KR20060114774A - (20Ｓ)-진세노사이드 Ｒｇ3을 함유하는 주름 예방 및개선용 화장료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (20S)-진세노사이드 Rg₃을 함유하는 주름 예방 및 개선용 화장료에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 진세노사이드 Rg₃의 입체 이성질체인 (20S)-진세노사이드 Rg₃이 섬유아세포(Fibroblast) 증식 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과, 엘라스틴 합성 촉진 효과, 피부 면역증강 효과, 항산화 효과, 피부 상처치유 효과 등의 복합적인 주름예방 및 개선 효과가 탁월함을 확인함으로써 (20S)-진세노사이드 Rg₃을 함유하는 주름 예방 및 개선용 화장료에 관한 것이다.

인삼,(20S)-진세노사이드 Rg3, 입체이성질체, 주름 예방 및 개선, 화장료

Description

(20Ｓ)-진세노사이드 Ｒｇ3을 함유하는 주름 예방 및 개선용 화장료{Cosmetic composition containing (20S)-ginsenoside Rg3 for preventing and improving skin wrinkles}

도 1은 실시예 1의 (20S)-진세노사이드 Rg₃의 HPLC를 나타낸 것이다.

도 2는 인공 주름 유발 후의 무모생쥐 피부를 나타낸 사진이다.

도 3은 인공 주름에 2주간 레티놀 2500 IU/g으로 피부 도포한 후 주름 개선 효과를 나타낸 사진이다.

도 4는 인공 주름에 2주간 실시예 2의 시료 9를 0.01% 피부 도포한 후 주름 개선 효과를 나타낸 사진이다.

도 5는 인공 주름에 2주간 실시예 1을 0.01% 피부 도포한 후 주름 개선 효과를 나타낸 사진이다.

도 6은 무모생쥐의 피부에 2주간 음성대조군을 도포한 후 탄력섬유 개선 효과를 나타낸 사진이다[흑색(줄무늬):탄력섬유].

도 7은 무모생쥐의 피부에 2주간 레티놀 2500 IU/g을 도포한 후 탄력섬유 개선 효과를 나타낸 사진이다[흑색(줄무늬):탄력섬유].

도 8은 무모생쥐의 피부에 2주간 실시예 2의 시료 9를 도포한 후 탄력섬유 개선 효과를 나타낸 사진이다[흑색(줄무늬):탄력섬유].

도 9는 무모생쥐의 피부에 2주간 실시예 1을 도포한 후 탄력섬유 개선 효과를 나타낸 사진이다[흑색(줄무늬):탄력섬유].

도 10은 무모생쥐의 피부에 2주간 음성대조군을 도포한 후 교원섬유 개선 효과를 나타낸 사진이다[청색:교원섬유, 흑갈색:세포핵, 적색:세포질/근육/케라틴].

도 11은 무모생쥐의 피부에 2주간 레티놀 2500 IU/g을 도포한 후 교원섬유 개선 효과를 나타낸 사진이다[청색:교원섬유, 흑갈색:세포핵, 적색:세포질/근육/케라틴].

도 12는 무모생쥐의 피부에 2주간 실시예 2의 시료 9를 도포한 후 교원섬유 개선 효과를 나타낸 사진이다[청색:교원섬유, 흑갈색:세포핵, 적색:세포질/근육/케라틴].

도 12는 무모생쥐의 피부에 2주간 실시예 1을 도포한 후 교원섬유 개선 효과를 나타낸 사진이다[청색:교원섬유, 흑갈색:세포핵, 적색:세포질/근육/케라틴].

본 발명은 (20S)-진세노사이드 Rg₃을 함유하는 주름 예방 및 개선용 화장료 에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 진세노사이드 Rg₃의 입체 이성질체인 (20S)-진세노사이드 Rg₃이 섬유아세포(Fibroblast) 증식 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과, 엘라스틴 합성 촉진 효과, 피부 면역증강 효과, 항산화 효과, 피부 상처치유 효과 등의 복합적인 주름예방 및 개선 효과가 탁월함을 확인함으로써 (20S)-진세노사이드 Rg₃을 함유하는 주름 예방 및 개선용 화장료에 관한 것이다.

현재까지 사용되고 있는 주름예방 및 개선 화장료는 비타민 A(레티놀) 또는 레티닐 팔미테이트를 함유하는 제품이 대표적이라 할 수 있다. 그러나, 이들 원료를 함유한 제품은 경시변화에 민감할 뿐만 아니라 유효농도 이상으로 피부에 침투되거나 분해될 경우, 상당한 피부 자극이 수반된다. 따라서, 우수한 주름개선 효과 및 약물의 안정성, 피부안전성을 만족하는 새로운 원료의 개발이 절실한 실정이다.

인삼(Panax Ginseng)은 한의학뿐만 아니라 민간요법으로 널리 알려져 사용되어온 오가피(Araliaceae)과의 인삼(Panax)속의 한방약제로, 그 상태에 따라 수삼, 백삼 및 홍삼으로 분류된다. 수삼은 수확 후 건조되지 않은 인삼의 뿌리이며, 백삼은 수삼의 잔뿌리를 제거하고 껍질을 벗겨낸 다음, 햇볕에 말린 인삼의 뿌리이다. 홍삼은 인삼의 뿌리를 쪄서 말리는 방법에 의해 제조된다. 인삼의 사포닌은 부신에서 카테콜아민(Cartecholamine)의 분비를 촉진하고 지질의 과산화 과정을 저해함으로써 항산화 활성을 지니며 방사선에 대한 방어효과, 알킬화제에 의한 염색체이상 및 미세핵 방어효과, 배양세포에서 돌연변이 감소 및 세포변형 감소 효 과 등이 보고된 바 있다.

세계보건기구 보고에 의하면 이렇듯 인삼의 주요 유효성분은 사포닌 진세노사이드류로 수삼, 백삼 및 홍삼에 공통적으로 함유되어 있는 약효성분은 Ro, Ra₁, Ra₂, Ra₃, Rb₁, Rb₂, Rb₃, Rc, Rd, Re, Rf, Rg₁, Rg₂, Rg₃, Rh₁, 20glc-Rf, Q-R₁ 및 N-R₁ 등 18종이 알려져 있으며, 수삼과 백삼에만 함유되어 있는 약효성분으로는 말로닐(Malonyl)-Rb₁, Malonyl-Rb₂, Malonyl-Rc및 Malonyl-Rd 등 4종이 있고, 홍삼에만 함유되어 있는 약효성분은 Rs₁, Rs₂, Rg₃(S), Rh₂, N-R₄, Rg₂(R), Rh₁(R) 및 Rh₄의 8종이 공지되어 있다.

인삼 사포닌은 사포닌 아글리콘(Aglycon)의 구조에 따라서 파낙사디올계 진세노사이드(Panaxadiol-type Ginsenosides : Ra₁, Ra₂, Ra₃, Rb₁, Rb₂, Rb₃, Rc, Rd, Rg₃), 파낙사트리올계 진세노사이드(Panaxatriol-type Ginsenosides : Re, Rf, Rg_l, Rg₂), 올레아노르산류 진세노사이드(Oleanolic acid-type Ginsenosides) 등 세 가지로 분류될 수 있다. 인삼뿌리에서의 파낙사디올계 사포닌 함량은 48 ∼ 60%로 가장 많고 다음으로 파낙사트리올계 사포닌이 30 ∼ 35%를 차지하고 있고 올레아놀린산류 사포닌은 미량 함유되어 있다.

이러한 인삼의 증삼과정에서 생성된 마이너 진세노사이드의 일종인 Rg₃에 관한 약리학적 작용으로는 암세포전이 억제작용, 혈소판응집억제작용 및 항혈전작용, 혈관이완작용, 실험적 간상해 억제작용, 항암제의 내성억제작용 등 경구용 약리작용에 관한 특허가 있고, 피부학적으로 외용 도포 시 주름개선효과에 대해 밝혀진 사례가 없었다. 또한, 종래에는 인삼으로부터 진세노사이드 Rg₃을 추출, 분리하여 정제할 경우 유기용매를 활용하여 인삼으로부터 조사포닌을 추출하여 농축한 다음 조사포닌을 실리카겔 크로마토그래피로 분리하는 방법이나 분취용 액체크로마토그래피법으로 반복된 정제과정을 거쳐 분리하였다. 그러나, 인삼 유래 조사포닌 추출물을 농축하여 진세노사이드 Rg₃을 분리 정제할 경우 나타나는 문제점은 분자량이 거의 같고 이화학적 특성이 매우 유사한 진세노사이드 Rg그룹의 사포닌 성분들이 혼합물 상태로 함께 분리되어 최종적으로 정제할 때까지도 극미량으로 혼합 검출되어 고순도로 분리, 정제하는 데는 반복되는 정제과정으로 시간과 비용이 많이 소요되며 최종적으로 얻어지는 진세노사이드 Rg₃의 수율도 낮았다. 이와 같이 진세노사이드 Rg₃의 함량을 높이려면 유기용매 추출 후 산, 염기 가수분해법 및 당분해 효소를 활용한 생물전환공정을 적용한 추출방법은 추출단계가 복잡할 뿐만 아니라 잔류용매의 문제점이 있었다.

인삼을 출발물질로 가열, 증삼 처리하여 갈색화를 촉진시킴으로서 구조적으로 불안정한 진세노사이드 아글리콘 C-20위치에 결합되어 있는 배당체결합이 쉽게 가수분해 됨과 동시에 수산기가 반전평형을 일으켜 C-20(S)와 C-20(R)의 이성체가 생성된다. 따라서, 가열, 증삼처리된 인삼을 만듦으로서 마이너 진세노사이드 라 불리는 특이성분인 Rh₁, Rh₂, Rs₁, Rs₂, Rg₃, Rg₅ 등으로 변화하여 추출되는데 프로사포게닌인 진세노사이드 Rg₃이 수삼이나 백삼에 비해 50배 가량 월등히 많은 함유되어 있다.

본 출원인은 진세노사이드 Rg₃이 피부 개선에 효과가 있음을 확인하여 이 진세노사이드 Rg₃을 함유하는 화장료 조성물을 특허 출원한 바 있다[제2003-65882호]. 그러나, 진세노사이드 Rg₃의 구체적인 함량범위에 따른 주름개선효과와 S-Form 및 R-Form의 비율에 따라 개선효과의 차이가 있음을 확인함으로써 더 개선될 여지가 있었다.

이에, 본 발명자들은 주름개선효과를 보다 더 극대화하기 위해 진세노사이드Rg₃의 함량변화와 S-형 및 R-형에 따른 개선효과를 구체적인 실험을 통하여 연구한 결과, 진세노사이드 Rg₃의 함량이 일정한 범위내에 있으면서 입체이성질체 중 S-Form의 비율이 높을수록 섬유아세포(Fibroblast) 증식 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과, 엘라스틴 합성 촉진 효과, 피부 면역증강 효과, 항산화 효과, 피부 상처치유 효과 등이 달라짐을 알게 되었고, 특히 (20S)-진세노사이드 Rg₃의 함량이 40 ~ 80 중량%이면서 이 입체이성질체 비율이 100%에 근접할수록 섬유아세포(Fibroblast) 증식 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과, 엘라스틴 합성 촉진 효과, 피부 면역증강 효 과, 항산화 효과, 피부 상처치유 효과 등의 복합적인 주름 예방 및 개선 효과가 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 (20S)-진세노사이드 Rg₃을 함유한 주름 예방 및 개선용 화장료를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 (20S)-진세노사이드 Rg₃을 유효성분으로 함유하는 주름 예방 및 개선용 화장료를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 진세노사이드 Rg₃의 입체 이성질체인 (20S)-진세노사이드 Rg₃가 섬유아세포(Fibroblast) 증식 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과, 엘라스틴 합성 촉진 효과, 피부 면역증강 효과, 항산화 효과, 피부 상처치유 효과 등의 복합적인 주름예방 및 개선 효과가 탁월함을 확인함으로써 (20S)-진세노사이드 Rg₃를 함유하는 주름 예방 및 개선용 화장료에 관한 것이다.

산가수분해 추출법으로 얻어진 인삼 유래 진세노사이드 Rg₃은 자체의 함량 및 이성질체인 (20S)-진세노사이드 Rg₃과 (20R)-진세노사이드 Rg₃의 조성비에 따라 주름개선 효과가 다르게 나타난다.

이때, 진세노사이드 Rg₃은 최종 수득물에 대하여 실리카겔 칼럼 크로마토그 래피(클로로포름:메탄올:정제수=9:3:1)를 반복, 분리 정제하여 순도를 높일 수 있으며 RS 이성질체의 비율도 조절이 가능하다. 인삼 추출 분말 총량에 대하여 진세노사이드 Rg₃을 20 ~ 95 중량%로 함량 조절이 가능하다.

특히, (20S)-진세노사이드 Rg₃의 함량이 40 ~ 80 중량%이면서 이 입체이성질체 비율이 100%에 근접할수록 피부에 도포하면 섬유아세포(Fibroblast) 증식효과, 콜라겐(Collagen) 생합성 촉진효과, 엘라스틴(Elastin) 합성 촉진 효과, 피부 면역 증강효과, 항산화 효과, 피부 상처 치유 효과를 극대화 시킬수 있는 결과를 확인하였으며, 이로써 주름 예방 및 개선 화장료로 사용이 가능하다.

그래서, (20S)-진세노사이드 Rg₃ 함량은 인삼 추출분말 총량에 대하여 40 ~ 80 중량%가 바람직하고, 만일 40 중량% 미만이면 그 효과가 약해지고, 80 중량% 초과하면 오히려 효능이 감소할 뿐만 아니라 추출, 정제시의 경제성이 떨어지게 되므로 상업화시 고비용이 드는 문제가 발생한다.

한편, 본 발명에 따른 인삼 유래 진세노사이드 Rg₃을 피부에 도포하는 경우, 천연추출물인 관계로 다른 합성 단일원료에 비해 부작용의 염려가 적으며, 실제로 상기 추출물에 대한 피부 독성시험 결과, 생체에 아무런 영향이 없는 것으로 판명되었다.

따라서, 상기 인삼 유래 진세노사이드 Rg₃을 화장료에 적용 시 유연화장수, 수렴화장수, 로션, 에센스, 크림, 겔, 팩, 비누, 에센스시트, 하이드로겔 패치 또 는 마스크 등의 제형으로 가능하며, 상기 인삼 유래 진세노사이드 Rg₃은 전체 화장료 조성에 대하여 0.000001 ~ 20.0 중량% 배합하는 것이 바람직하다. 상기 조성이 0.000001 중량% 미만일 경우에는 효과가 나타나기 어렵고, 20 중량% 초과한 경우에는 적용량 대비 효능 상승효과가 떨어지며 제형이 불안정해져 제품을 만들 수 없는 단점이 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 산가수분해법에 의한 진세노사이드 Rg ₃ RS형의 제조와 분리

인삼 2 kg을 세절하여 생약 중량의 5 ~ 10배의 70% 메탄올을 가하여 60 ~ 80 ℃에서 5시간동안 환류추출한 뒤, 이 추출물을 50 ℃로 감압 농축하여 인삼 추출물 368 g을 얻었다. 이 추출물을 정제수 5리터에 녹여 순차적으로 노르말헥산 2리터로 3회 세척한 후 수층을 다시 n-부탄올 2리터를 사용하여 3회 추출하여 부탄올 분획 214 g을 얻었다. 이 부탄올 분획물을 메탄올 1리터에 가온하여 녹인 후 냉침하여 침전물을 제거한 다음, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올:정제수=9:3:1)하여 (20R)-진세노사이드 Rg₃과 (20S)-진세노사이드 Rg₃ 혼합물 1.2 g을 얻었다. 진세노사이드 Rg₃ 혼합물 1.2 g을 메탄올 24 ml에 가온하여 현탁시킨 뒤 냉각하여 침전물을 제거하고 여액을 감압농축하였다. 감압농축물 576 mg을 피리딘 20 ml에 녹여 빙냉하면서 초산무수물 20 ml를 가하여 상온에서 5시간 교반하였다. 반응생성물을 에틸아세테이트 100 ml로 분배하여 2회 추출하고 5% 염산 100 ml로 3회, 정제수로 3회 세척한 다음, 에틸아세테이트 분획을 감압농축하였다. 이 감압농축물 341 mg을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄:에틸아세테이트 = 8:2)하여 분리된 (20S)-진세노사이드 Rg₃ 퍼아세테이트(Peracetate) 238 mg을 5% 염산/메탄올(40 ml)에 녹이고 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액에 증류 100 ml를 가하고 35 ℃로 감압농축하여 메탄올을 제거한 후 부탄올 50 ml로 3회 분배추출하고 부탄올 분획을 감압농축하여 실리카겔 크로마토그래피(클로로포름:메탄올:정제수=9:3:1에서 4:3:1로 극성을 높혀줌)하여 50±1.0 %의 진세노사이드 Rg₃ 158 mg을 얻었다. 또한, 이것을 물에 대한 용해도(극성을 달리하여)에 따라 (20S)-진세노사이드 및 (20R)-진세노사이드 Rg₃으로 분리하였다.

상기 추출방법에 따라 조성된 진세노사이드 Rg₃이 입체 이성질체로 조성되어 있어 섬유아세포(Fibroblast) 증식 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과, 엘라스틴 합성 촉진 효과, 피부 면역증강 효과, 항산화 효과, 피부 상처치유 효과 등의 복합적인 주름예방 및 개선 효과가 탁월함을 확인하였다.

이때, 진세노사이드 Rg₃은 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올:정제수=9:3:1)를 반복, 분리 정제하여 순도를 높일 수 있으며 RS 이성체의 비율 도 조절이 가능하다.

실시예: 2 진세노사이드 Rg ₃ 함량 및 RS 이성질체의 비율 변화

상기 실시예 1의 최종 수득물을 실카겔 칼럼크로마토그래피(클로로포롬:메탄올:정제수=9:3:1에서4:3:1)로 단계적으로 극성을 올려주고 반복, 분리 정제하여 함량이 다른 진세노사이드 Rg₃ 및 조성비가 조절된 (20S)-진세노사이드 Rg₃ 및(20R)-진세노사이드 Rg₃을 수득하였다.

또한, (20S)-진세노사이드 Rg₃의 구조식을 화학식 1에, 실시예 1의 (20S)-진세노사이드 Rg₃의 HPLC 및 조성비를 도 1에 나타냈다.

[화학식 1]

진세노사이드 Rg₃ 함량 및 입체 이성질체의 비율

시료 번호	진세노사이드 Rg3 함량	S-Form : R-Form(중량비)
시료 1	20±1.0	0 : 10
시료 2	20±1.0	5 : 5
시료 3	20±1.0	10 : 0
시료 4	40±1.0	0 : 10
시료 5	40±1.0	5 : 5
시료 6	40±1.0	10 : 0
시료 7	60±1.0	0 : 10
시료 8	60±1.0	5 : 5
시료 9	60±1.0	10 : 0
시료 10	80±1.0	0 : 10
시료 11	80±1.0	5 : 5
시료 12	80±1.0	10 : 0
시료 13	95±1.0	0 : 10
시료 14	95±1.0	5 : 5
시료 15	95±1.0	10 : 0

* 액체크로마토그래피 분석조건

1) 칼럼 : J'sphere ODS-80H(250 × 4.6 mm I.D, S-4 ㎛,YMC)

2) 자외선흡광도 : 205 nm

3) 이 동 상(Gradient system)

시간(분)	A(Actonitril, %)	B(Water, %)
0	15	85
10	40	60
25	50	50
40	70	30
55	100	0
70	100	0

4) 유 량 : 1 ml/min

참고예 1: 독성시험

가) 정맥 내 투여 및 경구투여에 의한 단회투여 독성시험

5주령의 위스타계 수컷 랫트를 이용하여 정맥 내 투여 및 경구 투여에 의한 5주령의 위스타계 수컷 랫트를 이용하여 정맥 내 투여 및 경구 투여에 의한 단회 투여 독성시험을 실시하였다. 상기 실시예 1의 최종 수득물과 이를 반복 추출, 분리 정제하여 얻어진, 실시예 2의 시료 1 ~ 15에서 채취한 진세노사이드 Rg₃을 50 mg/kg, 100 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여 및 200 mg/kg의 용량으로 경구투여 후 14일 동안 관찰한 결과, 폐사되는 동물은 나타나지 않았으며, 기타 해부학적 소견에 있어서도 대조군과 비교하여 아무런 이상이 발견되지 않아 실시예에서 얻은 추출 분말은 매우 안전한 물질임이 확인되었다.

나) 경구투여에 의한 3개월 반복투여 독성시험

생후 5주 경과한 Sprague Dawley계 수컷 랫트를 이용하여 경구투여에 의한 3개월 반복투여 독성시험을 실시하였다. 상기 실시예 1 최종 수득물과 실시예 2의 시료 1 ~ 15를 100 mg/kg의 용량으로 3개월간 연일 경구 투여하여 매일 일반 상태를 관찰하고, 7일 간격으로 체중을 측정하였다.

투여기간 종료 시에 뇨의 정성적, 정량적 검사, 혈액학적 검사, 부검 및 장기중량 측정을 실시한 결과, 모든 관찰 항목 및 검사항목에 대해 실시예에서 얻은 추출 분말은 투여의 영향은 전혀 나타나지 않아 매우 안전성이 높은 물질임이 확인되었다.

참고예 2 : 피부 안전성 시험

가) 피부 1차 자극성 시험

뉴질랜드산 백색종 토끼를 이용하여 피부 1차 자극성 시험을 실시하였다. 토끼의 등부분 정중선 좌우를 각각 약 3 ×10 cm의 정방향으로 제모하고 각각을 전후로 구분하여 4개소의 시험부위를 설정하였다. 좌우 대각의 2부위에 18 Gauge 주사바늘로 출혈이 생기지 않을 정도로 #자 모양의 틀을 만들고 나머지 2부위는 건상부위로 두었다. 상기 실시예 1의 최종 수득물을 부틸렌글리콜에 녹여 20% 용액을 조제하고, 이 용액 0.5 ㎖를 2.5 × 2.5 cm Lint 2매에 스며들게 한 다음, 우측 2부위에 폐색 부착하고, 좌측 2 부위에는 부틸렌글리콜만을 2.5 × 2.5 cm의 Lint 2매에 스며들게 한 다음 좌측 2부위에 폐색 부착하고 24, 48 및 72시간 피부의 이상 유무를 관찰하였다.

시험 결과, 실시예 1의 추출 분말 엑기스를 도포한 건상부위 및 손상부위 모두 발적및 부종 등의 피부 이상반응은 일어나지 않았다.

나) 연속 피부 자극성 시험

체중 약 350 g의 Hartley계 기니피그(Guinea pig)를 이용하여 연속피부 자극성 시험을 실시하였다. 실시예 1의 추출 분말을 부틸렌글리콜에 녹여 5% 용액을 만들고 0.1 ㎖를 동물의 좌측 복부에 1일 1회, 4주간 연속(주 6회)개방 도포하였다. 도포부위의 발적 및 부종 등의 피부반응 유무를 매일 관찰하고, 2% 소듐 라우릴 설페이트 용액을 동일하게 도포한 양성 대조군과 비교하여 이를 근거로 실시예 1의 최종수득물의 피부 자극성을 평가하였다.

시험결과, 실시예 1의 최종수득물의 반복 도포에 의한 피부 자극성 반응은 관찰되지 않았다.

다) 인체패쇄 첩포시험(Human patch test)

일본 첩포시험 연구회의 기준에 따라, 폐쇄 첩포시험은 건강한 성인 남성 30명을 대상으로 실시예 1의 시료를 등부위에 48시간 폐쇄첩포한 다음 제거 2시간 후와 익일(72시간 후) 2회 판정하였다. 또한, 광 자극반응 판정법으로 광첩포 시험은 시료를 등부위에 24시간 부착하고 제거 2시간 후에 DERMARAY UV-A등(BLB 10등)을 20 cm 거리에서 7분간 조사하였다. 두드러기 반응 판정을 위해 시료를 등부위에 2시간 부착하고 제거 10분 후에 판정하였다.

시험결과, 실시예 1에서 얻은 추출 분말의 반복 도포에 의한 피부 자극 반응은 관찰되지 않았다.

이상의 시험결과, 본 발명에 따른 인삼 유래 진세노사이드 Rg₃을 함유한 실시예 1의 추출 분말은 피부 도포시 안전성이 매우 높은 물질로 확인되었다.

실험예 1: 섬유아세포(Fibroblast) 증식효과

인체 정상 섬유아세포를 96-웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰에 5000 cell/well이 되도록 분주하고 우태아 혈청이 함유된 DMDM(Dulbeccos Modified Eagles Media)배지에서 24시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 상기 실시예 1과 실시예 2의 시료 1 ∼ 15를 배양배지로 1/10씩 순차적으로 희석하여 첨가한 후 37 ℃에서 3일간 배양한 후, 0.2% MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 용액을 각 웰당 30 ㎕씩 첨가하고 4시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고, 각 웰당 100 ㎕의 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용액을 가하여 10분 동안 진탕시키고 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)를 이용하여 570 nm에서 상층액의 흡광도를 측정하였다. 이를 실시예 1과 실시예 2의 시료 1 ∼ 15를 함유한 실험군과 대조군의 흡광도를 비교한 후, 측정값을 다음 수학식 1에 대입하여 섬유아세포 증식효과를 산출하고, 그 결과를 다음 표 2에 나타내었다.

섬유아세포 증식효과 시험결과

구 분	적용농도(%)	세포증식효과(%)	구 분	적용농도(%)	세포증식효과(%)
실시예 1	1 ×10-5	22	실시예 2 시료 8	1 ×10-5	28
	1 ×10-3	69		1 ×10-3	69
	1 ×10-1	88		1 ×10-1	94
실시예 2 시료 1	1 ×10-5	15	실시예 2 시료 9	1 ×10-5	31
	1 ×10-3	24		1 ×10-3	71
	1 ×10-1	32		1 ×10-1	98
실시예 2 시료 2	1 ×10-5	18	실시예 2 시료 10	1 ×10-5	24
	1 ×10-3	27		1 ×10-3	61
	1 ×10-1	36		1 ×10-1	81
실시예 2 시료 3	1 ×10-5	19	실시예 2 시료 11	1 ×10-5	27
	1 ×10-3	32		1 ×10-3	64
	1 ×10-1	41		1 ×10-1	85
실시예 2 시료 4	1 ×10-5	20	실시예 2 시료 12	1 ×10-5	29
	1 ×10-3	39		1 ×10-3	66
	1 ×10-1	58		1 ×10-1	88
실시예 2 시료 5	1 ×10-5	21	실시예 2 시료 13	1 ×10-5	21
	1 ×10-3	43		1 ×10-3	44
	1 ×10-1	66		1 ×10-1	65
실시예 2 시료 6	1 ×10-5	24	실시예 2 시료 14	1 ×10-5	23
	1 ×10-3	48		1 ×10-3	51
	1 ×10-1	72		1 ×10-1	71
실시예 2 시료 7	1 ×10-5	25	실시예 2 시료 15	1 ×10-5	26
	1 ×10-3	66		1 ×10-3	59
	1 ×10-1	92		1 ×10-1	76

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 시료 미처리 음성대조군에 비하여 실시예 1, 실시예 2의 시료 9를 처리한 시료군의 섬유아세포 증식율은 최고 98% 정도로 독성이 없으면서 향상된 섬유아세포 증식효능을 나타냈다. 이는 인삼 유래 진세노사이드 Rg₃의 함량과 S-Form 입체이성질체의 조성비율이 100%에 근접할수록 보다 개선된 세포증식효과를 가지는데, 이는 (20S)-진세노사이드 Rg₃의 함량이 40 ~ 80 중량% 이면서 이 입체이성질체의 비율이 100%일 때 좋은 세포증식효과를 나타냈다. 또한, 진세노이드 Rg₃ 함량이 60 중량%이며서 S-Form의 비율이 100%에서 극대효능을 나타내었다.

실험예 2: 콜라겐(Collagen) 생합성 효과

인체 정상 섬유아세포를 세포배양용 96-웰 마이크로 플레이트에 분주하고 5% FBS(Fetal bovine serum)를 함유하는 배지에서 37 ℃, 5% CO₂ 가스 조건 하에서 24시간 동안 배양한 후 PBS(Phosphate buffer saline)로 1회 세척하였다. 배양된 섬유아세포와 1% FBS를 함유하는 배지에 상기 실시예 1과 실시예 2에서 세포증식효과가 좋았던 시료 9와 동일 함량의 시료 7, 8과 동일 조성비로 함량이 다른 시료 3, 6, 12, 15를 1, 5, 10 μM이 되도록 처리한 후 L[2,3,4,5-H]플로린 5 μCi, 아스콜빈산 30 ㎍/㎖를 첨가하고 37 ℃, 5% CO₂ 가스 조건 하에서 24시간 배양한 후 상기 세포 및 배양액을 각각 1/2로 나누어 한쪽 분획에만 타입1 콜라게나제(Type 1 Collagenase)를 처리한 후 5% TCA(Trichloroacetic acid) 용액에 넣어 단백질을 침전시켜 두 분획의 방사활성의 차이로부터 생성된 콜라겐의 양을 측정하였다. 각 시료의 콜라겐 생합성 효과는 시료를 첨가하지 않은 음성대조군과 비교하여 실험군에 대한 콜라겐 생합성 값(RCB, Relative Collagen Biosynthesis)으로 환산하여 증가율을 표시하며, 또한 실시예 1과 실시예 2의 시료 대신 양성대조군으로 비타민 A(레티놀)를 사용하여 동일 방법으로 시험하였으며, 그 결과를 다음 표 3에 나타내었다.

구분	시료농도(μM)	콜라겐 합성 증가율(%)
시료미처리	-	-
실시예 1	1.0	34
	5.0	61
	10.0	84
실시예 2 시료 3	1.0	22
	5.0	29
	10.0	48
실시예 2 시료 6	1.0	26
	5.0	44
	10.0	63
실시예 2 시료 7	1.0	38
	5.0	64
	10.0	86
실시예 2 시료 8	1.0	41
	5.0	69
	10.0	91
실시예 2 시료 9	1.0	48
	5.0	72
	10.0	97
실시예 2 시료 12	1.0	35
	5.0	59
	10.0	81
실시예 2 시료 15	1.0	32
	5.0	51
	10.0	62
비타민 A	1.0	27
	5.0	42
	10.0	58

상기 실시예 1과 실시예 2의 시료 6, 9, 12 및 15에서 알 수 있듯이, 진세노사이드 Rg₃ 함량이 40 ~ 80 중량% 부근에서 S-Form의 이성질체 조성비가 100%에 근접할수록 시료 처리군이 비타민 A 시료군에 비하여 높은 콜라겐 생합성 촉진효능을 나타내었다.

실험예 3: 엘라스틴(Elastin) 합성 효과

인체 정상 섬유아세포를 96-웰 마이크로 플레이트에서 24시간 배양한 후 시료를 1 ∼ 10 μM으로 처리하여 2일간 배양하고 섬유아세포가 새롭게 합성 분비한 엘라스틴의 양을 엘라스틴 키트(Fastin elastin assay kit)를 이용하여 측정하고 엘라스틴 양을 세포수 또는 단백질량으로 보정하여, 그 결과를 다음 표 4에 나타내었다.

엘라스틴 증식효능

구 분	시료농도(μM)	엘라스틴 합성 증가율(%)
시료미처리	-	-
실시예 1	1.0	48
	5.0	69
	10.0	83
실시예 2 시료 3	1.0	31
	5.0	48
	10.0	64
실시예 2 시료 6	1.0	34
	5.0	52
	10.0	74
실시예 2 시료 9	1.0	50
	5.0	81
	10.0	96
실시예 2 시료 12	1.0	43
	5.0	61
	10.0	78
실시예 2 시료 15	1.0	36
	5.0	51
	10.0	69

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2의 시료의 콜라겐 합성촉진 효과와 유사한 효과를 나타냈음을 알 수 있어 진세노사이드 Rg₃ 함량 및 RS 이성질체의 비율에 따라 효과가 달라짐을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 피부면역 증강효과

8주령의 화이트 마우스를 대상으로 복부를 면도한 다음 Sun Lamp를 이용하여 자외선(UVB) 파장을 2.5 KJ/m²로 조사하면 접촉성 과민반응(Contact hypersensitivity)으로 인해 면역억제현상을 나타내게 된다. 여기에 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 시료 6, 9, 12의 추출 분말 엑기스를 70% 에탄올에 용해시켜 UV 조사 후 도포하고 3일이 경과한 후 UV 조사한 부위에 3% 트리니트로클로로벤젠(Trinitrochlorobenzene)으로 감작시켰다. 5일 후 1%의 트리니트로클로로 벤젠을 화이트 마우스의 복부에 도포하고 부종상태를 측정하였다. 피부 면역효과는 다음 수학식 2에 의해 계산하였으며, 그 결과를 다음 표 5에 나타내었다.

구분	UVB 조사 (KJ/m2)	적용농도 (㎍/㎖)	귀부종 두께 (×0.01 mm)	피부면역효과(%)
시료미처리	-	-	30.6	-
시료미처리	2.5	-	14.6	2.4
실시예 1	2.5	10	26.4	73.8
		50	35.4	130.0
		100	40.6	162.5
실시예 2 시료 6	2.5	10	22.8	51.3
		50	28.2	85.0
		100	36.3	135.6
실시예 2 시료 9	2.5	10	28.6	87.5
		50	35.8	132.5
		100	42.7	175.6
실시예 2 시료 12	2.5	10	23.6	56.3
		50	33.2	116.3
		100	38.1	146.9

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2의 시료 6, 9, 12처럼 진세노사이드 Rg₃의 함량비에 따라 피부면역 증가효과에 매우 큰 차이를 주며 실시예 2의 시료 9에서 최대효과가 있음을 확인할 수 있다.

실험예 5 : 항산화 효과 시험

상기 실시예 1 및 실시예 2의 시료 6, 9, 12의 시료에 대하여 생체효소 리폭시게나제(Lipoxygenase)에 의해 유발되는 지질과산화에 대한 저해율을 측정하고 양성대조군으로 항산화제로 널리 알려진 비타민 C가 사용되었다.

50 mM의 소듐-포스페이트 완충용액(pH 6.8) 12 ㎖를 시험관에 넣고 여기에 50 mM 소듐-포스페이트 완충용액에 용해된 0.1%(v/v) 시료용액 0.1 ㎖와 6.6 mM 아라키돈산[시그마] 0.1 ㎖를 첨가하였다. 각 시험관에 50 mM 소듐-포스페이트 완충용액에 용해된 리폭시게나제[시그마] 효소 0.1 ㎖를 넣고 25 ℃ 항온조에서 10분간 반응시켰다(각 반응용액에 첨가된 시료의 최종농도는 50 ㎍/㎖임). 이때 음성대조군에는 시료용액 대신 50 mM 소듐-포스페이트 완충용액 0.1 ㎖를 가하였다. 반응이 끝난 후 20%(v/v) 트리클로로아세트산 용액 1 ㎖와 0.67%(v/v) 티오바비투르산(Thiobarbituric acid)용액 2 ㎖를 가하고 끓는 물에서 10분간 중탕하고 중탕이 끝나면 상온까지 식혀 원심분리(1800 rpm, 3분)하고 상층액만을 취하여 광전분석계로 파장 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 항산화 효과(지질 과산화 저해율)를 다음 수학식 3으로 계산하고, 그 결과를 다음 표 6에 나타내었다.

항산화 효과 시험결과

구분	지질과산화 저해율(%)
비타민 C	66.7
실시예 1	69.2
실시예 2의 시료 6	66.3
실시예 2의 시료 9	71.0
실시예 2의 시료 12	67.5

상기 표 6에서 보는 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2의 시료 6, 9, 12가 양성대조군인 비타민 C 보다 지질과산화 억제율이 높아 우수한 피부노화 방지능력을 가지고 있음을 보여준다.

처방예 1 ∼ 4 : 화장수의 제조

본 발명의 추출물을 함유한 화장료 중 화장수의 처방예 1 ∼ 4는 다음 표 7과 같다.

번호	원료명	처방예 1	처방예 2	처방예 3	처방예 4
1	정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
2	1,3-부틸렌글리콜	4.0	4.0	4.0	4.0
3	디소듐 이디티에이	0.1	0.1	0.1	0.1
4	피이지-피피지 18/4 코폴리머	1.0	1.0	1.0	1.0
5	디-판테놀	0.1	0.1	0.1	0.1
6	메틸파라벤	0.2	0.2	0.2	0.2
7	에탄올	8.0	8.0	8.0	8.0
8	향	적량	적량	적량	적량
9	피피지-26-부테스-26/피이지-40 경화피마자유	0.5	0.5	0.5	0.5
10	에탄올	4.0	4.0	4.0	4.0
11	실시예 1	0.01	-	-	-
12	실시예 2의 시료 6	-	0.01	-	-
13	실시예 2의 시료 9	-	-	0.01	-
14	실시예 2의 시료 12	-	-	-	0.01

<제조방법>

1) 번호 2, 3, 4의 원료를 칭량한 후 번호 1의 정제수를 첨가하여 실온에서 교반하여 용해하였다.

2) 번호 5, 6, 7, 8, 9의 원료를 칭량한 후 교반용해하고 상기 1)에 첨가하였다.

3) 번호 10과 실시예에서 얻은 시료를 첨가하여 용해한 후 상기 1)에 넣고 적절하게 교반하고 여과하여 화장수를 제조하였다.

처방예 5 ∼ 7: 로션의 제조

본 발명의 추출물을 함유한 화장료 중 로션의 처방예 5 ∼ 7은 다음 표 8과 같다.

번호	원료명	처방예 5	처방예 6	처방예 7
1	쉐버터	0.5	0.5	0.5
2	세틸알코올	2.0	2.0	2.0
3	글리세릴모노스테아레이트	1.0	1.0	1.0
4	부틸메톡시디벤조일메탄	1.0	1.0	1.0
5	피이지-2 올리에이트	0.5	0.5	0.5
6	폴리소르베이트 60	1.5	1.5	1.5
7	마카다미아 오일	2.0	2.0	2.0
8	스쿠알란	5.0	5.0	5.0
9	디메치콘	0.3	0.3	0.3
10	사이크로메치콘	2.0	2.0	2.0
11	프로필파라벤	0.1	0.1	0.1
12	에틸헥실메톡시신나메이트	1.0	1.0	1.0
13	정제수	잔량	잔량	잔량
14	디-판테놀	0.05	0.05	0.05
15	메틸파라벤	0.2	0.2	0.2
16	디소듐 이디티에이	0.05	0.05	0.05
17	1,3-부틸렌글리콜	8.0	8.0	8.0
18	트리에탄올아민	0.1	0.1	0.1
19	산탄검	0.05	0.05	0.05
20	카보머	0.1	0.1	0.1
21	향	적량	적량	적량
22	에탄올	적량	적량	적량
23	실시예 1의 분말 엑기스	0.01	-	-
24	실시예 2의 시료 6	-	0.01	-
25	실시예 2의 시료 9	-	-	0.01

<제조방법>

1) 번호 1 ∼ 12의 원료를 칭량하여 유상가온탱크에 넣고 75 ℃에서 교반 용해하였다.

2) 번호 13 ∼ 18의 원료를 칭량하여 수상탱크에 넣고 75 ℃에서 교반 용해하였다.

3) 상기 2)를 진공감압 하에 유화탱크로 이송하고 이어서 상기 1)을 이송하여 3500 rpm으로 5분간 유화하였다.

4) 번호 19 ∼ 20의 원료를 칭량하여 1% 솔루션 용액으로 만든 후 진공감압 하에 유화탱크에 주입하여 2500 rpm으로 균질 혼합하고, 진공, 탈포하면서 페달믹서를 25 rpm으로 교반, 55 ℃로 냉각하였다.

5) 실시예의 원료를 칭량하여 실온에서 에탄올에 용해하고 이어서 향을 칭량하여 각각 유화탱크에 넣고 균질분산, 냉각한 후 30 ℃에서 작업 종료하여 로션을 제조하였다.

처방예 8 ∼ 10 및 비교처방예 1: 크림의 제조

본 발명의 추출물을 함유한 화장료 중 크림의 처방예 8 ∼ 10과 시료를 첨가하지 않은 비교처방예 1은 다음 표 9와 같다.

번호	원료명	처방예 8	처방예 9	처방예 10	비교처방예 1
1	망고버터	1.0	1.0	1.0	1.0
2	세틸알코올	2.0	2.0	2.0	2.0
3	글리세릴스테아레이트/피이지 100 글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5
4	부틸메톡시디벤조일메탄	1.0	1.0	1.0	1.0
5	스테아릴알코올/스테아릴글루코사이드	1.0	1.0	1.0	1.0
6	하이드로게네이티드 레시틴/C12-16 알코올/팔미틴산	1.5	1.5	1.5	1.5
7	마카다미아 오일	2.0	2.0	2.0	2.0
8	스쿠알란	6.0	6.0	6.0	6.0
9	디메치콘	0.3	0.3	0.3	0.3
10	사이크로메치콘	2.0	2.0	2.0	2.0
11	프로필파라벤	0.1	0.1	0.1	0.1
12	에틸헥실메톡시신나메이트	1.0	1.0	1.0	1.0
13	정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
14	디-판테놀	0.05	0.05	0.05	0.05
15	메틸파라벤	0.2	0.2	0.2	0.2
16	디소듐 이디티에이	0.05	0.05	0.05	0.05
17	1,3-부틸렌글리콜	8.0	8.0	8.0	8.0
18	트리에탄올아민	0.1	0.1	0.1	0.1
19	메틸셀룰로오스	0.05	0.05	0.05	0.05
20	카보머	0.1	0.1	0.1	0.1
21	향	적량	적량	적량	적량
22	에탄올	적량	적량	적량	적량
23	실시예 1	0.01	-	-	-
24	실시예 2의 시료 6	-	0.01	-	-
25	실시예 2의 시료 9	-	-	0.01	-

<제조방법>

1) 번호 1 ∼ 12의 원료를 칭량하여 유상가온탱크에 넣고 75 ℃에서 교반 용해하였다.

2) 번호 13 ∼ 18의 원료를 칭량하여 수상탱크에 넣고 75 ℃에서 교반 용해하였다.

3) 상기 2)를 진공감압 하에 유화탱크로 이송하고, 이어서 상기 1)을 이송하여 3500 RPM으로 5분간 유화하였다.

4) 번호 19 ∼ 20의 원료를 칭량하여 1% 솔루션 용액으로 만든 후, 진공, 감압하에 유화탱크에 주입하여 2500 RPM으로 균질 혼합하고, 진공, 탈포하면서 페달믹서를 25 RPM으로 교반, 55 ℃로 냉각하였다.

5) 실시예의 원료를 칭량하여 실온에서 에탄올로 용해하고 이어서 향을 칭량하여 각각 유화탱크에 넣고 균질분산, 냉각한 후 30 ℃에서 작업 종료하여 크림을 만든다.

처방예 11 ∼ 13 : 하이드로겔 패치의 제조

본 발명의 추출물을 함유한 화장료 중 하이드로겔 패치의 처방예 11 ∼ 13은 다음 표 10과 같다.

번호	원료명	처방예 11	처방예 12	처방예 13
1	정제수	잔량	잔량	잔량
2	글리세린	15.0	15.0	15.0
3	알긴산나트륨	0.5	0.5	0.5
4	아크릴레이트/아크릴아마이드 코폴리머	1.5	1.5	1.5
5	콘스타치	0.5	0.5	0.5
6	폴리아크릴산	2.0	2.0	2.0
7	에탄올	1.0	1.0	1.0
8	디-판테놀	0.1	0.1	0.1
9	메틸파라벤	0.2	0.2	0.2
10	디소듐 이디티에이	0.05	0.05	0.05
11	알루미늄하이드록사이드	0.1	0.1	0.1
12	타르타르산	0.2	0.2	0.2
13	솔비탄올리에이트	0.2	0.2	0.2
14	1,3-부틸렌글리콜	5.0	5.0	5.0
15	향	적량	적량	적량
16	에탄올	적량	적량	적량
17	실시예 1	0.01	-	-
18	실시예 2의 시료 6	-	0.01	-
19	실시예 2의 시료 9	-	-	0.01

<제조방법>

1) 번호 1 ∼ 6의 원료를 칭량하여 용해탱크에 넣고 실온에서 균질, 교반하여 점성액을 만들고, 번호 7 ∼ 9의 원료를 실온에서 별도로 용해하여 용해탱크에 주입한 후 균질, 교반하였다.

2) 번호 10 ∼ 14의 원료를 60 ℃로 가온, 용해한 후 여기에　15 ∼ 16의　원료　혼합하여　용해탱크에 소량씩 주입하여 겔을 만들었다.

3) 상기 처방으로 구성된 하이드로겔을 어플리케이터 갭을 가진 피복기계를 사용하여 하이드로겔 조성물을 실리콘화된 폴리에스테르 이형 필름 상에 가로 1m ×세로 1 m 면적에 700 g/m²으로 균질 피복하여 비공극성 폴리에틸렌 부직포로 적층하였다. 최종적으로 다층의 적층체 크기를 눈밑 및 얼굴전체에 부착할 수 있는 모양으로 이중 절단하여 종이, 저밀도 폴리에틸렌, 알루미늄 등 3겹으로 구성된 파우치 적층필름에 넣어 포장하였다.

실험예 6: 스쿠알렌-OOH법에 의한 무모 생쥐의 인공주름 유발시험

자외선 조사기에서 조광량(UVA, 30J/m²/sec)을 최대로 하여 1리터의 스쿠알렌을 4주간 조사하여 UV 조사된 스쿠알렌에 메탄올 1리터를 동량을 합하여 Shaker에서 2000 rpm으로 2시간동안 혼합하였다. 분리된 상층액만을 취하여 원심분리기에서 3분간 2000 rpm으로 분리한 후 상층액만 채취하여 스쿠알렌-OOH를 만들었다. 산화된 스쿠알렌과 에탄올을 1 : 3의 비율로 희석한 후 이 인공주름 유발물질을 1일 2회 일정한 간격으로 100 ㎕씩 8주령된 무모 생쥐의 피부에 도포하면서 6주간 반복하여 인공주름을 유발시켰다. 이것을 레프리카로 만들어 도 2에 2주간 시료처치 후의 인공주름 개선효과를 도 3 ∼ 5에 나타냈다.

실험예 7 : 베르회프 염색(Verhoeff Stain)법에 의한 탄력섬유 합성 촉진효과

본 실험예는 탄력섬유(Elastin) 염색법에 의해 무모 생쥐의 인공주름 유발 후 시료를 처지하였을 때 개선효과를 보기 위한 실험이다. 실험예 6에서 인공주름이 유발된 무모 생쥐를 80마리의 피부에 10마리씩 8개군으로 나눈 다음, 7개의 실험군에 실시예 1, 실시예 2의 시료 3, 6, 9, 12, 15 시료를 0.01% 및 양성대조군으로 레티놀(2500 IU/g)의 시료를 50% 에탄올 수용액에 녹이고 다른 1개의 실험군에는 음성대조군으로 50% 에탄올 수용액을 2주간 도포하여 적출한 무모 생쥐의 피부조직을 베르회프 염색법으로 탄력섬유개선 효과를 비교하였으며, 음성대조군인 도 6을 기준으로 도포 후의 개선 효과를 도 7 ~ 9에 나타내었다. 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 시료 9가 양성대조군인 레티놀 보다 탄력섬유 합성 촉진 효과가가 우수함을 보여주었다.

실험예 8 : 마송 삼색염색(Masson trichrome Stain)법에 의한 콜라겐 합성 촉진 효과

본 실험예는 교원섬유(Collagen) 염색법에 의해 무모 생쥐의 인공주름 유발 후 시료를 처지하였을 때 개선효과를 보기 위한 실험이다. 실험예 6에서 인공주름이 유발된 무모 생쥐를 실험예 7과 같은 실험군에서 적출한 피부조직으로 10마리씩 8개군으로 나눈 다음, 7개의 실험군에 실시예 1, 실시예 2의 시료 3, 6, 9, 12, 15 시료를 0.01% 및 양성대조군으로 레티놀(2500 IU/g)의 시료를 50% 에탄올 수용액에 녹이고 다른 1개의 실험군에는 음성대조군으로 50% 에탄올 수용액을 2주간 도포하여 적출한 무모 생쥐의 피부조직을 마송 삼색염색법으로 처리하여 음성대조군인 도 10을 기준으로 교원섬유개선 효과를 도 11 ~ 13에 나타내었다. 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 시료 9가 양성대조군인 레티놀 보다 교원섬유 개선 효과가 우수함을 보여주었다.

실험예 9: 랫트를 이용한 피부 상처 치유 효과

8주령의 위스타계 수컷 랫트를 이용하여 동물의 등을 제모하고 흡입 마취하에서 메스로 등부위를 절개하고 다시 봉합하였다. 상기 실시예의 진세노사이드 Rg₃ 함량이 다른 시료를 각각 0.01% 함유한 처방예 8, 9, 10의 크림과 0.1% 센탈라아시아티카를 함유한 크림, 비교처방예 1의 크림을 매일 1회 절개부위에 0.5 g씩 6일간 도포하였다. 6일 후 실험에 이용한 랫트를 흡입마취 하에 안락사시키고, 상처부위의 피부를 적출하여 절창선에서 폭 1 cm의 피부편을 개체당 3개의 표본씩 만들고 레오메타로 파열장력을 측정하여 평균값을 구하였다.

측정된 장력강도(g/cm)를 비교처방예 1의 크림만을 도포한 대조군의 장력강도를 기준으로 상대평가하고, 그 결과를 다음 표 11에 나타냈다.

구분	장력강도(g/cm)	증가율(%)
비교처방예 1	519	-
0.1% 센탈라아시아티카 함유 크림	646	24.6
처방예 8	678	30.4
처방예 9	674	29.6
처방예 10	691	32.9

상기 표 11의 결과로부터 본 발명의 추출물을 함유한 크림이 센탈라아시아티카를 함유한 양성대조군 크림 보다 상처치유 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 10 : 인체 피부 주름 개선 효과

처방예 8, 9, 10의 크림과 비교처방예 1의 크림을 건강한 30 ∼ 45세의 여성 60명을 대상으로 주름 개선 효과를 비교 실험하였다. 상기 4가지의 크림을 각각 15명의 피검자의 눈 밑부위에 1일 2회(아침과 취침 전), 8주간 사용하도록 한 후, 시제품을 사용하기 전과 사용 후 8주 후에 주름의 개선 정도를 피험자의 설문[표 15] 및 영상분석을 통해 평가하였다. 피험자 설문은 시제품 및 대조품 사용전과 비교하여 개선 없음, 약간 개선, 중간 개선, 매우 개선의 4단계로 구분, 판정하였으며, 영상분석을 통한 평가는 실험 시작 전과 실험종료 후 항온ㆍ항습실(22 ℃, 상대습도 50%)에서 충분한 피부안정화 후에 눈가피부의 레플리카(Replica)를 제작하여 화상분석기기(Image analyzer system)를 이용한 면적의 측정방법으로 주름의 상대적인 변화를 측정하였다.

구분	개선 없음	약간 개선	중간 개선	매우 개선
비교처방예 1	13 명	2 명	0 명	0 명
처방예 8	2 명	4 명	7 명	2 명
처방예 9	3 명	6 명	4 명	2 명
처방예 10	0 명	4 명	8 명	3 명

상기 표 12에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 처방예들을 사용할 경우, 주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있다. 특히, 비교처방예 1의 크림에 비하여 처방예 크림에서 피험자의 70% 이상이 인지 가능한 정도의 주름 개선 효과를 나타났다고 답하고 있다.

구분	측정부위	주름깊이(㎛)		감소율(%)
		사용 전	사용 후
비교처방예 1	눈 주위	0.197	0.189	5.03
처방예 8		0.196	0.129	34.18
처방예 9		0.194	0.133	30.93
처방예 10		0.198	0.116	41.72

또한, 상기 표 13에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 추출물을 함유한 처방예의 크림을 사용할 경우, 주름의 밀도가 사용 전에 비해 30% 이상 크게 감소하는 것을 알 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 인삼 유래 진세노사이드 Rg₃은 함량변화 및 입체이성질체의 조성비 따라 피부주름 개선 효과가 다르게 나타났으며, 특히 (20S)-진세노사이드Rg₃의 함량이 40 ~ 80 중량%이면서 이 입체이성질체의 조성비가 100%에 근접할수록 섬유아세포(Fibroblast) 증식효과, 콜라겐 생합성 촉진효과, 엘라스틴 합성 촉진효과, 피부면역 증강효과, 항산화 효과, 피부상처 치유효과 등의 복합적인 주름 개선효과가 뛰어나 화장료로 적용 가능하다.

Claims (5)

1. (20S)-진세노사이드 Rg₃을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 예방 및 개선용 화장료.
2. 제 1 항에 있어서, (20S)-진세노사이드 Rg₃은 인삼 추출분말에 대하여 40 ~ 80 중량%인 것을 특징으로 하는 주름 예방 및 개선용 화장료.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 (20S)-진세노사이드 Rg₃ 외에 (20R)-진세노사이드 Rg₃를 첨가하되, (20S)-진세노사이드 Rg₃와 (20R)-진세노사이드 Rg₃은 10 : 0 ~ 5 : 5 중량비로 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 주름 예방 및 개선용 화장료.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 (20S)-진세노사이드 Rg₃은 인삼으로부터 산가수분해로 분리된 것을 특징으로 하는 주름 예방 및 개선용 화장료.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 (20S)-진세노사이드 Rg₃은 전체 화장료 중에 0.000001 ∼ 20 중량% 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 주름 예방 및 개선용 화장료.

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