JP6626094B2

JP6626094B2 - 腎線維症を抑制するためのジンセノサイドｍ１の使用

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Publication number: JP6626094B2
Application number: JP2017512092A
Authority: JP
Inventors: シェアウ−ロンリー; ユー−チエリー; アンチェン; クオ−フェンフア; シュク−マンカ
Original assignee: ウェルヘッドバイオロジカルテクノロジーコーポレイション
Priority date: 2014-05-16
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2019-12-25
Anticipated expiration: 2035-05-18
Also published as: KR20170007426A; TWI670063B; CN106795546A; US20170087170A1; US10357507B2; DK3146062T3; WO2015172746A1; EP3146062A4; ES2739203T3; JP2017515904A; KR102360315B1; TW201609111A; EP3146062B1; EP3146062A1

Description

本発明は、腎線維症、特に間質性線維症を抑制するためのジンセノサイドＭ１の新規使用に関する。

腎線維症は腎疾患の最終段階である。腎線維症の原因には、尿管閉塞が含まれる。

尿管閉塞は泌尿器科医が直面する最も一般的な問題のうちの１つである。尿管閉塞は尿管内の尿の流れに対して障害を引き起こす。最も一般的には、閉塞は尿管腎盂移行部で発生する。「閉塞性尿路疾患」という広範な用語は、腎盂と尿道との間で発生する尿流への閉塞を示すために使用することができ、これにより、水腎症の発症および関連する腎機能障害を引き起こす。これについての事例は尿道狭窄および良性前立腺肥大症である。片側尿管閉塞（ＵＵＯ）の発生率は、成人では１／１，０００と報告されている。尿管結石が最も一般的な原因であり、急性閉塞は典型的には主要な症状として重大な腎疝痛を示す。例えば、非特許文献１を参照のこと。

ＵＵＯの初期において、間質には、ＴＧＦ−β１および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などのサイトカインを放出するマクロファージに対して「古典的に」活性化される単球が浸潤する。次に、ＴＧＦ−β１は、アポトーシスを経る（尿細管萎縮に至る）か、または上皮間葉移行（ＥＭＴ）を経て、間質に移動する線維芽細胞になるように、尿細管上皮細胞の表現型応答を促進する。単球の活性化によって産生されるアンギオテンシンＩＩ（ＡＮＧＩＩ）は、核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）の産生を刺激し、これにより、より多くのマクロファージの動員、および活性酸素種（ＲＯＳ）の産生の産生がもたらされ、尿細管障害を悪化させる。対照的に、代替的に活性化されたマクロファージは尿細管細胞の生存および増殖を増強することができる。内皮細胞は内皮−間葉移行（ＥｎｄＭＴ）またはアポトーシスを経て、これにより、毛細血管喪失および二次的腎虚血および低酸素症をもたらすことがある。内在周辺細胞および浸潤造血幹細胞もまた、線維芽細胞に分化することができる。マクロファージまたは他の細胞によって産生されるＴＧＦ−β１などのサイトカインの刺激下で、線維芽細胞はストレス線維を合成し、さらに分化して筋線維芽細胞になる。筋線維芽細胞は収縮性であり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の沈着を増大させ、進行性間質性線維症をもたらす。このプロセスは最終的に進行性腎線維症および不可逆性腎不全に至る。例えば、非特許文献２を参照のこと。

ニンジン（ｇｉｎｓｅｎｇ）の主要な活性成分であるジンセノサイドは、種々の薬理活性、例えば抗腫瘍活性、抗糖尿病活性、抗疲労（ａｎｔｉｆａｔｉｑｕｅ）、抗アレルギー活性および抗酸化活性を有することが知られている。ジンセノサイドは、１７個の炭素原子が４つの環に配置されたゴナンステロイド核からなる基本的な構造を共有する。ジンセノサイドは体内で金属化され、いくつかの最近の研究からは、ジンセノサイド代謝物が、天然に存在するジンセノサイドよりむしろ体内で吸収されやすく、活性成分として働くことが示唆される。中でも、ジンセノサイドＭ１は、ヒト腸内細菌によるギペノサイド経路を経たプロトパナキサジオール系ジンセノサイドの代謝物の１つとして知られている。これまで、腎線維症の処置におけるジンセノサイドＭ１の作用を報告した従来技術の参考文献はない。

Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、ｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｕｂｕｌａｒｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｒｅｎａｌｄａｍａｇｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｉｂｒｏｓｉｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇｕｒｅｔｅｒｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＲｅｎａｌＰｈｙｓｉｏｌ．２００６Ｊａｎ；２９０（１）：Ｆ４−１３Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、Ｕｒｅｔｅｒａｌｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｓａｍｏｄｅｌｏｆｒｅｎａｌｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓａｎｄｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．２００９Ｊｕｎ；７５（１１）：１１４５−５２

本発明において、ジンセノサイドＭ１が腎線維症を抑制するのに有効であることが予想外に見出された。したがって、本発明は、対象における腎線維症を治療または予防するための新規手法を提供する。

特に、本発明は、有効量のジンセノサイドＭ１を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における腎線維症を抑制するための方法を提供する。

いくつかの実施形態において、対象は閉塞性腎疾患を有する患者である。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、限定されないが、特に対象の尿細管間質区画における、単核白血球浸潤、尿細管拡張、尿細管萎縮、尿細管上皮細胞の増殖、線維芽細胞または筋線維芽細胞の活性化、およびコラーゲン（例えばＩＩＩまたはＩＶ）沈着を含む、１つまたは複数の症状または状態を減少または軽減させるのに有効である。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対象の腎間質における単核白血球浸潤または線維症を減少または軽減させるのに有効である。

いくつかの実施形態において、ジンセノサイドＭ１は非経口または腸経路によって投与される。

いくつかの実施形態において、ジンセノサイドＭ１は腎線維症の発症前または発症時に投与される。

いくつかの実施形態において、ジンセノサイドＭ１は腎線維症の発症後に投与される。

腎線維症を治療するための医薬を製造するためのジンセノサイドＭ１の使用も提供される。

本発明の一実施形態または複数の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明の他の特徴または利点は、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明、およびさらに添付の特許請求の範囲から明らかになる。

本発明を説明するため、実施形態を図に示す。しかしながら、本発明は、示された好ましい実施形態に限定されるものではないことを理解すべきである。

（Ａ）実験手順、（Ｂ）ＵＵＯ動物モデルの外科処置を含む、ＵＵＯ動物モデルの確立を示し、左は尿管の結紮後の疾患腎臓であり、右は尿管の結紮なしの正常な腎臓である。Ｈ＆Ｅ染色による腎臓の組織病理学的評価を示し、矢印は拡張尿細管を示す。（Ａ）腎臓の組織病理学的評価のためのＨ＆Ｅ染色。「＃」は拡張尿細管を示し、アスタリスクは単球を示し、「＊」は萎縮性尿細管を示す。組織病理学についての元の倍率は４００倍であった。（Ｂ）半定量により、尿細管間質損傷スコア（ＴＩＳ）を示す。白、黒および灰色の柱は、正常対照マウス、疾患対照マウスおよびＬＣＨＫ１６８＋ＵＵＯマウスをそれぞれ表す。^＊＊＊ｐ＜０．００５。（Ａ）矢印が陽性染色された細胞を示す、免疫組織化学的染色によるＰＣＮＡの検出、および（Ｂ）半定量的結果を含む、腎細胞のアポトーシスおよび増殖の評価を示す。元の倍率は４００倍である。白、黒および灰色の柱は、正常対照マウス、疾患対照マウスおよびＬＣＨＫ１６８＋ＵＵＯマウスをそれぞれ表す。^＊＊＊ｐ＜０．００５。（Ａ）マッソントリクローム染色による腎組織における線維化コラーゲンの発現を含む、線維症発現評価を示す。元の倍率は４００倍である。（Ｂ）免疫組織化学的染色による腎組織における平滑筋α−アクチン（α−ＳＭＡ）の発現を含む、線維症発現評価を示す。元の倍率は４００倍である。（Ｃ）免疫組織化学的染色による腎組織におけるコラーゲンＩＩＩの発現を含む、線維症発現評価を示す。元の倍率は４００倍である。（Ｄ）免疫組織化学的染色による腎組織におけるコラーゲンＩＶの発現（矢印は陽性染色細胞を示す）を含む、線維症発現評価を示す。元の倍率は４００倍である。（Ｅ）半定量的結果を含む、線維症発現評価を示す。白、黒および灰色の柱は、正常対照マウス、疾患対照マウスおよびＬＣＨＫ１６８＋ＵＵＯマウスをそれぞれ表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５。（Ａ）免疫組織化学的染色による腎組織におけるＮＦ−κＢの発現（矢印は陽性染色細胞を示す）、および（Ｂ）半定量的結果を示す。元の倍率は４００倍である。白、黒および灰色の柱は、正常対照マウス、疾患対照マウスおよびＬＣＨＫ１６８＋ＵＵＯマウスをそれぞれ表す。^＊＊＊ｐ＜０．００５。（Ａ）Ｆ４／８０^＋単球／マクロファージの検出を含む、腎組織における単核白血球浸潤を示す。元の倍率は４００倍である。（Ｂ）免疫組織化学的染色によるＣＤ３^＋Ｔ細胞（矢印は陽性染色細胞を示す）を含む、腎組織における単核白血球浸潤を示す。元の倍率は４００倍である。（Ｃ）半定量的結果を含む、腎組織における単核白血球浸潤を示す。白、黒および灰色の柱は、正常対照マウス、疾患対照マウスおよびＬＣＨＫ１６８＋ＵＵＯマウスをそれぞれ表す。^＊＊＊ｐ＜０．００５。ＬＣＨＫ１６８が骨盤尿中のＭＣＰ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現レベルを抑制することを示す。（Ａ）ＭＣＰ−１、（Ｂ）ＴＮＦ−α、および（Ｃ）ＩＬ−１βは、ＥＬＩＳＡによって尿試料中で検出される。白、黒および灰色の柱は、正常対照マウス、疾患対照マウスおよびＬＣＨＫ１６８＋ＵＵＯマウスをそれぞれ表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５。フローサイトメトリーによる（Ａ）ＣＤ３^＋ＣＤ６９^＋Ｔ細胞および（Ｂ）ＣＤ１９^＋ＣＤ６９^＋Ｔ細胞の検出を含む、細胞性免疫の活性化についての評価を示す。白、黒および灰色の柱は、正常対照マウス、疾患対照マウスおよびＬＣＨＫ１６８＋ＵＵＯマウスをそれぞれ表す。フローサイトメトリーによる（Ａ）ＣＤ３４^＋幹細胞および（Ｂ）Ｓｃａ−１^＋造血幹細胞の検出を含む、造血幹細胞の活性化の評価を示す。白、黒および灰色の柱は、正常対照マウス、疾患対照マウスおよびＬＣＨＫ１６８＋ＵＵＯマウスをそれぞれ表す。

他に記載がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は、他に記載がない限り、それらに準ずる意味を有する。

本明細書では冠詞「１つの（「ａ」および「ａｎ」）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）をいうのに使用される。例として、「１つのエレメント（ａｎｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つのエレメントまたは２つ以上のエレメントを意味する。

本発明において、ジンセノサイドＭ１は腎線維症の抑制に有効であることが予想外に見出されている。特に、マウスＵＵＯモデルにおいて、腎損傷／炎症が減少し、腎線維症への進行が抑制または軽減されることが見出されている。

げっ歯類の外科的介入ＵＵＯモデルは、ＵＵＯについてのハイスループット実験モデルとして数十年間使用されてきた。このモデルは、高血圧、タンパク尿または高脂血症によって悪化するものではなく、明らかな免疫または毒性の腎障害を伴わない。閉塞の期間に応じて、ＵＵＯは、最終的に尿細管間質性線維症をもたらす閉塞性腎疾患の様々な段階を模倣することができる。対側の腎臓の機能は、補完的機能および解剖学的肥大の結果として維持されるか、またはさらに増加するため、動物の寿命は損なわれない。このモデルの他の利点は、腎線維症の進行が十分に予測可能で再現性があり、比較的短期間（７〜１４日）で著しい線維化およびネフロン欠損を引き起こすという事実を含む。例えば、Ｅｄｄｙら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃｈｒｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙｄｉｓｅａｓｅｉｎｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｓ、ＰｅｄｉａｔｒＮｅｐｈｒｏｌ．２０１２Ａｕｇ；２７（８）：１２３３−４７；およびＧｒａｎｄｅＭＴａｎｄＬｏｐｅｚ−ＮｏｖｏａＪＭ、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ、ＮａｔＲｅｖＮｅｐｈｒｏｌ．２００９Ｊｕｎ；５（６）：３１９−２８を参照のこと。

以下の例およびデータは、（１）腎間質組織における細胞アポトーシスおよび尿細管損傷の減少、（２）腎間質組織における線維化およびコラーゲン沈着の阻止、（３）ＮＦ−κＢ活性化の減少、（４）腎臓のマクロファージおよびＴ細胞浸潤の阻止、ならびに（５）造血幹細胞および全身細胞性免疫の正常機能の維持を含む、ジンセノサイドＭ１の予測されない効果を示す。

したがって、本発明は、有効量のジンセノサイドＭ１を対象に投与することによって、必要とする対象における腎線維症を抑制するための新規手法を提供する。

ジンセノサイドＭ１、２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、当該技術分野において公知のサポニン代謝物の１つである。ジンセノサイドＭ１の化学構造は、以下の通りである。

ジンセノサイドＭ１は、ヒト腸内細菌によるギペノサイド経路を経たプロトパナキサジオール系ジンセノサイドの代謝物の１つとして知られている。ジンセノサイドＭ１は、摂取後に血液中または尿中で見出され得る。ジンセノサイドＭ１は、その全内容を本明細書に援用する台湾特許出願第０９４１１６００５（Ｉ２８０９８２）号および米国特許第７，９３２，０５７号などの当該技術分野において公知の方法により、真菌発酵を介してニンジン植物から調製することができる。ある種の実施形態では、ジンセノサイドＭ１を調製するためのニンジン植物は、ウコギ（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）科、トチバニンジン（Ｐａｎａｘ）属、例えばチョウセンニンジン（Ｐ．ｇｉｎｓｅｎｇ）およびトチバニンジン（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ）（サンシチ（Ｓａｎｑｉ）とも呼ばれる）を含む。一般に、ジンセノサイドＭ１の調製方法は、（ａ）ニンジン植物材料（例えば葉または茎）の粉末を用意するステップ；（ｂ）ニンジン植物材料を発酵させるための真菌を用意するステップであって、発酵温度は２０〜５０℃にわたり、発酵湿度は７０〜１００％にわたり、ｐＨ値は４．０〜６．０にわたり、発酵期間は５〜１５日にわたるステップ；（ｃ）発酵産物を抽出および採取するステップ；および（ｄ）発酵産物から２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを単離するステップを含む。

本発明ではジンセノサイドＭ１を「単離された」または「精製された」と記載する場合、完全に単離されたまたは精製されたのではなく、比較的に単離されたまたは精製されたものと理解すべきである。例えば、精製されたジンセノサイドＭ１とは、その天然に存在する形態と比較してより精製されたものをいう。一実施形態では、精製されたジンセノサイドＭ１を含む調製物は、全調製物の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または１００％（ｗ／ｗ）の量でジンセノサイドＭ１を含み得る。本明細書で比率または投与量を示すのに特定の数字を使用する場合、前記数字は一般に、その数字より１０％超および未満の範囲内、またはさらに詳しくは５％超および未満の範囲内のものを含むことを理解すべきである。

本発明は、有効量のジンセノサイドＭ１を、それを必要とする対象に投与することを含む、腎線維症を抑制するための方法を提供する。また、必要とする対象における腎線維症を抑制するための医薬を製造するためのジンセノサイドＭ１の使用も提供する。本発明の医薬は、限定されないが、特に対象の尿細管間質区画における、単核白血球浸潤、尿細管拡張、尿細管萎縮、尿細管上皮細胞の増殖、線維芽細胞または筋線維芽細胞の活性化、およびコラーゲン（例えばＩＩＩまたはＩＶ）沈着を含む、１つまたは複数の症状または状態を減少または軽減させるのに有効である。具体的には、本発明の医薬は、対象の腎間質における単核白血球浸潤または線維症を減少または軽減させるのに有効である。

本明細書に使用される「個体」または「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物、例えばコンパニオンアニマル（イヌ、ネコおよび同種のものなど）、農用動物（雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび同種のものなど）、または実験動物（ラット、マウス、モルモットおよび同種のものなど）を含む。特定の実施形態において、本発明の方法によって治療される対象は閉塞性腎疾患を有すると同定される。

「治療すること」または「治療」という用語は、本明細書で使用する場合、障害、障害の症状もしくは状態、それらの障害、障害の進行、または障害の症状もしくは状態により引き起こされた身体障害を治癒させる、癒やす、軽減する、緩和する、変化させる、改善する、寛解させる、好転させる、またはそれらに作用することを目的として、１種または複数種の活性剤を含む組成物を、障害、障害の症状もしくは状態、または障害の進行に悩む対象に外用または投与することをいう。「予防すること」または「予防」という用語は、本明細書で使用する場合、１種または複数種の活性剤を含む組成物を、障害またはその症状もしくは状態の疑いがあるか、またはそれらにかかりやすい対象に外用または投与することをいい、したがって障害またはその症状もしくは状態、またはその根本原因の発生の予防に関連する。

本明細書に使用される「治療有効量」という用語は、治療される対象に所望の治療効果を与える活性成分の量をいう。例えば、腎線維症を治療または予防するための有効量は、単核白血球浸潤、尿細管拡張、尿細管萎縮、尿細管上皮細胞の増殖、線維芽細胞または筋線維芽細胞の活性化、およびコラーゲン（ＩＩＩまたはＩＶ）沈着などの１つまたは複数の症状もしくは状態またはそれらの進行を防止する、好転させる、軽減する、減少させるまたは予防することができる量であり得る。これらの症状は、様々な疾患進行関連指標に基づき、当該分野において公知の方法、例えば染色により腎部分を分析することによって判定および評価することができる。有効量は、投与の経路および頻度、前記薬剤を投与される個体の体重および種、ならびに投与の目的など様々な理由に応じて変化してもよい。当業者は、それぞれの場合に本明細書の開示内容、確立された方法、および当業者自身の経験に基づき投与量を決定してもよい。例えば、特定の実施形態において、本発明に使用されるジンセノサイドＭ１の経口投与量は、１日１０〜１，０００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの例では、本発明に使用されるジンセノサイドＭ１の経口投与量は、１日１００〜３００ｍｇ／ｋｇ、１日５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１日２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、１日１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、または１日５〜３０ｍｇ／ｋｇである。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、ジンセノサイドＭ１は、一定期間定期的に投与され、例えば、少なくとも５日間、１０日間または１５日間、１ヶ月間または２ヶ月間以上連日投与される。

本発明によれば、ジンセノサイドＭ１は、腎線維症を治療または予防するための活性成分として使用することができる。一実施形態では、有効量の活性成分は、送達および吸収を目的として、薬学的に許容される担体と共に適切な形態の医薬組成物に製剤化してもよい。投与様式に応じて、本発明の医薬組成物は好ましくは約０．１重量％〜約１００重量％の活性成分を含み、重量パーセントは全組成物の重量に基づき計算される。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」は、担体が組成物中の活性成分との適合性があり、好ましくは前記活性成分を安定化でき、処置を受ける個体に安全であることを意味する。前記担体は、活性成分に対する希釈剤、ビヒクル、賦形剤またはマトリックスであってもよい。適切な賦形剤の一部の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルボース、マンノース、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガントガム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。組成物は、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油など滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエートなどの防腐剤；甘味料；ならびに着香剤をさらに含んでもよい。本発明の組成物は、患者への投与後の活性成分の迅速放出、持続放出または遅延放出の作用を持たせてもよい。

本発明によれば、前記組成物の形態は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ、パケット（ｐａｃｋｅｔ）剤、トローチ、エリキシル剤（ｅｌｉｘｅｒｓ）、懸濁剤、ローション、溶液剤、シロップ、軟質および硬質ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液、ならびに分包散剤であってもよい。

本発明の組成物は、経口法、非経口法（筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内など）、経皮法、坐剤法および経鼻法などの任意の生理学的に許容される経路により送達することができる。非経口投与については、本発明の組成物は好ましくは、溶液を血液に対して等張にするのに十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含んでもよい滅菌水溶液の形態で使用される。水溶液は、必要に応じて（好ましくは３〜９のｐＨ値で）適切に緩衝化してもよい。滅菌条件下での適切な非経口組成物の調製は、当業者によく知られている標準的な薬理学的技法を用いて達成することができ、追加の創造的労力は必要としない。

本発明によれば、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、腎線維症を治療または予防するのに使用してもよい。具体的には、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、疾患の発症を予防するため、または症状を改善させるため、または症状の悪化を遅延させるために腎線維症の個体または腎線維症に罹患するリスクがある個体に投与してもよい。具体的には、ジンセノサイドＭ１は、腎線維症の発症の時間の前または発症時に投与してもよいか、またはジンセノサイドＭ１は腎線維症の発症後に投与されてもよい。

さらに、本発明によれば、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、既存の治療方法または医薬、例えば、薬物治療、以下に限定されるものではないが、コルチコステロイド（プレドニゾロンなど）、非ステロイド性（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｉｏｄａｌ）抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、細胞傷害性薬（シクロホスファミド、クロラムブシルおよびアザチオプリンなど）、免疫抑制剤（シクロスポリンおよびミコフェノール酸モフェチルなど）、および血管拡張薬（アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤など））と組み合わせて使用してもよい。一実施形態では、組み合わせて使用される医薬または治療方法は、同時に（並行）使用しても、あるいは連続的に使用してもよい。医薬が組み合わせて使用される場合、医薬は同じ処方中で混合しても、あるいは別のカプセル、丸剤、錠剤および注射薬など異なる処方に別々に組み込んでもよい。

本発明について、限定ではなく実証を目的として提供する以下の例によりさらに説明する。

１．材料および方法
１．１動物モデルおよび実験プロトコル
ＵＵＯ（片側尿管閉塞）動物モデル
オスの８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、国立実験動物飼育研究センター（ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）（台北、台湾）から購入し、国防医療センター（ＮａｔｉｏｎａｌＤｅｆｅｎｓｅＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ）（台北、台湾）の動物センターで維持した。全ての動物実験は、国防医療センター（ＮａｔｉｏｎａｌＤｅｆｅｎｓｅＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ）（台湾）の動物実験委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得て行われ、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）のガイドラインと一致していた。

マウスを最初にペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔した。左腹部切開を行った後、左尿管を露出させ、６−０絹縫合糸で２点を結紮し、２つの結紮点の間を切断した。最後に、腹膜および皮膚を縫合した。偽手術は、尿管の結紮および切開を除いて、ＵＵＯ手順の全てのステップに従うことによって対照として実施した（ＸｉａｏらＡｄｅｎｏｓｉｎｅＡ２Ａｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａｔａｒｇｅｔｆｏｒｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｒｅｎａｌｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ、ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１３Ａｐｒ９；８（４）：ｅ６０１７３）。

簡潔に述べると、全てのマウスに術前鎮痛（５０ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィン（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ、Ｓｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）の皮下注射）を与え、続いて右尿管を２．０％のイソフルランにより誘発された麻酔下で小さな腹部切開を通して６．０絹で結紮した。腹部を２層に閉じ、マウスを換気ストーブで２８℃にて１２時間、手術から回復させた。マウスを手術の７または１４日後に屠殺した（Ｐｕｌｓｋｅｎｓら、Ｎｌｒｐ３ｐｒｅｖｅｎｔｓｅａｒｌｙｒｅｎａｌｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｅｄｅｍａａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｉｎｕｎｉｌａｔｅｒａｌｕｒｅｔｅｒａｌｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１４Ｊａｎ１５；９（１）：ｅ８５７７５）。

１．２ジンセノサイドＭ１および投与
台湾特許出願第０９４１１６００５（Ｉ２８０９８２）号明細書および米国特許第７，９３２，０５７号に記載されているような当該技術分野で公知の方法により、ジンセノサイドＭ１である、２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール（以下、ＬＣＨＫ１６８と称する）を調製した。ＬＣＨＫ１６８を３％のクレモフォア（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。ＵＵＯ操作の１日前から開始して、屠殺するまで腹腔内注射によってマウスにＬＣＨＫ１６８（３０ｍｇ／ｋｇ）の１日用量を与えた。

１．３腎臓の病理組織
パラフィン包埋した腎臓組織を切片にし、標準的なプロトコルを使用してマッソントリクロームならびにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。組織病理に関して、組織を１０％の緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、次いで切片（３μｍ）を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。

全ての切片を実装後に試験した。半定量的分析の方法は腎尿細管間質に対する炎症および線維化の程度に応じており、スコア付けのために２０の領域を無作為に選択した。「０」は正常形態を示し、「１」は流入面積が１０％未満であることを示し、「２」は流入面積が約１０〜３０％であることを示し、「３」は流入面積が約３０〜５０％であることを示し、「４」は流入面積が５０％超であることを示す。

１．４免疫組織化学（ＩＨＣ）およびアポトーシスの検出
ＩＨＣに関して、ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織切片を、ＤＡＫＯ抗体希釈緩衝液（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）中で希釈した、ＰＣＮＡ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ３（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、α−ＳＭＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ（両方、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ製、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）、Ｆ４／８０（単球／マクロファージ；Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ、ＵＳＡ）、ホスホ−ＮＦ−κＢｐ６５（ｐＮＦ−κＢｐ６５；ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）に対する抗体と共に４℃にて一晩、次いで、同じ緩衝液中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（ＤＡＫＯ）または抗ウサギポリマー−ＨＲＰ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に室温にて１時間インキュベートし、次いでＤＡＢ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を加えた。ヘマトキシリンを使用して核を対比染色した。アポトーシスの検出のために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）を使用した。ホルマリン固定組織切片を、製造業者の指示書に従ってＡｐｏｐＴａｇＰｌｕｓＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＩｎＳｉｔｕＡｐｏｐｔｏｓｉｓ検出キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して染色した。α−ＳＭＡ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶの存在度またはリン酸化ＮＦ−κＢｐ６５^＋、ＰＣＮＡ^＋、Ｆ４／８０^＋、ＣＤ３^＋およびアポトーシス細胞の数を、Ｐａｘ−Ｉｔ定量的画像解析ソフトウェア（Ｐａｘｃａｍ）によって皮質領域の尿細管間質区画の４００倍の倍率のランダムに選択した領域で計測した。

１．５フローサイトメトリー
マウス由来の脾細胞をトリス緩衝化塩化アンモニウムで処理して赤血球を除去し、洗浄し、１０％ウシ胎仔血清、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で再懸濁した。次いで、Ｔ細胞についてＦＩＴＣ結合抗マウスＣＤ３抗体（１７Ａ２）、Ｂ細胞について抗マウスＣＤ１９抗体（１Ｄ３）、およびフィコエリトリン結合抗マウスＣＤ６９抗体（Ｈ１．２Ｆ３；全てＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の抗体）を使用して、ＴまたはＢ細胞の表面マーカーについて細胞を染色した。骨髄細胞分析のために、マウス由来の骨髄を記載（ＴａｋｅｓｈｉｔａＳら、２０１４）の通りに単離し、マウスＳｃａ−１（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＣＤ３４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に対する抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。

１．６マッソントリクローム染色
３μｍの腎切片を７５℃で１５分間インキュベートする。上のスライドをキシレン（ｘｙｌｉｎｅ）および勾配アルコールに移す。媒染剤を、ヘマトキシリンで１分間染色した後、スライド上に載せる。０．７５％のオレンジＧ溶液、マッソン染色溶液Ｂ、２．５％のホスホタングステン酸溶液、およびアニリンブルー染色溶液で染色した後、スライドを１％の酢酸で２回洗浄し、アラビアゴムでマウントする。数分間空気乾燥させ、染色切片を光学顕微鏡上で検査する。

１．７酵素結合免疫吸着法
尿試料を２９Ｇインスリン注射器によって腎杯および骨盤から採取する。正常対照として、尿を代謝ケージによって採取する。次いで、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを、取扱説明書（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＲ＆Ｄ）に従ってＥＬＩＳＡによって検出する。簡潔には、捕捉抗体を９６ウェルプレート中で一晩被覆する。ＰＢＳＴで洗浄した後、ブロッキング緩衝液、試料、検出抗体、アビジン−ＨＲＰを順に充填する。ＴＭＢ基質ステップ後に発色し、次いで２ＮのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させる。最後に、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍを測定する。

１．８統計的解析
値は平均±ＳＤである。２つの群間の比較はスチューデントのｔ検定を使用して行った。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であるとみなした。

２．結果
２．１実験ＵＵＯモデルの確立
実験は８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスで行った。マウスを疑似対照、疾患対照およびＬＣＨＫ１６８治療群にランダムに分け、７または１４日間のＵＵＯ後に屠殺した。ＵＵＯ腎臓の骨盤内の尿の保持が観察され、ＵＵＯモデルが首尾よく確立されたことが示された。図１Ａおよび図１Ｂを参照のこと。

２．２腎臓の病理組織評価
腎臓組織を採取し、固定し、Ｈ＆Ｅ染色を行った。図２に示すように、７日目のＵＵＯにおいて、疾患対照マウスは間質領域において顕著な単核白血球浸潤および尿細管拡張を示し、この組織病理はＬＣＨＫ１６８投与によって抑制された。１４日目のＵＵＯにおいて、線維化および尿細管萎縮が観察され、それらはＬＣＨＫ１６８投与後に顕著に抑制される。

２．３腎細胞アポトーシスおよび増殖評価
ＵＵＯ腎臓において、尿の保持によって引き起こされる機械的ストレス、ならびにストレスに対する応答としての腎細胞によるサイトカインおよびＲＯＳ放出は、細胞の損傷を引き起こし、これにより、細胞の自己複製またはアポトーシス反応をもたらす。アポトーシス細胞について腎切片のＴＵＮＮＥＬ染色により、ＵＵＯ腎間質領域が示され、ＬＣＨＫ１６８投与後に減少した。図３Ａを参照のこと。

尿細管上皮細胞の増殖状態についてだけでなく、活性化された筋線維芽細胞および炎症細胞についてのマーカーである、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）による腎切片の免疫組織化学的染色は、特に拡張尿細管において、ＵＵＯ後、有意に増加したことが示された。しかしながら、ＰＣＮＡ発現はＬＣＨＫ１６８の投与後に減少した。これらの結果は、ＬＣＨＫ１６８が細胞アポトーシスおよび損傷を弱め得ることを示した。図３Ｂを参照のこと。

２．４線維症発現評価
ＵＵＯ腎臓において、線維症は腎組織損傷に対する不適応反応であり、閉塞が持続する場合、不可逆的な腎機能不全に発展する。マッソントリクローム染色による腎切片の組織化学的染色は、偽対照と比較してＵＵＯ間質領域において線維化組織の顕著な増加を示し、ＬＣＨＫ１６８投与後に減少した。図４Ａを参照のこと。さらなる検査をα−ＳＭＡ、コラーゲンＩＩＩ及びＩＶについて腎切片の免疫組織化学的染色によって実施し、それらはＵＵＯ間質領域で強く発現し、ＬＣＨＫ１６８投与後に減少した。図４Ｂ〜Ｅを参照のこと。得られたこれらのデータにより、ＬＣＨＫ１６８が腎間質における筋線維芽細胞の活性化および腎線維症を改善し得ることが示された。

２．５ＮＦ−κＢにより調節された炎症反応
２．５．１腎組織におけるＮＦ−κＢの発現
ＮＦ−κＢは、サイトカインおよび細胞接着分子のその刺激のための炎症関連因子の調節についての必須の核転写因子である。以前の研究により、ＮＦ−κＢの発現レベルが、腎疾患を含む様々な炎症性障害において上昇することが示された。ＮＦ−κＢについての腎切片の免疫組織化学的染色により、ＮＦ−κＢ発現の増加が示され、ＬＣＨＫ１６８投与後に抑制された。図５を参照のこと。このデータにより、ＬＣＨＫ１６８がＵＵＯ腎臓においてＮＦ−κＢを抑制し得ることが示された。

２．５．２単核白血球浸潤
以前の研究により、炎症細胞がＵＵＯの病因において重要な役割を果たすことが示された。単核白血球、特にマクロファージおよびＴリンパ球の浸潤は、ＵＵＯの初期段階で観察することができる。閉塞が持続すると、活性化された炎症細胞は尿細管上皮細胞または他の炎症細胞を刺激して様々なサイトカインおよびケモカインを放出し、腎間質領域に動員する炎症細胞をより多く引き起こし、腎炎症および線維症を誘発する。単核白血球浸潤の評価を、マクロファージおよびＴ細胞についてのマーカーである、Ｆ４／８０およびＣＤ３＋について腎切片の免疫組織化学的染色によって実施した。Ｆ４／８０およびＣＤ３＋の発現は、ＵＵＯ後に増加し、ＬＣＨＫ１６８投与後に減少した。図６Ａ、６Ｂを参照のこと。得られたデータにより、ＬＣＨＫ１６８が腎間質におけるマクロファージおよびＴ細胞の浸潤を予防し得ることが示された。

２．５．３尿中のＭＣＰ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現の評価
初期段階で、サイトカインおよびケモカインは腎臓において局所的に放出され、免疫細胞を動員することができる。次いで、動員された免疫細胞はますます炎症因子を放出する。腎盂においてＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１βが検出される。ＵＵＯおよびＵＵＯ＋ＬＣＨＫ群の両方は、７日目に正常対照群と比較して、より高度にＭＣＰ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを発現する。しかし、これらのサイトカインおよびケモカインのレベルは、ＵＵＯ群と比較してＵＵＯ＋ＬＣＨＫ群で１４日目に有意に減少した。図は、ＬＣＨＫ１６８が尿中のＭＣＰ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βレベルを有意に減少させ得ることを示している。

２．６細胞性免疫の活性化および造血幹細胞の活性化
２．６．１ＢおよびＴリンパ球の活性化
ＬＣＨＫ１６８が、全身細胞性免疫の抑制を介して局所炎症および線維化を予防するかどうかを検査するために、フローサイトメトリーによって脾細胞におけるＢ細胞およびＴ細胞活性化を検査した。図８Ａおよび図８Ｂに示すように、３つの群内でＣＤ３^＋ＣＤ６９^＋（活性化パンＢ）の割合に有意な変化はなく、ＣＤ１９^＋ＣＤ６９^＋（活性化パンＴ）も変化はなかった。得られたデータにより、ＵＵＯによって引き起こされる腎症は、全身細胞性免疫にほとんど影響を及ぼさない可能性があり、ＬＣＨＫ１６８は、全身細胞性免疫の抑制を介して局所炎症および線維化を予防しない可能性があることが示された。

２．６．２造血幹細胞の活性化
ＬＣＨＫ１６８が、造血幹細胞の活性化の抑制を介して局所炎症および線維化を予防するかどうかを検査するために、フローサイトメトリーによって骨髄細胞における幹細胞および造血幹細胞の活性化を検査した。図９Ａおよび９Ｂに示すように、３つの群内で幹細胞抗原−１−陽性細胞（造血幹細胞）およびＣＤ３４^＋（幹細胞）細胞の割合に有意な変化はなかった。得られたデータにより、ＵＵＯによって引き起こされた腎症が造血幹細胞活性にほとんど影響を与えず、ＬＣＨＫ１６８が造血幹細胞活性の抑制を介して局所炎症および線維化を予防しない可能性があることが示された。

要約すると、我々の研究は、ジンセノサイドＭ１がＵＵＯモデルにおいて腎線維症の発症を予防するのに有効であることを示す。特に、その結果は、（１）腎間質組織における細胞アポトーシスおよび尿細管損傷の減少、（２）腎間質組織における線維化およびコラーゲン沈着の予防、（３）ＮＦ−κＢ活性化の減少、（４）腎臓のマクロファージおよびＴ細胞浸潤の予防、ならびに（５）造血幹細胞の正常な機能および全身細胞性免疫を示す。これらの見解の全てにより、ジンセノサイドＭが、腎線維症の治療または予防のための候補新規薬物にさらに開発できることを示唆している。

本発明が属する技術分野の当業者は、さらに詳細な説明を必要とせずに、本発明を本明細書の説明に基づいて利用することができると考えられる。したがって、提供される説明および特許請求の範囲は、本発明の範囲を決して制限するものではなく、例示的な目的として理解されるべきである。

Claims

有効量のジンセノサイドＭ１を含む腎線維症抑制剤であって、前記抑制剤を必要とする対象に投与される抑制剤。
非経口又は腸経路によって投与するための、請求項１に記載の抑制剤。
１日１０ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与するための、請求項１に記載の抑制剤。
少なくとも５日間連日投与するための、請求項１に記載の抑制剤。
前記対象が閉塞性腎疾患を有する患者である、請求項１に記載の抑制剤。
前記ジンセノサイドＭ１が、前記対象における、単核白血球浸潤、尿細管拡張、尿細管萎縮、尿細管上皮細胞の増殖、線維芽細胞または筋線維芽細胞の活性化、およびコラーゲン沈着からなる群から選択される１つまたは複数の症状または状態を減少または軽減させるのに有効な量で投与される、請求項１に記載の抑制剤。
前記ジンセノサイドＭ１が、前記対象の腎間質における単核白血球浸潤または線維症を減少または軽減させるのに有効な量で投与される、請求項１に記載の抑制剤。
閉塞性腎疾患を有する対象を診断または同定した後に投与される、請求項１に記載の抑制剤。
必要とする対象における腎線維症を抑制するための医薬を製造するためのジンセノサイドＭ１の使用。
前記医薬が非経口又は腸経路によって投与される、請求項９に記載の使用。
前記医薬が１日１０ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項９に記載の使用。
前記医薬が少なくとも５日間連日投与される、請求項９に記載の使用。
前記対象が閉塞性腎疾患を有する患者である、請求項９に記載の使用。
前記医薬が、前記対象における、単核白血球浸潤、尿細管拡張、尿細管萎縮、尿細管上皮細胞の増殖、線維芽細胞または筋線維芽細胞の活性化、およびコラーゲン沈着からなる群から選択される１つまたは複数の症状または状態を減少または軽減させるのに有効である、請求項９に記載の使用。
前記医薬が、前記対象の腎間質における単核白血球浸潤または線維症を減少または軽減させるのに有効である、請求項９に記載の使用。