KR20070013622A

KR20070013622A - 피부노화 방지용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20070013622A
Application number: KR1020050068070A
Authority: KR
Inventors: 이순근; 곽의종; 조용백; 한창균; 신정주; 김주현; 이은주; 정칠만; 윤세준
Original assignee: 에스케이케미칼주식회사
Priority date: 2005-07-26
Filing date: 2005-07-26
Publication date: 2007-01-31

Abstract

본 발명은 피부노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 용담, 은행잎 및 아가리쿠스 버섯을 각각 추출, 분획, 정제하여 분말화하고 이를 적정비로 혼합, 균질화하여 복합 조성물을 적용함으로써, 엘라스타제 저해효과, 표피세포 재생효과, 히알루론산 생합성효과, 라미닌 생성효과, 피부면역 증강효과, 피부 턴오버 촉진효과, 탄력 개선효과, 피부 보습효과 등의 복합적인 피부탄력 개선작용 및 표피세포 재생효과가 뛰어난 피부노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부노화 방지, 용담, 은행잎, 아가리쿠스 버섯, 피부 탄력, 표피세포 재생

Description

피부노화 방지용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin anti-aging}

도 1은 비교예 및 실시예에 따른 생약 추출물의 T-세포 활성을 통한 피부면역 증강효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 비교예 및 실시예에 따른 생약 추출물의 이산화질소 생산능을 통한 피부면역 증강효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 시료 무처리군 도포 후 무모 생쥐의 피부조직을 베르회프 염색법으로 나타낸 그래프이다.

도 4는 비교예 2의 추출물을 도포 후 무모 생쥐의 피부조직을 베르회프 염색법으로 탄력섬유 개선 효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 비교예 10의 추출물을 도포 후 무모 생쥐의 피부조직을 베르회프 염색법으로 탄력섬유 개선 효과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 비교예 12의 추출물을 도포 후 무모 생쥐의 피부조직을 베르회프 염색법으로 탄력섬유 개선 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 실시예 1의 추출물을 도포 후 무모 생쥐의 피부조직을 베르회프 염색법으로 탄력섬유 개선 효과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 처방예 및 비교처방예의 크림 조성물의 인체 피부탄력 개선효과를 비 교한 그래프이다.

일반적으로 사람의 피부는 나이를 먹으면서 내외적 요인에 의해 변화를 겪는데, 피부노화가 진행되기 전의 여성의 피부는 남성의 피부와 달리 탄력적이고 부드럽고 촉촉하며, 피지분비 및 털이 적은 특징을 가진다. 또한, 피부세포의 생리활성이 활발하여 진피(Dermis)에 있는 섬유아세포(Fibroblast)에서는 콜라겐(Collagen)의 합성과 신진대사가 왕성하며, 피부수분 유지에 중요한 히알루론산(Hyaluronic acid) 합성도 활발하여 피부에 탄력성 및 보습력을 부여한다. 특히, 피부탄력은 진피층에 존재하는 엘라스틴(Elastin)으로 구성된 탄력섬유에 의해 나타나며, 이 탄력섬유는 탄성계수가 매우 낮아 작은 물리적 힘에 의해 쉽게 변형 되고 복원되는 성질을 가지고 있다. 그러나, 과도한 자외선 노출이나 피부노화현상이 진행되면 피부의 팽팽함이나 탄력에 관계하고 있는 엘라스틴에 특이적으로 작용하는 효소인 엘라스타제 효소가 활성화 되어 엘라스틴 섬유의 생합성이 감소되어 탄력이 상실된다. 또한, 히아루로니다제 효소가 활성화 되어 세포간극에 수분을 유지하거나 조직 내에 젤리상의 매트릭스를 형성하여 세포를 유지하거나 피부의 윤활성과 유연성을 유지하는 히아루론산은 감소하게 된다. 특히, 40대 전후로 호르몬의 균형이 깨져 세포재생능력, 피부지질의 생성능력이 크게 저하된다.

지금까지 피부에 탄력과 윤기를 주고 주름과 늘어짐의 발생을 방지하여 피부의 노화방지를 목적으로 하는 화장료는 여러 가지 타입의 제품이 제안되어 있다. 그 대표적인 것으로는 글리세린, 솔비톨과 같은 다가알코올류, 히알루론산(Hyaluronic acid), 콜라겐(Collagen), 엘라스틴(Elastin), 천연보습인자(Natural Moisturizing Factor; 아미노산, 젖산염, 소듐 피롤리돈카르본산, 우레아, 세포간지질) 등의 보습성분을 배합한 화장료, 비타민A, 비타민C, 비타민E 및 유도체, 비타민F(리놀렌산), 비타민H(글루타치온) 등의 비타민류, 호르몬류, 식물 추출물(감초산, 베타-카로텐), 동물 추출물(우태반 추출물, 로얄제리) 등의 세포부활성분을 배합한 화장료가 있다.

그러나, 기존의 원료들은 그 효능이 미흡하거나 피부 부작용을 유발하는 등 여러 가지 문제점을 가지고 있었다.

이에, 본 발명자들은 종래의 기술에 의해 나타나는 피부탄력 효과 및 표피세포 재생효과를 포함하는 피부노화 방지를 한층 더 상승시키기 위하여 엘라스타제, 히알루노니다제의 활성을 억제하는 억제제뿐만 아니라 피부 단백질 결합을 촉진하는 라미닌(Laminin) 합성 증진효과, 피부면역 강화작용, 피부 턴오버 촉진작용, 표피세포 증식효과, 히알루론산 생합성효과, 피부탄력 개선효과, 피부 보습효과 등의 복합적인 피부탄력 개선작용 및 피부노화 방지를 증대시키는 조성물을 제공하는 동시에, 단일활성 원료 및 단방생약의 문제점인 효능미약, 제형 불안정성, 피부부작용을 해결하기위해 현재까지 알려진 여러 가지 생약 추출물을 대상으로 탐색연구를 거듭한 결과, 피부탄력 개선효과 및 피부세포 재생효과를 포함하는 복합적인 피부노화 방지에 해당되는 실험방법을 선택, 적용하여 용담, 은행잎, 아가리쿠스 버섯 등을 추출, 분획, 정제하여 적정비로 균질, 혼합하여 적용할 경우 피부부작용이 없는 안전한 물질이며, 피부탄력 개선 및 피부노화 방지효과가 극대화됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 용담, 은행잎 및 아가리쿠스 버섯을 각각 추출하여 농축 분말화한 뒤 이를 적정비율로 만든 복합조성물을 함유하는 저자극성이며 피부노화 방지에 효과가 있는 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 용담, 은행잎 및 아가리쿠스 버섯을 각각 추출하여 농축 분말화한뒤 이를 적정비율로 만든 복합 조성물을 함유하는 저자극성이며 피부노화 방지에 효과가 있는 화장료 조성물을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 용담, 은행잎 및 아가리쿠스 버섯을 각각 추출, 분획, 정제하여 분말화하고 이를 적정비로 혼합, 균질화하여 복합 조성물을 적용함으로써, 엘라스타제 저해효과, 표피세포 재생효과, 히알루론산 생합성효과, 라미닌 생성효과, 피부면역 증강효과, 피부 턴오버 촉진효과, 탄력 개선효과, 피부 보습효과 등의 복합적인 피부탄력 개선작용 및 표피세포 재생효과가 뛰어난 피부노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

용담과(Gentianaceae)에 속하는 용담(龍膽,Gentiana scabra Bunge)은 다년생 초본식물로 우리나라 전역뿐만 아니라 일본, 중국에 널리 분포하는 한방생약으로 겐티아닌(Gentianine), 겐티오피크로사이드(Gentiopicroside), 겐티신(Gentisin), 겐티아노즈(Gentianose) 등의 약효성분을 함유하고 있으며, 한방에서는 말린 뿌리 및 줄기를 소화불량, 식욕부진 등에 고미건위약으로 처방된다. 또한, 소염작용, 해열작용, 항균작용이 알려져 있다.

은행잎(백과엽)은 은행나무(Ginkgo biloba L)의 잎으로 매우 다양한 성분을 포함하고 있다. 은행잎이 함유하고 있는 중요성분은 플라보노이드와 바이플라보노이드, 프로안토시아니딘, 테르펜락톤 등을 함유하고 있다. 이중 은행잎에 함유된 플라보노이드는 퀘르세틴(Querctin),이소람네틴(Isorhamnetins), 3-O-메칠미리스티신(3-O-methylmyristicins), 켐프페롤(Kaempferol) 등이 함유되어 있으며, 바이플라본 성분으로는 아멘토 플라본(Amentoflavone), 바이로베틴(Bilobetin),5- 메톡시바이로베틴, 깅제틴(Ginkgetin), 이소깅제틴(Isoginkgetin) 등도 함유되어 있다. 또한, 프로안토시아니딘(Proanthocyanidins)도 있으며, 페르펜락톤으로는 깅코라이드(Ginkgolide) A, B, C가 함유되어 있다. 이들 물질들은 항염증, 항알러지 및 항류마티스, 항암작용, 진통작용과 같은 생리활성이 밝혀져 있으며, 현재 혈액순환 개선제 성분으로도 사용되고 있다.

아가리쿠스 버섯(Agaricus blazei Murrill)은 브라질의 피에다데(Piedade)라고 하는 산간지역에서 자생하는 버섯으로 생물분류상으로 주름버섯과에 속한다. 서식지는 북아메리카, 브라질, 한국, 일본에도 분포하며, 건강보조식품으로 사용된 것은 많이 보고 되어 있다. 약효성분으로는 세레비스테롤(Cerevisterol),항종양활성 스테로이드 A, B, C, 지방산 12종, 미량금속원소 K외 10종, 비타민B1, B2, D2, 나이아신(Niacin), 베타-D-글루칸, 글루코만난(Glucomannan)단백질복합체, 헤테로글루칸(Heteroglucan)단백질복합체, 만난(Mannan) 단백질복합체, 자이로글루칸(Xyloglucan)단백질복합체, 레시친 등이 있다.

상기 세 가지 생약으로 피부탄력 개선 및 표피세포 재생효과를 포함하는 노화방지 기능이 우수한 농축 분말 복합 조성물을 제조하는 방법은 통상적인 생약 추출법을 각각 얻고 이를 농축 분말화하여 2 : 0.5 ∼ 2 : 0.5 ∼ 2의 중량비로 혼합, 균질화하여 복합 조성물을 제조한다.

바람직하게는 상기 세 가지 생약을 각각 물 또는 유기용매로 가열하여 추출하는 것이 좋으며,

더욱 바람직하게는 1) 건조한 용담뿌리를 세절하여 생약 중량 대비 5 ~ 10배 수의 물 또는 유기용매로 가열하여 2 ~ 4회 추출한 후 여과하여 감압 농축하며 다시 일정량의 증류수를 넣어 공비 농축하여 유기용매를 제거하고 진공 건조하는 단계 ;

2) 건조한 은행잎에 유기용매를 넣고 2 ~ 4회 용매 추출한 후, 여과하여 감압 농축하며 다시 일정량의 증류수를 넣어 공비 농축하여 유기용매를 제거하여 분말화한다. 추출물 건조분말 대비 2 ~ 3배 중량의 증류수로 현탁시킨 후, 에틸 아세테이트를 넣고 교반 정체하여 분획물을 얻고, 여기에 2 ~ 5배 중량의 노말헥산을 넣어 생성된 침전 분획물을 세척, 여과하여 진공 건조하는 단계;

3) 건조한 아가리쿠스 버섯을 세절하여 생약 중량 대비 5 ~ 10배수의 물 또는 유기용매로 가열하여 2 ~ 4회 추출한 후, 여과하여 감압 농축하며 다시 일정량의 증류수를 넣어 공비농축하여 유기용매를 제거하고 진공 건조하는 단계;

4) 상기 1), 2), 3)의 추출과정에서 얻어진 추출분말을 2 : 0.5 ∼ 2 : 0.5 ∼ 2의 중량비로 혼합하여 농축 복합 조성물을 얻는다.

이때, 상기 유기용매로는 에탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 벤젠, 노말헥산, 디에틸에테르, 디클로로포름 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상이 사용될 수 있다.

특히, 본 발명에서 용담 에탄올 추출물, 은행잎 에틸아세테이트 추출물 및 아가리쿠스 버섯 에탄올 추출물을 건조 분말화한, 이들 3가지 생약 추출물을 2 : 0.5 ∼ 2 : 0.5 ∼ 2의 중량비로 혼합한 복합 조성물이 각각의 추출물에 비해 생약 성분들 사이의 상승작용으로 인해 우수한 피부탄력 개선효과 및 표피세포 재생효과 를 나타내며, 이때 각 추출된 건조분말의 조성비율도 상기 비율로 혼합하는 것이 가장 유리한 약효를 나타내는데, 여기서 추출된 생약들의 혼합비가 상기범위를 벗어나면 엘라스타제 저해효과, 표피세포 증식효과, 히알루론산 생합성효과, 라미닌 생성효과, 피부면역 증강효과, 피부 턴오버 촉진효과, 탄력 개선효과, 피부 보습효과 등의 피부탄력 개선작용 및 표피세포 재생효과를 포함하는 피부노화 방지효과를 극대화할 수 없고, 특정 효능에만 한정되는 단점이 있다.

또한, 본 발명의 농축분말 복합 조성물을 피부에 도포하는 경우, 천연 추출물인 관계로 다른 합성 단일원료에 비해 부작용의 염려가 적으며, 실제로 생약 복합 추출물에 대한 피부독성시험 결과, 생체에 아무런 영향이 없는 것으로 판명되었다.

이와 같이 본 발명은 용담, 은행잎 및 아가리쿠스 버섯의 3종 생약을 각각 추출, 분획, 농축. 분말화하여 조성물을 만듦으로써 피부탄력 개선 및 표피세포 재생효과가 극대화되는 장점이 있다.

따라서, 상기 생약추출 농축분말 복합조성물을 화장료에 적용시 유연화장수, 수렴화장수, 로션, 에센스, 크림, 겔, 팩, 비누, 에센스시트, 하이드로겔 패치 또는 마스크 등의 제형으로 가능하며, 상기 생약 추출 농축분말 복합 조성물은 전체 화장료 조성에 대하여 0.001 ∼ 10.0 중량% 배합하는 것이 바람직하다. 만약 생약 추출 농축 분말 복합조성물이 0.001 중량% 미만이면 효과가 미미하며, 10 중량% 초과이면 적용농도 대비 효과를 극대화할 수 없고 화장료 제형을 만드는데 문제가 될 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

비교예 1 ~ 15

용담, 은행잎 및 아가리쿠스 버섯을 각각 100 g을 세절하여 얻은 분쇄물에 다음 표 1에 나타낸 각각 용매 1리터를 첨가하고 냉각 콘덴서가 달린 환류 추출기에서 70 ~ 80 ℃로 5시간 동안 끊여 추출한 다음, 200 메쉬 여과포로 여과하고, 각각의 단계에서 얻어진 추출액을 상온에서 화트만(Whatman) 여과지로 여과하여 불용성 성분을 제거한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 55 ~ 60 ℃로 감압 농축하고 진공 건조하여 추출분말을 얻었다. 각각의 경우에 사용한 생약재, 용매 및 얻어진 추출분말의 건조 중량은 다음 표 1에 나타냈다.

비교예	생약재	용매	건조중량(g)
1	용 담	정제수	31
2		50% 에탄올	28
3		에탄올	18
4		50% 에틸 아세테이트	12
5		에틸 아세테이트	7
6	은행잎	정제수	21
7		50% 에탄올	18
8		에탄올	12
9		50%에틸 아세테이트	6
10		에틸 아세테이트	0.4
11	아가리쿠스 버섯	정제수	16
12		50% 에탄올	14
13		에탄올	11
14		50%에틸 아세테이트	9
15		에틸 아세테이트	4

실시예 1

비교예 2에서 추출된 용담 농축분말, 비교예 10에서 추출된 은행잎 농축분말 및 비교예 12에서 추출된 아가리쿠스 버섯 농축분말을 각각 2 : 1 : 1로 균질 혼합하여 복합 조성물을 얻었다.

비교예 16

용담 100 g, 은행잎 50 g 및 아가리쿠스 버섯 50 g을 혼합 세절하여 얻은 분쇄물을 50% 에탄올로 상기 비교예와 같이 추출하여 복합 생약 추출분말을 얻었다.

처방예 및 비교처방예: 크림 제조

본 발명의 실시예 1의 각각 생약 추출 후 엑기스를 농축 분말화하고 이것을 적정비율로 혼합한 복합 조성물을 함유한 크림(처방예)과 이를 처리하지 않은 크림(비교처방예)은 다음과 같이 제조하였다.

번호	원료명	처방예(중량%)	비교처방예(중량%)
1	망고버터	1.0	1.0
2	세틸알코올	2.0	2.0
3	글리세릴모노스테아레이트/ 피이지 100 글리세릴스테아레이트	1.5	1.5
4	스테아린산	1.0	1.0
5	세테아릴알코올/ 세테아릴글루코사이드	1.0	1.0
6	하이드로게네이티드 레시틴/ C_12-16 알코올/팔미틴산	1.5	1.5
7	마카다미아 오일	2.0	2.0
8	스쿠알란	6.0	6.0
9	디메치콘	0.3	0.3
10	사이크로메치콘	2.0	2.0
11	프로필파라벤	0.1	0.1
12	초산토코페롤	0.1	0.1
13	정제수	잔량	잔량
14	디-판테놀	0.05	0.05
15	메틸파라벤	0.2	0.2
16	디소듐 이디티에이	0.05	0.05
17	1,3-부틸렌글리콜	8.0	8.0
18	트리에탄올아민	0.1	0.1
19	메틸셀룰로오스	0.05	0.05
20	카보머	0.1	0.1
21	향	적량	적량
22	실시예 1 복합 조성물	0.2	-

1) 번호 1 ∼ 12의 원료를 칭량하여 유상가온탱크에 넣고 75 ℃에서 교반 용해하였다.

2) 번호 13 ∼ 18의 원료를 칭량하여 수상탱크에 넣고 75 ℃에서 교반 용해하였다.

3) 상기 2)를 진공감압 하에 유화탱크로 이송하고, 이어서 상기 1)을 이송하여 3500 rpm으로 5분간 유화하였다.

4) 번호 19 ∼ 20의 원료를 칭량하여 1%수용액으로 만든 후, 진공, 감압하에 유화탱크에 주입하여 2500 rpm으로 균질 혼합하고, 진공, 탈포하면서 페달믹서를 25 rpm으로 교반하고, 55 ℃로 냉각하였다.

5) 실시예 1의 농축분말 복합조성물을 칭량하여 일부의 1.3-부틸렌글리콜로 가온하여 용해하고 이어서 향을 칭량하여 각각 유화탱크에 넣고 균질 분산, 냉각한 후 30 ℃에서 작업 종료하여 크림을 제조하였다.

비교처방예도 상기와 동일한 방법으로 하여 시료 미처리 크림을 제조하였다.

실험예 1: 피부 안전성 시험

상기 비교예 1 ~ 16 및 실시예에 따라 제조된 복합 생약 추출물 및 화장료 조성물에 대한 피부안전성을 다음과 같이 측정하였다.

피검자 30명(연령분포 24~40세, 피부병변 보유자 제외)에 대하여 비교예 1 ~ 16 및 실시예 1의 추출물을 0.2 중량%씩 50% 1.3-부틸렌글리콜에 용해시킨 것과 처방예 크림 및 비교예 크림을 각각 15 ㎍씩 핀챔버(Finn Chamber)에 적하시킨 후, 실험 부위인 상박부에 고정시켰다. 첩포는 24시간 동안 도포하고 첩포를 제거한 후에는 마킹펜(Marking Pen)으로 실험부위를 표시하여 24시간, 48시간 및 72시간 후에 실험부위를 관찰하여 피부자극 여부를 판정하였다. 피부자극 유무의 판정은 다음 표 2의 국제접촉피부염학회(ICDRG)의 규정에 따라 판정하였다.

등 급	자극양성율(%)	피부자극 판정
1	0 ~ 0.75	무자극
2	0.76 ~ 1.50	미자극
3	1.51 ~ 2.50	경자극
4	2.51 ~ 4.00	중자극
5	4.01 이상	강자극

구분	자극 양성율(%)	결과
비교예 1	0.15	무 자 극
비교예 2	0.10	무 자 극
비교예 3	0.12	무 자 극
비교예 4	0.16	무 자 극
비교예 5	0.18	무 자 극
비교예 6	0.08	무 자 극
비교예 7	0.18	무 자 극
비교예 8	0.16	무 자 극
비교예 9	0.16	무 자 극
비교예 10	0.18	무 자 극
비교예 11	0.08	무 자 극
비교예 12	0.10	무 자 극
비교예 13	0.08	무 자 극
비교예 14	0.12	무 자 극
비교예 15	0.16	무 자 극
실시예 1	0.02	무 자 극
비교예 16	0.04	무 자 극
처방예	0.10	무 자 극
비교처방예	0.10	무 자 극

비교예 및 실시예의 추출물 모두 피부자극감 시험에 의한 피부안전성 실험결과, 자극양성율이 전 구간에서 0.2% 미만으로 판정되어 매우 안전한 물질임이 확인되었다.

실험예 2: 엘라스타제 효소 저해시험( In Vitro )

상기 비교예 1 ∼ 15의 추출용매에 따른 상기 3가지 생약 추출물 및 실시예 1의 3가지 생약을 각각 추출하여 농축, 분말화한 복합 조성물과 비교예 16의 3가지 생약 복합 추출물의 엘라스타제 저해효과를 측정하기 위하여 상기 추출물이 피부탄력 개선에 중요인자로 작용하는 엘라스타제 효소 활성을 억제하는 역할을 하는지를 음성대조군과 비교하였다.

합성기질 Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Ala-Pro-p-Nitroanilide(8.0 mM, 25 ㎕)을 5 ㎍/ml의 인간호중구 유래 엘라스타제 함유 0.1M Hepes 완충액(pH 7.4, 0.5M NaCl 함유) 25 ㎕ 및 상기 비교예 및 실시예의 시료와 함께 37 ℃에서 30분간 반응시키고, 그 후 분해생성물인 4-니트로아닐린(Nitroaniline) 생성량을 마이크로플레이트 리더로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 효소저해율을 다음 수학식 1에 따라 산출하였으며, 그 결과를 다음 표 4에 나타내었다.

A : 시료 미첨가시의 흡광도, B: 시료첨가시의 흡광도

구분	엘라스타제 저해
구분	0.02 % 농도에서의 저해율(%)	IC₅₀(㎍/ml)
비교예 1	32.8	18.0
비교예 2	68.3	12.3
비교예 3	50.8	22.3
비교예 4	28.8	26.6
비교예 5	22.1	30.6
비교예 6	46.4	20.4
비교예 7	50.6	17.1
비교예 8	62.4	14.0
비교예 9	71.2	12.4
비교예 10	80.8	4.2
비교예 11	56.6	18.0
비교예 12	76.2	9.0
비교예 13	69.3	18.8
비교예 14	49.2	20.6
비교예 15	32.4	22.8
실시예 1	92.4	1.8
비교에 16	63.0	13.2

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 엘라스타제에 대한 저해활성은 추출용매 및 분획층에 따라 효과의 차이가 다르게 나타났다. 단독 추출물의 비교예 1 ~ 15와 비교예 16의 3가지 생약 복합 추출물 보다 실시예 1의 각각 3가지 생약을 추출한 뒤 농축 분말화하여 이를 적정비율로 혼합 균질화한 농축분말 복합 조성물이 엘라스타제 저해활성에서 현저한 효과를 나타내었다.

실험예 3: 인간 유래 표피세포 증식효과 시험(In Vitro)

인체에서 채취한 표피세포에 0.01%로 비교예 2, 10, 12 및 실시예 1의 추출물을 희석한 시료군과 시료 미처리의 대조군을 기준으로 표피세포의 증식효과를 측정하였다.

우태아 혈청이 2.5% 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양한 사람의 표피세포를 96웰 평판배양기에 5×10³세포/웰이 되도록 분주하였다. 상기의 시료들을 3일간 1일 2회 100 ㎕씩 처리하여 배양한 후, 0.2%의 MTT(3-[4,5-Dimethylthiodiazol-2-yl]-2,5-Phenyltertazolium bromide) 용액을 각 웰당 50 ㎕씩 첨가하고 다시 37 ℃에서 4시간 동안 배양한 다음, 생성된 포르마잔(미토콘드리아의 탈수소효소와 MTT가 반응하여 생긴 산물)을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 녹였다. 용해된 포르마잔(Formazan)의 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 여기서 시료 미처리군을 대조군으로 사용하였다. 측정된 흡광도를 이용하여 상기 시료들의 표피세포 증식효과를 나타냈는데, 세포가 증식되어 세포의 양이 증가되면 흡광도가 증가하기 때문에 세포의 양과 비례한다. 표피세포 증식효과는 대조군의 흡광도와 각각 시료에서의 흡광도를 비교하여 다음 수학식 2에 의해 계산되었다.

구분	표피세포 증식효과(%)
비교예 2	38
비교예 10	71
비교예 12	64
실시예 1	82
시료 미처리 대조군	0

상기 표 5에서와 같이, 단독 추출물에 비해 실시예 1의 3가지 생약 추출 농축분말을 적정비율로 혼합하여 균질화한 복합 조성물의 경우 표피세포 증식효과에서도 우수한 효과를 나타내었다.

실험예 4: 히알루론산 생산능 촉진 시험(In Vitro)

히알루론산은 세포간극에 있어서 수분의 유지, 조직내 젤리상의 매트릭스를 형성시켜 세포의 유지, 조직의 윤활성과 유연성의 유지, 외력에의 저항, 세균감염방지 등의 많은 기능을 갖고 있다. 이렇듯 피부 섬유성 단백질은 조직의 형태를 유지하거나 피부에 탄성을 부여하는 등의 기능을 담당하고 있다. 따라서, 섬유성 단백질의 생산이 촉진되면 피부에 탄력을 주게 되어 탱탱한 피부가 된다. 피부세포 단백질 결핍으로 인하여 생기는 대표적인 노화현상 중의 하나는 피부탄력의 감소이다. 피부 결합단백질의 결핍이 생기면 표피세간의 결합력과 표피와 진피간의 결합력이 약화되어 피부가 얇아지면 탄력 감소가 나타난다. 이러한 탄력 감소를 개선하기 위해서는 결합단백질 대사를 촉진하는 방법이며 그 실험모델중 하나가 피부 결합단백질 중의 하나인 히아루론산 생산능 촉진효과 시험이다.

인간표피세포를 사용하여 표피세포의 히알루론산 생산능에 대한 상기 비교예 2, 10, 12 및 실시예 1 추출물의 작용을 평가하였다. KGM(표피세포용 배지)에 현탁한 표피세포(5 × 10⁴세포/구멍)를 24개 구멍 배양용 플레이트에 접종하여 인큐베이터(37 ℃, 5% CO₂)에서 컨플루언트로 될 때까지 배양하였다. 이어서 상기 추출물을 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml을 함유시킨 표피세포용 배지와 시료 미첨가용 배지에 교환하여 동일한 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 배양된 상층을 채취하여 배양상층 중의 히알루론산 양을 측정하였다. 히알루론산 양은 히알루론산플레이트(측정용 키트)를 사용하여 측정하였다. 이 결과를 다음 표 6에 나타냈으며, 평가의 지표는 다음의 기준에 의한다.

- : 형성 없음(음성대조군)

+ : 형성은 확인되지만 미약함

++ : 형성 확인

+++ : 뚜렷한 형성 확인

구분	농도(㎍/ml)	히알루론산 생성효과
비교예 2	10	-
	50	+
	100	++
비교예 10	10	+
	50	+
	100	++
비교예 12	10	+
	50	++
	100	+++
실시예 1	10	+
	50	+++
	100	+++
대조군	미첨가	-

상기 표 6에서와 같이, 단독 추출물에 비해 실시예 1의 추출물 복합 조성물이 히알루론산 생성효과에서도 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 5: 라미닌의 생산능 촉진 측정시험(In Vitro)

표피 각질세포의 배양표피 각질세포는 인간 피부로부터 단리하여, 칼슘 농도가 낮은 표피세포 배양배지에서 배양하였다. 이 배지에는 소 뇌하수체 추출액과 EGF를 첨가하였다. 세포는 제4대까지 배양배지에서 배양한 다음, 트립신-EDTA 처리에 의해 접착세포를 상등시키고, 여과에 의해 세포의 아글리게이트를 제외하고, 균일한 세포현탁액을 얻었다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고, DMEM-F12(2:1)-0.1% BSA에 8×10⁴/ml이 되도록 재현탁시켰다. 이 세포현탁액을 0.5 ml, 2배 농도의 피험시료를 포함하는 동 배지 0.5 ml에 가하였다. 배양은 24 웰 플레이트를 사용하여 37 ℃에서 24 시간 행하였다. 배양 종료시에, 배양상층을 에펜도르프 튜브로 옮기고, 15000 rpm으로 5 분간 원심분리하여, 상층을 새로운 튜브에 옮기고, 라미닌의 측정일까지 - 20 ℃로 보존하였다. 세포내와 배양플라스틱 상에서 결합한 라미닌을 가용화하기 때문에, 각종 계면활성제를 포함하는 트리스염산 완충액(pH 7.4)을 각 웰에 첨가하고, 하루밤 동안 -20 ℃로 보존하였다. 다음날, 초음파 처리를 행하고, 다시 동결하였다. 이튿날, 재용해 후, 15000 rpm 으로 5 분간 원심분리하고, 상층을 튜브에 옮겨 라미닌의 측정일까지 - 20 ℃로 보존하였다.

샌드위치 ELISA 법에 의한 라미닌의 측정배양상층, 세포층에 존재하는 라미닌은 샌드위치 ELISA 법으로 측정하였다. 96 웰 ELISA 플레이트의 고체층에 라미닌의 라미닌 3 쇄에 대한 모노크로날 항체, BMI 65를 결합시켰다. 라미닌을 샌드위치하여 측정하기 때문에, 또 다른 1종의 항체로서 라미닌 3 쇄에 대한 모노크로날 항체인 6F12를 미리 비오틴화(b-6F12)하여 사용하였다. 본 방법에서는, 기능을 발휘할 수 있는 헤테로트리머체(332) 만을 측정하고, 헤테로다이머(32)를 검출하지 않는다. b-6F12를 포함하는 3% 젤라틴인산 완충용액을 미리 넣어둔 각 웰에 시료를 첨가하였다. 시료의 웰 내에서의 최종 희석률은 배양액이 1/4, 세포층이 1/10로 하였다. 항원항체반응은 37 ℃에서 2 시간 동안 행하여 세정한 다음, 아비딘 HRP(호스래디쉬(horseradish)퍼옥시다아제) 용액을 첨가하여, 다시 30 분에서 1시간 반응시켰다. 세정 후, HRP의 기질인 ABTS 용액을 가하고, 405 nm에서 흡광도를 ELISA 플레이트리더를 사용하여 측정한 뒤, 라미닌의 생성량을 대조군을 기준으로 백분율로 표시하여, 그 결과를 다음 표 7에 나타내었다.

구분	농도(㎍/ml)	Laminin 생성효과(%)
비교예 2	10	19.0
	50	44.6
	100	65.3
비교예 10	10	38.0
	50	68.2
	100	84.4
비교예 12	10	28.2
	50	63.4
	100	81.5
실시예 1	10	54.9
	50	88.2
	100	92.3
대조군	미첨가	-

상기 표 7에서와 같이, 단독 추출물 보다 실시예 1의 추출물 농축분말 복합조성물이 라미닌 생성 효과에 있어서도 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 피부면역증강 효과 측정시험( In Vitro )

본 실험에서 사용한 실험동물은 4주령의 Balb/c계 흰쥐(무게 :30 g 내외)를 사용하여 본 발명의 비교예 2, 10, 12 및 실시예 1 및 대조군(시료 무처리) 일반배양물을 5 mg/ml의 농도로 1.3-부틸렌 수용액에 용해시켜 복강주사하고 3일 후 마우스 복강세포를 채취하여 셀 카운팅(Cell Counting)하여 2×10⁴ Cell/웰로 플레이팅(Plating)하였고, 인큐베이터(37 ℃, 5% 이산화탄소)에서 48시간 배양 후 MTT를 첨가하여 4시간 배양하고 15분간 실온에서 진탕한 후 96웰 플레이트(Well Plate)용 ELISA리더로 550 nm에서 흡광도(MTT가 세포에 의해 환원된 양 및 각 웰에 존재하는 생존 세포수와 비례함)를 측정하였다.

상기와 동일한 마우스를 사용하여 복강 및 비장세포를 2×10⁴ Cell/웰로 96웰 플레이트에 상기와 동일 시료와 동일농도로 인큐베이터(37 ℃, 5% 이산화탄소)에서 24시간 배양 후, 그리스 시약을 넣고 가볍게 진탕하고 550 nm에서 흡광도를 측정하여 이산화질소의 함량을 측정하였다. 또한, 상기 시료를 코팅 완충액을 사용하여 희석하고 웰에 분주한 다음 두껑을 닫고 24시간 방치 후, 웰을 세척용 완충액을 사용하여 세척하였다. 어세이 딜루언트(Assay Diluent)를 넣은 후, 실온에서 1시간 방치하고 시료를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 실온에 방치한 후 5회 세척하고 TMB 기질(Substrate) 용액을 넣고 뚜껑을 닫지 않은 상태에서 30분간 암실에서 방치 후 반응종결용액을 넣고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 IL-2(Interleukin-2) 생산능을 측정하였다.

<비장세포의 IL-2활성 판정>

상기와 동일시료 5 mg/ml의 농도로 100 ㎕씩 복강주사 3일 후 비장세포를 콘카나발린 A(Concanavalin A= 콩에서 추출한 당단백질 T-세포의 활성을 주는 면활성물질)로 자극하여 비장세포내의 IL-2의 활성도를 측정한 결과를 도 1에 나타냈다( IL-2의 기능은 T세포 활성화 및 B세포의 분화를 유도함).

<복강세포의 이산화질소 생산능 판정>

상기와 동일시료 5 mg/ml의 농도로 200 ㎕씩 복강주사 3일 후 복강세포를 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide=그람음성균 세포벽에서 추출한 당지질로 B세포에 활성화를 주는 면역활성물질)로 자극하여 복강세포 내의 이산화질소 생산능을 측정한 결과를 도 2에 나타냈다.

도 1과 도 2의 시험결과에서 면역증강 효과는 비교예 2(용담 50% 에탄올 추출물), 비교예 10 및 비교예 12(아가리쿠스 버섯 50% 에탄올 추출물)의 단독 추출물에 비해 실시예 1의 3가지 생약 추출 농축분말 복합 조성물이 면역 증강효과가 가장 우수하였다.

실험예 7: 무모생쥐 피부조직 염색법에 의한 탄력섬유 합성 촉진효과

자외선 조사기에서 조광량(UVA, 30 J/m²/sec)을 최대로 하여 1리터의 스쿠알렌을 4주간 조사하여 UV 조사된 스쿠알렌에 메탄올 1리터를 동량을 합하여 Shaker에서 2000 rpm으로 2시간동안 혼합하였다. 분리된 상층액만을 취하여 원심분리기에서 3분간 2000 rpm으로 분리한 후 상층액을 채취하여 스쿠알렌-OOH를 만들었다. 산화된 스쿠알렌과 에탄올을 1 : 3의 비율로 희석한 후 이 인공주름 유발물질을 1일 2회 일정한 간격으로 100 ㎕씩 8주령된 무모 생쥐의 피부에 도포하면서 6주간 반복하여 인공주름을 유발시켰다.

본 실험예는 탄력섬유(Elastin) 염색법에 의해 무모 생쥐의 인공주름 유발 후 시료를 도포하였을 때 탄력 개선효과를 보기 위한 실험이다. 상기 실험으로 인공주름이 유발된 무모 생쥐를 50마리의 피부에 10마리씩 5개군으로 나눈 다음, 4개의 실험군에 비교예 2, 10, 12 및 실시예 1의 시료를 0.01% 시료를 50% 에탄올 수용액에 녹이고, 다른 1개의 음성대조군에는 50% 에탄올 수용액을 2주간 도포하여 적출한 무모 생쥐의 피부조직을 베르회프 염색법으로 탄력섬유개선 효과를 비교하였으며, 도 3의 시료 무처리 대조군을 기준으로 비교하여 그 결과를 도 4 ~ 7에 나타내었다.

도 3의 대조군을 기준으로 각 시료의 탄력섬유 합성효과를 나타낸 도 4 ~ 7에서와 같이, 단독 추출물에 비해 본 발명의 실시예 1에서 탄력섬유 밀도가 가장 높아 효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 8: 인체피부에서의 피부 턴오버 촉진 효과 확인 시험

본 발명에 의한 비교예 2, 10, 12 및 실시예 1 및 시료 무처리 대조군과 젖산을 함유한 양성대조군의 피부 턴오버(Turn over) 촉진 효과를 알아보기 위해 건강한 남녀 20명(평균연령 34세)을 대상으로 시료 도포 전 피시험자의 팔 상박부 안쪽 색상을 색도변화계로 측정한 후 디하이드록시 아세톤(DHA)이 함유된 크림을 사용하여 인공탠닝시키고, 시료 도포 전과의 색상 차이를 비교하였다. 이후 1일 2회씩 상기 실시예 및 대조군에 따라 얻어진 시료를 혼합용매(물: 에탄올: 부틸렌글리콜 = 80: 15 : 5)에 0.2 중량%씩 녹여진 시료를 도포하면서 매일 탈색되는 정도를 색도변화계로 측정하여 원래의 피부색으로 돌아오는데 걸리는 시간(단백질 변색에 따른 색도변화=피부 턴오버시간)을 측정하였다. 피부 턴오버 촉진율을 다음 수학식 3으로 계산하여 그 결과 다음 표 8에 나타냈다.

여기서 턴오버 시간은 기존의 각질층이 새로운 각질층으로 교체되는데 걸리는 시간, 즉 DHA에 의해 탠닝된 후 피부가 원상복귀되는데 걸리는 시간임.

구분	Turn Over Time(Days)	피부 턴오버 촉진율(%)
비교예 2	12.8 ± 3.0	29.7
비교예 10	13.4 ± 2.8	26.4
비교예 12	15.2 ± 2.6	16.5
실시예 1	11.8 ± 2.4	35.2
시료 미처리 대조군	18.2 ± 2.2	-
1% 젖산 함유 대조군	13.6 ± 2.8	25.3

상기 표 8에서 보듯이, 실시예 1의 생약추출 농축분말 복합 조성물은 종래의 젖산을 함유한 대조군과 단독 추출물에 비해 피부 턴오버 주기가 짧아져 세포재생력이 우수함을 알 수 있었다.

실험예 9: 인체피부에서의 탄력효과 임상시험

처방예과 비교처방예의 크림을 안면에 도포했을 때 피부 탄력성이 증가되는 효과를 측정하기 위해 실내온도 25 ℃, 상대습도 50% 조건에서 건강한 남녀 20명(평균연령=35세)에게 안면 좌측 부위에는 처방예의 크림을, 안면 우측 부위에는 비교예의 크림을 아침, 저녁으로 1일 2회 도포하고 1주, 2주, 3주, 4주 후에 피부 탄력측정기기(Ball Istometer)를 이용하여 피부의 탄력도를 측정하였다. 그 결과를 다음 표 9 및 도 8에 나타냈다.

구분			처방예 크림					비교처방예 크림
구분			0주	1주	2주	3주	4주	0주	1주	2주	3주	4주
탄 력 성	진 폭	첫번째	1.8	3.6	5.4	6.8	7.6	1.7	3.3	3.9	4.2	4.4
		두번째	1.6	3.4	4.4	5.4	6.1	1.6	2.3	2.6	2.8	3.1
		세번째	0.0	2.3	2.8	4.8	5.8	0.0	0.0	1.8	2.2	2.5
		네번째	0.0	0.0	1.7	3.8	4.4	0.0	0.0	0.0	0.0	0.4
평균값			0.85	2.33	3.58	5.20	5.98	0.83	1.40	2.08	2.30	2.60

상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 복합 추출물을 함유하는 처방예의 크림이 시료를 첨가하지 않은 비교처방예 크림에 비해 피부탄력 개선효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 10: 인체피부에서의 보습 효과 확인 시험

실내온도 25 ℃, 상대습도 50% 조건의 실내에서 건강한 남녀 20명(평균연령=35세)을 대상으로 처방예 및 비교처방예의 크림을 팔 상박에 1일 2회 8주간 도포한 후 피부 손상도 측정기(Tewameter)를 이용하여 경피수분 손실량(Transepidermal Water Loss)의 값을 측정하고, 시간에 따른 변화량인 ΔTEWL을 계산하였다. 또한, 피부 수분 측정기(Corneometer)를 이용하여 표피 수분량(0 ~ 150 범위)에 따른 전기전도도의 변화로 보습효과를 판정하였다.

구분	TWEL변화값(g/hm²)	Corneometer값
처방예 크림	4.6	125
비교처방예 크림	2.8	106

상기와 같이 시험한 결과, 경피수분손실량(TWEL)값은 8주 뒤 평가에서 비교처방예에 비해 현저히 개선됨을 알 수 있었고, 피부 수분량 측정에서도 처방예가 비교처방예 크림 조성물에 비해 높은 값을 나타내어 피부 보습효과가 우수함을 확인하였다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 용담, 은행잎, 아가리쿠스 버섯생약을 각각 추출한 뒤, 농축 분말을 일정비율로 혼합한 복합조성물이 엘라스타제 저해효과, 표피세포 증식효과, 히알루론산 생합성효과, 라미닌 생성효과, 피부면역증강효과, 피부 턴오버 촉진효과, 탄력 개선효과, 피부 보습효과 등에 우수함이 확인되어 이를 화장료로 적용 시, 복합적인 피부탄력 개선효과 및 표피세포 재생효과를 포함하는 피부노화 방지용 화장료로서 매우 유용하리라 기대된다.

Claims

용담 에탄올 추출물, 은행잎 에틸아세테이트 추출물 및 아가리쿠스 버섯 에탄올 추출물을 2 : 0.5 ∼ 2 : 0.5 ∼ 2의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 엘라스타제 저해효과, 표피세포 증식효과, 히알루론산 생합성효과, 라미닌 생성효과, 피부면역 증강효과, 피부 턴오버 촉진효과, 탄력 개선효과 및 보습효과를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 농축 분말 복합 조성물은 전체 화장료 조성에 대하여 0.001 ∼ 10.0 중량% 함유된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화장료는 유연화장수, 수렴화장수, 로션, 에센스, 크림, 겔, 팩, 비누, 에센스시트, 하이드로겔패치 또는 마스크의 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.