KR20090109789A

KR20090109789A - 나노리포좀으로 안정화된 산삼 추출물을 함유하는 화장료조성물

Info

Publication number: KR20090109789A
Application number: KR1020080035200A
Authority: KR
Inventors: 김선택; 허현주; 한충섭
Original assignee: 장수산삼 영농조합법인
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2008-04-16
Publication date: 2009-10-21
Also published as: KR100992042B1

Abstract

본 발명은 산삼을 압력 500∼3000MPa, 온도 40∼90℃에서 5∼60분간 처리한 후, 추출한 산삼 추출물에 나노리포좀을 혼합하여 안정화된 산삼 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성을 막아주는 티로시나제 활성 억제효과, 멜라닌 합성 억제효과 등의 미백효과와 자유라디칼 소거 효과, 콜라게나제(MMP-1)의 활성 및 발현억제 등의 주름개선효과가 우수하고, 온도 변화에 대해 변색과 분리 및 침전이 발생하지 않는 우수한 안정성을 갖는다.

나노리포좀, 멜라닌, 산삼, 주름, 항산화, 화장료

Description

나노리포좀으로 안정화된 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물{ cosmetic composition containg ginseng extract stabilized by nanoliposome}

본 발명은 나노리포좀으로 안정화된 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 산삼 추출물에 나노리포좀를 함유시켜 안정화된 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부색을 결정하는 인자는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분적 또는 전체적인 색소침착과 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강상태 등이 있다.

이상의 인자들 가운데에서도 피부색을 결정하는 가장 중요한 인자는 색소침착이다. 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 이러한 멜라닌 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종 인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제(tyrosinase)에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 케라티노사이트로의 이동은 부분적으로 호르몬과 자외선 등에 영향을 받고 일차적으로는 유전적인 영향을 크게 받는다.

그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다(박수남, 대한화장품학회지, 25: 77-127, 1999). 따라서 피부색을 결정짓는 멜라닌의 합성을 억제하고 이에 관여하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하여 피부의 미백효과를 기대할 수 있다.

종래에는, 기미, 주근깨, 색소침착 등과 같은 피부색소 이상침착 증상과 자외선 노출 등에 의해 발생한 과도한 멜라닌 색소침착을 치료 또는 경감시켜주기 위해서, 이전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 티로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합 사용하여 왔다.

그러나 이들은 매우 불안정하고, 피부로의 전달이 용이하지 않아 특별한 안정화 시스템과 전달 체계가 필요하며, 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합시 제형 및 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

한편, 현재 이들 기존 미백 효능 물질들 이외에 천연물 중에서 미백 활성성분을 찾기 위한 연구가 계속 이루어지고 있는데, 그 중 상백피 (일본공개특허 소(昭)55-44375, 소(昭)64-26507, 소(昭)64-83009, 평(平)1-25687, 평(平)5-139950, 한국공개특허 제1992-002109호, 제1997-021273호), 감초(일본공개특허 소(昭)60-214721, 소(昭)63-23809, 소(昭)64-63506, 평(平)1-149706, 한국공개특허 제1992-002109호, 제1997-025601호) 등 다수의 식물추출물이 티로시나제에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다는 사실이 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 안정성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효 농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점이 있으며 만족 할 만한 효과를 내지 못하는 실정이다.

다음으로, 피부에 영향을 미치는 인자로는 피부의 노화로 인한 주름의 생성과 탄력의 저하이다. 사람의 피부는 나이를 먹으면서 피부노화와 색소침착에 의해 끊임없이 변한다. 피부노화는 크게 자연 노화(혹은 내인성 노화)와 외적 노화로 구분되며(EB Doris, Cosmetics & Toiletories, 111: 31-37, 1996), 자연 노화는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외적 노화 인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적인 노화 현상이 바로 주름 형성이다(HW Daniel, Ann Intern Med, 75(6): 873-880, 1971; GL Grove, et al., J Am Acad Dermatol, 21: 631-637, 1989; CE Griffiths, et al., Arch Dermatol, 128: 347-351, 1992).

자외선에 의해 야기되는 광노화 메카니즘 중의 하나는 자유 라디칼 경로를 경유하는 것이다(D Harman, J Gerontol, 11(3): 298-301, 1956). 자유 라디칼들은 피부 콜라겐 등의 결합조직형성 파괴, 세포막 기능저해, DNA 변이촉진, 단백질 작용 변형, 세포간 에너지 전이, 신진대사와 관련된 분자들의 변형 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(AF Kligman and RM Lavker, J Cutan Aging Cosmet Dermatol, 1: 5-12, 1988). 노화에 자유 라디칼이 관여한다는 사실은 자유 라디칼을 불활성화하는 항산화제 또는 여러 가지 화학적 소거제들을 사용하여 노화 과정을 지연시킬 수 있다는 것을 의미한다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 'MMP'라 칭함), 특히 콜라게나제(collagenase, 이하 'MMP-1'이라 칭함)와 젤라티나제 (gelatinase, 이하 'MMP-2'라 칭함)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사와 자유 라디칼에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다.

MMP는 그 기질특이성에 따라 MMP-1, MMP-2, MMP-9로 크게 분류되는데, MMP-1은 간질의 효소인 섬유아세포 타입 콜라게나제이며 기질로는 콜라겐 타입 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅹ 및 젤라틴이 있으며 원래 콜라겐 길이의 3/4이나 1/4 길이의 펩타이드로 잘라 비특이적인 효소(gelatinase)의 작용이 용이하도록 한다. MMP-2는 72 KD의 젤라티네이즈(A)가 속하며 젤라틴, 콜라겐 타입 Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅹ, 엘라스틴 및 파이브로넥틴과 같은 기질을 분해한다. 호중구 및 다형핵성 백혈구의 MMP는 산화과정에 의하여 일차적으로 활성화되는데 그 과정은 먼저 세포 내에서 과산화수소가 발생되면 염소 이온의 존재 하에서 미엘로페록시다제(myeloperoxidase)에 의하여 차아염소산으로 전환되고 이것이 MMP를 활성화한다.

자외선에 의한 노화를 방지하기 위하여 자외선 차단제가 함유된 제품을 피부에 직접 도포하는 방법이 가장 일반화되어 있으나, 1988년 레티노인산이 노화된 피부의 피부 거칠음 및 잔주름의 완화에 효과가 있다고 보고 되었고(KS Weiss, et al., JAMA, 259: 527-532, 1988), 전 세계적으로 피부노화를 억제 혹은 개선하는 물질을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 비타민 A, C, E, 비타민류의 유도체 및 AHA(alpha-hydroxy acid)는 현재까지 알려진 피부노화 개선의 대표적인 물질이다(Hermitte, Cosmetics & Toiletries, 107: 63-67, 1992; DR Rosenthal, et al., J Invest Dermatol, 95: 510-515, 1990; TD Ditre, et al., J Invest Dermatol, 34: 187-195, 1996). 하지만, 이들은 자연환경에서 매우 불안정하여 사용상 문제점이 있거나, 혹은 가시적 효과를 나타내기엔 다소 미흡하다는데 문제가 있다.

따라서 본 발명자는 천연물에서 피부 미백 및 피부노화 억제에 관한 물질을 찾고자 노력하였고, 산삼에 주목하게 되었다.

인삼(Panax ginseng)은 오갈피나무과( Araliaceae)에 속하는 다년생 초본류로서, 한방에서는 그 뿌리를 인삼(Ginseng Radix)이라 하며 강장(强壯), 강정(强精), 조혈(造血), 보온(保溫), 건위(健胃), 피로회복, 정신안정, 진정작용 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 인삼의 주요 유효성분으로는 사포닌, 사포게닌, 폴리아세틸렌, 피라진 유도체, 말톨 등이 있으며, 인삼 사포닌은 화학구조의 특성에 따라 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)계, 프로토파낙사트리올 (protopanaxatriol)계 및 올레아노난(oleanonane)계 사포닌으로 구분하는데, 현재까지 각각 19종, 10종, 1종의 화합물이 분리 정제되었으며, 디올계와 트리올계는 체내에서의 약리작용이 서로 다른 것으로 알려져 있다. 인삼 사포닌은 다른 식물의 사포닌과 달리 독성이 없고 0.001% 이하에서는 용혈작용을 나타내지 않는 것으로 알려져 있으며, 중추신경 억제작용, 단백질합성 촉진작용, 부신피질호르몬 분비촉진작용, 면역증강작용 등이 있는 것으로 보고되고 있다. 한편, 산삼은 산에 자연적으로 나는 인삼으로, 적응증이나 효용은 인삼과 비슷하나 그 약효가 월등히 뛰어나며, 대표적인 효능으로는 신체 조절 기능의 항상성 유지 작용이라 할 수 있다. 이러한 작용에 근거하여 항피로 및 항스트레스 작용, 혈압조절 작용, 항암작용, 동맥경화 및 고혈압의 예방, 위장기능 강화, 면역기능 강화, 항바이러스 작용 등이 보고되고 있다.

한편, 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었으며 효소의 발현양은 조절하지 못하는 문제점이 있었다. 또한 최근 소비자들은 점차 특수한 조성에 따른 고품질의 기능적 특성을 가짐과 동시에 피부보호, 자극억제, 염증억제, 일광차단 등의 최소한의 부작용을 갖는 화장품의 사용을 요구하고 있고, 피부자극을 최소화하기 위해 종래의 화학물질 원료를 사용하는 대신에 천연재료를 이용한 화장품에 대한 소비자의 호응이 높아짐에 따라 천연재료를 화장품의 원료로써 개발할 필요성이 한층 제기되고 있다.

이에 본 발명은 미백효과, 항산화 효과, 잔주름 방지효과, 콜라겔 합성효과를 나타내는 나노리포좀으로 안정화시킨 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 산삼을 압력 500∼3000MPa, 온도 40∼90℃에서 5∼60분간 처리한 후, 추출한 산삼 추출물에 나노리포좀을 혼합하여 안정화된 산삼 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 과제 해결수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 산삼을 압력 500∼3000MPa, 온도 40∼90℃에서 5∼60분간 처리한 후, 추출한 산삼 추출물에 나노리포좀을 혼합하여 안정화된 산삼 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명에 사용되는 산삼은바람직하게는 압력 500∼1000MPa, 온도 50∼90℃에서 10∼30분간 처리된 것이 좋다.

한편, 본 발명에 사용되는 산삼은 바람직하게는 증기 또는 60∼90℃의 물로 5∼60분간 전처리 과정을 하는 것이 좋다.

한편, 본 발명에서 산삼 추출은, 특정 pH에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 초고압처리시 초고압기 내부 물의 pH를 1∼6으로 낮춰 처리하는 것이 좋다.

한편, 본 발명에 사용되는 추출용매는 특정의 종류에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄,헥산 및 그의 혼합물로부터 선택된 것이 좋다.

한편, 본 발명에 사용된 산삼 추출물은 추출액을 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출액 중에 함유되고 있는 주효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로, 인지질 분자의 양극성 성질을 가지고 있으며, 소수성 부분은 탄화수소 사슬과의 회합을 촉진하고, 극성 머리기는 친수성 성분과의 회합을 촉진하기 때문에 공존하면 불안정한 소수성과 친수성 성분들을 안정화시키는 역할을 한다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 1-100nm이며,, 피부침투의 개선 및 제형 안정성을 개선한다.

한편, 산삼 추출물은 특정의 범위에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 나노리포좀의 총중량에 대해 0.01~60중량% 함유되는 것이 좋은데, 0.01중량% 미만으로 첨가하는 경우에는, 효과를 기대하기 힘들고, 60중량%를 초과하여 첨가되는 경우에는 뚜렷한 효능 효과의 상승이 보이지 않는다.

한편, 나노리포좀을 함유하는 산삼 추출물의 첨가량은 특정의 범위에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 화장료 조성물의 총 중량에 대해 0.1~30중량% 함유되는 것이 좋은데, 0.1중량% 미만으로 첨가되는 경우에는 유효한 효과를 기대하기 힘들고, 30중량%를 초과하는 경우에는 뚜렷한 효능의 상승이 나타나지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기의 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

한편, 나노리포좀은 특정의 과정을 통해 수득되는 것에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 인지질, 글루타치온, 95% 변성 에탄올, 글리세린, 폴리솔베이트 20을 포함하는 리포좀을 고압 유화장치에 통과시켜 수득된 것이 좋다.

한편, 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 일예로 피부 미백용, 피부 주름개선용, 피부탄력 강화용으로 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제형은 특정의 종류에 한정되는 것은 아니나, 일예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형과 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나의 외관을 가질 수 있다.

또한, 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있다. 이는 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 화장 분야에서 통상적인 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방 향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 및 염료를 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총중량에 대해 0.01 내지 20중량%이다. 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이 산삼 추출물에 나노리포좀을 혼합하여 안정화된 산삼 추출물을 함유하는 본 발명의 화장료 조성물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성을 막아주는 티로시나제 활성 억제효과, 멜라닌 합성 억제효과 등의 미백효과와 자유라디칼 소거 효과, 콜라게나제(MMP-1)의 활성 및 발현억제 등의 주름개선효과가 우수하고, 온도 변화에 대해 변색과 분리 및 침전이 발생하지 않는 우수한 안정성을 갖는다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

< 실시예 1> 산삼 제조

산삼을 시료로 선별하여 세척한 후, 초고압처리기를 이용하여 압력 1000MPa 하에서 온도를 70℃로 승온시키고 30분간 처리한 후 실온으로 냉각시킨 후 건조기에서 12∼13%의 수분 함량으로 건조하여 산삼을 수득하였다(실시예 1).

< 실험예 1> 산삼의 유효성분 함량 측정

대조구는 실시예 1과 동일한 동일한 산삼을 시료로 선별하여 세척하여 스팀을 이용하여 3시간 동안 70℃로 승온시킨 후 스팀을 정지하고 실온으로 냉각한 후 약 12∼13%의 수분 함량으로 건조하여 제조하였고, 비교예 1은 4년근 수삼으로 하였다.

각 시료의 총사포닌 함량과 각각의 진세노사이드 함량을 분석하였으며 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

		실시예 1	대조구	비교예 1
조사포닌		77.8	65.3	22.1
진세노사이드 (Ginsenoside)	Rg1	0.014	0.0124	0.215
	Rg2	0.234	0.2092	0.204
	Rg3	1.532	1.2855	0.074
	Re	0.012	0.0117	0.210
	Rb1	0.076	0.0703	0.128
	Rb2	0.275	0.2228	0.081
	Rb3	0.081	0.077	0.098
	Rc	0.077	0.0765	0.137
	Rd	0.271	0.265	0.086
	Rh1	0.451	0.435	-
	Rh2	0.136	0.123	-

산삼의 유효성분 함량 측정을 한 결과,실시예 1의 조사포닌 및 진세노사이드의 함량이 높은 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터 본 발명의 추출 조건에서 추출된 산삼 추출물은 조사포닌 및 진세노사이드의 함량이 증대된 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2> 나노리포좀을 함유하는 산삼 추출물 제조

우선 상기 실시예 1로 부터 수득한 산삼을 정제수로 분산 및 용해하여 산삼 추출물을 제조한 다음, 여과하여 추출액을 수득하였다.

그리고 나노리포좀은 인지질, 글루타치온, 95% 변성 에탄올, 글리세린, 폴리솔베이트 20(A 상)를 고압 유화시켜 폐쇄된 이중층 구조의 나노 리포좀을 제조하였다.

더욱 상세하게는 표 2의 A상을 95℃까지 가온하여 균일하게 혼합, 용해시킨후, 1200바, 유속 500m/s의 조건하에서 고압 유화장치 (Microfluidizer M210EH, 미국)에 5회 통과시켜, 안정화한 나노리포좀을 얻었다. 이를 40℃까지 냉각한 다음, B상을 넣고 혼합하여 나노리포좀을 함유하는 산삼 추출물을 제조하였다.

1회 통과하여 얻은 리포좀의 크기는 약 125㎚이었지만, 5회째의 크기는 약 70㎚로 나타났다.

	원료명	함량
A상	인지질	5
	글루타치온	0.1
	95% 변성 에탄올	20
	글리세린	30
	폴리솔베이트 20	5
B상	산삼 추출물	20
B상	정제수	19.9
합계		100

< 실험예 2> 미백효과의 측정

실시예 2에서 수득한 산삼 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 티로시나제 (tyrosinase)라는 효소의 억제되는 정도 측정하였다.

티로시나제는 생체내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 실험예 2에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(SH Pomerantz, J Biol chem, 241: 161-168, 1966)을 응용해 미백효과를 판정하였다.

코지산, 알부틴, 상백피 추출물 및 실시예 2에서 제조한 산삼 추출물을 시료로 사용하여 티로시나제 활성 억제효과를 조사하였다. 각 시료들의 티로시나제에 대한 저해활성은 시료 15㎕를 96공 평판 배양기(96-well plate)에 넣고, 50mM 인산 완충액(pH 6.5) 150㎕, 1.5mM L-티로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500units/㎖, Sigma) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 흡광 광도계 (microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 활성 저해율을 측정하였다.

IC₅₀ 값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

시료명	티로시나제 활성 저해 효과(IC₅₀)
실시예 2	0.01 %
코지산	0.03 %
알부틴	0.45 %
상백피 추출물	0.65 %

티로시나제 활성 억제효과를 시험한 결과, 산삼 추출물의 IC₅₀ 값은 0.01%로 나타났는데, 이는 티로시나제 저해효과가 뛰어나다고 알려진 기존의 미백제인 코지산, 알부틴, 상백피 추출물보다 높게 나타났다.

상기의 결과로부터 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

< 실험예 3> B16F1 멜라노싸이트를 이용한 세포 내 티로시나제 효소 활성 억제효과 측정

실시예 2에서 수득한 산삼 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트 내 티로시나제 효소 활성 억제정도를 세포 내 티로시나제 효소 활성을 측정하여 판단한 것이다.

본 실험예 3에서 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며 티로시나제라는 효소를 합성하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하고 세포에서 티로시나제를 분리하여 효소의 활성을 측정함으로써 티로시나제 효소활성 억제 정도를 비교평가 하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다. B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제 효소 활성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F1 멜라노싸이트를 6공 평판배양기에 각 웰 당 2 X 10⁶농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(Trypsin) -EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 세포 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하고, 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 상등액을 회수하였다. 50mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 1.5mM L-티로신, 0.06mM L-도파, 세포 상등액을 각각 넣고, 37℃에서 30분간 배양한 후 흡광 광도계로 490㎚에서 흡광도를 측정하여 티로시나제 효소 활성 억제효과를 측정하였다.

IC₅₀ 값은 세포내 티로시나제 효소의 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

시료명	티로시나제 활성 저해 효과( IC₅₀)
실시예 2	0.02 %
코지산	0.04 %
알부틴	0.25 %
상백피 추출물	0.70 %
유용성 감초 추출물	0.03 %

B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제 효소 활성 억제효과를 측정한 결과, 산삼 추출물의 IC₅₀ 값은 0.02%로 나타났는데, 기존의 미백제인 코지산, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 보다 낮은 농도에서도 티로시나제의 활성을 효과적으로 저해하는 것으로 측정되었다.

이와 같은 결과로 볼 때, 본 발명의 산삼 추출물를 함유하는 화장료 조성물의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

< 실험예 4> B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

실시예 2에서 수득한 산삼 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도에 따라 미백효과를 판단하였다.

본 실험예 4예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양 받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6공 평판배양기에 각 웰당 2 X 10⁶농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(R. Lotan and D. Lotan, Cancer Res, 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 변형하여 실시하였다. 세포 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 흡광광도계로 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다.

IC₅₀ 값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

시료명	멜라닌 합성 저해 효과(IC₅₀)
실시예 2	0.004 %
하이드로퀴논	0.02 %
알부틴	0.5 %
상백피 추출물	4.0 %
유용성 감초 추출물	0.03 %

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과, 산삼 추출물의 IC ₅₀ 값은 0.004%로 측정되었는데, 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 보다 우수한 멜라닌 합성 저해 효과를 나타냈다.

< 실험예 5> 항산화 효과 측정

실시예 2에서 수득한 산삼 추출물의 항산화효과를 확인하기 위해 활성산소 라디칼 소거효과를 측정하였다.

활성산소 라디칼 소거작용은 Furuno 등(K Furuno, et al., Biol Pharm Bull, 25(1): 19-23, 2002)의 방법에 따라 각 시료의 크산틴- 크산틴옥시다제 시스템에 의해 생성된 활성산소를 소거하는 효과를 측정하였다. 0.05M Na₂CO₃ 완충액에 3mM 크산틴, 3mM EDTA, 0.72mM 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium; NBT), 0.15% BSA(bovine serum albumin) 용액과 시료를 각각 첨가하여 혼합한 다음, 25℃에서 10분간 반응하였다. 그 후 각 시험관에 크산틴옥시다제(0.25U/㎖)용액을 첨가하여 25℃에서 30분간 반응한 후, 565㎚에서 흡광도를 측정하였다.

시료명	농도(%)	항산화효과(%)
실시예 2	0.001	37
	0.005	81
	0.01	95
녹차 추출물	0.5	98
비타민 E	0.5	91

항산화 효과 측정한 결과, 실시예 2는 대표적인 항산화제인 녹차 추출물과 비타민 E와 농도 대비 항산화 효과(%)를 비교하였을 때, 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

상기의 결과로부터 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 우수한 항산화 효과를 추론할 수 있었다.

< 실험예 6> 콜라겐 합성 효과 측정

실시예 2에서 수득한 산삼 추출물의 콜라겐 합성효과를 관찰하기 위해 인간으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 처리하여 실험하였다. 대조군은 실시예를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도로 하였다.

96공 평판 배양기에 2.5% 우 태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)과 인간 섬유아세포 (5 X 10³세포/웰)를 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 다음 산삼 추출물을 각각 0.01% 및 0.001%의 농도로 1일 처리 후 세포배양액을 채취하여 콜라겐 단백질 측정기구(Catalog No. : MK 101, Takara Shuzo Co. Ltd, 일본)를 이용하여 콜라겐 합성량을 측정하였다. 측정방법은 우선 1차 콜라겐 항체가 균일하게 도포된 96공 평판 배양기에 채취된 세포 배양액을 넣고 3시간동안 항원-항체 반응을 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96공 평판 배양기에 넣고 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색 유발물질을 넣어 실온에서 발색시키고, 1M 황산을 넣어 발색을 중지시켰다. 반응색의 색깔은 노란색을 띠며, 반응의 정도에 따라 진한 정도가 달라진다.

노란색을 띤 96공 평판 배양기를 흡광광도계를 이용하여 450㎚에서 측정하였다.

시료명		콜라겐 합성 효과(%)
실시예 2	0.01%	90
	0.001%	65
대조군		0

콜라겐 합성 효과 측정한 결과, 실시예 2는 우수한 콜라겐 생성 촉진효과를 나타냈다.

상기의 결과로부터 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 우수한 콜라겐 생성 촉진 효과를 추론할 수 있었다.

< 실험예 7> MMP -1의 활성 억제효과 측정

실시예 2에서 제조된 산삼 추출물의 기질 금속단백질 분해효소(MMP-1) 활성 억제효과 측정은 Wang 등(Y. Wang, et al., J Biol. Chem., 274: 33043-33049, 1999)이 사용한 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 즉, 반응 완충액 100㎕에 0.25㎎/㎖로 반응 완충액에 용해한 DQ-콜라겐 20㎕와 시료 40㎕를 첨가하고 0.5 unit로 희석된 콜라게나제 40㎕를 첨가하였다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(LS55, PERKIN ELMER, 미국)를 이용하여 흡수파장 495㎚, 방출파장 515㎚로 형광값을 측정하였고, 대조그룹으로서 효소액 대신 반응 완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였다. 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다. 양성 대조군으로 MMP-1 활성 저해 작용이 있는 것으로 알려진 1,10-페난트롤린(phenanthroline)을 사용하였다.

시료명		MMP-1 활성억제효과(%)
실시예 2	0.001%	33
	0.005%	70
	0.01%	91
양성 대조군(2mM, 10-페난트롤린)		73

MMP-1의 활성 억제효과 측정한 결과, 실시예 2는 농도 의존적으로 콜라게나제 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 양성 대조군으로 사용된 1,10-페난트롤린의 경우는 2mM에서 73% 활성 저해효과를 나타내었다.

이와 같은 결과로 볼 때 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 우수한 콜라게나제 활성 저해효과를 추론할 수 있었다.

< 실험예 8> 자외선 조사 후 MMP -1 발현억제 측정

실시예 2에서 수득한 산삼 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1의 발현량을 측정하기 위해서 ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)를 실시하였다(S. E. Dunsmore, et al., J Biol. Chem., 271: 24576-24582, 1996).

UV 챔버를 이용하여 인간 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96공 평판 배양기에 코팅하였다. 일차항체(단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 90분간 반응시켰다. 이차항체인 항마우스 이뮤노글로불린 지(alkaline phosphatase conjugated anti-mouse IgG)를 다시 90분정도 반응시킨 후, 완충용액으로 세척한 다음 알카린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖p-nitrophenyl phosphate in diethanolamine buffer)을 상온에서 30분간 반응시키고 흡광광도계를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

이때, 실시예 2를 처리하지 않은 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

시료명		MMP-1발현 억제율(%)
실시예 2	0.001%	30
	0.005%	64
	0.01%	90
레티놀(3.5μM)		52

자외선 조사 후 MMP-1 발현억제 측정한 결과, 실시예 2는 농도 의존적으로 MMP-1 발현 저해효과를 나타내었다. 양성 대조군으로 사용된 레티노인산의 경우는 3.5uM에서 52% 발현 저해효과를 나타내었다.

상기의 결과로부터 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 우수MMP-1 발현 저해효과를 추론할 수 있었다.

< 실시예 3> 화장료 제조

상기 실시예 2에서 산삼 추출물을 함유하는 화장료를 제조하였다.

하기 화장료의 성분들은 표 10와 같았고, 통상적인 화장료의 제조방법에 따라 에멀젼을 제조하였다(실시예 3, 실시예 4, 실시예 5, 비교예 2).

원료(중량%)	실시예 3	실시예 4	실시예 5	비교예 2
폴리솔베이트-60	1.5	1.5	1.5	1.5
소르비탄스테아레이탄	0.5	0.5	0.5	0.5
스테아린산	1	1	1	1
스쿠알란	5	5	5	5
세토스테아릴알콜	2	2	2	2
세틸 옥타노에이트	5	5	5	5
카보머	0.15	0.15	0.15	0.15
트리에탄올아민	0.2	0.2	0.2	0.2
글리세린	5	5	5	5
산삼 추출물	10	1	0.1	-
정제수	69.65	78.65	79.55	79.65
합계(중량%)	100	100	100	100

< 실험예 9> 미백효과 측정

상기에서 제조된 실시예 3과 비교예 2의 미백효과에 대해 측정하였다.

실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 3을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 색차계로 얼굴색을 비교하여 가장 어두운 색을 5, 중간색을 3, 가장 환한 색을 1로 정하고 그 중간 정도를 어림잡아 평가하였다. (n=20, p<0.01)

	숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 3	비교예 2	실시예 3	비교예 2
평균값	1.9	2.85	1.65	2.7

화장료의 미백효과를 측정한 결과, 실시예 3을 도포한 실험자의 안면 피부에서 우수한 미백효과가 나타났다.

상기의 결과로부터 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 우수한 미백효과를 확인할 수 있었다.

< 실험예 10> 피부 잔주름의 개선효과 측정

실시예 4와 비교예 2를 사람을 대상으로 적용하여 피부 잔주름 개선효과를 평가하였다.

실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽부위에는 실시예 2를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 잔주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘 수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름 장치와 피부 영상 분석기로 눈가 잔주름의 상태를 비교하였다.

	실시예 4		비교예 2
	사용전	사용후	사용전	사용후
평균 잔주름 깊이(AU)	0.198	0.148	0.199	0.194
사용전 대비 주름 감소율(%)	25.25%		2.5%

화장료의 피부 잔주름의 개선효과 측정한 결과, 실시예 4가 비교예 2보다 사용 전 대비 주름 감소율이 높게 나타났다.

상기의 결과로부터 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 우수한 피부 잔주름 개선 효과를 확인할 수 있었다.

< 실험예 11> 안정성 측정

본 발명의 산삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유한 화장료에 대한 제형의 안정성을 하기의 방법으로 측정하였다.

실시예 3과 비교예 3(실시예 2의 산삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 사용하는 대신, 실시예 1의 산삼 추출물 10 중량%(즉, 나노리포좀으로 안정화시키지 않은 산삼 추출물)를 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법으로 제조된 에멀젼)을 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 시료, 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 시료, -5℃에서 45℃를 순환하는 순환 챔버(1회/일)에 12주 동안 보관한 시료에 대하여 분리, 변색 정도 및 침전 정도를 비교 측정하였다. 제품 분리 및 변색 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다(0: 변화 없음, 1: 극히 조금 분리(변색), 2: 조금 분리(변색), 3: 조금 심하게 분리(변색), 4: 심하게 분리(변색), 5: 극히 심하게 분리(변색)).

온도	실시예 3	비교예 3
45℃	0	3
4℃	0	2
순환	0	3

화장료 에멀젼의 분리 및 변색 정도를 측정한 결과, 나노리포좀을 함유하는 실시예 3은 4℃, 45℃ 및 순환 시험에서 변색이나 분리 증상이 없이 안정하였으나, 나노리포좀을 함유하지 않은 비교예 3은 분리(변색)가 일어나 불안정상태를 나타냈다.

상기의 결과로 부터 본 발명의 나노리포좀을 함유한 산삼 추출물을 함유하는 화장료의 우수한 안정성을 확인할 수 있었다.

또한, 제품 침전 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다(0: 변화 없음, 1: 극히 조금 침전, 2: 조금 침전, 3: 조금 심하게 침전, 4: 심하게 침전, 5: 극히 심하게 침전).

온도	실시예 3	비교예 3
45℃	0	3
4℃	0	2
순환	0	2

화장료 에멀젼의 침전 정도를 측정한 결과, 나노리포좀을 함유하는 실시예 3은 침전이 발생하지 않았고, 나노리포좀을 함유하지 않은 비교예 3은 침전이 발생하였다.

상기의 결과들로 부터 산삼 추출물에 나노리포좀을 첨가하지 않고 제형 내의 다른 약한 이온성 고분자들과 쉽게 반응하여 침전 및 변색이 발생한다는 사실을 확인할 수 있었고, 본 발명의 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 안정성도 확인할 수 있었다.

Claims

산삼을 압력 500∼3000MPa, 온도 40∼90℃에서 5∼60분간 처리한 후, 추출한 산삼 추출물에 나노리포좀을 혼합하여 안정화된 산삼 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물
제 1항에 있어서,

추출용매는,

정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄,헥산 및 그의 혼합물로부터 선택된 것을 특징으로 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물
제1항에 있어서,

산삼 추출물은,

나노리포좀의 총중량에 대해 0.01~60중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물
제1항에 있어서,

나노리포좀을 함유하는 산삼 추출물은

화장료 조성물의 총 중량에 대해 0.1~30중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물
제1항에 있어서,

나노리포좀은,

인지질, 글루타치온, 95% 변성 에탄올, 글리세린, 폴리솔베이트 20을 포함하는 리포좀을 고압 유화장치에 통과시켜 얻는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물
제1항 내지 5항에 있어서 어느 한 항에 있어서,

산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물은,

피부 미백용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물
제1항 내지 5항에 있어서 어느 한 항에 있어서,

산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물은,

피부 주름개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물
제1항 내지 5항에 있어서 어느 한 항에 있어서,

산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물은,

피부탄력 강화용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물
제1항 내지 5항에 있어서 어느 한 항에 있어서,

산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제형은,

화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형과 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물