241395分别增加和降低切割的胱天蛋白酶-1的产生。图2H：切割的胱天蛋白酶-1的产生在A_2A受体缺陷巨噬细胞中降低。来自至少三个独立实验的数据表达为平均值±SD。显示的免疫印迹是来自至少三个独立实验的结果。通过学生t检验测定的p<0.05。

图3A-3I图解了如下发现：腺苷经由cAMP-PKA途径通过上调pro-IL-1β的转录取代了LPS诱导的耐受性并且增加IL-1β产生。PEC被用于所有下列实验。图3A：使用LPS(100ng/ml)致敏(Pri)持续16小时，接着使用LPS(100ng/ml)、或NECA(10μM)或CGS21680(10μM)在存在或不存在LPS(100ng/ml)的情况下刺激(Stim)持续6小时。图3B：在具有或不具有LPS致敏的情况下，如指示的剂量使用毛喉素处理6小时。图3C：使用或不使用NECA(10μM)、CGS21680(10μM)或db-cAMP(200μM)处理6小时。图3D：在存在或不存在SQ22536、H89和PKi的情况下，LPS致敏和使用NECA或CGS21680处理。图3E：使用LPS致敏16小时并且使用ATP处理20min，接着是在存在或不存在腺苷酸环化酶和PKA抑制剂SQ22536和H-89的情况下的CGS 21680。图3F：使用LPS致敏并且使用或不使用NECA(10μM)或db-cAMP(200μM)处理6小时。图3G：使用或不使用CGS21680(10μM)处理3小时，并且通过添加5μg/ml放线菌素D终止转录，并且在指定的时间点收集RNA样品。图3H：使用NECA(10μM)刺激从野生型或A_2AR-cKO小鼠获得的LPS致敏的PEC持续6小时。在每个处理后收获细胞并且分离RNA，并且通过使用特异性引物的实时PCR定量Il1b和如指示的其它基因的基因表达。图3I：使用LPS致敏16小时并且使用ATP处理20min，接着是在存在或不存在SQ22536或H-89的情况下的CGS 21680。通过特异性抗IL-1β和抗胱天蛋白酶-1p10抗体进行细胞裂解物中proIL-1β、胱天蛋白酶-1的免疫印迹分析(图3C，3E-3F，3I)。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。显示的免疫印迹是来自至少三个独立实验的代表性结果。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图4A-4H图解了腺苷经由HIF-1α依赖性途径介导pro-IL-1β的增加的发现。图4A：IL-1β启动子上共有的NFκB和HRE结合位点。图4B：使用或不使用NECA或CGS21680刺激从A_2AR-cKO和对照获得的LPS致敏的PEC。图4C：在如指示的时间点使用或不使用NECA刺激从HIF-1α-cKO和对照获得的LPS致敏的PEC。在每个处理后收获细胞并且分离RNA，并且通过实时PCR定量Il1b和Hif1α的基因表达。图4D：在存在或不存在CREB显性失活质粒(CREBΔ)的情况下，使THP-1细胞转染有HRE-β启动子荧光素酶构建体和β-半乳糖苷酶质粒，并且然后使用LPS/PMA接着NECA致敏。图4E：在存在或不存在CREBΔ的情况下，使THP-1细胞转染有人IL-1β启动子荧光素酶构建体和β-半乳糖苷酶质粒，并且然后使用LPS/PMA接着CGS21680或NECA致敏。测量荧光素酶活性并且归一化为β-半乳糖苷酶活性并且使用对照进行归一化。数据是一式三份的培养物的平均值±SD并且代表三个独立实验。图4F：CD14-MD2-TLR4-HEK293细胞转染有NFκB启动子荧光素酶构建体和Renilla荧光素酶(Rluc)对照报道基因载体，并且然后在存在LPS的情况下使用CGS21680、NECA或ZM241395处理。如指示的，测量荧光素酶活性并且归一化为Rluc活性并且使用对照进行归一化。对于图4B-4F，数据是一式三份的培养物的平均值±SD并且代表三个独立实验。图4G：在如指示的不同时间点使用或不使用NECA处理从HIF-1α-cKO和对照获得的LPS致敏的PEC，接着脉冲给药ATP。在ATP脉冲给药后5小时内收集细胞上清液。通过ELISA测量细胞上清液中的IL-1β。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。图4H：在如指示的不同时间点使用或不使用NECA处理从HIF-1α-cKO和对照小鼠获得的LPS致敏的PEC，接着脉冲给药ATP。在ATP脉冲给药后收集细胞裂解物。通过蛋白质印迹测量细胞上清液中的HIF-1α、胱天蛋白酶原-1(pro-caspase-1,procasp-1)、胱天蛋白酶-1和pro-IL-1β。显示的免疫印迹是来自至少三个独立实验的代表性结果。

图5A-5H图解了肝损伤和纤维化依赖于巨噬细胞中的A_2A受体信号传导的发现。图5A：A_2AR-cKO和对照小鼠腹膜内注射LPS(1mg/kg)和D-半乳糖胺(500mg kg^-1)持续6小时，接着收集肝脏组织和血清用于H&E染色和ALT试验。图5B：收集肝脏RNA样品并且通过使用特异性引物的实时PCR试验Il1b基因。图5C：通过使用特异性抗体的免疫印迹分析对胱天蛋白酶原-1(procaspase-1)、切割的胱天蛋白酶-1(p10)、和β-肌动蛋白水平进行肝脏组织裂解物试验。对于图5A-5D，来自每个组中的10-11只小鼠的数据表达为平均值±SD。图5D：收集血清用于IL-1β的测量。图5E：A_2AR-cKO和对照小鼠腹膜内注射单剂量的TAA，接着如指示的收集肝脏组织进行H&E染色。图5F：收集肝脏RNA样品并且通过实时PCR试验Il1b基因。图5G：还在TAA注射后第7天获得肝脏组织并且进行纤维化的H&E和天狼星红(Sirius red)染色。图5H：收集血清并且进行血清ALT试验(来自每个组中的5只小鼠的数据表达为平均值±SD)。通过学生t检验测定的*p<0.05。比例尺对应于500μm。

图6A-6B图解了骨髓巨噬细胞和肝脏库普弗细胞(Kupffer cell)响应于腺苷信号传导增加IL-1β的发现。图6A：使用LPS致敏鼠骨髓源巨噬细胞(BMDM)持续16小时，使用NECA(10μM)处理1小时，并且然后脉冲给药ATP。图6B：使用LPS致敏原代鼠肝脏库普弗细胞持续16小时，使用NECA(10μM)处理1小时，并且然后脉冲给药ATP。在脉冲给药ATP后5小时测量上清液中的IL-1β分泌。来自至少三个独立实验的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图7A-7H图解了如下发现：腺苷信号传导在上调广泛类型的炎性小体刺激物中是重要的。图7A：使用NECA(10μM)处理LPS致敏的PEC持续1小时，并且然后暴露于MSU持续6小时。图7B：使用EHNA(10μM)处理CpG-B致敏的PEC持续1小时并且然后脉冲给药ATP。图7C：使用ZM241385(10μM)处理CpG-B致敏的PEC，并且然后脉冲给药ATP。图7D：使用ZM241385(10μM)处理Pam(3)CysSK(4)致敏的PEC，并且然后脉冲给药ATP。图7E：使用ZM241385(10μM)处理LPS致敏的PEC，并且然后使用150微米PMMA珠进行刺激。图7F：使用ZM241385(10μM)处理LPS致敏的PEC，并且然后暴露于MSU持续6小时。图7G：使用或不使用ZM241385(10μM)预处理PEC持续1小时，并且然后使用肝脏裂解物刺激2小时。在脉冲给药ATP后5小时在上清液中测量IL-1β分泌。图7H：在具有或不具ZM241385的情况下，MSU晶体被腹膜内注入野生型小鼠，并且在6小时后在腹膜灌洗中定量IL-1β。来自每个组中的6只小鼠的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图8A-8B图解了腹膜巨噬细胞中使用Cre/flox系统的A_2AR和HIF-1α的表达的减少。图8A：使用LPS(100ng ml^-1)、Pam(3)CysSK(4)(10ng ml^-1)或CpG-B(3μM)刺激从Adora2afl/fl-LysM-Cre+(A_2AR-cKO)和Adorafl/fl–LysM-Cre-对照(Ctrl)小鼠获得的PEC细胞6小时。在每个处理后收获细胞并且分离RNA，并且通过使用特异性基因引物的实时PCR定量Adora2a的基因表达。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。图8B：从HIF-1αfl/fl-LysM-Cre+(HIF-1α-cKO)和HIF-1αfl/fl–LysM-Cre-对照(Ctrl)小鼠获得的PEC细胞被暴露于低氧超过12小时。通过使用特异性HIF-1α抗体的免疫印迹分析细胞裂解物。显示的免疫印迹数据代表三个独立实验。

图9A-9H图解了响应于腺苷激动剂的腹膜巨噬细胞中的细胞因子和组织修复基因的表达的改变。如指示的，使用LPS(100ng ml^-1)、CGS21680(10μM)或NECA(10μM)在不同时间点刺激LPS天然(naive)PEC或LPS致敏的PEC。在每个处理后收获细胞并且分离RNA，并且通过使用如列举的每个特异性基因引物组的实时PCR定量ProIL-1β(Il1b)(图9A)、IL-6(Il6)(图9B)、IL-4(Il4)(图9C)、TNF-α(tnfa)(图9D)、TIMP-1(Timp1)(图9E)、VEGF(vegf)(图9F)、PGK-1(Pgk1)(图9G)、GLUT-1(Slc2a1)(图9H)的基因表达。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图10A-10F图解了通过腺苷激动剂的A_2AR和Il1r缺陷腹膜巨噬细胞中的抗菌基因的表达。使用LPS(100ng ml^-1)或NECA(10μM)刺激LPS天然PEC或LPS致敏的PEC持续6小时。在每个处理后收获细胞并且分离RNA，并且通过使用如列举的每个特异性基因引物组的实时PCR定量Marco(图10A，10D)、Ptges(图10B，10E)、和Fpr1(图10C，10F)的基因表达。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图11A-11D图解了在炎性小体活性中的LPS致耐受性和非致耐受性条件下，通过cAMP信号传导的IL-1β分泌的差异。在16小时LPS致敏的(图11A)或3小时致敏的BMDM(图11B)中，使用db-cAMP(200μM)处理1小时，并且然后脉冲给药ATP。在ATP脉冲给药后如指定的时间过程，收集细胞上清液用于通过ELISA的IL-1β试验。图11C-11D：在3小时LPS致敏的BMDM中，使用如指示的不同剂量下的毛喉素处理1小时，并且然后脉冲给药ATP。在ATP脉冲给药后5小时内收集细胞上清液用于通过ELISA的IL-1β试验(图11C)，并且收集细胞裂解物用于对活性胱天蛋白酶-1进行蛋白质印迹(图11D)。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图12A-12D图解了如下发现：HIF-1α对腺苷诱导的Pro-IL-1β和NLRP3的上调是需要的。图12A：在存在或不存在HIF-1α抑制剂CAY 10585(30μM)的情况下，LPS致敏的PEC被NECA(10μM)刺激6小时。在每个处理后收获细胞并且分离RNA，并且通过使用特异性基因引物的实时PCR定量Il1a的基因表达。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。图12B：使用或不使用CGS21680(10μM)或NECA(10μM)处理LPS致敏的PEC持续1小时，或使用CAY10585处理，并且然后脉冲给药ATP。在ATP脉冲给药5小时后测量细胞上清液中的IL-1β分泌。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。图12C-12D：从野生型或HIF-1α-cKO小鼠获得的LPS致敏的PEC被NECA(10μM)刺激6小时。在每个处理后收获细胞并且分离RNA，并且通过使用每个特异性基因引物组的实时PCR定量Nlrp3和Txnip的基因表达。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图13是图解主要的肝细胞群体在A_2AR-cKO小鼠中的正常分布的一组图像。从A_2AR-cKO和对照小鼠收集肝脏组织，并且然后分离肝脏单核细胞。通过FACS测定CD11b+、CD11b+/F4/80+、Gr1+/Ly6-C+和Ly6-C+亚群的频率。

图14A-14F图解了在存在或不存在腺苷激动剂的情况下使用LPS处理的小鼠中血清ALT的增加和肝脏基因表达的变化。野生型C57BL/6小鼠腹膜内注射LPS(1μg/小鼠)。16小时后，小鼠通过IP接收NECA(2.5mg kg^-1体重)和D-半乳糖胺(500mg kg^-1)持续2小时，接着进行肝脏组织和血清收集。测定血清ALT(图14A)，并且通过使用如列举的每个特异性引物组的实时PCR定量Il1β(图14B)、Il6(图14C)、Hif1α(图14D)、Nlrp3(图14E)、和tnfα(图14F)的基因表达。来自每个处理组中的6只小鼠的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图15A-15C图解了A_2AR-cKO小鼠中通过反复的TAA注射的持续的IL1β产生。(图15A)TAA(200mg kg^-1体重)注射的图。图15B-15C：在最后一次注射后16小时内收集肝脏组织和血清，组织裂解物被应用于Pro-IL-1β和成熟的IL-1β的蛋白质印迹(图15B)，并且通过ELISA测定血清IL-1β水平(图15C)。来自每个组中的5只小鼠的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图16A-16B图解了响应于腺苷激动剂的野生型对照而不是胱天蛋白酶-1-缺陷小鼠中增加的肝纤维化。图16A：野生型和胱天蛋白酶-1-/-小鼠腹膜内注射TAA，而且共注射CGS21680(2.5mg kg^-1体重)或媒介物。在第一次注射后3天收集来自每个组的肝脏组织，并且通过天狼星红染色可视化组织胶原，并且显示了代表性图像。比例尺对应于500μm。图16B：提取总肝脏RNA并且定量Timp1mRNA水平。来自三个独立实验的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图17A-17B图解了参与炎性小体激活的两种信号(信号1和信号2)(图17A)和腺苷在调节炎性小体激活中的作用(图17B)。

图18图解了地高辛的结构。

图19是图解小鼠中的血浆地高辛水平的柱状图。在小鼠中每天以1.0mg/kg的剂量注射盐水或地高辛。最终注射后24小时测量的血浆地高辛水平处于或低于人的治疗范围(0.8-2ng/mL)。

图20A-20C图解了地高辛抑制急性肝损伤模型中的炎症的发现。

图21A-21C图解了地高辛减少肝脏损害、炎症、糖酵解和总胆固醇的发现。图21A：在同时IP注射或不IP注射地高辛(每周两次，1.0mg/kg)或PBS对照的情况下，给野生型C57BL/6小鼠供应高脂膳食食物(Research diets D12451 45％脂肪)持续12周。肝脏组织进行H&E染色，并且中性粒细胞被染色，通过FACS检测CD11b/Ly6G双阳性细胞。来自每个处理组中的5只小鼠的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。图21B：血清从如图21A中显示的收集，并且通过酶联法进行血清总胆固醇水平的测定。来自每个处理组中的5只小鼠的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。图21C：肝脏总RNA根据如来自图21A的程序分离，并且进行illumina转录组分析。列举了最高度表达的超过15种基因。来自每个处理组中的3只小鼠的数据表达为平均值±SD。

图22A-22D图解了地高辛减少小鼠中的高脂饲养诱发的肥胖的发现。在同时IP注射或不IP注射地高辛(每周两次，1.0mg/kg)或PBS对照的情况下，给野生型C57BL/6小鼠供应高脂膳食食物(Research diets D12451 45％脂肪)持续12周。体重仔细地监测为每3天的平均值的变化。代表性图片显示了I.P.注射地高辛(1mg/kg)持续12周或没有注射的小鼠的形态学变化。图22A图解了具有(DIG)和不具有(对照)地高辛的高脂膳食的小鼠的实例。HFD的小鼠记载了较少的体重增加(图22B)。显示了12周后白色脂肪组织和体重的比率(图22C)。HFD的小鼠没有观察到食物摄入的显著变化(作为每3天的平均值的变化)(图22D)。来自每个处理组中的5只小鼠的数据表达为平均值±SD。通过学生t检验测定的*p<0.05。

图23A-23D图解了地高辛保护实验性急性肝衰竭的严重性的发现。地高辛以2、1、0.2、0.05mg/kg体重的剂量和盐水对照被腹膜内施用至C57BL/6小鼠持续1小时，并且然后使用LPS(1mg/kg体重)/D-半乳糖胺(D-GalN)攻击小鼠5小时。通过H&E染色测定肝脏组织的形态，并且通过中性粒细胞浸润的Gr-1抗体染色测定炎症。图解了来自地高辛和盐水对照的肝脏切片(原始放大倍数×100)的代表性H&E染色(图23A，上部)和Gr-1(图23A，下部)阳性区域。图表显示了通过使用Image J的形态测量定量损伤区域(图23B)或Gr-1(图23C)阳性区域。对于地高辛组的每个剂量对盐水对照，*p<0.05。测量来自地高辛对盐水对照的血清水平的肝损伤标记丙氨酸转氨酶(ALT)的活性(图23D)。遍及附图的所有数据显示为平均值±SD。通过单因素ANOVA测定统计学显著性。

图24A-24G图解了地高辛限制肝脂肪变性和炎症的发现。图24A：C57BL/6小鼠接受HFD或普通饮食同时每周两次腹膜内注射的地高辛(1mg/kg)和盐水对照持续12周(图24A，24C，24F，24G)，或在开始5周接受HFD并且然后同时开始腹膜内注射地高辛(1mg/kg)持续进一步的3周(图24B，24D，24E，24H)。对肝脏组织应用H&E染色，并且图表显示了NAFLD组织学活性评分的定量(图24A-24B)。还通过中性粒细胞和单核细胞浸润测定肝脏组织炎症，其通过使用FACS测量CD11b/Ly6G和CD11b/Ly6C双阳性细胞(图24F-24H)。显示了来自地高辛对盐水对照的代表性FACS流动(图24F-24G)。进行地高辛对盐水对照中的中性粒细胞和单核细胞的定量。测量地高辛对盐水对照中的血清ALT水平(图24C-24D)。测定地高辛处理对盐水对照后三酰甘油(TG)的脂肪变性标记积聚水平(图24E)。来自每个组中的5只小鼠的遍及附图的所有数据显示为平均值±SD。通过单因素ANOVA测定统计学显著性。对于每个地高辛组对盐水对照，*p<0.05，**p<0.01。

图25A-25H图解了地高辛减轻肝氧化应激和炎性小体激活的发现。C57BL/6小鼠腹膜内注射地高辛(1mg/kg)和PBS对照持续1小时，并且然后使用LPS(1mg/kg)/D-GlaN(500mg/kg)攻击持续5h；C57BL/6小鼠接受HFD，同时腹膜内注射地高辛(1mg/kg)持续12周。通过在处死小鼠前的最后30min内腹膜内注射DHE，监测细胞氧化应激和细胞内ROS产生。图解了来自地高辛对盐水对照的LPS/D-GlaN(图25A)和HFD(图25B)中的代表性DHE染色。进行了地高辛对盐水对照中的DHE阳性区域的定量(图25A，下部，和图25B，下部)。分离来自肝脏组织的总RNA，并且应用于proIL-1β、TNFα、NLRP3和HIF1a的基因表达(图25C-25F)。总肝脏蛋白质通过蛋白质印迹应用于HIF1α、胱天蛋白酶-1、proIL-1β的蛋白质表达(图25H)。通过ELISA测量血清IL-1β(图25G)。来自每个组中的5只小鼠的遍及附图的所有数据显示为平均值±SD。通过单因素ANOVA测定统计学显著性。对于每个地高辛组对盐水对照，*p<0.05，**p<0.01。

图26图解了地高辛以低剂量依赖性方式限制肝脂肪变性和炎症的发现。C57BL/6小鼠接受HFD或普通饮食，同时每周两次腹膜内注射地高辛(0.2和0.05mg/kg)和盐水对照持续12周。肝脏组织应用于H&E染色，并且图表显示了NAFLD组织学活性评分的定量。测量地高辛对盐水对照中的血清ALT水平。来自每个组中的5只小鼠的遍及附图的所有数据显示为平均值±SD。通过单因素ANOVA测定统计学显著性。对于每个地高辛组对盐水对照，*p<0.05。

图27包括图解人中性粒细胞中的ROS产生的图表。使用如指示的剂量的DIG处理人中性粒细胞持续3小时，并且然后CM-H2DCFDA(5-(和-6)-氯甲基-2’,7’-二氯双氢荧光素二乙酸酯，乙酰酯；H₂DCFDA的氯甲基衍生物，其用作细胞中活性氧种类(ROS)的荧光指示剂)持续20min。通过酶标仪(plate reader)动态地测量CM-H2DCFDA密度。

图28A-28D包括图解施用地高辛改变接受HFD的小鼠的体重的发现的一组图表。C57BL/6小鼠接受HFD或普通饮食，同时每周两次如指示剂量的地高辛和盐水对照持续12周(图28A-28C)，或在开始5周接受HFD并且然后同时开始地高辛(1mg/kg)持续进一步的3周(图28D)。每周两次监测体重(图28A-28D)。来自每个组中的5只小鼠的遍及附图的所有数据显示为平均值±SD。测定统计学显著性。*p<0.05。

图29A-29B包括图解地高辛不影响HFD小鼠的食物摄入的发现的一组图表。C57BL/6小鼠接受HFD或普通饮食，同时每周两次如指示剂量的地高辛和盐水对照持续12周(图29A-29B)。每周两次测量食物摄入(图29A-29B)。遍及附图的所有数据来自每个组中的5只小鼠。

图30A-30C包括图解HFD小鼠在地高辛处理后的形态的一组图像和图表。C57BL/6小鼠接受HFD或普通饮食，同时每周两次地高辛和盐水对照持续12周(图30A-30C)。图解了小鼠肝脏和白色脂肪组织的代表性形态学图片(图30A-30B)。测量肝脏、白色脂肪组织与体重的比率(图30C)。测定统计学显著性。*p<0.05。

图31A-31B包括图解地高辛减少脂肪沉积的发现的一组图像和图表。C57BL/6小鼠接受HFD或普通饮食，同时每周两次地高辛(1mg/kg)和盐水对照持续12周(图31A-31B)。使用油红使肝脏切片染色。显示了油红的代表性染色(图31A，左)并且使用Image J测量油红阳性区域的定量(图31A，右)。通过ELISA测量肝脏TG含量(图31B)。遍及附图的所有数据来自每个组中的5只小鼠。测定统计学显著性。*p<0.05。

具体实施方式

在一个方面，本发明涉及如下意想不到的发现：低剂量的强心苷对治疗或预防哺乳动物中的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是有效的。在另一个方面，本发明涉及如下意想不到的发现：低剂量的强心苷对治疗或预防哺乳动物中的肝脏疾病或障碍是有效的，所述肝脏疾病或障碍比如但不限于与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症。在还另一个方面，本发明涉及如下意想不到的发现：低剂量的强心苷对治疗或预防哺乳动物中的自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、和其它毒性和/或炎性肝脏病症是有效的。在还另一个方面，本发明涉及如下意想不到的发现：低剂量的强心苷对在哺乳动物中促进体重减轻是有效的。

在某些实施方式中，给哺乳动物施用强心苷抑制哺乳动物的肝脏中的炎症。在其它实施方式中，给哺乳动物施用强心苷抑制哺乳动物中的肝脏脂肪变性。在还其它实施方式中，给哺乳动物施用强心苷减少哺乳动物中的肝脏损害和/或糖酵解。在还其它实施方式中，给哺乳动物施用强心苷减少哺乳动物中的脂肪诱发的肥胖。在还其它实施方式中，给哺乳动物施用强心苷导致体重减轻而不减少食物摄入。在还其它实施方式中，强心苷提高哺乳动物中的葡萄糖耐量。在还其它实施方式中，强心苷减少哺乳动物中的一种或多种糖尿病症状和/或并发症。在还其它实施方式中，哺乳动物是人。

本发明考虑本文叙述的生物学作用可以与强心苷自身和/或在哺乳动物的体内形成的一种或多种其代谢物相关联。在某些实施方式中，本发明考虑给哺乳动物施用治疗有效量的生物活性强心苷代谢物(一种多种)以引发本文叙述的生物学作用。

定义

除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料可以用于实践或测试本发明，但是描述了优选的方法和材料。

如本文使用的，下列术语中的每个具有与其在此部分中相关联的含义。

如本文使用的，冠词“一个”和“一种”用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。

如本文使用的，当提及可测量的值比如量、持续时间等时，“大约”意为包含距离规定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，和还更优选地±0.1％的变化，因为这样的变化适合进行公开的方法。

如果疾病或障碍的症状的严重性、患者经历这样的症状的频率或二者减小，则疾病或障碍被“减轻”。

如本文使用的，与药物剂量相关的术语“临床上显著的心脏影响”指示一旦施用至对象，药物剂量不引起对象中显著的、有害的和/或可测量的心脏影响。

在一个方面，与对象相关的术语“共同施用的”和“共同施用”指的是给对象施用本发明的化合物，或其衍生物、溶剂化物、盐或前体药物盐，连同还可以治疗本发明考虑的障碍或疾病的化合物。在某些实施方式中，共同施用的化合物被单独地施用，或作为单一治疗途径的一部分以任何种类的组合施用。共同施用的化合物可以以任何种类的组合配制为各种固体、凝胶和液体制剂下的固体和液体的混合物，和配制为溶液。

如本文使用的，术语“组合物”或“药物组合物”指的是在本发明内有用的至少一种化合物与药学上可接受的载体的混合物。药物组合物促进施用化合物至患者或对象。本领域中存在的施用化合物的多种技术包括，但不限于，静脉内、口服、气溶胶、肠胃外、眼部、鼻部、肺部和外部施用。

如本文使用的，术语“地高辛”指的是4-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S)-3-[(2S,4S,5R,6R)-5-[(2S,4S,5R,6R)-5-[(2S,4S,5R,6R)-4,5-二羟基-6-甲基-烷-2-基]氧-4-羟基-6-甲基-烷-2-基]氧-4-羟基-6-甲基-烷-2-基]氧-12,14-二羟基-10,13-二甲基-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-十四氢环戊[a]菲-17-基]-5H-呋喃-2-酮，或其盐或溶剂化物。

如本文使用的“疾病”是动物的如下健康状态：其中动物不能维持稳态，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康继续恶化。

如本文使用的“障碍”在动物中是如下健康状态：其中动物能够维持稳态，但是其中动物的健康状态比它在不存在障碍的情况下将具有的健康状态更不利。不加以治疗，障碍不必然引起动物的健康状态的进一步降低。

如本文使用的，术语“有效量”、“药学有效量”和“治疗有效量”指的是无毒的但是足够的量的药剂以提供期望的生物学结果。该结果可以是征兆、症状或病因的减少和/或减轻，或生物系统的任何其它期望的改变。可以使用常规实验由本领域普通技术人员确定任何个案中的适当的治疗量。

如本文使用的，术语“HFD”指的是高脂膳食。

如本文使用的术语“说明材料”包括可以用于传达本发明的组合物和/或化合物的有用性的套药包中的出版物、记录、图表、或任何其它表达介质。套药包的说明材料可以例如附加至容纳本发明的化合物和/或组合物的容器或与容纳化合物和/或组合物的容器一起运送。可选地，说明材料可以与容器分离地运送，目的是接受者协作地使用说明材料和化合物。说明材料的递送可以例如通过传达套药包的有用性的出版物或其它表达介质的物理递送，或可以可选地通过电子传输实现，例如借助计算机，比如通过电子邮件，或从网站下载。

术语“患者”、“对象”或“个体”在本文可交换地使用，并且指的是服从本文描述的方法的任何动物或其细胞，无论在体外或在原位。在非限制性实施方式中，患者、对象或个体是人。

如本文使用的，术语“药学上可接受的”指的是材料，比如载体或稀释剂，其不废除化合物的生物学活性或性质，并且是相对无毒的，即，材料可以被施用至个体而不引起非期望的生物学作用或以有害的方式与在组合物中包含的组合物的任何组分相互作用。

如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”意思是药学上可接受的材料、组合物或载体，比如液体或固体填料、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或封装材料，其涉及在患者内携带或输送在本发明内有用的化合物或将在本发明内有用的化合物携带或输送至患者，以便它可以执行其预定功能。通常，这样的构建体被从身体的一个器官或一部分携带或输送至身体的另一个器官或另一部分。每种载体在与制剂——其包括在本发明内有用的化合物——的其它成分相容的意义上必须是“可接受的”，并且对患者无害。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括糖类，比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，和其衍生物，比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，比如可可脂和栓剂蜡；油，比如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，比如丙二醇；多元醇，比如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，比如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原的水(pyrogen-free water)；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和在药物制剂中采用的其它无毒的相容性物质。

如本文使用的，“药学上可接受的载体”还包括任何和所有包衣、抗菌剂和抗真菌剂、和吸收延迟剂、和与在本发明内有用的化合物的活性相容且患者生理学上可接受的类似物。补充性活性化合物也可以并入组合物。

“药学上可接受的载体”可以进一步包括在本发明内有用的化合物的药学上可接受的盐、前体药物、溶剂化物或衍生物。可以包括在用于本发明的实践的药物组合物中的其它另外的成分是本领域已知的，并且在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Genaro,Ed.,Mack Publishing Co.,1985,Easton,PA)中描述，其通过引用并入本文。

如本文使用的，语言“药学上可接受的盐”指的是由药学上可接受的无毒的酸——其包括无机酸、有机酸、其溶剂化物、水合物、或笼形物——制备的施用的化合物的盐。

如本文使用的，“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防(prevention)”意思是避免或延迟与对象中的疾病或病症相关联的症状的发病，所述对象在施用药剂或化合物时还没有发展出这样的症状。

“治疗性”处理是出于削弱或消除那些征兆的目的给展示病理学征兆的对象施用的治疗。

如本文使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”被限定为应用或施用治疗性药剂——即，本发明的化合物(单独地或与另一种药剂组合地)——至患者，或应用或施用治疗性药剂至来自患者的分离的组织或细胞系(例如，用于诊断或离体应用)，所述患者具有本文考虑的病症、本文考虑的病症的症状或发展出本文考虑的病症的可能性，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响本文考虑的病症、本文考虑的病症的症状或发展出本文考虑的病症的可能性。基于从药物基因组学(pharmacogenomics)领域获得的知识，这样的治疗可以被特异性地调整或修改。

如本文使用的，术语“特异性地结合(specifically bind)”或“特异性地结合(specifically binds)”意思是第一分子优先地结合至第二分子(例如，特定的受体或酶)，但是不必然地仅结合至第二分子。

遍及此公开内容，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解范围格式的描述仅仅为了便利和简洁，并且不应当解释为对本发明的范围的僵化的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如，范围比如1至6的描述应当被认为已经具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.1、5.3、5.5和6。不管范围的宽度，这都适用。

公开内容

IL-1β的产生是大范围的急性和慢性炎性和纤维变性反应的中心步骤。两种不同的途径已知对初始炎性小体激活和IL-1β产生是必需的(图17A)。信号1途径通常认为经由Toll样受体被激活，其导致NFkβ介导的Pro-ILβ基因，以及炎性小体组件的基因的上调。第二途径(信号2)对炎性小体机制(machinery)的激活是必需的。信号2通过大范围的刺激被递送，该刺激的范围包括病原体源分子比如鞭毛蛋白和胞质DNA，和非病原体源微粒比如尿酸晶体。

上面的两种途径似乎提供炎性小体激活的最低要求，然而，它们的激活与在24小时内显著地消退的IL-1β的急性产生相关联。炎性小体激活还在大量慢性炎性和纤维变性疾病中具有重要作用。通过更大的数目、浓度和持续时间的暴露于起始信号1和2途径的配体，IL-1β的持续产生理论上可以在上面的途径的框架内发生。然而，持续暴露于PAMP导致耐受性状态的发展，并且信号2途径比如ATP诱导细胞死亡。

如本文证明的，存在另外的调控信号，其独立于提供信号1和2的配体。这样的信号的额外的优势在于它们可以提供不同的功能信息。本研究涉及腺苷在炎性小体激活的调节中的作用(图17B)。细胞外腺苷浓度响应于组织损害升高，并且腺苷通过细胞摄入和腺苷脱氨酶介导的代谢从组织快速地去除。这提供了预兆局部组织缺血和损伤的快速应答机制。然而，腺苷不被认为是DAMP(损伤相关分子模式分子(damage-associated molecularpattern molecule))，因为它以除炎症之外的许多方式协调对组织损伤的适应性反应，并且大多数免疫学作用减少细胞因子产生。

如本文证明的，经由A_2A受体作用的腺苷是炎性小体活性的关键调节物。组织损伤期间发现的腺苷的浓度增加炎性小体反应的最大幅度和持续时间。通过腺苷的炎性小体调节不替换信号1或2，但是调节由宽范围的PAMP(病原相关分子模式分子)和DAMP起始的炎性小体活性。cAMP/PKA/CREB/HIF-1α信号传导途径下游A_2A受体被激活，并且导致Pro-IL1β和NLRP3的上调，和更大的胱天蛋白酶-1激活。除通过腺苷的病理学浓度调节炎性小体活性之外，对用于最大的IL-1β产生的生理学水平的腺苷存在需要。最后，在巨噬细胞已经接收信号1和2后，腺苷可以调节进一步的IL-1β产生，而不需要任一种起始信号。这证明这样的细胞不简单地对进一步的信号耐受或无反应，而是处于激活后状态，其中它们已经从初始的DAMP驱动的表型转变为后续的腺苷cAMP驱动的表型。

在一个方面，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法。在另一个方面，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中的疾病或障碍——比如与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症——的方法。在还另一个方面，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中的自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、和其它毒性和/或炎性肝脏病症的方法。在还另一个方面，本发明提供了在哺乳动物中促进体重减轻的方法。

在某些实施方式中，方法包括给哺乳动物施用治疗有效低剂量的至少一种强心苷，或其至少一种生物活性代谢物。在某些实施方式中，强心苷抑制哺乳动物的肝脏中的HIF-1α合成。在其它实施方式中，强心苷抑制哺乳动物的肝脏中的炎症。在其它实施方式中，强心苷抑制哺乳动物中的肝脏脂肪变性。在还其它实施方式中，强心苷减少哺乳动物中的肝脏损害和/或糖酵解。在还其它实施方式中，强心苷减少哺乳动物中的脂肪诱发的肥胖。在还其它实施方式中，强心苷在哺乳动物中不具有显著的、有害的和/或可测量的强心活性，例如，如测量为发生房性心动过速、房室传导阻滞、房室结传导降低、和/或房室结内的有效不应期增加。在某些实施方式中，哺乳动物经受体重减轻而没有相伴的食物摄入的减少。

在本发明的方法中有用的强心苷包括，但不限于，乙酰洋地黄毒甙、蟾蜍灵、华蟾毒配基、铃兰毒甙、磁麻甙、洋地黄毒苷配基、地高辛素、异羟洋地黄毒苷配基、地高辛、羟基洋地黄毒苷配基、羟基洋地黄毒甙、海蟾蜍毒素、黄夹次甙B、夹竹桃甙、苦毒毛旋花子甙、萝藦苦甙、甲黄次甙、原海葱苷A、毒毛旋花子甙K和/或UNBS1450、和其衍生物、前体药物、盐或溶剂化物。

在本发明内考虑的强心苷的剂量给予如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗或预防心脏疾病比如心力衰竭和/或房性心律不齐需要的强心苷血浆水平。在某些实施方式中，强心苷是地高辛并且在方法内有用的剂量给予如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗心脏疾病需要的地高辛血浆水平(大约0.8ng/ml)。

在某些实施方式中，强心苷是地高辛并且在方法内有用的剂量给予大约0.02至大约0.8ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.02至大约0.05ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.1ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.15ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.2ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.25ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.3ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.35ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.4ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.45ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.5ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.55ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.6ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.65ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.7ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.75ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予大约0.05至大约0.8ng/ml的范围内的地高辛血浆水平。在还其它实施方式中，在方法内有用的地高辛剂量给予选自如下的地高辛血浆水平：大约0.02ng/ml、大约0.05ng/ml、大约0.1ng/ml、大约0.15ng/ml、大约0.2ng/ml、大约0.25ng/ml、大约0.3ng/ml、大约0.35ng/ml、大约0.4ng/ml、大约0.45ng/ml、大约0.5ng/ml、大约0.55ng/ml、大约0.6ng/ml、大约0.65ng/ml、大约0.7ng/ml、大约0.75ng/ml、和大约0.8ng/ml。

在某些实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0025mg/天至大约0.125mg/天的范围内。在其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0025mg/天至大约0.0075mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.015mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.0225mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.030mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.0375mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.045mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.0525mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.060mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.0675mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.075mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.0825mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.090mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.0975mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.105mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.113mg/天的范围内。在还其它实施方式中，口服地高辛剂量在大约0.0075mg/天至大约0.120mg/天的范围内。

在某些实施方式中，大约每天一次、大约每隔一天、大约每隔两天、大约每隔三天、大约每隔四天、大约每隔五天或大约每周一次给哺乳动物施用强心苷。

在某些实施方式中，给哺乳动物进一步施用至少一种另外的药剂，其治疗或预防NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症，或减少其症状。

在某些实施方式中，给哺乳动物进一步施用至少一种另外的药剂，其治疗或预防自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、和其它毒性和/或炎性肝脏病症，或减少其症状。

在某些实施方式中，给哺乳动物进一步施用促进体重减轻的至少一种另外的药剂。

在某些实施方式中，哺乳动物是人。

在某些实施方式中，组合物通过选自如下的至少一种途径施用至哺乳动物：鼻部、吸入、外部、口服、含服、直肠、胸膜、腹膜、阴道、肌肉内、皮下、经皮、硬膜外、气管内、耳部、眼内、鞘内和静脉内。

套药包

本发明包括套药包，其至少包括强心苷、施用器、和其使用说明材料。

在某些实施方式中，包括在套药包中的说明材料包括用于预防或治疗哺乳动物中的肝脏疾病或障碍——比如NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症——的说明。说明材料叙述了应当被施用至哺乳动物的至少一种强心苷的量和频率。在其它实施方式中，套药包进一步包括至少一种另外的药剂，其治疗、预防或减少肝脏疾病或障碍——比如NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症——的症状。

在某些实施方式中，包括在套药包中的说明材料包括用于预防或治疗哺乳动物中的自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、和其它毒性和/或炎性肝脏病症的说明。说明材料叙述了应当被施用至哺乳动物的至少一种强心苷的量和频率。在其它实施方式中，套药包进一步包括至少一种另外的药剂，其治疗、预防或减少自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、和其它毒性和/或炎性肝脏病症的症状。

在某些实施方式中，包括在套药包中的说明材料包括用于促进体重减轻的说明。说明材料叙述了应当被施用至哺乳动物的至少一种强心苷的量和频率。在其它实施方式中，套药包进一步包括促进体重减轻的至少一种另外的药剂。

联合疗法

在某些实施方式中，在本发明内考虑的化合物结合至少一种另外的药剂在本发明的方法内是有用的，所述至少一种另外的药剂对治疗或预防肝脏疾病或障碍比如NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症是有用的。此另外的化合物可以包括本文鉴定的化合物或已知治疗、预防或减少NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症的症状的化合物，例如，商购的化合物。

在某些实施方式中，在本发明内考虑的化合物结合至少一种另外的药剂在本发明的方法内是有用的，所述至少一种另外的药剂对治疗或预防自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、和其它毒性和/或炎性肝脏病症是有用的。此另外的化合物可以包括本文鉴定的化合物或已知治疗、预防或减少自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、和其它毒性和/或炎性肝脏病症的症状的化合物，例如，商购的化合物。

在某些实施方式中，在本发明内考虑的化合物结合至少一种另外的药剂在本发明的方法内是有用的，所述至少一种另外的药剂对促进体重减轻是有用的。此另外的化合物可以包括本文鉴定的化合物或已知促进体重减轻的化合物，例如，商购的化合物。

在某些实施方式中，另外的药剂是抗糖尿病药或奥贝胆酸(又称为(3α,5β,6α,7α)-6-乙基-3,7-二羟基胆甾烷-24-酸(cholan-24-oic acid)；或(4R)-4-[(3R,5S,6R,7R,8S,9S,10S,13R,14S,17R)-6-乙基-3,7-二羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-17-基]戊酸)，或其衍生物、前体药物、盐或溶剂化物。

在本发明内考虑的体重减轻药的非限制性实例包括奥利司他、西布曲明、苯甲曲秦酒石酸盐、脱氧麻黄碱、IONAMIN^TM、芬特明、芬氟拉明、右芬氟拉明、壳聚糖、吡啶甲酸铬(chromium picolinate)、共轭亚油酸、绿茶提取物、瓜尔豆胶、蝴蝶亚属植物(hoodia)、托吡酯(topiramate)和芬特明的组合、安非他酮和唑尼沙胺的组合、安非他酮和纳曲酮的组合、芬特明和氟西汀的组合、芬特明和曲舍林的组合、芬特明和西酞普兰的组合、芬特明和依他普仑(escitalopram)的组合物、或芬特明和曲唑酮的组合物。

在本发明内考虑的抗糖尿病药的非限制性实例包括：

α-葡萄糖苷酶抑制剂：抑制负责消化碳水化合物的上GI酶(α-葡萄糖苷酶)，其减慢葡萄糖的吸收；还引起餐后血糖浓度的较慢上升。非限制性实例：阿卡波糖(Precose,Glucobay)；米格列醇(Glyset)；伏格列波糖(Vogseal,Volix,Basen)；

脂酶抑制剂：抑制胰腺和胃脂酶，其阻断脂肪吸收。非限制性实例：奥利司他(Xenical,Alli)；

磺酰脲：充当胰岛素促分泌素(secretagogue)，其通过与胰腺β-细胞的ATP依赖性钾通道相互作用触发胰岛素释放。最终结果是在所有血糖浓度下释放更多胰岛素。它们是用于治疗患有2型糖尿病的患者最常用的药物，但是由于它们触发胰岛素自身的释放，胰岛素和磺酰脲的组合是不常用的。非限制性实例：第1代磺酰脲——醋磺己脲、氯磺丙脲(Diabinese)、甲苯磺丁脲(Orinase)、妥拉磺脲；第2代磺酰脲——格列齐特(Diamicron R,Diamicron MR)、优降糖或格列本脲(Diabeta,Micronase,Glynase)、格列吡嗪(Glucotrol,Glucotrol XL)、格列美脲(Amaryl)、格列喹酮(Glurenorm)；

格列奈类药物(meglitinide)：通过调节胰腺β-细胞中的ATP依赖性钾通道作用的短效降糖药物，类似于磺酰脲；在结构上不同于磺酰脲并且也经由不同的受体作用。非限制性实例：米格列奈(mitiglinide)(Glufast)；那格列奈(nateglinide)(Starlix)；瑞格列奈(Prandix)；

双胍：减少来自肝脏的葡萄糖释放和增加通过骨骼肌的葡萄糖摄入。二甲双胍是2型糖尿病的优选的初始治疗，其具有良好的血糖功效(glycemic efficacy)，不存在体重增加和低血糖，一般耐受性并且低成本。与单独的胰岛素或胰岛素和磺酰脲的组合相比，二甲双胍和胰岛素的组合通常与较低的体重增加相关联。与磺酰脲、二甲双胍和罗格列酮(rosiglitazone)的三元组合相比，磺酰脲、二甲双胍和甘精胰岛素(insulin glargine)的三元组合已经显示具有较少的副作用、较少的血脂(lipid profile)问题和较低的成本。非限制性实例：二甲双胍(Glucophage)；苯乙双胍(DBI)；丁二胍(Glybigid,Glybigidum)；

噻唑烷二酮：通过作用于脂肪、肌肉和肝脏组织增加胰岛素敏感性以增加葡萄糖利用和降低葡萄糖产生。作用机制不被完全理解，但是它们似乎结合和激活一种或多种过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)，其调节基因表达。非限制性实例：罗格列酮(Avandia)；吡格列酮(Actos)；曲格列酮(Rezulin)；替格列扎(tesaglitazar)(Pargluva)；

普兰林肽(pramlintide)(Symlin)：又称为胰岛淀粉样多肽，是减慢胃排空和抑制胰高血糖素的人糊精的合成类似物，其减小血糖水平的餐后上升；被FDA批准以降低1型糖尿病患者中的血糖；

肠降血糖素模拟物：这些胰岛素促分泌素充当胰高血糖素样肽-1(GLP-1)膜受体激动剂。它们以葡萄糖依赖性方式作用，其仅当血糖水平比正常高时刺激胰岛素分泌。它们还促进动物模型中的β-细胞再生。肠降血糖素模拟物减少胃运动和引起恶心。非限制性实例：艾塞那肽(exenatide)、exedin-4或AC2993(Byetta)；利拉鲁肽(liraglutide)、NN2211或NNC 90-1170；它由GLP-1的脂质缀合物构成，在人中具有高蛋白结合和～10h的半衰期；

DPP-IV抑制剂：影响葡萄糖调节，其抑制GLP-1的降解。与标准治疗相比，它们通常引起较少的低血糖或体重增加的问题。非限制性实例：西他列汀(sitagliptin)(Januvia)；西他列汀和二甲双胍(Janumet)；维达列汀(vildagliptin)(Galvus)；维达列汀和二甲双胍(Eucreas)；

SGLT2抑制剂：它们抑制SGLT2蛋白，其引起从体内分泌而不是再吸收过量的葡萄糖。非限制性实例：达格列净(dapaglifozin)。

例如，可以使用合适的方法计算协同效应，比如，例如，S形E_max公式(Holford&Scheiner,1981,Clin.Pharmacokinet.6:429-453)、Loewe相加的公式(Loewe&Muischnek,1926,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114:313-326)和中效公式(median-effect equation)(Chou&Talalay,1984,Adv.Enzyme Regul.22:27-55)。上面提及的每个公式可以被应用于实验数据以生成对应的图表，以帮助评价药物组合的作用。与上面提及的公式相关联的对应的图表分别是浓度-效应曲线、等效线图解法(isobologram)曲线和复合指数曲线。

组合物

本发明包括药物组合物，其包括强心苷或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，其中强心苷包括地高辛，由此给哺乳动物施用组合物给予等于或低于大约0.8ng/ml的地高辛血浆水平。

本发明进一步包括药物组合物，其包括强心苷或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，和至少一种另外的药剂或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，所述至少一种另外的药剂治疗、预防或减少NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和/或其它毒性肝脏病症的症状。

本发明进一步包括药物组合物，其包括强心苷或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，和至少一种另外的药剂或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，所述至少一种另外的药剂治疗、预防或减少自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、和其它毒性和/或炎性肝脏病症的症状。

本发明进一步包括药物组合物，其包括强心苷或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，和促进体重减轻的至少一种另外的药剂或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物。

在某些实施方式中，至少一种强心苷选自乙酰洋地黄毒甙、蟾蜍灵、华蟾毒配基、铃兰毒甙、磁麻甙、洋地黄毒苷配基、地高辛素、异羟洋地黄毒苷配基、地高辛、羟基洋地黄毒苷配基、羟基洋地黄毒甙、海蟾蜍毒素、黄夹次甙B、夹竹桃甙、苦毒毛旋花子甙、萝藦苦甙、甲黄次甙、原海葱苷A、毒毛旋花子甙K、和UNBS1450。在其它实施方式中，至少一种另外的药剂包括抗糖尿病药或奥贝胆酸。在还其它实施方式中，至少一种强心苷包括地高辛，由此给哺乳动物施用组合物给予等于或低于大约0.8至2.0ng/ml的地高辛血浆水平。

给药/剂量/制剂

给药方案可以影响由什么构成有效量。治疗性制剂可以在本发明中考虑的疾病或障碍的发作之前或之后被施用至对象。进一步，几个分开的剂量以及交错的剂量可以被每日或顺序地施用，或剂量可以被连续地输注，或可以是快速浓注。进一步，根据治疗或预防情况的紧急状态指示，治疗性制剂的剂量可以成比例地增加或减少。

施用本发明的组合物至患者，优选地哺乳动物，更优选地人，可以使用已知的程序以对治疗在本发明中考虑的疾病或障碍有效的剂量和持续时段实施。实现治疗效果必需的治疗性化合物的有效量可以根据如下因素变化，比如患者中的疾病或障碍的状态；患者的年龄、性别和重量；和治疗性化合物治疗在本发明中考虑的疾病或障碍的能力。可以调节剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，几种分开的剂量可以被每日施用，或根据治疗情况的紧急状态指示，剂量可以成比例地减少。本发明的治疗性化合物的有效剂量范围的非限制性实例是大约1和5,000mg/kg体重/每天。本领域普通技术人员将能够研究相关因素并且做出关于治疗性化合物的有效量的决定而不需要过度实验。

本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以便于获得的活性成分量对具体的患者、组合物、和施用模式实现期望的治疗反应是有效的而且对患者是无毒的。

本发明的化合物的治疗有效量或剂量取决于患者的年龄、性别和重量，患者的当前的医疗状况和在本发明中考虑的疾病或障碍的进展。

具有本领域普通技术的医师——例如人医或兽医——可以容易地确定和开处方需要的药物组合物的有效量。例如，人医或兽医可以以比为了实现期望的治疗效果需要的低的水平开始在药物组合物中采用的本发明化合物的剂量，并且逐渐地增加剂量直到取得期望的效果。

本发明的化合物的合适剂量可以在大约0.01mg至大约5,000mg/天，比如大约0.1mg至大约1,000mg，例如，大约1mg至大约500mg，比如大约5mg至大约250mg/天的范围中。剂量可以以单剂量或以多剂量施用，例如每天1至4或更多次。当使用多剂量时，每个剂量的量可以是相同的或不同的。例如，1mg/天的剂量可以施用为两个0.5mg剂量，剂量之间具有大约12小时间隔。

用于施用的本发明的化合物可以在大约1μg至大约10,000mg、大约20μg至大约9,500mg、大约40μg至大约9,000mg、大约75μg至大约8,500mg、大约150μg至大约7,500mg、大约200μg至大约7,000mg、大约3050μg至大约6,000mg、大约500μg至大约5,000mg、大约750μg至大约4,000mg、大约1mg至大约3,000mg、大约10mg至大约2,500mg、大约20mg至大约2,000mg、大约25mg至大约1,500mg、大约30mg至大约1,000mg、大约40mg至大约900mg、大约50mg至大约800mg、大约60mg至大约750mg、大约70mg至大约600mg、大约80mg至大约500mg的范围中，以及其间的任何和所有整体或部分增量。

在一些实施方式中，本发明的化合物的剂量是从大约1mg和大约2,500mg。在一些实施方式中，在本文描述的组合物中使用的本发明的化合物的剂量小于大约10,000mg、或小于大约8,000mg、或小于大约6,000mg、或小于大约5,000mg、或小于大约3,000mg、或小于大约2,000mg、或小于大约1,000mg、或小于大约500mg、或小于大约200mg、或小于大约50mg。类似地，在一些实施方式中，本文描述的第二化合物的剂量小于大约1,000mg、或小于大约800mg、或小于大约600mg、或小于大约500mg、或小于大约400mg、或小于大约300mg、或小于大约200mg、或小于大约100mg、或小于大约50mg、或小于大约40mg、或小于大约30mg、或小于大约25mg、或小于大约20mg、或小于大约15mg、或小于大约10mg、或小于大约5mg、或小于大约2mg、或小于大约1mg、或小于大约0.5mg，以及其任何和所有整体或部分增量。

在某些实施方式中，本发明的组合物以每天一至五次或更多次的范围内的剂量被施用至患者。在其它实施方式中，本发明的组合物以如下剂量范围被施用至患者，所述剂量范围包括，但不限于，每天一次，每两天、每三天至每周一次，和每两周一次。本领域技术人员显而易见的是，本发明的多种组合的组合物的施用频率因人而异，这取决于许多因素，其包括，但不限于，年龄、待治疗的疾病或障碍、性别、总体健康、和其它因素。因而，本发明不应当解释为限于任何特定的剂量方案，并且由主治医师考虑关于患者的所有其它因素来确定待施用至任何患者的精确的剂量和组合物。

可以理解的是，在非限制性实例中，每天给药的化合物的量可以每天，每隔一天，每2天，每3天，每4天，或每5天施用。例如，在每隔一天施用的情况下，5mg/天剂量可以在星期一开始，在星期三施用第一个随后的5mg/天剂量，在星期五施用第二个随后的5mg/天剂量，等等。

在其中患者的状态改进的情况下，在医生的慎重决定之后，本发明的抑制剂的施用任选地被连续地给出；可选地，施用的药物的剂量被暂时地减少或暂时地暂停某一时间长度(即，“药物假期(drug holiday)”)。药物假期的长度在2天和1年之间任选地变化，其包括(仅举例而言)，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天、或365天。药物假期期间的剂量减少包括10％-100％，其包括(仅举例而言)，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％。

一旦已经发生患者的病症的改善，根据需要，施用维持剂量。随后，根据疾病或障碍，施用剂量或频率或二者被减小至在其下疾病保持改善的水平。在某些实施方式中，在症状和/或感染的任何复发之后，患者需要长期的间歇性治疗。

用于本发明的方法的化合物可以以单位剂型配制。术语“单位剂型”指的是适合作为接受治疗的患者的单一剂量的物理离散单位，其中每个单位包含估计产生期望的治疗效果的预定数量的活性材料，任选地结合合适的药学载体。单位剂型可以用于单日剂量或多日剂量中的一个(例如，每天大约1至4次或更多次)。当使用多日剂量时，单位剂型可以是每个剂量相同或不同的。

这样的治疗方案的毒性和治疗功效任选地在细胞培养物或实验动物中测定，其包括，但不限于，LD₅₀(对群体50％的致死剂量)和ED₅₀(在50％群体中治疗上有效的剂量)的测定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其表达为LD₅₀和ED₅₀之间的比率。从细胞培养试验和动物研究获得的数据任选地用于配制用于人的一系列剂量。这样的化合物的剂量优选地位于包括具有最小毒性的ED₅₀的循环浓度的范围内。剂量任选地在此范围内变化，这取决于采用的剂型和利用的施用途径。

在某些实施方式中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体配制本发明的组合物。在一个实施方式中，本发明的药物组合物包括治疗有效量的本发明的化合物和药学上可接受的载体。

载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣比如卵磷脂、在分散的情况下通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂。可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂实现防止微生物活动，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂将是优选的，例如，糖、氯化钠或多元醇比如甘露醇和山梨醇。

在某些实施方式中，本发明涉及包装的药物组合物，其包括存放单独的或结合第二药剂的治疗有效量的本发明的化合物的容器；和使用该化合物治疗、预防或减少在本发明中考虑的疾病或障碍的一种或多种症状的说明。

制剂可以以与常规的赋形剂——即药学上可接受的有机或无机载体物质，其适于本领域已知的任何合适的施用模式——的混合物被应用。药物制剂可以被灭菌，并且如果需要，可以与助剂混合，例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压缓冲液的盐、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。在需要的时候，它们也可以结合其它活性剂，例如，止痛剂。

本发明的任何组合物的施用途径包括鼻部、吸入、外部、口服、含服、直肠、胸膜、腹膜、阴道、肌肉内、皮下、经皮、硬膜外、气管内、耳部、眼内、鞘内和静脉内途径施用。

合适的组合物和剂型包括，例如，分散剂、悬浮液、溶液、糖浆、颗粒、珠剂(bead)、粉末、粒剂(pellet)、用于鼻部或口服施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉末或雾化制剂等。应当理解的是，将在本发明中有用的制剂和组合物不限于本文描述的具体的制剂和组合物。

口服施用

对于口服应用，特别合适的是片剂、糖衣片、液体、滴剂、栓剂、或胶囊、囊片(caplet)和软胶囊(gelcap)。意欲口服使用的组合物可以根据本领域已知的任何方法制备，并且这样的组合物可以包含选自适合制造片剂的惰性的、无毒的药学赋形剂的一种或多种药剂。这样的赋形剂包括例如惰性稀释剂比如乳糖；粒化剂和崩解剂比如玉米淀粉；结合剂比如淀粉；和润滑剂比如硬质酸镁。片剂可以没有包衣或它们可以通过已知的技术包衣，用于精确或延迟释放活性成分。用于口服使用的制剂还可以以硬的明胶胶囊提供，在其中活性成分与惰性稀释剂混合。

对于口服施用，本发明的化合物可以是片剂或胶囊的形式，其通过常规的手段使用药学上可接受的赋形剂比如结合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，玉米淀粉、乳糖、微晶纤维素或磷酸钙)；润滑剂(例如，硬酯酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠)；或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)制备。如果需要，片剂可以使用合适的方法和包衣材料被包衣，所述包衣材料比如从Colorcon,WestPoint,Pa.可以获得的OPADRYTM^TM膜包衣系统(例如，OPADRYTM^TM OY型、OYC型、OrganicEnteric OY-P型、Aqueous Enteric OY-A型、OY-PM型和OPADRYTM^TM White,32K18400)。用于口服施用的液体制剂可以是溶液、糖浆或悬浮液的形式。液体制剂可以通过常规的手段使用如下药学上可接受的添加剂制备，比如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、甲基纤维素或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或金合欢)；非水性媒介(例如，杏仁油、油酯或乙醇)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、或山梨酸)。

在药学领域熟知用于改变活性成分的起始粉末或其它微粒状材料的粒化技术。粉末通常与粘合剂材料混合为较大的永久性自由流动的团块或颗粒，其被称为“成粒”。例如，使用溶剂的“湿”的成粒工艺的特征一般在于粉末与粘合剂材料组合，并且使用水或有机溶剂在导致形成湿的颗粒状物质的条件下将其弄湿，然后溶剂必须从其蒸发。

熔融成粒通常在于使用在室温下为固体或半固体的材料(即具有相对低的软化点或熔点范围)以促进粉末状或其它材料的成粒，其必须是在缺乏添加的水或其它液体溶剂的情况下。当加热至熔点范围中的温度时，低熔点固体液化以充当粘合剂或成粒介质。液化的固体自身扩散在与其接触的粉末状材料的表面，并且当冷却时，形成固体颗粒状物质，其中初始材料结合在一起。然后，所得的熔化颗粒可以提供至压片机或被封装，用于制备口服剂型。通过形成固体分散物或固溶体，熔化颗粒改善了活性成分(即药物)的溶解速率和生物利用度。

美国专利号5,169,645公开了具有改进的流动性质的直接可压缩的含蜡颗粒剂。当蜡在熔融物中与某些流动改进添加剂混合，接着混合物冷却和混合物成粒时，获得颗粒剂。在某些实施方式中，仅蜡自身熔化在蜡(一种或多种)和添加剂(一种或多种)的熔融组合中，并且在其它情况下，蜡(一种或多种)和添加剂(一种或多种)二者都熔化。

本发明还包括多层片剂，其包括提供延迟释放本发明的一种或多种化合物的层，和提供立即释放用于治疗脑相关疾病或障碍的药物的进一步的层。使用蜡/pH敏感性聚合物混合物，可以获得其中包裹活性成分的胃不溶性组合物，以确保其延迟释放。

肠胃外施用

对于肠胃外施用，本发明的化合物可以配制用于注射或输注，例如，静脉内、肌肉内或皮下注射或输注，或者用于以弹丸剂量施用和/或持续输注。可以使用油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳剂，其任选地包含其它配制剂比如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

另外的施用形式

本发明的另外的剂型包括如在美国专利号6,340,475；6,488,962；6,451,808；5,972,389；5,582,837；和5,007,790中描述的剂型。本发明的另外的剂型还包括如在美国专利申请号20030147952；20030104062；20030104053；20030044466；20030039688；和20020051820中描述的剂型。本发明的另外的剂型还包括如在PCT申请号WO 03/35041；WO03/35040；WO 03/35029；WO 03/35177；WO 03/35039；WO 02/96404；WO 02/32416；WO 01/97783；WO 01/56544；WO 01/32217；WO 98/55107；WO 98/11879；WO 97/47285；WO 93/18755；和WO 90/11757中描述的剂型。

控释制剂和药物递送系统

在某些实施方式中，本发明的制剂可以但不限于是短期、快速失效(rapid-offset)、以及受控的，例如，持续释放、延迟释放和脉冲释放制剂。

术语持续释放以其常规的意思使用，指的是药物制剂在延长的时段内提供逐步的药物释放，并且其可以在延长的时段内导致药物的基本上恒定的血液水平，但是非必须。时段可以长达一个月或更多，并且应当是比以弹丸形式施用的相同量的药剂更长的释放。

对于持续释放，化合物可以使用为化合物提供持续释放性质的合适的聚合物或疏水材料配制。正因如此，使用本发明的方法的化合物可以以微粒的形式施用，例如，通过注射，或通过以晶片或圆片的形式植入施用。

在本发明的一个实施方式中，使用持续释放制剂，本发明的化合物单独地或与另一种药剂结合施用至患者。

术语延迟释放在本文以其常规的意思使用，指的是在药物施用之后药物制剂在一些延迟后提供药物的初始释放，并且其可以包括从大约10分钟至多至大约12小时的延迟，但是非必须。

术语脉冲释放在本文以其常规的意思使用，指的是药物制剂以在药物施用后产生药物的脉冲血浆分布(pulsed plasma profile)的方式提供药物的释放。

术语立即释放在本文以其常规的意思使用，指的是药物制剂在药物施用后立即提供药物的释放。

如本文使用的，短期指的是在药物施用后多至并包括大约8小时、大约7小时、大约6小时、大约5小时、大约4小时、大约3小时、大约2小时、大约1小时、大约40分钟、大约20分钟、或大约10分钟、和其任何或所有整体或部分增量的任何时段。

如本文使用的，快速失效指的是在药物施用后多至并包括大约8小时、大约7小时、大约6小时、大约5小时、大约4小时、大约3小时、大约2小时、大约1小时、大约40分钟、大约20分钟、或大约10分钟，和其任何和所有整体或部分增量的任何时段。

本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文描述的具体的程序、实施方式、权利要求和实例的众多等价物。这样的等价物被认为在本发明的范围内，并且由所附的权利要求覆盖。例如，应当理解的是，使用本领域认识到的替代选择且仅使用常规实验，反应条件的改变包括但不限于反应时间、反应大小/体积和实验试剂比如溶剂、催化剂、压力、环境条件——例如氮气气氛——和还原/氧化剂在本申请的范围内。

可以理解无论在本文的什么地方提供值和范围，由这些值和范围包含的所有值和范围意为包含在本发明的范围内。而且，落入这些范围内的所有值以及值的范围的上限或下限也是本申请考虑的。

下列实施例进一步说明了本发明的方面。然而，它们绝不是本文陈述的本发明的教导或公开内容的限制。

实施例

现在参考下列实施例描述本发明。这些实施例仅是出于说明目的提供，并且本发明绝不应当解释为限于这些实施例，而是应当解释为包含由于本文提供的教导显而易见的所有变型。

材料和方法

动物和巨噬细胞：

C57BL/6小鼠购自美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)。已经描述了ASC-/-、胱天蛋白酶-1-/-、Nlrp3-/-和P2xr7-/-小鼠(Rock等,2010,Annu RevImmunol.28:321-42)。A2ora2a flox/flox小鼠和LysMcre小鼠购自杰克逊实验室(JacksonLaboratory)。HIF-1a flox/flox小鼠由Ruslan M Medzhitov博士(Yale University)友好地提供。在大多数实验中使用具有各种遗传操纵的7至12周龄雄性。基于这些实验模型的先前的经验选择每个实验组中小鼠的数目。通过在腹膜内注射4％巯基乙醇酸盐(thioglycollate)溶液(B2551,Fluka)3天后腹膜灌洗来分离小鼠腹膜巨噬细胞(PEC)。在12孔皿中以3×10⁶个细胞的密度平板接种细胞并且在3h后去除未贴壁细胞。使用多种化学品和随后的刺激处理使用100ng/ml LPS或10ng/ml Pam3CSK4致敏过夜的细胞。细胞在补充有10％FBS、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养。从骨髓细胞分离小鼠骨髓源巨噬细胞，并且在补充有2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μM 2-巯基乙醇(所有来自Invitrogen)、10％热灭活的FBS和20ng/ml M-CSF(PeproTech)的完全RPMI-1640培养基中分化7天。通过Optiprep(Sigma)的密度梯度离心分离库普弗细胞(KC)，并且然后在接种细胞2小时后温和地清洗平板并且补充培养基以提高KC纯度。

试剂：

ATP、来自明尼苏达沙门氏菌Re-595的LPS、毛喉素(cAMP类似物)、SQ22536(AC抑制剂)、H-89(PKA抑制剂)、MRS1523(A3拮抗剂)、腺苷、EHNA(腺苷脱氨酶抑制剂)、5′-(N-乙基甲酰氨基(ethylcarboxamido))腺苷(NECA)(非选择性腺苷受体激动剂)、N6,2′-O-二丁酰基腺苷3′,5′-环一磷酸钠盐(dbcAMP)和腺苷三磷酸双磷酸酶获得自Sigma(St.Louis,MO)。腺苷脱氨酶获得自Worthington Biochemical corporation(Lakewood,NJ)。CGS21680(A_2A激动剂)、DPCPX(A1拮抗剂)、ZM241385(A_2A拮抗剂)和MRS 1706(A2B拮抗剂)获得自TOCRIS(Ellisville,MI)。尼日利亚菌素(Nigericin)购自Calbiochem，Pam3CSK4和B型CpG寡核苷酸(ODN 1668,CpG-B)购自Invivogen(San Diego,CA)。CAY10585(HIF-1α抑制剂)购自Cayman Chemical(Ann Arbor,MI)。TRIZOL和Dulbecco的改进的Eagle培养基(DMEM)购自GIBCO/Invitrogen(Carlsbad,CA)。所有试剂具有可商购的最高质量等级。如先前描述的生产MSU晶体(Martinon等,2009,Annu Rev Immunol.27:229-65)。简言之，4mg/ml尿酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)通过连续地调节pH至8.0溶解于0.1M硼酸盐缓冲液。过滤溶液，并且7天后沉淀的晶体使用无水乙醇清洗两次和使用丙酮清洗一次，并且在使用前在组织培养罩(hood)中风干。

定量实时RT-PCR：

使用TRIZOL试剂(Invitrogen)提取总RNA，并且使用寡聚物(dT)引物和Superscript II系统(Invitrogen,USA)生成cDNA，接着使用LightCycler 480系统(Roche)进行分析。使用商业化引物-探针装置(Applied Biosystems Inc.)以及DNA反应混合剂(master mix)(Roche)对Il1b进行q-PCR。GAPDH的表达被用于使样品标准化，并且结果表达为相对于对照的比率；使用LightCycler 480SYBR Green I反应混合剂(Roche)对tnfa、Il6、Txnip、Nlrp3、Hif1a、Timp1进行q-PCR。基于β-肌动蛋白的表达使结果归一化。引物序列列举在表1中。

表1.用于qRT-PCR实验的引物序列

转染和荧光素酶报道基因试验：

在存在CREBΔ质粒或空载体的情况下，THP-1细胞(Sigma-Aldrich)瞬时转染有人IL-1β启动子(-1至-4000)荧光素酶或HRE-荧光素酶构建体。对于每个转染，根据制造商的说明，总计2.0μg的质粒与200μl的Opti-I培养基(没有血清和抗生素)和8.0μl的X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche,Indianapolis,IN)混合。混合物在室温下培育20分钟并且以逐滴的方式添加至包含细胞和完全培养基的6孔板。培育细胞48小时并且使用报道基因裂解缓冲液(Promega)收获，用于测定荧光素酶活性。细胞共转染有β-半乳糖苷酶报道基因质粒以使实验的转染功效归一化。293T细胞(InvivoGen)通过Lipofectamine^TM 2000试剂瞬时转染有NFkB启动子荧光素酶报道基因构建体连同Renilla荧光素酶(Rluc)控制报道基因载体。测量所有荧光素酶活性并且归一化为Rluc或β-半乳糖苷酶活性，并且指示具有对照组的百分比的归一化的值。

流式细胞术：

分离肝脏非实质细胞并且使抗体缀合至特异于CD11b(1:200,M1/70)、GR-1(1:200,RB6-8C5)(BD Biosciences-Pharmingen)、Ly6-C(1:200,HK1.4)和F4/80(1:200,BM8,eBioscience)的FITC、PE、别藻蓝蛋白(APC)。使用FACScalibur(BD Biosciences)分析染色的细胞。

细胞因子ELISA测量：

致敏的PEC均脉冲给药5mM ATP或10μM尼日利亚菌素持续20min，并且不处理直到收集培养物上清液。通过酶联免疫吸附试验(ELISA；R&D系统)测定IL-1β的分泌。

蛋白质印迹分析：

肝脏组织裂解物或PEC在补充有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和2mM二硫苏糖醇的RIPA缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中裂解。裂解物在4-12％Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen)中分离并且通过电印迹转移至硝酸纤维素(Invitrogen)。使用下列抗体：兔抗胱天蛋白酶-1p10(SC-514,Santa Cruz)，山羊抗小鼠IL-1β(BAF401,R&D Systems)，兔抗小鼠HIF-1α(NB100-449,Novus Biologicals,Littleton,CO)。

统计学分析：

所有数据表达为平均值±SD。使用学生t检验用于结果的统计学评价。显著性设定在p<0.05下。

实施例1：腺苷以炎性小体依赖性方式刺激IL-1β。

测试腺苷是否可以增加IL-1β产生超过由LPS和ATP——其二者分别激活信号1和2——产生的IL-1β。LPS和ATP的组合导致高水平的IL-1β产生，如ATP后5小时试验的，并且这被腺苷显著地增加(图1A)。为了确认经由腺苷的降解产生的代谢物比如肌苷不负责提高的IL-1β，通过使用腺苷脱氨酶抑制剂EHNA(赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤抑制来自细胞来源的腺苷的代谢，并且这还导致IL-1β产生的显著增加(图1A)。在不存在LPS或ATP的情况下，腺苷和EHNA不导致任何可检测的IL-1β。为了测定实验上减少的腺苷浓度的作用，添加腺苷脱氨酶并且导致IL-1β释放的显著减少(图1A)。

时间过程证明了通过抑制腺苷脱氨酶的IL-1β产生的持续增加(图1B)。为了进一步确认腺苷代谢物不经由一些其它途径负责IL-1β的增加，使用不可降解的全-腺苷受体激动剂NECA(5′-N-乙基甲酰氨基腺苷)，并且还以LPS和ATP，和时间依赖性方式刺激IL-1β产生的增加(图1C-1D)。IL-1受体使用被用作大多数TLR的相同的Myd88衔接蛋白并且可以经由自分泌环增加IL-1β产生。排除NECA增强此自分泌途径，显示NECA可以以类似的程度增加来自野生型和IL-1受体缺陷小鼠的巨噬细胞中的IL-1β产生(图1E)。然后测试此现象是否具有对其它类型的巨噬细胞的适用性。LPS和ATP诱导导致产生IL-1β的骨髓源巨噬细胞和库普弗细胞的刺激，并且这通过NECA显著地增加(图6A-6B)。通过LDH(乳糖脱氢酶)释放的试验检查细胞死亡，并且在存在或不存在EHNA的情况下不显示与IL-1β的分泌的关联，其指示巨噬细胞存活中的差异不是增加的IL-1β产生的原因(图1F)。

测试腺苷途径对其它细胞因子的影响的作用并且腺苷脱氨酶的抑制导致TNF-α的产生的减少，对IL-10没有影响并且导致IFN-γ的增加(图1G-1I)。然后测试观察到的IL-1β产生的增加是否依赖于胱天蛋白酶-1、NLRP3、ASC和P2x7受体。在不存在任何这些分子的情况下，通过添加全-腺苷受体激动剂(NECA)或抑制腺苷脱氨酶(EHNA)刺激腺苷信号不导致通过LPA和ATP的IL-1β的显著产生(图1J)。NECA还通过LPS和单钠尿酸(MSU)晶体的组合增加IL-1β产生(图7A)。这还由来自不同操纵的数据支持，其中导致CpG-B和ATP增加的腺苷代谢的抑制诱导IL-1β的增加(图7B)。通过在炎性小体激活——其通过各种刺激物(CpG-B和ATP、Pam3和ATP、LPS和珠、LPS和MSU以及肝细胞裂解物)——中使用A_2A受体拮抗剂ZM241385测试A_2A受体信号传导对IL-1β产生的贡献的逆向问题(reverse question)(图7C-7G)。

在MSU诱发的腹膜内无菌性炎症的炎性小体依赖性模型中测试体内A_2A受体信号传导的贡献，其证明了在存在A_2A受体拮抗的情况下的显著减少(图7H)。这些数据显示了腺苷途径的激活以NLRP3炎性小体依赖性方式提高LPS和ATP诱导的IL-1β产生的量和持续时间，并且这不是由于IL-1β自分泌环。

实施例2：A+受体激活增大信号1和2途径

存在四种鉴定的腺苷受体(A₁、A_2A、A_2B和A₃)。这些受体广泛地分布并且结合至刺激性(A_2A、A_2B)或抑制性(A₁和A₃)腺苷酸环化酶。NECA增加了IL-1β产生，并且这被A_2AR拮抗剂(ZM241395)而不是A₁R(DPCPX)、A_2BR(MRS1706)和A₃R(MRS1523)特异性受体拮抗剂(图2A)抑制。通过检查A_2A受体激动剂(CGS21680)以与NECA和EHNA相当的程度增加IL-1β产生的能力来重复此结果。所有这些刺激物被ZM241395抑制(图2B)。LDH试验指示了ZM241395对LPS和ATP诱导的IL-1β分泌的抑制功能不是由于其细胞毒性(图2C)。为了确认A_2A受体的作用，在来自A_2A受体缺陷小鼠(Adora2a-/-)的巨噬细胞中测试刺激腺苷途径以增加IL-1β产生的能力。在不存在A_2A受体的情况下，几乎没有通过LPS和ATP的IL-1β的产生，并且这不通过刺激与腺苷途径的广泛刺激相关的几种组分而增加(图2D)。为了鉴定IL-1β的增加的产生是否是由于腺苷诱导的信号1和信号2的刺激，检查响应于CGS21680的来自野生型和A_2A缺陷小鼠的腹膜巨噬细胞中的Il1b基因的上调(图2E-2F)。通过Adora2a敲除小鼠和Adora2a^flox/flox/溶菌酶M-(LysM)-Cre(A_2ARcKO)小鼠的常规品种确认A_2A受体的需要，所述品种具有巨噬细胞中显著减小的A_2A受体表达(图8A-8B)，来自两个品种的巨噬细胞具有响应于LPS的显著小的Il1b mRNA的上调(图2E-2F)。为了检查A_2A受体激活对信号2激活的炎性小体途径的作用，检查A_2A受体的激活对活性胱天蛋白酶-1的形成的影响。单独的A_2A受体激动剂CGS21680不导致可检测的活性胱天蛋白酶-1(图2G)。响应于LPS/ATP，检测到活性胱天蛋白酶-1，并且这通过使用ZM241385阻断A_2A受体降低和通过使用CGS21680激活A_2A受体增加。活性胱天蛋白酶-1通过CGS21680的增加还被ZM241385抑制。此外，还在响应于LPS/ATP的A_2AR-cKO巨噬细胞中检测到活性胱天蛋白酶-1的明显减少(图2H)。共同地，这些数据显示腺苷诱导的LPS和ATP刺激的IL-1β产生的增加经由A_2A受体并且是由于信号1和信号2途径二者的增加。

实施例3：腺苷经由CAMP-PKA途径取代LPS耐受性

腺苷信号传导可以不仅增加幅度而且增加IL-1β产生的持续时间的证明直接地影响良好地表征的LPS耐受性的现象。在此现象中，暴露于LPS导致对随后的通过LPS和其它TLR激动剂的刺激的低反应性，并且部分地通过缺少pro-IL-1β5的上调而发生。测试激活腺苷途径调节来自先前暴露于LPS的PEC的Pro-IL-1β诱导的能力。如预期的，使用LPS(Stim)初始刺激PEC后3小时，存在Il1b mRNA表达的上调(图3A)。使用LPS(Pri)预处理16小时的PEC具有低水平的pro-IL-1β，并且不应答于使用LPS的重复刺激(图3A)。与缺少LPS预处理的PEC对重复的LPS刺激的应答形成强烈对比，存在响应于NECA或CGS21680的Il1b mRNA表达的显著增加(图3A)。这些结果证明了在初始的信号1后，当PEC对进一步的信号1配体无反应时，它们通过上调Il1b变得对腺苷具有高度反应性。然后测试腺苷取代LPS耐受性的此能力是否适用于其它细胞因子。在6和24小时内，CGS21680和NECA能够增加Il1b、ll6、Il4而不是tnfa的表达水平(图9A-9D)。相关基因的表达分析显示了对于金属蛋白酶-1(TIMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、和葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)的组织抑制剂，CGS21680和NECA取代LPS耐受性的一致的能力(图9E-9H)。相比之下，其它抗菌基因如巨噬细胞受体Marco通过腺苷信号激活而上调，并且这发现依赖于A_2A和IL-1受体信号传导(图10A-10F)。

A_2A受体结合至刺激性腺苷酸环化酶，其导致cAMP的上调和蛋白激酶A(PKA)的激活。为了测试此途径，使用腺苷酸环化酶活化剂毛喉素，其以剂量依赖性方式诱导Il1b基因的诱导(图3B)。这通过直接地使用cAMP的稳定类似物(db-cAMP)被确认，其连同NECA和CGS诱导Pro-IL-1β的上调(图3C)。为了测试A_2A受体信号诱导的IL-1β产生对腺苷酸环化酶/cAMP/PKA途径的需要，腺苷酸环化酶抑制剂(SQ22536)被测试并且能够阻断由CGS21680和EHNA诱导的IL-1β的增加(图3D)。使用H-89和PKI 14-22酰胺(PKi)的特异性抑制剂测试PKA下游的cAMP激活的需要。PKA抑制显著地减少响应于NECA和CGS21680的IL-1β产生(图3D)。这通过蛋白质印迹确认了pro-IL-1β蛋白水平(图3E)。来自A2A受体缺陷小鼠(图2E)的细胞中应答的缺失不是由于发育作用，如通过测试db-cAMP增加A_2AR-cKO小鼠中的pro-IL1β蛋白水平的能力证明的(图3F)。

为了测定A_2A受体激活后较大量的Pro-IL-1β转录物是否是由于增加的转录稳定性，放线菌素D被用于抑制转录，并且检查CGS21680对Pro-IL-1β转录物的失去的影响。Il1bmRNA表达的失去率相同，其显示CGS不影响转录物稳定性(图3G)。为了确认A_2A受体在增加TLR诱导的Pro-IL-1β上调中的作用，测试来自A_2A受体缺陷小鼠的巨噬细胞的应答。在不存在A_2A受体的情况下，存在LPS诱导的Il1b mRNA表达的上调的最小增加(图3H)。测试腺苷信号传导和A_2A受体在与大量细胞因子和炎性小体相关转录物相关联的变化中的作用(图3H)。与A_2A受体缺陷细胞中降低的Il1b和Il6mRNA形成对比，存在更高水平的tnfa。感兴趣的是，在A_2A受体缺陷细胞中还存在更低水平的Nlrp3和Txnip转录物。进一步测试腺苷酸环化酶/cAMP/PKA途径对A_2A受体诱导的活性胱天蛋白酶-1的增加是否需要。情况就是这样，LPS/ATP诱导的活性胱天蛋白酶-1的CGS21680诱导的上调被SQ22536和H-89减少(图3I)。与这些发现形成对比，在无LPS致耐受性条件下，腺苷-cAMP信号传导不显示通过炎性小体激活的IL1β分泌的增加，其指示腺苷在获得IL-1β产生中的不同作用(图11A-11D)。共同地，这些数据显示了腺苷信号传导可以经由A2A受体取代信号1的LPS耐受性，并且这样做经由腺苷酸环化酶/cAMP/PKA介导的途径。

实施例4：腺苷经由CREB和HIF-1α诱导pro-IL-1β

为了理解PKA激活和Pro-IL1β上调之间的关联，在人和小鼠Il1b启动子中鉴定HIF-1α反应元件(图4A)。这表明HIF-1α激活在上调Pro-IL-1β中可以是中心步骤。研究显示了A_2A受体激活导致Hif1a mRNA的上调(图4B)。HIF-1α抑制剂CAY10585能够显著地降低腺苷激动剂诱导的Il1b表达和IL-1β产生(图12A-12B)。为了具体地测试HIF-1α在A_2A受体激活诱导的Il1b mRNA的上调中的作用，生成HIF-1α^flox/flox/溶菌酶M(LysM)-Cre小鼠(HIF-1α-cKO)，并且在骨髓源巨噬细胞中证明了高缺失效率(图8B)。与野生型巨噬细胞相比，LPS致敏的HIF-1α-cKO巨噬细胞具有显著更小的A_2A受体刺激诱导的Il1b的上调(图4C)。与野生型巨噬细胞相比，LPS致敏的HIF-1α-cKO巨噬细胞具有显著更小的A_2A受体刺激诱导的Nlrp3和Txnip mRNA的上调(图12C-12D)。

PKA激活和HIF-1α上调之间的直接关联由cAMP反应元件结合蛋白(CREB)提供，其增强HIF-1α中的两个C-端反式激活(transactivating)结构域。通过在存在或不存在CREB显性失活质粒(CREBΔ)的情况下，使THP-1人单核细胞系转染有HRE启动子荧光素酶构建体和β-半乳糖苷酶质粒持续24小时，并且然后使用LPS/PMA致敏16小时，接着NECA处理超过8小时，测试CREB在腺苷诱导的HIF-1α的上调中的需要。腺苷刺激导致HRE报道基因荧光素酶活性，并且这被显性失活CREB质粒的存在抑制(图4D)。以类似的方式，在存在或不存在CREB显性失活形式的情况下，转染IL-1β启动子荧光素酶构建体和β-半乳糖苷酶质粒证明了IL-1β的产生对CREB信号传导的需要(图4E)。初始的LPS刺激对Pro-IL-1β的转录上调经由NF-kB途径的激活。在测试Pro-IL-1β的随后的转录上调是否还使用此途径之后，腺苷激动剂被发现不增加NF-kB途径的活性高于已经被LPS诱导的活性(图4F)。在不存在HIF-1α的情况下，在胱天蛋白酶原-1、激活的胱天蛋白酶-1、pro-IL-1β、和最终活性IL-1β中存在蛋白质水平下的显著减小(图4G-4H)。这些数据显示了腺苷诱导的IL-1β的上调依赖于CREB/HIF-1α途径，其与用于响应于LPS初始产生IL-1β的NF-kB途径不同。

实施例5：肝损伤依赖于巨噬细胞中的A+受体

本文叙述的结果显示了在体外通过巨噬细胞的IL-1β的最大产生对经由A_2A受体的腺苷信号传导的需要。已知组织炎症和损伤细胞外腺苷水平通过各种手段从1μM以下的基础水平增加至高至100mM的水平。测试A_2A受体驱动的炎性小体活性是否与在体内相关；使用两个肝损伤的模型：一个急性LPS驱动的模型，其中在LPS后6小时内评估肝损伤，和通过硫代乙酰胺(TAA)对肝脏的毒性代谢创伤的无菌损伤的第二模型，其中在第1、2和7天检查损伤。使用特异性地缺失巨噬细胞中的Adora2a基因的A_2AR-cKO小鼠。肝脏免疫群体在这些小鼠中是完整的(图13)。在LPS和D-半乳糖胺诱发的肝损伤后六小时，在来自A_2AR-cKO小鼠的肝脏中存在显著少的出血和坏死，并且这通过较低的血清ALT值被确认(图5A)。炎性小体的减小的活性通过如下被确认：证明了整个肝脏具有较低水平的Il1b mRNA、较小活性的胱天蛋白酶-1，并且存在较低水平的血清IL-1β(图5B，5C-5D)。为了测试增加腺苷信号传导在体内的影响，在存在或不存在腺苷激动剂NECA的情况下使用LPS处理野生型小鼠。NECA的存在导致血清ALT，Il1b、Il6、Hif1a和Nlrp3的全肝脏转录物的显著升高，并且导致tnfa的转录物的减少(图14A-14F)。

通过TAA的毒性损伤证明了在第1天的最大的出血和坏死。在A_2AR-cKO小鼠中存在较少的肝脏出血和坏死，以及较低水平的肝脏Il1b mRNA和血清ALT(图5E-5H)。除炎症之外，许多器官中纤维变性反应的发展需要炎性小体活性。为了评价纤维化是否在组织巨噬细胞上不存在A_2A受体的情况下受影响，来自TAA后7天的肝脏组织通过天狼星红进行胶原染色。与野生型相比，在来自A_2AR-cKO小鼠的肝脏中存在显著较少的纤维化(图5G)。在反复的TAA注射的过程后，在野生型对照而不是A_2AR-cKO小鼠中还观察到肝脏组织和血清中持续的IL-1β产生(图15A-15C)。

为了进一步测试增加的腺苷信号传导对纤维化的影响，野生型和胱天蛋白酶-1缺陷小鼠在共注射或不共注射腺苷激动剂CGS21680的情况下注射TAA。在一周后，使用天狼星红对肝脏组织进行胶原染色。CGS21680在野生型而不是胱天蛋白酶-1缺陷小鼠中增加TAA诱发的肝纤维化和Timp1表达(图16A-16B)。共同地，这些数据确认了腺苷经由A_2A受体诱导的信号传导对炎性小体在急性和慢性损伤中的体内激活是重要的。

实施例6：

巨噬细胞中的炎性小体激活的当前模型不足以说明活性如何在慢性炎症、修复和纤维化中持续。问题不仅是由信号1和2诱导的自限性炎性反应，而且是巨噬细胞对类似后继信号的无反应性。由于巨噬细胞对于重复暴露于初始信号无反应，研究进一步的信号是否是在性质上不同的，其中来自组织损伤的信号是引人注意的候选者。腺苷经由四种广泛分布的受体调节对应激和损伤的组织应答。腺苷水平通过从胞质贮藏(store)释放和随后来自ATP的脱磷酸化响应于细胞应激和死亡在细胞外环境中快速地增加，并且通过摄入和代谢快速地减小。增加腺苷信号传导的操纵导致来自常规激活的PEC的IL-1β的增加的释放，并且这不是由于IL-1介导的正反馈环的增强(图1A-1E)。腺苷具有与常规的炎性小体激活同时或在其之后的作用。体内暗示是在炎性小体激活期间和之后，环境腺苷浓度调节炎性小体激活的持续时间，并且可以对其进行重新刺激(restimulate)。本文呈现的数据与来自A_2A受体缺陷小鼠的原始的体内数据一致，其显示缺少响应于LPS10的血清IL-1β升高。

A_2A受体激活的贡献是上调Pro-IL-1β、NLRP3以及其它的转录物水平。这意味着腺苷刺激可以上调信号1和2途径的臂(arm)，如通过较大水平的pro-IL-1β蛋白和活性胱天蛋白酶-1证明的(图3E，3I)。此外，这是腺苷的广泛应答，其响应于信号1的一系列TLR刺激物增加炎性小体激活，以及ATP、单钠尿酸和合成珠诱导的信号2的激活(图7A-7H)。

PEC通过LPS的初始激活导致高水平的Pro-IL1β，并且随后暴露于LPS不能刺激反复的升高(LPS耐受性)。如本文证明的，在初始激活后，PEC响应于腺苷信号上调Pro-IL-1β和产生IL-1β而不进一步暴露于常规的信号1和2。这些PEC以全面的方式明显地不是无反应性的，就在通过LPS和ATP的初始激活后，它们已经将其表型转换为其中Pro-IL1β产生被腺苷信号调节的状态(图3A)。不希望受限于任何理论，这更好地表征为激活后，而不是无反应状态。然而，腺苷的作用对于所有细胞因子是不一致的。具体而言，腺苷导致TNF-α产生的下调，并且不改变最抗菌的蛋白质的基因(图10A-10F)。

增加的IL-1β产生需要的初始步骤下游的A_2A受体是信号传导分子cAMP和PKA(图3B-3F)。使用HIF-1α抑制剂、报道基因构建体和巨噬细胞特异性敲除的详细研究证明了腺苷信号上调pro-IL-1β的能力依赖于HIF-1α和CREB，其中CREB靠近HIF-1α(图4B-4C)。这与用于在初始的TLR激活后用于前细胞因子(pro-cytokine)上调的NF-kB途径不同，初始的TLR激活不通过腺苷信号传导减少。

不希望受限于任何理论，在不存在巨噬细胞上的A_2A受体信号传导的情况下，存在减少的炎性小体激活，以及较少的组织损伤和纤维化。这是LPS和TAA诱发的肝损伤的急性和持续模型中的情况(图5)。这提供了体内腺苷信号的规模的有价值的确认。在大量实验模型中，总的A_2A受体缺陷动物具有更大的器官损伤。不希望受限于任何理论，腺苷可以同时地作用以增强基于巨噬细胞的炎性反应，并且提供实质细胞保护——其均是对通过病原体和无菌创伤的组织损伤的综合反应的一部分。

本文公开的数据证明了接收常规的信号1和2后的巨噬细胞经由A_2A受体依赖于腺苷用于初始的和持续的炎性小体活性和IL-1β产生。

实施例7：低剂量强心苷保护免于小鼠中的NASH和酒精性肝炎

炎性小体在NASH和酒精性肝炎的发病机理中起决定性作用，并且持续的炎性小体活性需要HIF-1α。地高辛被视为潜在的HIF1α拮抗剂，但是没有检查其在肝脏疾病中的作用。进行本研究以评价低剂量的地高辛在小鼠中的NASH和酒精性肝炎中是否具有治疗效果，并且研究地高辛的活性的分子机制。

在具有和不具有地高辛(每周腹腔注射(ip)1mg/kg两次)的情况下，C57BL/6J雄性小鼠被置于45％高脂膳食(HFD)持续11周。小鼠中的地高辛——每天腹腔注射1mg/kg——导致在人中取得的治疗性血清水平(0.5-2ng/ml)。分析血浆ALT、肝脏组织学、中性粒细胞染色、血细胞概况、线粒体活性氧种类(ROS)生成、和基因转录组微阵列。测试地高辛抑制小鼠和人巨噬细胞中的炎性小体的能力。还进行酒精性肝炎的慢性加酗酒性(binge)模型和LPS/D-GalN肝炎模型。

在所有三种模型中，地高辛导致减少的组织学损伤、中性粒细胞浸润和较低的血清ALT(HFD中417±398U/L对HFD+DIG中91±73U/L，P<0.001)。HFD四周后开始地高辛仍显示肝脏炎症的显著减少(中性粒细胞：HFD中24.6％对HFD+DIG中14.3％；单核细胞：HFD中31.6％对HFD+DIG中19.1％)而没有食物摄入减少。在LPS/DGalN肝炎中，两次剂量滴定——人等效剂量的四分之一和二十分之一——导致肝脏出血和坏死的改进，肝脏HIF-1α和Pro-IL-1β转录物以及IL-1β、HIF-1α、pro-IL-1β和切割的(P10)胱天蛋白酶-1的蛋白质的减少。HFD肝脏中的微阵列分析揭示了信号基因的显著变化：地高辛下调ROS代谢、抗氧化途径和糖酵解。

体外数据显示地高辛剂量依赖性地抑制小鼠和人巨噬细胞中的TLR和过氧化氢刺激下的线粒体ROS产生。地高辛还抑制小鼠巨噬细胞中的IL-1β分泌和胱天蛋白酶-1激活。

如本文证明的，低剂量的地高辛经由ROS-HIF1α-炎性小体途径减少NASH和酒精性肝炎的实验模型中的肝脏脂肪变性和炎症。低剂量地高辛因而在NASH和酒精性肝炎的治疗中具有显著的效用。

实施例8：临床研究

研究

进行随机双盲安慰剂对照临床试验以评估强心苷(比如地高辛)在NASH的治疗中的用途。

研究包括每个实验组(arm)中的25名患者，其中每个患者接受48周的地高辛(75mcg/天)或安慰剂。在研究的开始和结束进行肝脏生物活组织检查。研究对象的进入标准包括30-45的BMI和组织学证明的NASH。

研究的主要终点包括NASH的组织学改进。次要终点包括NASH的放射学改进、体重减轻、和/或血清胆固醇的减少。

研究

进行随机双盲安慰剂对照临床试验以评估强心苷(比如地高辛)在酒精性肝炎的治疗中的用途。

研究包括每个实验组中的25名患者，其中每个患者接受48周的地高辛(75μg/天)或安慰剂。在研究的开始和结束进行肝脏生物活组织检查。研究对象的进入标准包括25-30的BMI和标准临床诊断上的酒精性肝炎。

研究的主要终点包括以判别函数(discriminant function)的组织学改进。

本文引用的每个和每种专利、专利申请、和出版物的公开内容由此通过引用以其全部并入本文。

虽然已经参考具体的实施方式公开了本发明，但是明显的是，本领域技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变型，而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意欲解释为包括所有这样的实施方式和等价的变型。

序列表

<110> 耶鲁大学

W·米海

X·欧阳

<120> 对治疗或预防肝脏疾病或障碍和促进体重减轻有用的新型组合物和方法

<130> 047162-7040WO1(00328)

<150> 62/039,619

<151> 2014-08-20

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 1

aaatggcctc cctctcat 18

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cacgtggtcc attctggtag 20

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ccaggccttg acaagcta 18

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cgcggagaaa gagacaag 18

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agtaaggcct gtagctgtgc 20

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<223> 化学合成的

<400> 12

cgctggtata aggtggtctc 20

Claims (47)

1.在有需要的哺乳动物中治疗或预防肝脏疾病或障碍的方法，所述肝脏疾病或障碍选自非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和其它毒性肝脏病症，

其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种强心苷；和

其中给所述哺乳动物施用所述至少一种强心苷给予所述哺乳动物中如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗或预防遭受心脏疾病的哺乳动物中的心脏疾病需要的强心苷血浆水平。

2.权利要求1所述的方法，其中给所述哺乳动物施用所述至少一种强心苷不引起所述哺乳动物中临床上显著的心脏影响。

3.权利要求2所述的方法，其中所述临床上显著的心脏影响包括选自发生房性心动过速、发生房室传导阻滞、房室结传导降低、和房室结内有效不应期增加中的至少一种。

4.权利要求1所述的方法，其中所述强心苷抑制所述哺乳动物的肝脏中的HIF-1α合成。

5.权利要求1所述的方法，其中所述强心苷抑制所述哺乳动物的肝脏中的炎症。

6.权利要求1所述的方法，其中所述强心苷抑制所述哺乳动物中的肝脏脂肪变性。

7.权利要求1所述的方法，其中所述强心苷在所述哺乳动物中减少选自肝脏损害和糖酵解的至少一种病症。

8.权利要求1所述的方法，其中所述强心苷减少所述哺乳动物中的脂肪诱发的肥胖。

9.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种强心苷是选自乙酰洋地黄毒甙、蟾蜍灵、华蟾毒配基、铃兰毒甙、磁麻甙、洋地黄毒苷配基、地高辛素、异羟洋地黄毒苷配基、地高辛、羟基洋地黄毒苷配基、羟基洋地黄毒甙、海蟾蜍毒素、黄夹次甙B、夹竹桃甙、苦毒毛旋花子甙、萝藦苦甙、甲黄次甙、原海葱苷A、毒毛旋花子甙K、和UNBS1450的至少一种。

10.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种强心苷包括地高辛。

11.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种强心苷包括地高辛，并且给所述哺乳动物施用所述至少一种强心苷给予等于或低于大约0.8ng/ml的地高辛血浆水平。

12.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种强心苷包括地高辛，并且给所述哺乳动物施用所述至少一种强心苷给予选自如下的地高辛血浆水平：大约0.02至大约0.05ng/ml；大约0.05至大约0.1ng/ml；大约0.05至大约0.15ng/ml；大约0.05至大约0.2ng/ml；大约0.05至大约0.25ng/ml；大约0.05至大约0.3ng/ml；大约0.05至大约0.35ng/ml；大约0.05至大约0.4ng/ml；大约0.05至大约0.45ng/ml；大约0.05至大约0.5ng/ml；大约0.05至大约0.55ng/ml；大约0.05至大约0.6ng/ml；大约0.05至大约0.65ng/ml；大约0.05至大约0.7ng/ml；大约0.05至大约0.75ng/ml；和大约0.05至大约0.8ng/ml。

13.权利要求1所述的方法，其中大约每天一次、大约每隔一天、大约每隔两天、大约每隔三天、大约每隔四天、大约每隔五天或大约每周一次给所述哺乳动物施用所述至少一种强心苷。

14.权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物被进一步施用至少一种另外的药剂，其减少肝脏疾病或障碍的症状，治疗或预防肝脏疾病或障碍，所述肝脏疾病或障碍选自NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和其它毒性肝脏病症。

15.权利要求14所述的方法，其中所述至少一种另外的药剂包括抗糖尿病药或奥贝胆酸。

16.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种强心苷通过选自如下的至少一种途径施用至所述哺乳动物：鼻部、吸入、外部、口服、含服、直肠、胸膜、腹膜、阴道、肌肉内、皮下、经皮、硬膜外、气管内、耳部、眼内、鞘内和静脉内。

17.权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

18.套药包，其包括至少一种强心苷、施用器、和其使用说明材料，其中所述说明材料包括用于在哺乳动物中预防或治疗肝脏疾病或障碍的说明，所述肝脏疾病或障碍选自NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和其它毒性肝脏病症。

19.权利要求18所述的套药包，进一步包括至少一种另外的药剂，其治疗、预防或减少肝脏疾病或障碍的症状，所述肝脏疾病或障碍选自NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和其它毒性肝脏病症。

20.权利要求19所述的套药包，其中所述至少一种另外的药剂包括抗糖尿病药或奥贝胆酸。

21.权利要求18所述的套药包，其中给所述哺乳动物施用在所述说明材料中描述的至少一种强心苷量给予所述哺乳动物中如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗或预防遭受心脏疾病的哺乳动物中的心脏疾病需要的强心苷血浆水平。

22.药物组合物，其包括至少一种强心苷，或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，其中所述至少一种强心苷包括地高辛，由此施用所述组合物至哺乳动物给予所述哺乳动物中等于或低于大约0.8ng/ml的地高辛血浆水平。

23.药物组合物，其包括至少一种强心苷，或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，和至少一种另外的药剂，或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，所述至少一种另外的药剂治疗预防或减少肝脏疾病或障碍的症状，所述肝脏疾病或障碍选自NASH、与遭受NASH的哺乳动物中的酒精消耗相关联和/或由其引起的肝损伤、酒精性肝炎、药物诱发的肝损伤、原发性硬变性胆管炎、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬变、和其它毒性肝脏病症。

24.权利要求23所述的药物组合物，其中所述至少一种强心苷是选自乙酰洋地黄毒甙、蟾蜍灵、华蟾毒配基、铃兰毒甙、磁麻甙、洋地黄毒苷配基、地高辛素、异羟洋地黄毒苷配基、地高辛、羟基洋地黄毒苷配基、羟基洋地黄毒甙、海蟾蜍毒素、黄夹次甙B、夹竹桃甙、苦毒毛旋花子甙、萝藦苦甙、甲黄次甙、原海葱苷A、毒毛旋花子甙K、和UNBS1450的至少一种。

25.权利要求23所述的药物组合物，其中所述至少一种另外的药剂包括抗糖尿病药或奥贝胆酸。

26.权利要求23所述的药物组合物，其中给所述哺乳动物施用所述组合物给予所述哺乳动物中如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗或预防遭受心脏疾病的哺乳动物中的心脏疾病需要的强心苷血浆水平。

27.权利要求23所述的药物组合物，其中所述至少一种强心苷包括地高辛，由此施用所述组合物至哺乳动物给予等于或低于大约0.8ng/ml的地高辛血浆水平。

28.在有需要的哺乳动物中促进体重减轻的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种强心苷，其中给所述哺乳动物施用至少一种强心苷给予所述哺乳动物中如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗或预防遭受心脏疾病的哺乳动物中的心脏疾病需要的强心苷血浆水平。

29.权利要求28所述的方法，其中给所述哺乳动物施用的所述至少一种强心苷的量不引起所述哺乳动物中临床上显著的心脏影响。

30.权利要求29所述的方法，其中所述临床上显著的心脏影响包括选自发生房性心动过速、发生房室传导阻滞、房室结传导降低、和房室结内有效不应期增加中的至少一种。

31.权利要求28所述的方法，其中所述强心苷减少所述哺乳动物中的脂肪诱发的肥胖。

32.权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物不经历食物摄入的显著减少。

33.权利要求28所述的方法，其中所述至少一种强心苷是选自乙酰洋地黄毒甙、蟾蜍灵、华蟾毒配基、铃兰毒甙、磁麻甙、洋地黄毒苷配基、地高辛素、异羟洋地黄毒苷配基、地高辛、羟基洋地黄毒苷配基、羟基洋地黄毒甙、海蟾蜍毒素、黄夹次甙B、夹竹桃甙、苦毒毛旋花子甙、萝藦苦甙、甲黄次甙、原海葱苷A、毒毛旋花子甙K、和UNBS1450的至少一种。

34.权利要求28所述的方法，其中所述至少一种强心苷包括地高辛。

35.权利要求28所述的方法，其中所述至少一种强心苷包括地高辛，并且给所述哺乳动物施用所述至少一种强心苷给予等于或低于大约0.8ng/ml的地高辛血浆水平。

36.权利要求28所述的方法，其中所述至少一种强心苷包括地高辛，并且给所述哺乳动物施用所述至少一种强心苷给予选自如下的地高辛血浆水平：大约0.02至大约0.05ng/ml；大约0.05至大约0.1ng/ml；大约0.05至大约0.15ng/ml；大约0.05至大约0.2ng/ml；大约0.05至大约0.25ng/ml；大约0.05至大约0.3ng/ml；大约0.05至大约0.35ng/ml；大约0.05至大约0.4ng/ml；大约0.05至大约0.45ng/ml；大约0.05至大约0.5ng/ml；大约0.05至大约0.55ng/ml；大约0.05至大约0.6ng/ml；大约0.05至大约0.65ng/ml；大约0.05至大约0.7ng/ml；大约0.05至大约0.75ng/ml；和大约0.05至大约0.8ng/ml。

37.权利要求28所述的方法，其中其中大约每天一次、大约每隔一天、大约每隔两天、大约每隔三天、大约每隔四天、大约每隔五天或大约每周一次给所述哺乳动物施用所述至少一种强心苷。

38.权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物被进一步施用促进体重减轻的至少一种另外的药剂。

39.权利要求28所述的方法，其中所述至少一种强心苷通过选自如下的至少一种途径施用至所述哺乳动物：鼻部、吸入、外部、口服、含服、直肠、胸膜、腹膜、阴道、肌肉内、皮下、经皮、硬膜外、气管内、耳部、眼内、鞘内和静脉内。

40.权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

41.套药包，其包括至少一种强心苷、施用器、和其使用说明材料，其中所述说明材料包括用于在哺乳动物中促进体重减轻的说明。

42.权利要求41所述的套药包，进一步包括促进体重减轻的至少一种另外的药剂。

43.权利要求41所述的套药包，其中给所述哺乳动物施用在所述说明材料中叙述的至少一种强心苷量给予所述哺乳动物中如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗或预防遭受心脏疾病的哺乳动物中的心脏疾病需要的强心苷血浆水平。

44.药物组合物，其包括至少一种强心苷，或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物，和在哺乳动物中促进体重减轻的至少一种另外的药剂，或其溶剂化物、盐、前体药物或衍生物。

45.权利要求44所述的药物组合物，其中所述至少一种强心苷是选自乙酰洋地黄毒甙、蟾蜍灵、华蟾毒配基、铃兰毒甙、磁麻甙、洋地黄毒苷配基、地高辛素、异羟洋地黄毒苷配基、地高辛、羟基洋地黄毒苷配基、羟基洋地黄毒甙、海蟾蜍毒素、黄夹次甙B、夹竹桃甙、苦毒毛旋花子甙、萝藦苦甙、甲黄次甙、原海葱苷A、毒毛旋花子甙K、和UNBS1450的至少一种。

46.权利要求44所述的药物组合物，其中给所述哺乳动物施用在所述说明材料中叙述的至少一种强心苷量给予所述哺乳动物中如下的强心苷血浆水平：其等于或低于治疗或预防遭受心脏疾病的哺乳动物中的心脏疾病需要的强心苷血浆水平。

47.权利要求44所述的药物组合物，其中所述至少一种强心苷包括地高辛，由此施用所述组合物至对象给予选自如下的地高辛血浆水平：大约0.02至大约0.05ng/ml；大约0.05至大约0.1ng/ml；大约0.05至大约0.15ng/ml；大约0.05至大约0.2ng/ml；大约0.05至大约0.25ng/ml；大约0.05至大约0.3ng/ml；大约0.05至大约0.35ng/ml；大约0.05至大约0.4ng/ml；大约0.05至大约0.45ng/ml；大约0.05至大约0.5ng/ml；大约0.05至大约0.55ng/ml；大约0.05至大约0.6ng/ml；大约0.05至大约0.65ng/ml；大约0.05至大约0.7ng/ml；大约0.05至大约0.75ng/ml；和大约0.05至大约0.8ng/ml。