CN106795546A - 人参皂苷m1用于抑制肾纤维化之用途 - Google Patents

人参皂苷m1用于抑制肾纤维化之用途 Download PDF

Info

Publication number
CN106795546A
CN106795546A CN201580019639.7A CN201580019639A CN106795546A CN 106795546 A CN106795546 A CN 106795546A CN 201580019639 A CN201580019639 A CN 201580019639A CN 106795546 A CN106795546 A CN 106795546A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ginsenoside
renal
fibrosis
individuality
kidney
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580019639.7A
Other languages
English (en)
Inventor
理筱龙
理昱杰
陈安
花国峰
贾淑敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Li Xiao Long
Original Assignee
Wellhead Biological Technology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wellhead Biological Technology Corp filed Critical Wellhead Biological Technology Corp
Publication of CN106795546A publication Critical patent/CN106795546A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供一种在有需要的个体抑制肾纤维化的方法。

Description

人参皂苷M1用于抑制肾纤维化之用途
技术领域
本发明关于人参皂苷M1用于抑制肾纤维化之新颖用途，特别是抑制间质性纤维化
背景技术
肾纤维化是肾脏疾病的最终阶段。造成肾纤维化的原因包括输尿管阻塞(ureteral obstruction)。
输尿管阻塞是泌尿科医师最常遇到的问题。输尿管阻塞会造成在输尿管中尿液流动的阻抗。最常见的阻塞发生在输尿管肾盂接合处。较广义的“阻塞性尿路病变”乙词可用来表示任何发生在肾盂与尿道之间的尿液流动阻塞，其导致逐渐形成肾盂积水以及相关的肾损伤。尿道狭窄与良性前列腺肥大是这方面的例子。据报告，单侧输尿管阻塞(UUO)的发生率在成人中为1/1,000。输尿管结石为最常见的原因，且急性阻塞通常伴随明显的肾绞痛为主要的症状。参见，例如，Docherty等人，抑制肾小管细胞凋亡保护对抗输尿管阻塞后之肾损伤及纤维化发展的证据，Am J Physiol Renal Physiol.2006Jan；290(1):F4-13。
在发生单侧输尿管阻塞(UUO)初期，间质组织由单核细胞所渗入，其典型地受到活化(classically activated)转变为巨噬细胞，而释放细胞激素，如TGF-β1与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。接着，TGFβ1促进肾小管上皮细胞的表现型反应，而进入细胞凋亡(造成肾小管萎缩)，或进入上皮间质转化作用(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，而变成纤维母细胞，其可迁移至间质组织。血管收缩素II(AngiotensinII，ANG II)，由单核细胞的活化所产生，可刺激核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的产生，其引致更多巨噬细胞的聚集，以及产生活性含氧物(reactive oxygen species，ROS)，其加重了肾小管的损伤。相反地，替代性活化(alternatively activated)的巨噬细胞则增加肾小管细胞的存活与增殖。内皮细胞可以进行内皮间质转换作用(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)或细胞凋亡，其造成毛细管损失与续发性肾缺血与缺氧。周边细胞与浸润性造血干细胞亦可分化为纤维母细胞。在细胞激素的刺激下，例如由巨噬细胞或其它细胞产生的TGF-β1，纤维母细胞合成压力纤维，且进一步分化而变成肌纤维母细胞。该肌纤维母细胞可收缩且增加胞外基质(extracellular matrix，ECM)的沈积，导致恶化型间质纤维化。此过程最终导致恶化型肾纤维化以及不可逆的肾功能衰竭。参见，例如，Chevalier等人，以输尿管阻塞作为肾间质纤维化与阻塞性肾病变的模型，KidneyInt.2009Jun；75(11):1145-52。
人参皂苷是人参之主要成分，已知具有多种药理学活性，例如，抗肿瘤、抗糖尿病、抗疲劳、抗过敏及抗氧化活性。人参皂苷类具有相同的基础结构，其系由具17个碳原子排成四个环的性脂烷类固醇(gonane steroid nucleus)核心组成。人参皂苷会在体内代谢，近来许多研究指出，在体内易吸收而作为活性成分的是人参皂苷代谢物而非天然存在之人参皂苷。其中，人参皂苷M1已知为原人参二醇型(protopanaxadiol-type)人参皂苷代谢物之一，其系经由人体肠道细菌之绞股蓝皂苷(gypenoside)途径生成。迄今，尚未有前案报导人参皂苷M1于狼疮性肾炎的治疗功效。
发明内容
在本发明中，不可预期地发现人参皂苷M1可有效抑制肾纤维化。因此，本发明提供一种治疗或预防个体之肾纤维化的新颖方法。
具体而言，本发明提供一种在有需要的个体抑制肾纤维化的方法，包含对该个体投予治疗有效量的人参皂苷M1。
在部分具体实施例中，该个体是具有阻塞性肾病变的病患。
在部分具体实施例中，本发明的方法能有效降低或缓解一或多种病征或症状，包括但不限于，单核白血球发炎、肾小管扩张、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞的增殖、纤维母细胞或肌纤维母细胞的活化，以及胶原蛋白(例如第III型或第IV型)的沈积，具体而言是在该个体的肾小管间质腔室中。
在部分具体实施例中，本发明的方法可有效降低或缓解在个体的肾间质中的单核血球发炎或纤维化。
在部分具体实施例中，该人参皂苷M1由非经肠道或肠道内途径投予。
在部分具体实施例中，该人参皂苷M1于肾纤维化发生之前或发生时投予。
在部分具体实施例中，该人参皂苷M1于肾纤维化发生之后投予。
本发明提供人参皂苷M1用于制造供治疗肾纤维化之药物的用途
本发明之一或多个具体实施例之详述系列于下方之说明中。本发明之其他特征或优势可由下列数个具体实施例之详细说明及所附之主张而更臻清楚。
附图说明
欲说明本发明，图式具体实施例如下。然而，应理解到，本发明未局限于所示之较佳具体实施例。在图式中：
图1显示UUO动物模式的建立，包括(A)实验流程、(B)UUO动物模式的手术流程，其中左边是输尿管结扎后的疾病肾脏，以及右边是无输尿管结扎的正常肾脏。
图2显示以苏木精及伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色进行之肾脏组织病理学评估，其中箭头指示处为扩张的肾小管。(A)肾脏组织病理学评估的H&E染色。#表示扩张的肾小管，星状表示单核细胞，以及＊表示萎缩的肾小管。病理学的原始放大倍数为400倍。(B)半定量显示肾小管间质损伤评分(tubulointerstitialscore,TIS)。白色、黑色及灰色柱状分别代表正常对照组小鼠、疾病对照组小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。
图3显示肾细胞凋亡与增殖的评估，包括(A)以免疫组织化学染色侦测PCNA，其中箭头指示处为阳性染色细胞，以及(B)半定量结果。原始放大倍数为400倍。白色、黑色与灰色柱状分别代表正常对照组小鼠、疾病对照组小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。
图4显示纤维化表现评估，包括(A)以Masson氏毛状体染色分析在肾组织中纤维化的胶原蛋白的表现，(B)以免疫组织化学染色分析在肾组织中平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)的表现，(C)以免疫组织化学染色分析在肾组织中平滑胶原蛋白第III型的表现，(D)以免疫组织化学染色分析在肾组织中平滑胶原蛋白第IV型的表现，其中箭头指示处为阳性染色细胞，以及(E)半定量结果。原始放大倍数为400倍。白色、黑色与灰色柱状分别代表正常对照组小鼠、疾病对照组小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。
图5显示(A)以免疫组织化学染色分析在肾组织中NF-κB的表现，其中箭头指示处为阳性染色细胞，以及(B)半定量结果。原始放大倍数为400倍。白色、黑色与灰色柱状分别代表正常对照组小鼠、疾病对照组小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。
图6显示在肾组织中单核白血球浸润，包括以免疫组织化学染色侦测(A)F4/80+单核细胞/巨噬细胞以及(B)CD3+T细胞，其中箭头指示处为阳性染色细胞，以及(C)半定量结果。原始放大倍数为400倍。白色、黑色与灰色柱状分别代表正常对照组小鼠、疾病对照组小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。
图7显示LCHK168抑制肾盂尿中的MCP-1、TNF-α及IL-1β的表现水平。(A)MCP-1、(B)TNF-α及(C)IL-1β以ELISA侦测尿液样本。白色、黑色与灰色柱状分别代表正常对照组小鼠、疾病对照组小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。
图8显示细胞免疫力的活化评估，包括以流式细胞仪侦测(A)CD3+CD69+T细胞以及(B)CD19+CD69+T细胞。白色、黑色与灰色柱状分别代表正常对照组小鼠、疾病对照组小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。
图9显示造血干细胞的活化评估，包括以流式细胞仪侦测(A)CD34+干细胞以及(B)Sca-1+造血干细胞。白色、黑色与灰色柱状分别代表正常对照组小鼠、疾病对照组小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的技术性及科学性术语具有本发明领域之技术人员所能常规理解的意义。除非另有指明，本文所使用的下列术语具有赋予其之涵义。
本文所使用的冠词“一”与“一者”是指一个或多于一个(亦即，至少一者)之该冠词语法对象。举例而言，“一组件”是指一个组件或多于一个之组件。
在本发明中，意外地发现人参皂苷M1可有效抑制肾纤维化。特别是，发现在小鼠UUO模型中，肾损伤/发炎降低，且肾纤维化的恶化受到抑制或减轻。
对啮齿科动物进行手术干预的UUO模型数十年来已被用来作为UO的高通量实验模型。此模型不会并发高血压、蛋白尿或高血脂症，且不涉及任何明显的免疫或毒性肾衰竭。取决于阻塞时间的长短，UUO可以模拟不同阶段的阻塞性肾病变，其最终导致肾小管间质纤维化。该动物的寿命不会受到损害，因为对侧的肾脏仍具有功能，或甚至因为补偿功能与解剖肥大之故而增加功能。此模型的其它优点包括，肾纤维化的进展为高度可预期且可重复，并在相对短的期间(7-14天)内导致显着纤维化及肾元损失。参见，例如，Eddy等人，研究小鼠模型中慢性肾脏疾病的机制，Pediatr Nephrol.2012Aug；27(8):1233-47；以及GrandeMT与López-Novoa JM，在阻塞性肾病变中的纤维母细胞的活化与肌纤维母细胞的产生，NatRev Nephrol.2009Jun；5(6):319-28。
以下的实施例与数据显示出人参皂苷M1的不可预期效果，包括(1)在肾间质组织中降低细胞凋亡与肾小管损伤，(2)在肾间质组织中预防纤维化与胶原蛋白沈积，(3)降低NF-κB的活化，(4)预防肾脏巨噬细胞与T细胞之浸润，以及(5)维持造血干细胞的正常功能与全身性细胞免疫力。
因此，本发明提供一种在有需要的个体治疗或预防肾纤维化的方法，包含对该个体投予治疗有效量的人参皂苷M1。
人参皂苷M1，即20-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)，为本领域习知之皂素代谢物之一。人参皂苷M1之化学结构如下：
人参皂苷M1已知为原人参二醇型人参皂苷之代谢物之一，其系经由人体肠道细菌之绞股蓝皂苷途径产生。人体服用人参后，可于血液或尿液中发现人参皂苷M1。人参皂苷M1可制备自人参植物，其系以本领域习知方法如真菌发酵方式进行，例如，中国台湾发明专利申请案第094116005号(I280982)及美国专利第7,932,057号，其全部内容在此列入本案以作为参考数据。在部分具体实施例中，用于制备人参皂苷M1的人参植物包括五加科(Araliaceae)、人参属(Panax genus)，如人参(P.ginseng)及假人参(P.pseudo-ginseng)(亦称作三七)。一般而言，人参皂苷M1之制备方法包括步骤：(a)提供人参植物材料(如叶或茎)的粉末；(b)提供真菌，以进行人参植物材料之发酵，其中发酵温度范围为20至50℃、发酵湿度范围为70至100％、pH值范围为4.0至6.0、及发酵时间范围为5至15天；(c)萃取及收集发酵产物；以及(d)自发酵产物分离20-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇。
在本发明中，当以“分离”或“纯化”描述人参皂苷M1时，其应理解为非绝对的分离或纯化，而是相对的分离或纯化。举例而言，纯化的人参皂苷M1是指相较于其天然存在形式而言，纯度更高。在一具体实施例中，含有纯化的人参皂苷M1的制剂可包含的人参皂苷M1之含量为总制剂的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％(w/w)。应理解的是，当以某数字显示比例或剂量时，该数字通常包括其10％上下之范围，或更特别地，包括其5％上下之范围。
本发明提供一种抑制肾纤维化之方法，包括将有效量之人参皂苷M1投用于有需要此治疗的个体。亦提供的是人参皂苷M1用于制造药物之用途，其系供于有需要的个体抑制肾纤维化。本发明的药物有效于降低或缓解个体的一或多种症状或病况，包括但不限于，单核白血球发炎、肾小管扩张、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞的增殖、纤维母细胞或肌纤维母细胞的活化以及胶原蛋白(第III型或第IV型)的沈积，特别是在肾小管间质腔室。特定而言，本发明的药物有效于降低或缓解在个体的肾间质中的单核白血球发炎或纤维化。
本文所使用的“个人”或“个体”等词包括人类或非人类动物，例如陪伴动物(如狗、猫等)、农场动物(如牛、绵羊、猪、马等)、或实验动物(如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。
本文所使用的“治疗”乙词是指施加或投予包括一或多种活性药剂的组合物至具有疾病、疾病之症状或病况、或疾病恶化之个体，其目的在于治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进、或影响疾病、疾病之症状或病况、疾病引发之失能、或疾病恶化。如本文所使用，“预防”乙词意指施用或投予包括一或多种活性剂的组合物至易感受或倾向于疾病或其症状或病症的个体内，而因此涉及预防该疾病或其症状或病症或其病因的发生。
本文所使用的“有效量”乙词是指于接受处理之个体产生想要的医疗功效之活性成分的量。例如，用于治疗或预防肾纤维化的有效量为可以抑制、改善、缓解、降低或预防一或多种症状或病况，例如，单核白血球发炎、肾小管扩张、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞的增殖、纤维母细胞或肌纤维母细胞的活化以及胶原蛋白(第III型或第IV型)的沈积，特别是在肾小管间质腔室。该症状可使用本领域习知方法基于不同疾病进展相关指数予以决定与评估，例如，藉由透过染色分析肾切片。该有效量可根据不同理由而改变，例如，投予途径与频率、接受该药物的个体的体重与物种，以及投予的目的。本领域技艺者基于本文所揭露者、已建立的方法，以及其经验来决定在个案中的剂量。例如，在部分具体实施例中，本发明所使用的人参皂苷M1口服剂量为每日10至1,000mg/kg。在部分实例中，本发明所使用的人参皂苷M1口服剂量为每日100至300mg/kg、每日50至150mg/kg、每日25至100mg/kg、每日10至50mg/kg、或每日5至30mg/kg。此外，在本发明之部分具体实施例中，人参皂苷M1系周期性投予一段时间，例如，每日投予达至少15天、一个月或二个月或更久。
依据本发明，人参皂苷M1可作为活性成分，以治疗或预防肾纤维化。在一具体实施例中，针对输送及吸收目的，有效量之活性成分可与医药上可接受载体配制成适当形式之医药组合物。依据投予模式，本发明之医药组合物较佳为包含约0.1％重至约100％重之活性成分，其中百分比重系以组合物之总重量为基准计算。
本文所使用的“医药上可接受”乙词是指载体与组合物之活性成分兼容，且较佳为可稳定该活性成分且对于接受治疗之个体具安全性。该载体可为活性成分之稀释剂、载剂、赋形剂、或介质。适用之赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、及甲基纤维素。本组合物可额外包含润滑剂如滑石、硬脂酸镁、及矿物油；润湿剂；乳化剂及悬浮剂；防腐剂如甲基及丙基羟基苯甲酸酯；增甜剂；以及调味剂。在投予至病患后，本发明之组合物可提供活性成分快速、持续、或缓慢释放之效果。
依据本发明，该组合物之形式可为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、悬剂、乳液、溶液、糖浆、软与硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液、及包装粉剂。
本发明之组合物可经由任何生理上可接受途径输送，例如，口服、非口服(如肌内、静脉、皮下、及腹腔)、经皮、栓剂、及鼻内方法。关于非口服投予，较佳为使用无菌水溶液，其可包含其他物质，如足以使溶液与血液等张的盐类或葡萄糖。水溶液可视需求适当地经缓冲(较佳为具pH值3至9)。本领域之技术人员可由习知之标准药理学技术于无菌条件下制备适合的非口服组合物。
依据本发明，含有以人参皂苷M1作为活性成分的人参皂苷M1或组合物可用于治疗或预防罹患肾纤维化之个体。特定而言，含有以人参皂苷M1作为活性成分的人参皂苷M1或组合物可投予至罹患肾纤维化之个体或具有罹患肾纤维化风险之个体，以预防疾病发生或改善症状或推迟症状恶化。特定而言，人参皂苷M1可在发生肾纤维化时或之前投用，或在发生肾纤维化之后投用。
此外，依据本发明，含有以人参皂苷M1作为活性成分的人参皂苷M1或组合物可用于结合现有的疗法或药剂，如医药治疗，包括但不限于，皮质类固醇(如肾上腺皮质酮)、非类固醇消炎药物(NSAIDs)、细胞毒性药物(如环磷酰胺、氯芥苯丁酸、及硫唑嘌呤)、免疫抑制剂(如环孢素及霉酚酸酯)、及血管扩张剂(如血管紧张素转化酶抑制剂(ACE抑制剂)。在一具体实施例中，用于结合之药剂或疗法可同时(并行)或依序使用。当结合药剂使用时，可将药剂混入相同配方或分别使用不同配方，如个别的胶囊、丸剂、片剂、及注射剂。
本发明系进一步以下列实例说明，其目的旨在阐述而非局限。
实施例
1.材料及方法
1.1动物模型与实验方法
UUO(单侧输尿管阻塞(Unilateral ureteral obstruction，UUO)动物模型
雄性8周龄C57BL/6小鼠系购自实验动物繁殖及研究中心(中国台湾，台北)，且饲养于NDMC的动物中心(中国台湾，台北)。所有动物实验的进行皆获得中国台湾NDMC的IACUC的核准，且符合NIH实验动物照护及使用指南。
小鼠首先以戊巴比妥钠(50mg/kg，腹腔注射)麻醉。在小鼠左侧切开一开口，暴露出左侧输尿管，以6-0丝缝线捆绑于二个点上，并切断二个捆绑点之间的输尿管。最后，缝合围肠膜与皮肤。依照所有UUO程序的步骤，除了捆绑与切除输尿管的步骤之外，以进行假手术作为对照组(Xiao等人，腺苷A2A受体：在阻塞性肾病变中调节肾间质纤维化的目标，PLoSOne.2013Apr 9；8(4):e60173)。
简言之，所有小鼠均接受术前止痛(皮下注射50mg/kg丁基原啡因(Temgesic，Shering-Plough))，右侧输尿管随后在2.0％异氟醚诱导麻醉下，透过一个小的腹部切口以6.0丝捆绑。腹部以二层缝合关闭，且小鼠于28℃下于通风橱内进行术后恢复12小时。小鼠在术后7或14天进行牺牲(Pulskens等人，Nlrp3预防早期肾间质水肿以及在单侧输尿管阻塞中的血管通透性，PLoS One.2014Jan 15；9(1):e85775)。
1.2人参皂苷M1与投予
人参皂苷M1，即20-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，以下称为LCHK168)，系以本领域习知之方法制备，如中国台湾专利申请案第094116005号(I280982)及美国专利第7,932,057号所揭示者。LCHK168系溶解于3％cremophore中(Sigma-Aldrich公司)。在UUO手术前一天开始，以腹腔注射方式每天给予小鼠日剂量的LCHK168(30mg/kg)直到牺牲为止。
1.3肾组织病理学
石蜡包埋的肾脏组织进行切片，并使用标准程序以Masson氏三色染剂以及苏木精及伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色。针对组织病理学，该组织以10％缓冲的甲醛固定，并包埋于石蜡中，然后制备切片(厚度3μm)并以苏木精及伊红(H&E)染色。
所有的切片在固定后检视。半定量方法是根据肾小管间质上的发炎及纤维化的程度进行，随机选择20个视野进行评分。0表示正常形态学，1表示有影响的区域少于10％，2表示有影响的区域约10至30％，3表示有影响的区域约30至50％，以及4表示有影响的区域大于50％，
1.4免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)与细胞凋亡的侦测
针对IHC，甲醛固定且石蜡包埋的组织切片于4℃下以抗PCNA抗体(Santa Cruz生物科技公司，Santa Cruz，加州，美国)、CD3抗体(DAKO公司，Glostrup，丹麦)、α-SMA抗体(Thermo Fisher Scietific公司，Waltham，麻州，美国)、胶原蛋白第III型抗体、胶原蛋白第IV型抗体(两者皆来自SouthernBiotech公司，Birmingham，亚拉巴马州，美国)、F4/80抗体(单核细胞/巨噬细胞；Serotec公司，Raleigh，北卡罗讷州，美国)、磷酸化-NF-κB p65抗体(pNF-κB p65；Cell Signaling Technology公司，Beverly，麻州，美国)，稀释于DAKO抗体稀释缓冲液中(DAKO公司，Glostrup，丹麦)处理整夜，然后在室温下以在相同缓冲液的共轭连接辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的二级抗体(DAKO公司)或是抗-兔聚合物-HRP抗体(BioGenex公司，Fremont，加州，美国)处理1小时；然后加入DAB(BioGenex公司)。苏木精系用于复染细胞核。针对细胞凋亡的侦测，使用末端脱氧核苷酸转移酶-调节的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-endlabeling，TUNEL)。使用凋亡标记加上过氧化酶原位细胞凋亡侦测套组(ApopTag PlusPeroxidase In Situ Apoptosis detection kit，Chemicon公司，Temecula，加州，美国)根据制造商的指示对甲醛固定的组织切片染色。大量的α-SMA、胶原蛋白第III型、胶原蛋白第IV型，或磷酸化NF-κB p65+、PCNA+、F4/80+、CD3+以及细胞凋亡的细胞的数量，在随机选择的皮质区肾小管间质腔室的视野中(放大倍率400倍)，以Pax-It量化图像分析软件进行计数(Paxcam)。
1.5流式细胞仪
来自小鼠的脾细胞以Tris缓冲的氯化铵处理，以去除红血球，清洗后，再悬浮于补充有10％胎牛血清、Hepes缓冲液、L-麸酰胺酸，以及青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中(皆来自Invitrogen/Life Technologies公司，Grand Island，纽约州，美国)。接着细胞以T或B细胞的表面标记染色，使用FITC共轭结合的抗-小鼠CD3抗体(17A2)侦测T细胞，以抗小鼠CD19抗体(1D3)侦测B细胞，以及藻红蛋白-共轭结合的抗-小鼠CD69抗体(H1.2F3；所有抗体皆来自BD Biosciences公司)。针对骨髓细胞分析，来自小鼠的骨髓依照描述分离(Takeshita S等人，2014年)，且以抗小鼠Sca-1抗体(BD Biosciences公司)或CD34抗体(eBioscience公司，San Diego，加州，美国)染色。使用FACSCalibur仪器(BD Biosciences公司)进行流式细胞分析。
1.6梅生三色染色(Masson's Trichrome Staining)
将3μm的肾切片培养在75℃达15分钟。将玻片移转上方至二甲苯及梯度酒精。在苏木紫染色1分钟后，将媒染剂固定于玻片上。在以0.75％橘G溶液、梅生染色溶液B、2.5％磷钨酸溶液及苯胺蓝染色溶液染色之后，以1％醋酸清洗两次并以阿拉伯胶固定。风干数分钟，在光学显微镜上观察染色的切片。
1.7酵素免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)
藉由29G胰岛素注射针筒从肾大盏及肾盂收集尿液。在正常对照组，则由代谢笼收及尿液。依据制造商(eBioscience and R&D)的说明书，藉由ELISA侦测MCP-1、TNF-α及IL-1β。简言之，将捕获抗体涂布在96孔盘上经过隔夜。以PBST清洗后，将阻断缓冲液、样本、侦测抗体及亲合素-HRP依序加入。在TMB基质步骤后发展颜色，然后加入2N H2SO4停止反应。最后，测量O.D.450nm。
1.8统计分析
数值是平均值±SD。以Student’s t检定进行二组别间之比较。p值<0.05视为具有显着差异。
2.结果
2.1实验UUO模型的建立
实验系以8-10周龄的C57BL/6小鼠进行。小鼠随机分为假手术对照组、疾病对照组与LCHK168治疗组，且在UUO之后7或14天进行牺牲。在UUO肾脏的肾盂中观察到尿液滞留，显示UUO模型建立成功。参见图1A及图1B。
2.2肾组织病理学评估
收集肾组织、固定并且进行H&E染色。如图2所示，在UUO第7天，疾病对照组小鼠在间质区域显现出显着的单核白血球浸润及肾小管扩张，这些组织病理学特征在投予LCHK168后受到抑制。在UUO第14天，观察到纤维化与肾小管萎缩，这些在投予LCHK168之后也显着受到抑制。
2.3肾细胞凋亡与增殖的评估
在UUO肾脏中，尿液滞留而造成机械应力，而由肾细胞释放出细胞激素与ROS响应该应力，导致细胞的损伤，其导致细胞自我更新或凋亡反应。肾切片进行TUNNEL染色以分析凋亡的细胞，结果显示UUO肾间质区域的染色在投予LCHK168后下降。参见图3A。
以增殖的细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，进行肾切片免疫组织化学染色，其系一种不只针对肾小管上皮细胞增殖状态也针对活化的肌纤维母细胞与发炎细胞的标记，结果显示在UUO之后PCNA显现出显着地增加，特别是在扩张的肾小管中。然而，在投予LCHK168之后，PCNA的表现下降。这些结果显示，LCHK168可能减弱细胞凋亡与损伤。见图3B。
2.4纤维化表现评估
在UUO肾脏中，纤维化是一种对肾组织损伤的不良反应，且若阻塞持续存在，则将会发展为不可逆的肾功能不全。以梅生三色染色进行肾切片的组织化学染色显示，相较于假手术对照组，在UUO间质区域内纤维化组织显着地增加，而在投予LCHK168后减少。参见图4A。进一步对肾切片进行α-SMA、胶原蛋白第III型以及胶原蛋白第IV型的免疫组织化学染色分析，结果显示这些指针都在UUO间质区域中强烈地表现，且在投予LCHK168后表现下降。参见图4B-图4E。这些数据显示，LCHK168可能减缓肌纤维母细胞的活化以及在肾间质中的肾纤维化。
2.5NF-κB调节的发炎反应
2.5.1NF-κB在肾组织中的表现
NF-κB是一种针对其细胞激素与细胞黏附分子的刺激之发炎相关因子的调节所必需的核转录因子。先前的研究显示，在各种发炎性疾病中，包括肾脏疾病，NF-κB的表现水平提升。针对NF-κB的肾切片免疫组织化学染色显示NF-κB表现的增加，且在投予LCHK168后被抑制。参见图5。这数据显示，LCHK168可抑制在UUO肾脏内的NF-κB。
2.5.2单核白血球浸润
先前的研究显示，发炎细胞在UUO的发病机制中扮演重要的角色。单核白血球的浸润可在UUO的早期阶段中被观察到，特别是巨噬细胞与T淋巴细胞。随着阻塞的持续，活化的发炎细胞刺激肾小管上皮细胞或其他发炎细胞释放各种细胞激素与趋化激素，引致更多的发炎细胞聚集至肾间质区域，以及诱发的肾发炎与纤维化。单核白血球浸润的评估以肾切片的F4/80与CD3+免疫组织化学染色来进行，其为巨噬细胞与T细胞的标记。在UUO之后F4/80与CD3+的表现增加，且在投予LCHK168后减少。参见图6A、图6B。这些数据显示，LCHK168可预防肾间质的巨噬细胞与T细胞浸润。
2.5.3尿液中MCP-1、TNF-α及IL-1β的表现评估
在初始阶段，细胞激素及趋化激素集中释放在肾并可聚集免疫细胞。被聚集的免疫细胞接着释放越来越多的发炎因子。侦测肾盂中的MCP-1、TNF-α及IL-1β。UUO及UUO+LCHK组均表现较高的MCP-1、TNF-α及IL-1β，相较于第7天的正常对照组而言。虽然这些细胞激素及趋化激素在第14天，在UUO+LCHK组显着下降，相较于UUO组而言。图式显示LCHK168可显着降低尿液的MCP-1、TNF-α及IL-1β水平。
2.6细胞免疫力的活化与造血干细胞活化
2.6.1B与T淋巴细胞的活化
为了检验LCHK168是否透过抑制全身性细胞免疫力来预防局部发炎反应与纤维化，我们以流式细胞仪检验了在脾细胞中的B细胞与T细胞的活化。如图8A与图8B所示，在这三个族群中CD3+CD69+(活化的泛B细胞)与CD4+CD69+(活化的泛T细胞)的百分比皆无显着的改变。这些数据显示，由UUO造成的肾病变可能对全身性细胞免疫力的影响不大，且LCHK168可能并非透过抑制全身性细胞免疫力来预防局部发炎反应与纤维化。
2.6.2造血干细胞的活化
为了检验LCHK168是否透过抑制造血干细胞的活化而预防局部发炎反应与纤维化，我们以流式细胞仪检验了在骨髓细胞中的干细胞与造血干细胞的活化。如图9A与图9B所示，在这三个族群中，干细胞抗原-1-阳性细胞(造血干细胞)与CD34+(干细胞)的百分比皆无显着的改变。该获得的数据显示，由UUO造成的肾病变可能对造血干细胞活化的影响不大，且LCHK168可能并非透过抑制造血干细胞的活化来预防局部发炎反应与纤维化。
总而言之，我们的研究显示，人参皂苷M1在UUO模型中能有效预防肾纤维化的发展。特别是，研究结果显示人参皂苷M1(1)降低肾间质组织的细胞凋亡与肾小管损伤，(2)预防肾间质组织的纤维化与胶原蛋白沈积，(3)降低NF-κB的活化，(4)预防肾脏的巨噬细胞与T细胞浸润，以及(5)造血干细胞的正常功能与全身性细胞免疫力。所有的发现暗示了人参皂苷M1可以进一步被发展为治疗或预防肾纤维化的候选新药。
相信熟习本发明领域普通知识之技术人员可基于本文之阐述最大限度利用本发明，而毋须进一步说明。因此，应理解到，所提供之说明及主张仅用于示例之目的，而非以任何方式局限本发明之范畴。

Claims (9)

1.一种在有需要的个体抑制肾纤维化之方法，包括将治疗有效量之人参皂苷M1投用于该个体。
2.如权利要求1的方法，其中该个体是具有阻塞性肾病变的病患。
3.如权利要求1的方法，其中该药物是以能有效降低或缓解于该个体中的一或多种选自于由以下所组成之群组的症状或病况的量投用：单核白血球发炎、肾小管扩张、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞的增殖、纤维母细胞或肌纤维母细胞的活化，以及胶原蛋白的沈积。
4.如权利要求1的方法，其中该药物是以能有效降低或缓解于该个体的肾间质中的单核白血球发炎或纤维化的量投用。
5.如权利要求1的方法，其包括在投用人参皂苷M1之前诊断或鉴定该病患为具有阻塞性肾病变。
6.一种人参皂苷M1用于制造供抑制有需要的个体之肾纤维化之药物的用途。
7.如权利要求6的用途，其中该个体是具有阻塞性肾病变的病患。
8.如权利要求6的用途，其中该药物能有效降低或缓解于该个体中的一或多种选自于由以下所组成之群组的症状或病况：单核白血球发炎、肾小管扩张、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞的增殖、纤维母细胞或肌纤维母细胞的活化，以及胶原蛋白的沈积。
9.如权利要求6的用途，其中该药物可有效降低或缓解于该个体的肾间质中的单核白血球发炎或纤维化。
CN201580019639.7A 2014-05-16 2015-05-18 人参皂苷m1用于抑制肾纤维化之用途 Pending CN106795546A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461994486P 2014-05-16 2014-05-16
US61/994,486 2014-05-16
PCT/CN2015/079156 WO2015172746A1 (en) 2014-05-16 2015-05-18 Use of ginsenoside m1 for inhibiting renal fibrosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106795546A true CN106795546A (zh) 2017-05-31

Family

ID=54479353

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580019639.7A Pending CN106795546A (zh) 2014-05-16 2015-05-18 人参皂苷m1用于抑制肾纤维化之用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10357507B2 (zh)
EP (1) EP3146062B1 (zh)
JP (1) JP6626094B2 (zh)
KR (1) KR102360315B1 (zh)
CN (1) CN106795546A (zh)
DK (1) DK3146062T3 (zh)
ES (1) ES2739203T3 (zh)
TW (1) TWI670063B (zh)
WO (1) WO2015172746A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115297867A (zh) * 2020-02-20 2022-11-04 理筱龙 人参皂甙m1作为血管收缩素调节酶的调节剂及其在治疗包括冠状病毒引起的症状的疾病或病征的用途

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100381441B1 (ko) * 2000-06-14 2003-04-26 기장 메디칼 주식회사 약쑥과 약재혼합쑥을 이용한 경피흡수제와 그 제조방법 및사용방법
JP6619361B2 (ja) * 2014-11-03 2019-12-11 シャウ−ロン リー ＩｇＡ腎症を治療するためのジンセノサイドＭ１の使用
KR20210003715A (ko) * 2018-04-23 2021-01-12 시우-롱 리 헌팅턴병을 치료하기 위한 진세노사이드 m1의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006118364A1 (en) * 2005-05-02 2006-11-09 Sk Chemicals Co., Ltd. COSMETIC COMPOSITION CONTAINING (20S)-GINSENOSIDE Rg3 FOR PREVENTING AND IMPROVING SKIN WRINKLES

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050102326A1 (en) * 2003-10-22 2005-05-12 Nitzan Peleg Method and apparatus for performing conflict resolution in database logging
CN100402038C (zh) * 2004-03-09 2008-07-16 山东绿叶天然药物研究开发有限公司 人参皂苷c-k在制备治疗或预防肝纤维化的药物中的应用
WO2005102326A2 (en) * 2004-04-23 2005-11-03 Ab Science Use of c-kit inhibitors for treating renal diseases
PL3520815T3 (pl) * 2005-02-08 2022-04-11 Genzyme Corporation Przeciwciała przeciwko TGFBETA
US7932057B2 (en) * 2007-07-09 2011-04-26 Sheau-Long Lee Method for preparing 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol (ginsenoside M1) by using sanqi leaves and stems
TW200930388A (en) * 2008-01-10 2009-07-16 Shih-Ming Chen Pharmaceutical composition for treating cisplatin induced nephropathy
US8080568B1 (en) * 2010-06-29 2011-12-20 Ewha University - Industry Collaboration Foundation 2-pyridyl substituted imidazoles as therapeutic ALK5 and/or ALK4 inhibitors
CN102942610A (zh) * 2012-11-26 2013-02-27 吉林农业大学 人参皂苷m1正丁酸酯的制备及其抗糖尿病医药用途
TWI672143B (zh) * 2014-05-02 2019-09-21 理筱龍 人蔘皂苷ｍ１用於治療狼瘡性腎炎的用途
JP6619361B2 (ja) * 2014-11-03 2019-12-11 シャウ−ロン リー ＩｇＡ腎症を治療するためのジンセノサイドＭ１の使用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006118364A1 (en) * 2005-05-02 2006-11-09 Sk Chemicals Co., Ltd. COSMETIC COMPOSITION CONTAINING (20S)-GINSENOSIDE Rg3 FOR PREVENTING AND IMPROVING SKIN WRINKLES

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张伟云等: "人参皂苷代谢产物M1及其脂肪酸酯EM1抗肿瘤活性研究进展", 《人参研究》 *
王东等: "人参有效单体对活化的肾系膜细胞株的影响", 《四川中医》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115297867A (zh) * 2020-02-20 2022-11-04 理筱龙 人参皂甙m1作为血管收缩素调节酶的调节剂及其在治疗包括冠状病毒引起的症状的疾病或病征的用途

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170007426A (ko) 2017-01-18
ES2739203T3 (es) 2020-01-29
JP2017515904A (ja) 2017-06-15
TWI670063B (zh) 2019-09-01
US10357507B2 (en) 2019-07-23
DK3146062T3 (da) 2019-08-12
KR102360315B1 (ko) 2022-02-08
EP3146062B1 (en) 2019-05-08
JP6626094B2 (ja) 2019-12-25
EP3146062A1 (en) 2017-03-29
US20170087170A1 (en) 2017-03-30
TW201609111A (zh) 2016-03-16
WO2015172746A1 (en) 2015-11-19
EP3146062A4 (en) 2017-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Erianin alleviates diabetic retinopathy by reducing retinal inflammation initiated by microglial cells via inhibiting hyperglycemia-mediated ERK1/2–NF-κB signaling pathway
CN106795546A (zh) 人参皂苷m1用于抑制肾纤维化之用途
Shen et al. Anti-proliferation and anti-inflammation effects of corilagin in rheumatoid arthritis by downregulating NF-κB and MAPK signaling pathways
CN106573010B (zh) 人参皂苷m1用于治疗iga肾炎之用途
Zhen-Zhen et al. Bupleurum polysaccharides ameliorated renal injury in diabetic mice associated with suppression of HMGB1-TLR4 signaling
CN114306296A (zh) 双硫仑在制备治疗膜性肾病药物中的应用
CN106573009B (zh) 人参皂苷m1用于治疗狼疮性肾炎的用途
Liu et al. Chebulanin exerts its anti-inflammatory and anti-arthritic effects via inhibiting NF-κB and MAPK activation in collagen-induced arthritis mice
Jia et al. Strictosamide alleviates the inflammation in an acute ulcerative colitis (UC) model
Zhang et al. Protective effect of Pai-Nong-San against AOM/DSS-induced CAC in mice through inhibiting the Wnt signaling pathway
JP2023515084A (ja) アンジオテンシン調節酵素のモジュレーターとしてのジンセノサイドｍ１、およびコロナウイルスによって引き起こされる症状を含む疾患または病気の治療のためのその使用
TW201540297A (zh) 蛇床子素用於製備治療局部腎絲球硬化症之組合物的用途
Wu et al. Protective Effect of the Abelmoschus manihot Flower Extract on DSS‐Induced Ulcerative Colitis in Mice
CN109303921A (zh) Fxr激动剂与sirt1激动剂联用在制备抗肝纤维化药物中的应用
Tan et al. Sodium houttuyfonate against cardiac fibrosis attenuates isoproterenol-induced heart failure by binding to MMP2 and p38
CN115252631B (zh) 三七提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用
Wei et al. Qiguiyishen decoction reduced the accumulation of extracellular matrix in the kidneys of rats with adriamycin-induced nephropathy
Lin et al. Inhibition of soluble epoxide hydrolase relieves adipose inflammation via modulating M1/M2 macrophage polarization to alleviate airway inflammation and hyperresponsiveness in obese asthma
CN109512962A (zh) 一种用于器脏纤维化的中药组合物及其制备方法和应用
CN104547388A (zh) 治疗阿尔茨海默病的中药组合物、其制备方法和用途
CN109985180A (zh) 一种中药复方组合物在制备抗肝纤维化药物中的用途
EA018614B1 (ru) Фармацевтическая композиция для лечения гиперплазии предстательной железы, её применение для лечения гиперплазии предстательной железы и способ лечения гиперплазии предстательной железы
He et al. Isofraxidin attenuates dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis through inhibiting pyroptosis by upregulating Nrf2 and reducing reactive oxidative species
TWI818466B (zh) 用於治療砷誘發之肺功能損傷之類黃酮藥物
US20240148686A1 (en) Pharmaceutical composition of forskolin-isoforskolin and pentacyclic triterpenoid compound, and application thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200608

Address after: 32056, 8 / F, No.135, Section 1, Qingxi Road, Zhongli District, Taoyuan, Taiwan, China

Applicant after: Li Xiao Long

Address before: Taoyuan City, Taiwan, China

Applicant before: WELLHEAD BIOLOGICAL TECHNOLOGY Corp.

TA01 Transfer of patent application right