CN108379274B - 南美蟾毒精在治疗和改善创伤性脑损伤的应用及药用方法 - Google Patents

南美蟾毒精在治疗和改善创伤性脑损伤的应用及药用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了南美蟾毒精在治疗和改善创伤性脑损伤中的应用。本发明证实南美蟾毒精可以明显降低创伤性脑损伤大鼠的神经损伤严重程度，缓解创伤性脑损伤导致的颅内水肿，抑制创伤性脑损伤后炎症因子IL‑6、IL‑1β、COX‑2、TNF‑α在脑组织中的表达，抑制NF‑κB和p‑IκB‑α蛋白在创伤性脑损伤脑组织中的表达，抑制创伤性脑损伤后RelA/p65和NF‑κB1/p50蛋白从脑组织细胞的胞浆向胞核内转移，抑制创伤性脑损伤后磷酸化RelA/p65及其信号通路上游的磷酸化ERK蛋白表达水平的提高。上述结果表明，南美蟾毒精具有治疗和改善创伤性脑损伤的作用，可以帮助患者在创伤性脑损伤的早期救治生命，处理并发症的同时改善认知行为功能，具有广阔的应用前景。

Description

南美蟾毒精在治疗和改善创伤性脑损伤的应用及药用方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及化合物的新用途，尤其涉及南美蟾毒精在治疗和改善创伤性脑损伤的应用及药用方法。
背景技术
创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是一种外力引起的创伤性结构损伤和/或脑功能障碍。据估计，全球每年约有1千万创伤性脑损伤的患者，其中几乎三分之一的患者是儿童和青年人群。创伤性脑损伤大致可分为两个阶段即：原发性脑损伤和继发性脑损害。原发性损伤源于机械外力直接作用于颅骨和脑，继而导致的脑部神经细胞死亡，属于不可逆的机械损伤。而继发性脑损害是指在原发性损伤的基础上，所产生的后续脑组织损伤，可持续数小时至数天，甚至数年。创伤性脑损伤的伤情非常复杂，可能会导致不同程度的挫伤、出血、弥漫性轴索损伤和神经退行性疾病。并且其导致的认知行为障碍及各种远期并发症，给个人工作和生活造成极大的影响，发现后早期给予对症性药物治疗显得尤为重要。目前关于创伤性脑损伤的研究主要集中在如何减少继发性损伤，而探索具有神经保护作用的药物干预策略和治疗靶点，是改善颅脑损伤患者预后的关键。因此，找到一种早期可以在分子水平维持认知行为功能的药物是一种具有临床应用前景的策略。华蟾素是一种蟾酥类中药，早已被广泛应用于临床癌症治疗，而南美蟾毒精作为主要在下丘脑和肾上腺皮质中生成的内源性化合物，是其中主要的活性成分之一。以往研究发现，炎症介质的激活在脑损伤的病情恶化中发挥着主要作用，而相关炎症通路的阻断剂能够缓解脑损伤导致的一系列炎症相关并发症。因此本研究探讨南美蟾毒精作为ERK/MAPK炎症通路阻断剂能否缓解脑损伤导致的炎症介质的激活，脑水肿及认知行为障碍等相关并发症。
发明内容
本发明的目的是提供南美蟾毒精的新用途。
本发明的目的是提供南美蟾毒精在治疗和改善创伤性脑损伤中的应用。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的治疗和改善脑损伤是指缓解创伤性脑损伤导致的认知功能障碍。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的治疗和改善脑损伤是指抑制创伤性脑损伤导致的炎症并发症。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的治疗和改善脑损伤是指抑制创伤性脑损伤导致的NF-κB信号通路的激活。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的治疗和改善脑损伤是指抑制创伤性脑损伤导致的ERK/MAPK信号通路的激活。
本发明的另一个目的在于提供南美蟾毒精在制备治疗和改善创伤性脑损伤药物中的应用。
利用南美蟾毒精制备治疗和改善创伤性脑损伤药物的方法，所述方法为制药时加入南美蟾毒精。
本发明所述的南美蟾毒精在治疗和改善创伤性脑损伤中的应用，可以治疗和改善创伤性脑损伤及相关症状、障碍和疾病，有望应用于临床。
本发明的有益效果是：
本发明通过实验证实南美蟾毒精可以显著降低创伤性脑损伤大鼠的神经损伤严重程度评分，显著降低创伤性脑损伤导致的脑含水量升高，抑制创伤性脑损伤后炎症因子IL-6、IL-1β、COX-2、TNF-α在脑组织中的表达，抑制NF-κB和p-IκB-α蛋白在创伤性脑损伤大鼠脑组织中的表达，抑制RelA/p65和NF-κB1/p50蛋白表达在创伤性脑损伤大鼠脑组织细胞核内的升高，抑制RelA/p65和NF-κB1/p50蛋白表达在创伤性脑损伤大鼠脑组织细胞浆中的降低，抑制创伤性脑损伤后RelA/p65和NF-κB1/p50的蛋白从脑组织细胞的胞浆向胞核内转移，抑制创伤性脑损伤后磷酸化RelA/p65及其信号通路上游的磷酸化ERK蛋白表达水平的提高，缓解创伤性脑损伤导致的认知功能障碍，抑制创伤性脑损伤导致的炎性并发症，抑制创伤性脑损伤导致的NF-κB信号通路的激活，抑制创伤性脑损伤导致的ERK/MAPK信号通路的激活的作用，这些结果表明南美蟾毒精具有治疗和改善创伤性脑损伤的作用，能够用于治疗和改善创伤性脑损伤，在制备治疗和改善创伤性脑损伤药物方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为TBI模型的构建方法流程图；
图2为TBI后及南美蟾毒精治疗后24小时的NSS评分；
图3为TBI后及南美蟾毒精治疗后48小时的NSS评分；
图4为TBI后及南美蟾毒精治疗后24小时的脑含水量；
图5为TBI后及南美蟾毒精治疗后48小时的脑含水量；
图6为TBI后及南美蟾毒精治疗后脑组织中炎症因子IL-6的蛋白表达量；
图7为TBI后及南美蟾毒精治疗后脑组织中炎症因子IL-1β的蛋白表达量；
图8为TBI后及南美蟾毒精治疗后脑组织中炎症因子COX-2的蛋白表达量；
图9为TBI后及南美蟾毒精治疗后脑组织中炎症因子TNF-α的蛋白表达量；
图10为TBI后及南美蟾毒精治疗后，NF-κB和p-IκB-α蛋白在大鼠脑组织中表达的定量分析；
图11为TBI后及南美蟾毒精治疗后，RelA/p65和NF-κB1/p50在细胞浆和细胞核内表达的定量分析；
图12为TBI后及南美蟾毒精治疗后，免疫组化染色分析大鼠脑组织中磷酸化RelA/p65的表达情况(Scare bars，200μm)；
图13为TBI后及南美蟾毒精治疗后，p-ERK蛋白在大鼠脑组织中表达的定量分析；
图14为TBI后及南美蟾毒精治疗后，p-JNK蛋白在大鼠脑组织中表达的定量分析；
图15为TBI后及南美蟾毒精治疗后，p-p38蛋白在大鼠脑组织中表达的定量分析。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种治疗和改善创伤性脑损伤的药物及其使用方法。旨在解决南美蟾毒精作为ERK/MAPK炎症通路阻断剂改善脑损伤导致认知功能障碍及炎症相关并发症。
本发明是这样实现的，一种治疗创伤性脑损伤的药物，所述治疗创伤性脑损伤的治疗药物为南美蟾毒精。
本发明的另一目的在于提供一种所述治疗创伤性脑损伤的药物的使用方法，所述治疗创伤性脑损伤的药物的使用方法为南美蟾毒精抑制ERK/MAPK信号通路，并且抑制NF-κB的表达以及抑制RelA/p65和NF-κB1/p50蛋白从细胞的胞浆向胞核内转移；南美蟾毒精通过抑制ERK/MAPK信号通路的激活和抑制NF-κB信号通路系统产生作用。
本发明提供的治疗创伤性脑损伤的药物的使用方法，证实了南美蟾毒精可以抑制ERK/MAPK信号通路并且抑制RelA/p65和NF-κB1/p50蛋白的核内转移，一定程度上缓解了创伤性脑损伤的认知功能障碍及炎性并发症，但无论是炎性并发症还是分子表达水平，都始终未能达到正常水平；未能观察到认知行为的完全恢复。ERK/MAPK信号通路的阻断一定程度上改善了大鼠创伤性脑损伤后的认知行为障碍及炎性并发症并可能通过调控NF-κB信号通路的表达和转位产生作用，为后期临床应用和联合治疗提供了部分依据。通过创伤性脑损伤的早期应用南美蟾毒精，可以帮助患者在创伤性脑损伤的早期救治生命，处理并发症的同时改善认知行为功能，为患者更好的配合治疗提供了基础，也为后期的康复锻炼争取了条件，最终为患者的临床神经功能改善创造条件。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的南美蟾毒精可从商业途径获得。
健康雄性Sprague-Dawley(SD)成年大鼠50只，8周龄，体重220-250g，大连医科大学SPF动物中心(Certificate No.SCXK(Liao)2008-0002)。
兔抗大鼠单克隆抗体(Cell Signaling Technology,Inc.,USA)；辣根过氧化物标记山羊抗兔IgG(碧云天，中国)；ELISA炎症因子检测试剂盒(ShanghaiSaimoBiotechnology，中国)；BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime Biotechnology，中国)；免疫组化显微镜(Leica，Germany)；外伤性脑损伤模型制作设备(自行组建和制造)。
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。数据以平均数±标准差(SD)表示，组间差异的显著性分析采用单因素方差分析和Durmett检验。##相对Sham组p<0.01，*相对TBI组p<0.05，**相对TBI组p<0.01。
实施例1：
一、创伤性脑损伤(TBI)动物模型的制备
如图1所示，TBI动物模型制备包括以下步骤：
S1：应用4％异氟醚与2:1的N2O/O2气体相混合作为麻醉剂，将所有健康雄性SD大鼠均置于密闭瓶子内持续吸入60秒；
S2：麻醉后，大鼠取俯卧位，固定于外伤性脑损伤(TBI)制作设备中，应用机械通气装置辅助呼吸。应用2％异氟醚与2:1的N2O/O2相混合的气体维持麻醉状态；
S3：剔除头顶部毛发，碘伏消毒，正中偏右侧切开并且牵开皮肤，骨膜剥离器清理局部软组织，暴露颅骨；
S4：使用气动磨钻进行局部颅骨开窗，开窗范围4mm，类圆形，前后界为冠状缝和人字缝，左右界为矢状缝和冠状脊。保留完整硬膜；
S5：延伸碰撞轴，降低落体砝码头部至开窗处直至其接触硬膜，调整落体砝码至皮层表面的撞击距离设置，进行零度调整；
S6：回缩落体砝码碰撞轴，设定落体砝码头部撞击深度以形成脑组织损伤，设置为2.8mm，撞击速度设置为2米/秒；
S7：停止麻醉，不复置骨瓣，丝线缝合皮肤。将大鼠从设备中撤下，置笼中观察。
二、实验动物分组
空白对照组(Sham)，仅去除骨瓣，脑组织不进行打击损伤；空白对照联合南美蟾毒精治疗组(Sham+MGB)，空白对照组每天给予南美蟾毒精(10mg/Kg)腹腔注射；创伤性脑损伤组(TBI)，仅行脑组织打击损伤，无药物干预；创伤性脑损伤联合南美蟾毒精治疗组(TBI+MBG)，创伤性脑损伤造模后即每天给予南美蟾毒精(10mg/kg或20mg/kg)腹腔注射，每组实验大鼠10只，共50只。
实施例2：
南美蟾毒精对TBI大鼠认知行为功能障碍的缓解作用
根据表1，神经损伤严重程度评分(neurological severity score，NSS)表，对Sham，Sham+MGB，TBI，TBI+MBG，进行NSS评分。
表1
Figure BDA0001653247170000051
Figure BDA0001653247170000061
结果如图2、图3所示，通过观察不同组之间的NSS评分，大鼠创伤性脑损伤后，NSS评分急剧提高(p<0.01)，而南美蟾毒精治疗后显著降低(p<0.01)。24小时后，在南美蟾毒精浓度分别为10mg/kg、20mg/kg时，可分别降低18.33％和33.33％；而48小时后，在南美蟾毒精浓度分别为10mg/kg、20mg/kg时，可分别降低38.57％和64.29％。综上，南美蟾毒精缓解了TBI导致的认知功能障碍。
实施例3：
南美蟾毒精对TBI大鼠炎性并发症的抑制作用
一、南美蟾毒精对TBI大鼠颅内水肿的改善
目前认为创伤性脑损伤后的炎性并发症可表现为脑水肿，脑含水量是评估脑水肿严重程度的敏感指标，因此选择脑含水量作为评价指标和研究对象。大鼠深度麻醉后，固定并用30-40ml肝素化生理盐水灌注冲洗血液。断头，迅速取出大脑，分离伤侧大脑皮层并称重，得到湿重(wet weight，WW)。将样本置于80℃烘箱中烘烤，48小时后取出，再次称重，得到干重(dry weight，DW)。脑含水量(％)计算公式如下：(WW-DW)/WW×100％.
如图4、图5所示，创伤性脑损伤后的早期，颅内水肿明显增强，通过南美蟾毒精干预，能够一定程度上缓解脑水肿的严重程度。图4显示，平均值计算创伤性脑损伤24小时后脑水肿加重，而南美蟾毒精治疗组缓解了脑水肿，24小时后，南美蟾毒精浓度分别为10mg/kg、20mg/kg时，颅内水分含量可分别降低5.81％和12.79％；图5显示，平均值计算创伤性脑损伤48小时后脑水肿加重，而南美蟾毒精治疗组缓解了脑水肿，48小时后，南美蟾毒精浓度分别为10mg/kg、20mg/kg时，颅内水分含量可分别降低6.74％和13.48％。尽管南美蟾毒精治疗创伤性脑损伤后炎性并发症有所改善，但未能恢复至空白对照组水平。
二、南美蟾毒精抑制TBI大鼠炎症因子的表达
分别于TBI损伤后24小时和48小时脱颈处死大鼠，迅速暴露大鼠脑组织，行形态学检查标本置入4％多聚甲醛固定过夜，制备石蜡切片，其余标本迅速置入-80℃中准备下一步实验。
取出-80℃中各组的样本，按比例加入细胞裂解液(50mM Tris，pH 7.4，150mMNaCl，1％Triton X-100，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS)及蛋白酶和磷酸酶抑制剂。匀浆，置于4℃离心机12000转，20分钟后收集上清，应用BCA蛋白检测试剂盒进行总蛋白定量。应用IL-6，IL-1β，COX-2和TNF-α特异性的ELISA试剂盒进行定量检测脑组织中的炎症因子的表达水平。
如图6所示，创伤性脑损伤脑组织中炎症因子IL-6表达增加，而南美蟾毒精显著抑制了IL-6在脑组织中的表达；如图7所示，创伤性脑损伤脑组织中炎症因子IL-1β表达增加，而南美蟾毒精显著抑制了IL-1β在脑组织中的表达；如图8所示，创伤性脑损伤脑组织中炎症因子COX-2表达增加，而南美蟾毒精显著抑制了COX-2在脑组织中的表达；如图9所示，创伤性脑损伤脑组织中炎症因子TNF-α表达增加，而南美蟾毒精显著抑制了TNF-α在脑组织中的表达。
综上，南美蟾毒精对TBI炎性并发症具有抑制作用。
实施例4：
南美蟾毒精抑制NF-κB信号通路的激活
一、Western blot检测
取出-80℃中各组冰冻样本，按比例加入细胞裂解液(50mM Tris，pH 7.4，150mMNaCl，1％Triton X-100，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS)及蛋白酶和磷酸酶抑制剂。匀浆，置于4℃离心机12000转，20分钟后收集上清即细胞总蛋白。
将细胞浆细胞核蛋白分离后检测，胞浆蛋白/核蛋白提取步骤如下：离心收集脑组织细胞沉淀于1.5ml EP管中，加入500μl胞浆蛋白提取液(含蛋白酶抑制剂)，用移液器将细胞沉淀吹散，冰上孵育10min。加入25μl 10％NP-40，涡旋混合10s；4℃，3000rpm/min离心10min，收集上清，即胞浆蛋白于新的1.5ml EP管内-80℃保存；向沉淀中加入200μl核蛋白提取液，置于冰上，每隔10min，涡旋一次，总共三次；4℃，14000rpm/min离心30min，收集上清，即核蛋白-80℃保存。
BCA法分别测定细胞总蛋白、胞浆蛋白及核蛋白浓度并调一致，进行SDS凝胶电泳后转至硝酸纤维素膜。5％脱脂奶粉或5％BSA封闭，一抗4℃过夜，一抗包括：NF-κB，p-IκB-α，p65，p50，p-ERK，p-JNK，p-p38和β-actin(Cell SignalingTechnology,Inc.,USA)。二抗采用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔室温孵育。化学增强发光法(ECL)曝光显影定影，定量数据分析采用Image J软件(NationalInstitutes of Health，美国)。
如图10所示，通过NF-κB和p-IκB-α的蛋白表达在大鼠脑组织中的定量分析可见，TBI后，NF-κB和p-IκB-α蛋白表达水平显著提高，而通过南美蟾毒精干预后表达显著降低(p<0.01)，南美蟾毒精显著抑制了NF-κB和p-IκB-α在创伤性脑损伤脑组织中的表达。
如图11所示，细胞核内蛋白检测结果显示TBI后RelA/p65和NF-κB1/p50蛋白表达水平明显提高(p<0.01)，而南美蟾毒精治疗后胞核中的RelA/p65和NF-κB1/p50蛋白表达水平明显降低(p<0.01)；胞浆内蛋白检测结果显示TBI后RelA/p65和NF-κB1/p50蛋白表达水平明显降低(p<0.01)，而南美蟾毒精治疗后胞核中的RelA/p65和NF-κB1/p50蛋白表达水平明显提高(p<0.01)。南美蟾毒精治疗后，RelA/p65和NF-κB1/p50的蛋白表达在细胞核内显著减少，而在细胞浆中显著增加，南美蟾毒精抑制了RelA/p65和NF-κB1/p50的蛋白向胞核内转移的过程，抑制了NF-κB通路的激活。
二、免疫组化检测
免疫组织化学采用S-P法染色，操作步骤如下：将厚度4μm石蜡切片置于60℃烤箱过夜。进行免疫组化染色，步骤如下：
S1脱蜡、水化：将切片浸润于二甲苯I、二甲苯II、100％乙醇I、100％乙醇II、95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇，各5min。PBS洗涤两次；
S2抗原修复：将步骤S1所得切片放入盛有适量0.01M柠檬酸缓冲液的烧杯中，再将烧杯放入微波炉中，中火10min，停2min，5次。PBS洗涤两次；
S3使用3％H2O2孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗，3min/次×3次；
S4滴加山羊血清工作液室温孵育10-15min，倾去，勿洗；
S5滴加一抗p-p65抗体(1:200)，4℃过夜；
S6使用PBS洗涤，3min×3次；
S7滴加生物素化二抗工作液，室温或37℃孵育10-15min；
S8使用PBS冲洗，3min/次×3次；
S9滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，室温或37℃孵育10-15min；
S10使用PBS冲洗，3min/次×3次；
S11使用DAB显色：使用DAB显色试剂盒，1mL蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色5-10min，显微镜下观察染色效果，适时终止；
S12自来水冲洗；
S13封片和观察。
结果如图12所示，免疫组化染色示TBI后脑组织中的磷酸化RelA/p65染色显著加深，磷酸化RelA/p65蛋白表达水平显著提高，而南美蟾毒精治疗后部分缓解，激活的磷酸化的RelA/p65表达显著降低。Scale bars，200μm。免疫组化定量分析采用Image J软件(National Institutes of Health，美国)。
实施例5：
南美蟾毒精抑制ERK/MAPK信号通路的激活
方法见本发明实施例4，第一部分，Western blot检测。
结果如图13、图14、图15所示，TBI后，MAPK蛋白，包括ERK、JNK和p38的磷酸化水平均显著提高(p<0.01)。如图13所示，TBI+MGB组中，ERK MAPK蛋白的磷酸化水平显著下调，相比TBI组，差异具有统计学意义(p<0.01)；而图14和图15显示，JNK MAPK和p38MAPK蛋白的磷酸化水平均未出现明显下调，甚至出现少量提高。南美蟾毒精对ERK MAPK蛋白的磷酸化激活有抑制作用。
综上，本发明证实了南美蟾毒精可以对ERK MAPK蛋白的磷酸化激活产生抑制作用，进而抑制RelA/p65和NF-κB1/p50蛋白从胞浆向胞核内的转位，从而抑制了NF-κB信号通路的激活。南美蟾毒精一定程度上缓解了TBI的并发症以及认知行为障碍，但是未能恢复到正常水平。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种南美蟾毒精在制备治疗和改善创伤性脑损伤药物中的应用。
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CN106714809A (zh) * 2014-08-20 2017-05-24 耶鲁大学 对治疗或预防肝脏疾病或障碍和促进体重减轻有用的新型组合物和方法

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