CN115364168B - 用于治疗和/或预防糖尿病微血管并发症和/或神经并发症的中药组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药组合物,还涉及制备该中药组合物的方法,还涉及含有该中药组合物的药物,还涉及该中药组合物在制备用于治疗糖尿病微血管和/或神经并发症的药物中的用途。该中药组合物对糖尿病心脏病、肾脏病变、脑病、神经病变及肝脏病变的病理学表现及器官功能均有一定的改善作用。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域,具体涉及一种中药组合物,还涉及制备该中药组合物的方法,含有该中药组合物的药物,该中药组合物在制备用于治疗糖尿病微血管并发症和/或神经并发症的药物中的用途。
背景技术
近年来,随着生活方式、饮食结构及人口老龄化的加剧,糖尿病已成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题之一。我国作为世界第一糖尿病大国,成年人的糖尿病患病率高达11.2%,其中2型糖尿病约占所有糖尿病患者的90%~95%[1-2]。糖尿病患者临床多表现为糖脂代谢紊乱及蛋白质代谢异常,而危及糖尿病患者生活质量和生命安全的多为糖尿病引起的并发症。其中,糖尿病微血管并发症是由糖尿病引起的血管病变累及几乎全身各个器官的微小血管导致的疾病,例如糖尿病心脏病、糖尿病脑病、糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病肝脏病变等。
根据流行病学资料显示,2型糖尿病中68%的死亡是由心脏并发症引起的[3];2型糖尿病患者发生痴呆的风险约是一般人群的2倍[4];同时,将有20%~40%的糖尿病患者进展为糖尿病肾病[5],50%的糖尿病患者发生糖尿病周围神经病变[6];此外,糖尿病门诊患者中约有30%~50%伴有胃排空延迟[7];2型糖尿病患者中非酒精性脂肪肝的患病率亦高达28%~70%[8]。因此,糖尿病微血管并发症的主要不良结局包括心力衰竭、肾功能衰竭、认知功能障碍、截肢、肝硬化等。此外,伴微血管并发症的糖尿病患者年直接医疗费用是无并发症患者的3.18倍[9],因此,若疾病后期才进行干预,往往医疗花费巨大,且治疗效果甚微,为社会带来沉重经济负担。
目前糖尿病微血管并发症的发病机制尚不明确,研究发现高血糖可促进晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs)的形成,同时激活全身和局部的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin–angiotensin–aldosterone system,RAAS),之后通过下游的多种途径(例如氧化应激途径、TGF-β/Smad通路等)诱发炎症反应,促进血管重塑,最终导致器官组织纤维化[10]。其病理特征主要包括基底膜增厚、透明样物质沉积、微血管异常生长和血管通透性改变等[11]。在糖尿病心肌病发展过程中,持续血糖升高可诱导心肌细胞发生肥大、变性、坏死,同时出现心肌纤维化和心肌僵硬度增加,心脏结构发生重构,进一步导致耗氧量增加及心肌缺血,使得心脏在早期出现舒张功能障碍,最终发展为心力衰竭[12];糖尿病脑病在发展过程中可出现病理产物沉积及神经微血管病变,包括脑皮质及海马神经元固缩、排列紊乱,毛细血管局部扭聚成丛,微血管内可见透明血栓,管腔狭窄甚至闭塞,同时海马组织还可出现磷酸化Tau蛋白和淀粉样β蛋白的过量沉积,诱导神经元凋亡变性,随疾病发展最终出现认知功能障碍及痴呆[13];在糖尿病肾病发展过程中,早期可见细胞外基质(ECM)过度沉积、肾小球基底膜逐渐增厚,从而致使肾小球系膜增殖,大量胶原沉积,晚期则表现为肾小球硬化以及肾小管间质纤维化,最终导致肾小球滤过率下降,进展为终末期肾病[14];在糖尿病神经病变发病过程中,由于神经对缺血缺氧敏感性增高,进而可出现基底膜增厚、内皮细胞功能障碍及微血管异常等病理特征,随病情进展可出现下肢疼痛、感觉丧失,最终发生糖尿病足溃疡、感染和截肢[15]。同时,高血糖还可累及胃肠道自主神经,并导致胃组织出现微血管病变,可见微血管管壁迂曲、厚薄不均及连续性中断,进而使得胃组织缺血,抑制平滑肌的正常舒缩功能,影响胃动力,发展为糖尿病胃轻瘫[16]。此外,在糖尿病肝脏病变在发展过程中,由于2型糖尿病可因胰岛素抵抗出现脂代谢紊乱,因此可表现为脂肪变性及小叶间动脉内膜内皮细胞脱落、嗜伊红物质沉积、内膜偏心性增厚、管腔狭窄至闭塞,中膜平滑肌增生或萎缩,外膜纤维组织增生等微血管病变,最终可发展为肝纤维化等[17]。以上病理机制均证实,糖尿病可使全身多器官发生微血管病变,且与高血糖刺激下诱发的多种病变机制密切相关,最终导致组织器官的纤维化及病理产物的沉积,严重影响全身各个器官的生理功能,因此探索一种治疗多种糖尿病微血管及神经并发症的防治药物意义重大。
目前尚无专门针对糖尿病多种微血管及神经并发症的药物,临床多根据不同的致病因素,在控制血糖、血压、血脂的基础上,针对不同靶器官进行对症治疗,促进组织器官的功能恢复并改善患者临床症状,例如加以扩张血管、抗炎、抗纤维化、抗氧化应激、营养神经、促进胃动力等药物。此外,新型的降糖药包括DPP-4抑制剂、GLP-1受体激动剂和SGLT-2抑制剂也可在降低血糖水平的同时可改善心功能及肾功能。然而,上述治疗手段在治疗基础病的同时均存在一定的不良反应,例如胃肠道反应、泌尿系感染等。因此,亟需寻找更为安全有效的治疗方法。与化学药品相比,中药复方成分复杂,其中所包含的不同成分可通过多途径、多靶点协同发挥效应,对早期治疗疾病、延缓疾病发展、改善患者临床症状具有显著的疗效,且副作用小,治疗成本低。
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发明内容
本发明提供一种中药组合物,包括以下原料药:太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣,或者所述中药组合物由包括以下原料药的原料制成:太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣,其中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为(25~35):(5~15):(5~15):(5~15):(5~15):(5~15):(10~20):(5~15):(5~15):(5~15):(2~10):(1~5)。
在某些实施方案中,所述的中药组合物,由以下原料药组成:太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣,或者由以下原料药制成:太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣,其中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为(25~35):(5~15):(5~15):(5~15):(5~15):(5~15):(10~20):(5~15):(5~15):(5~15):(2~10):(1~5)。
在某些实施方案中,所述的中药组合物中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为(27~33):(8~12):(8~12):(8~12):(8~12):(8~12):(11~19):(8~12):(8~12):(8~12):(3~9):(2~4)。
在某些实施方案中,所述的中药组合物中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为(28~32):(9~11):(9~11):(9~11):(9~11):(9~11):(12~18):(9~11):(9~11):(9~11):(4~8):(2.5~3.5)。
在某些实施方案中,所述的中药组合物中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为(29~31):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(14~16):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(5~7):(2.5~3.5)。
在某些实施方案中,所述的中药组合物中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为:太子参30:10:10:10:10:10:15:10:10:10:6:3。
本发明还提供一种制备所述的中药组合物的方法,包括:
将原料药混合,得到原料药混合物;
用水浸提所得原料药混合物。
本发明还提供一种药物,包括所述的中药组合物,和药学可接受的辅料或赋型剂。
本发明还提供所述的中药组合物在制备用于治疗和/或预防糖尿病微血管并发症和/或神经并发症的药物中的用途。
在某些实施方案中,所述的糖尿病微血管并发症和/或神经并发症为2型糖尿病微血管并发症和/或神经并发症。
在某些实施方案中,所述的糖尿病微血管并发症和/或神经并发症为糖尿病心脏病、糖尿病脑病、糖尿病肾病、糖尿病神经病变或糖尿病肝脏病变。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义,即便如此,本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释,提及的术语和短语如有与公知含义不一致的,以本发明所表述的含义为准。
本发明中,术语“太子参”,其拉丁名为Radix Pseudoxtellariae,其为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm的干燥块根。在入药时,优选的炮制方法为:除去杂质及残留须根,抢水洗净,捞出干燥。
本发明中,术语“黄芪”,其拉丁名为Astragali Radix,其为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus Fisch)Bge.var.mongholicus(Bg e)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.的干燥根。在入药时,优选的炮制方法为:除去杂质,大小分开,洗净,润透,切厚片,干燥。
本发明中,术语“麦冬”,其拉丁名为OphiopogonisRadix,其为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根。在入药时,优选的炮制方法为:除去杂质,洗净,润透,轧扁,干燥。
本发明中,术语“醋五味子”,其拉丁名为Schisandrae Chinensis fructus,其为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。在入药时,优选的炮制方法为:取净五味子,照醋蒸法(通则0213)蒸至黑色,用时捣碎。
本发明中,术语“丹参”,其拉丁名为SalviaeMiltiorrhizae Radix et Rhizoma,其为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根茎。在入药时,优选的炮制方法为:除去杂质和残茎,洗净,润透,切厚片,干燥。
本发明中,术语“当归”,其拉丁名为Angelicae Sinensis Radix,其为伞形科植物当归Angelica sin:ensis(Oliv.)Diels的干燥根。在入药时,优选的炮制方法为:除去杂质,洗净,润透,切薄片,晒干或低温干燥。
本发明中,术语“赤芍”,其拉丁名为Paeonia Radix Rubra,其为毛莨科植物芍药Paeonia lacti,lora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根。在入药时,优选的炮制方法为:除去杂质,分开大小,洗净,润透,切厚片,干燥。
本发明中,术语“鬼箭羽”,其拉丁名为RamulusEuonymi,其为卫矛科植物卫矛Euonymus alatus(Thunberg)Siebold的干燥带有翅状物的枝条或翅状物。在入药时,优选的炮制方法为:取原药,除去杂质,筛去灰屑。
本发明中,术语“浙贝母”,其拉丁名为FritillariaeThunbergii Bulbus,其为百合科植物浙贝母FritillarathunbergiiMiq.的干燥鳞茎。在入药时,优选除去杂质,未切片者,洗净,润透,切厚片,干燥;或打成碎块。
本发明中,术语“夏枯草”,其拉丁名为Prunellae Spica,其为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥。在入药时,优选的炮制方法为:拣去杂质,去柄,筛去泥土。
本发明中,术语“三七”,其拉丁名为Notoginseng Radix Et Rhizoma,其为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎。在入药时,优选的炮制方法为:洗净,蒸透,取出,及时切片,干燥。
本发明中,术语“蜈蚣”,其拉丁名为Scolopendra,其为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch的干燥体。在入药时,优选的炮制方法为:去竹片,洗净,微火焙黄,剪段。
本发明所述的中药组合物或药物可以经多种途径施用,例如口服片剂,胶囊,粉剂,口服液,注射剂和透皮制剂。根据常规的药物上的惯例,药学上可接受的载体包括稀释剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂、着色剂、调味剂或其它常规添加剂。典型的药学上可接受的载体包括例如微晶纤维素、淀粉、交连聚维酮、聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、麦芽糖醇,柠檬酸,十二烷基磺酸钠或硬脂酸镁等。
本发明所述的中药组合物或药物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明所述的中药组合物,针对不同患者的特定使用剂量和使用方法决定于诸多因素,包括患者的年龄,体重,性别,自然健康状况,营养状况,服用时间,代谢速率,病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。这里优选使用剂量介于0.001-1000mg/kg体重/天。
本申请所提供的中药组合物被命名为益消方,在本发明实施例中,术语“中药组合物”、“中药”和“益消方”具有相同的含义,三者可以互换使用;术语“中药组合物组”、“中药组”和“益消方组”具有相同的含义,三者可以互换使用。
本发明的有益技术效果
本发明提供的中药组合物对糖尿病微血管并发症例如糖尿病心脏病、肾脏病变、脑病及肝脏病变的病理学表现及器官功能均有一定的改善作用。
该中药组合物可通过多靶点,同时作用于不同组织器官的微血管及神经,协同发挥效应,对全身多处组织器官均有一定的疗效。
与目前临床控制血糖、血压、血脂及针对不同靶器官进行对症治疗的化学药品相比,该中药组合物副作用小,治疗成本低,且对于早期治疗疾病、延缓疾病发展、改善患者临床症状均具有显著的疗效。
附图说明
图1为各组小鼠心肌组织AngⅡ蛋白表达的检测结果,显示了本申请中药组合物(益消方)对各组小鼠心肌组织AngⅡ的影响,其中左侧图为各个时间点各组小鼠心肌组织AngⅡ蛋白表达的Western blot蛋白质免疫印迹检测的结果,泳道1:正常组4W,泳道2:模型组4W,泳道3:中药组4W,泳道4:正常组8W,泳道5:模型组8W,泳道6:中药组8W,泳道7:正常组12W,泳道8:模型组12W,泳道9:中药组12W;右侧图为给药12W时各组小鼠心肌组织AngⅡ与β-actin mRNA的比值。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠心肌AngⅡ蛋白及mRNA相对表达水平显著上调(p<0.05),与模型组相比,益消方组小鼠心肌AngⅡ蛋白及mRNA相对表达水平均显著下调(p<0.05)。
图2为各组小鼠心肌组织的HE染色和Masson染色结果,显示了本申请中药组合物(益消方)对各组小鼠心肌病理及心肌纤维化的影响,其中A为各组小鼠的心肌纵切面HE染色结果;B为各组小鼠的心肌Masson染色结果及纤维化面积占比直方图,与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,△P<0.05,△△P<0.01。结果显示,益消方可改善心肌细胞排列紊乱,细胞肿胀,心肌细胞肥大、细胞间隙增大、空泡样变等病变;益消方组在给药12周后可观察到心肌间质的胶原纤维面积较模型组显著减少(P<0.01)。
图3为给药12周后各组小鼠心肌组织的免疫组化检测结果,显示了本申请中药组合物(益消方)对各组小鼠心肌collagenⅠ和collagenⅢ的影响,其中左侧图为各组小鼠心肌collagenⅠ和collagenⅢ蛋白表达图像;右侧图为各组小鼠的心肌collagenⅠ和collagenⅢ的阳性面积占比直方图,与对照组相比,*P<0.05;与模型组相比,#P<0.05。结果显示,益消方组collagenⅠ和collagenⅢ的阳性面积较模型组显著减少(P<0.05)。
图4为给药12周后,各组小鼠的心肌组织蛋白表达及mRNA表达水平检测结果,显示了本申请中药组合物(益消方)对心肌组织TGF-β/Smads信号通路活性的影响,其中:采用Western blot检测各组小鼠心肌TGF-β、Smad7表达以及Smad2和Smad3的磷酸化水平,采用RT-qPCR检测各组小鼠TGF-β、Smad7的mRNA表达水平,并且与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,△P<0.05,△△P<0.01。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠心肌TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白及mRNA相对表达水平显著上调(p<0.05),Smad7蛋白相对表达水平显著下调;与模型组相比,益消方组小鼠心肌TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白及mRNA相对表达水平均显著下调(p<0.05)。
图5和图6为各组小鼠脑冠状切面海马组织HE染色结果(放大400×),其中:图5显示了本申请中药组合物(益消方)对各组小鼠海马CA1区神经细胞的影响,图6显示了本申请中药组合物(益消方)对各组小鼠海马CA3区神经细胞的影响,黄色箭头示意细胞凋亡,黑色箭头示意细胞坏死。结果显示,模型组小鼠海马CA1区及CA3区自干预第4周起神经细胞排列疏松,胞膜和核仁较模糊,可见部分固缩、深染的凋亡细胞及坏死细胞,且随着疾病的发展,可发展为成片细胞坏死区域,益消方干预后可以不同程度缓解上述病理改变。
图7为给药12周后各组小鼠海马组织蛋白表达及mRNA表达水平检测结果,显示了本申请中药组合物(益消方)对海马组织TGF-β/Smads信号通路活性的影响,其中:采用Western blot法检测各组小鼠海马组织TGF-β、Smad7表达以及Smad2和Smad3的磷酸化水平(n=3);采用RT-qPCR检测各组小鼠海马TGF-β、Smad7的mRNA表达水平(n=3),并且与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,△P<0.05,△△P<0.01。结果显示,益消方组TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3水平较模型组明显降低(P<0.05),Smad7水平较模型组显著升高(P<0.01)。
图8和图9为给药12周后,各组小鼠肾脏组织的HE染色和Masson染色结果,其中图8显示了本申请中药组合物(益消方)对各组小鼠肾脏病理的影响,图9显示了本申请中药组合物(益消方)对各组小鼠肾脏纤维化的影响。结果显示,给药12周后,益消方可改善肾小球肥大,肾小球基底膜增厚,细胞外膜基质增加,肾小管上皮细胞肿胀等病变;益消方可显著降低肾小球及肾小管间质胶原纤维的沉积。
图10和图11为给药12周后,各组小鼠肝脏组织的HE染色和Masson染色结果,其中图10显示了本申请中药组合物(益消方)对各组小鼠肝脏病理的影响,图11显示了本申请中药组合物(益消方)对各组小鼠肝脏纤维化的影响。结果显示,在给药12周后,益消方可改善肝细胞肿胀,细胞核间距离增大,脂肪空泡,窦周及中央静脉周纤维组织增生等病变;益消方可显著降低窦周及中央静脉周胶原纤维的沉积。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本申请的内容。在本申请中,以下所述的实施例是为了更好的阐述本申请,并不是用来限制本申请的范围。
本发明实施例中各中药原料的来源和炮制方法如下:
(1)太子参Radix Pseudoxtellariae(石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm的干燥块根,炮制:除去杂质及残留须根,抢水洗净,捞出干燥),
(2)黄芪Astragali Radix(豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus Fisch)Bge.var.mongholicus(Bg e)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.的干燥根,炮制:除去杂质,大小分开,洗净,润透,切厚片,干燥),
(3)麦冬OphiopogonisRadix(百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根,炮制:除去杂质,洗净,润透,轧扁,干燥),
(4)醋五味子Schisandrae Chinensis fructus(木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实,炮制:取净五味子,照醋蒸法(通则0213)蒸至黑色,用时捣碎),
(5)丹参SalviaeMiltiorrhizae Radix et Rhizoma(唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎,炮制:除去杂质和残茎,洗净,润透,切厚片,干燥),
(6)当归Angelicae Sinensis Radix(伞形科植物当归Angelica sin:ensis(Oliv.)Diels的干燥根,炮制:除去杂质,洗净,润透,切薄片,晒干或低温干燥),
(7)赤芍Paeonia Radix Rubra(毛莨科植物芍药Paeonia lacti,lora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根,炮制:除去杂质,分开大小,洗净,润透,切厚片,干燥),
(8)鬼箭羽RamulusEuonymi(卫矛科植物卫矛Euonymus alatus(Thunberg)Siebold的干燥带有翅状物的枝条或翅状物,炮制:取原药,除去杂质,筛去灰屑),
(9)浙贝母FritillariaeThunbergii Bulbus(百合科植物浙贝母FritillarathunbergiiMiq.的干燥鳞茎,炮制:除去杂质,未切片者,洗净,润透,切厚片,干燥,或打成碎块),
(10)夏枯草Prunellae Spica(唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗,炮制:拣去杂质,去柄,筛去泥土即得),
(11)三七Notoginseng Radix Et Rhizoma(五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎,炮制:洗净,蒸透,取出,及时切片,干燥),
(12)蜈蚣Scolopendra(蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch的干燥体,去竹片,洗净,微火焙黄,剪段)。
实施例1中药组合物(益消方)的制备
1.1中药组合物的组成、来源及炮制方法
该中药组合物(益消方)由以下中药原料制成:太子参30g,黄芪10g,麦冬10g,醋五味子10g,丹参10g,当归10g,赤芍15g,鬼箭羽10g,浙贝母10g,夏枯草10g,三七6g,蜈蚣3g。
1.2中药组合物(益消方)的制备方法
取上述中药原料共134g,加10倍体积的蒸馏水后浸泡30min,煮沸1h,之后静置过滤,用第一次煎药后提取的残渣再次重复以上程序。最后,将2次过滤后的溶液合并,浓缩至浓度为0.77g/ml(即1ml提取液含0.77g干燥的生药提取物)。将上述所得药液在室温冷却后于4℃冰箱保存备用。
实施例2
实施例2的中药组合物的组成如下:
太子参25~35g,黄芪5~15g,麦冬5~15g,醋五味子5~15g,丹参5~15g,当归5~15g,赤芍10~20g,鬼箭羽5~15g,浙贝母5~15g,夏枯草5~15g,三七2~10g,蜈蚣1~5g。
参照实施例1中1.2中所述方法制备得到实施例2的中药组合物(益消方)。
实验例
本申请提供的中药组合物(益消方)具有益气养阴,消癥散结的作用,可用于治疗糖尿病微血管并发症和/或神经并发症。下面的实验例对本申请提供的中药组合物的药理作用进行验证。
1实验材料及仪器
1.1实验药物
本申请实施例1制备得到的中药组合物(益消方)。
氯沙坦钾片(批准文号国药准字J20180006),规格:100mg/片,购自杭州默沙东制药有限公司。
1.2实验试剂
伊红染液(北京Solarbio公司,货号:G1100);苏木素染液(北京Solarbio公司,货号:G1140);改良Masson三色染色试剂盒(北京Solarbio公司,货号:G1346);载玻片(江苏世泰CITOTEST公司,货号:188105W);盖玻片(江苏世泰CITOTEST公司,货号:10212424C);中性树胶(北京Solarbio公司,货号:G8590);兔二步法检测试剂盒(中杉金桥,货号:PV-9001);TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad7、Collagen I抗体(美国Abcam公司,货号ab215715、ab40855、ab40854、ab280888、ab52903、ab216428、ab270993);CollagenⅢ抗体(武汉Proteintech公司,货号:22734-1-AP);GAPDH抗体(美国CST公司,货号:#4970);AngII抗体(美国Abbiotec,货号:251229);RNeasy plus Mini Kit(德国Qiagen公司,货号:74134);TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京Transgen Biotech公司,货号:AT301-02);BlasTaqTM 2X qPCR MasterMix(ABM公司,货号:G891)。
1.3主要仪器
罗氏活力血糖仪及其配套试纸(上海罗氏制药有限公司);全封闭式组织脱水机(德国Leica公司);全自动组织包埋机(德国Leica公司);轮转式切片机(德国Leica公司);高分辨率小动物彩色多普勒超声成像系统(美国Visual Sonics公司);QuantStudioTM6Flex实时荧光定量PCR系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
2检测方法
2.1病理学观察:取小鼠心脏、肾脏、肝脏、海马组织做常规HE染色、Masson染色:标本经10%中性甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、制片、行HE染色,在光镜下观察组织形态学改变并拍照;行Masson染色,光镜下观察胶原纤维染色情况。
2.2采用免疫组化方法检测心脏、肾脏和肝脏组织Collagen I、CollagenⅢ的蛋白表达:石蜡切片脱蜡后,放入EDTA抗原修复液中进行抗原修复,滴加正常山羊血清封闭后PBS清洗,滴加一抗,4℃,过夜,第二天二抗孵育,DAB显色,显微镜下观察,拍照,图像分析系统分析比较蛋白表达。
2.3采用Western blot检测各组织TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad7的蛋白表达及心肌组织AngII的蛋白表达:取冻存组织研磨,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,10%SDS-PAGE电泳分离,转至PVDF膜,加入一抗、二抗孵育,ECL法显色,凝胶成像分析系统摄像分析。
2.4采用实时定量RT-PCR方法检测各组织TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad7的含量及心肌组织AngII的含量:取冻存组织,按照RNeasy Plus Mini Kit试剂盒说明书步骤,提取组织总RNA,经紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度,依逆转录试剂盒说明书提取1.5ug总RNA逆转录成cDNA。按照实时定量PCR试剂盒说明书组成实时定量PCR反应体系,在实时定量PCR仪内进行扩增反应。
3实验方案及结果
3.1益消方对糖尿病小鼠血糖的影响
实验动物为12周龄雄性C57BL/6J小鼠24只和12周龄雄性自发性2型糖尿病KKAy小鼠72只(均购自北京华阜康生物科技股份有限公司)。适应性喂养2周后,测量KKAy小鼠空腹血糖(FBG),FBG≥13.9mmol/L者确定为糖尿病小鼠,纳入实验。24只C57BL/6J小鼠为对照组,将KKAy小鼠随机分为模型组、益消方组(中药组)和氯沙坦钾组(西药组),每组24只。KKAy小鼠给予高脂饲料,C57BL/6J小鼠给予普通饲料(饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司)。小鼠等效剂量的给药量为临床成人每公斤体重用药量的10倍,每10g体重灌胃0.1ml。益消方组灌胃予益消方7.7g/(kg·d);氯沙坦钾组灌胃予氯沙坦钾10mg/(kg·d);模型组及对照组在治疗给药期间灌胃给予同容积的蒸馏水,每天给药1次,连续给药3个月。
分别在给药0、4、8、12周(即第14、18、22、26周龄),各组按随机原则处死小鼠。末次给药后禁食12h,尾静脉取血,用血糖仪测定小鼠血糖值。之后麻醉小鼠,经摘眼球取血,离心血清以备检测血清学指标。采血完毕后,分别取小鼠心脏、肾脏、海马、肝脏,冰盐水清洗后称重,均切取部分组织放入10%中性甲醛用以组织学检测,其余部分投入液氮,转入-80℃冰箱保存。
小鼠血糖检测结果见表1。结果显示,模型组、益消方组小鼠于给药0、4、8、12周空腹血糖水平与对照组比较均较高(p<0.01);益消方组小鼠空腹血糖水平于给药第8周和12周较模型组相比显著下降(p<0.01)。
表1各组小鼠干预期间空腹血糖水平(mmol/L)
注:与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。
3.2益消方对糖尿病小鼠脂质代谢的影响
实验动物为雄性SPF级C57BL/6J小鼠40只,雄性SPF级KKAy小鼠80只,均购自中国医学科学院实验动物研究所。KKAy小鼠测量空腹血糖(FBG),FBG≥13.9mmol/L者确定为糖尿病小鼠,纳入实验。将KKAy小鼠随机分为模型组和中药组,C57BL/6J小鼠则为正常对照组,分组后给药,小鼠给药量为20.2g/(kg·d),即中药组给予20.2g/(kg·d)灌服益消方中药,模型组及正常组给予20.2g/(kg·d)灌服蒸馏水,给药共12周。实验期间,C57BL/6J小鼠给予小鼠生长维持颗粒饲料,KKAy小鼠给予高脂饲料(含10%猪油、10%蛋黄粉和10%葡萄糖,为KKAy小鼠专用高能量饲料),饲料均由中国医学科学院医学实验动物研究所提供。在实验的第4、8、12周末,水合氯醛麻醉后,腹主动脉采血,分离血清,使用全自动生化分析仪测定三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)等指标,结果见表2至表5。
结果显示,给药12周后,与正常组比较,给药4、8、12周模型组及益消方组小鼠TG、TC、LDL水平明显升高(p<0.01);益消方组小鼠在第8周时与模型组相比TC、TG、LDL均显著下降(p<0.05);HDL显著升高(p<0.05)。
表2各组小鼠血清TC的比较(mmol/L)
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注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,△P<0.05,ΔΔP<0.01。
表3各组小鼠血清TG的比较(mmol/L)
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,△P<0.05,△△P<0.01。
表4各组小鼠血清LDL的比较(mmol/L)
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,ΔP<0.05,△ΔP<0.01。
表5各组小鼠血清HDL的比较(mmol/L)
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。
3.3益消方对糖尿病小鼠心脏病的影响
3.3.1益消方对糖尿病小鼠心肌组织的影响1
实验动物为雄性SPF级C57BL/6J小鼠40只,雄性SPF级KKAy小鼠80只,均购自中国医学科学院实验动物研究所。测量空腹血糖(FBG),FBG≥13.9mmol/L者确定为糖尿病小鼠,纳入实验。实验期间,将KKAy小鼠随机分为模型组和中药组,C57BL/6J小鼠则为正常对照组,C57BL/6J小鼠给予小鼠生长维持颗粒饲料,KKAy小鼠给予高脂饲料(含10%猪油、10%蛋黄粉和10%葡萄糖,为KKAy小鼠专用高能量饲料),饲料均由中国医学科学院实验动物研究所提供。中药组给予20.2g/(kg·d)灌服益消方中药,模型组及正常组给予20.2g/(kg·d)灌服蒸馏水,给药共12周。
在实验的第4、8、12周末,水合氯醛麻醉后,各组按随机原则处死小鼠,取心脏,称重后均切取部分组织放入10%中性福尔马林固定用以检测。采用Western Blot检测各组小鼠心肌组织Ang II蛋白表达水平,并且采用RT-qPCR检测各组小鼠心肌组织Ang II的mRNA相对表达水平,结果见表6和表7以及图1。
结果显示,与对照组相比,模型组小鼠心肌Ang II蛋白及mRNA相对表达水平显著上调(p<0.05),与模型组相比,益消方组小鼠心肌Ang II蛋白及mRNA相对表达水平均显著下调(p<0.05)。
表6各组小鼠心肌组织Ang II蛋白相对表达量的比较(Ang II蛋白与β-actin WB比值)
注:与正常组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组较ΔP<0.05。
表7各组小鼠Ang II mRNA相对表达量的比较(Ang II蛋白与β-actinmRNA比值)
注:与正常组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组较ΔP<0.05。
3.3.2益消方对糖尿病小鼠超声心动的影响
实验动物、分组及给药同3.1。
对小鼠进行超声心动测量,检测小鼠的心功能情况。于给药0、4、8、12周,小鼠处死前1-2天行超声心动图测量,获取小鼠经胸廓二维,M模式超声心动图和脉冲波多普勒谱成像。检测以下指标:小鼠左心室射血分数(LVEF)、舒张期左室前壁厚度(LVAWd)、舒张期左室后壁厚度(LVPWd)、E/A、e’/a’、E/e’。结果如表8所示。
结果显示,在给药0、4周时,与对照组相比,模型组、益消方组的LVAWd、LVPWd均有显著增加(P<0.05);在给药8、12周时,益消方组LVAWd、LVPWd均较模型组显著减少(P<0.05);在给药0周,与对照组比较,模型组、益消方组的E/A、e’/a’均有降低(P<0.05);在给药第8、12周时,益消方组E/A、e’/a’较模型组均有显著增加(P<0.05);各组小鼠的LVEF均在正常范围内,且组间无统计学意义(P>0.05)。
表8 KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠心脏功能学指标的比较/>
注:与对照组相比,*P<0.05,与模型组相比,▲P<0.05。
3.3.3益消方对糖尿病小鼠心肌组织的影响2
实验动物、分组及给药同3.1。心肌组织各项指标的检测方法参见2。
对各组小鼠心肌组织进行HE染色和Masson染色,染色结果如图2所示。结果显示,益消方可改善心肌细胞排列紊乱,细胞肿胀,心肌细胞肥大、细胞间隙增大、空泡样变等病变;益消方组在给药12周后可观察到心肌间质的胶原纤维面积较模型组显著减少(P<0.01)。
给药12周后各组小鼠心肌组织的免疫组化检测结果见图3。结果显示,益消方组collagen I和collagenIII的阳性面积较模型组显著减少(P<0.05)。
给药12周后,各组小鼠的心肌组织蛋白表达及mRNA表达水平见图4,与对照组相比,模型组小鼠心肌TGF-β、p-Smad2、p-Smad3、Ang II蛋白及mRNA相对表达水平显著上调(p<0.05),Smad7蛋白相对表达水平显著下调;与模型组相比,益消方组小鼠心肌TGF-β、p-Smad2、p-Smad3及mRNA相对表达水平均显著下调(p<0.05)。
3.4益消方对糖尿病小鼠脑病的影响
3.4.1益消方对糖尿病小鼠认知功能的影响
实验动物为雄性SPF级C57BL/6J小鼠12只和雄性SPF级KKAy小鼠30只,,均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。C57BL/6J小鼠为正常组,随机分为灌胃4周和8周组(各6只)。随机选取糖尿病模型KKAy小鼠24只,分模型组和中药组(各12只),再各自随机分为2个小组,即灌胃4周和灌胃8周组(各6只)。C57BL/6J小鼠予普通饲料喂养,KKAy小鼠予高脂饲料(含猪油、蔗糖、蛋黄粉、玉米、大豆油等组分)。测量空腹血糖(FBG),2次FBG均高于13.9mmol/L者确定为糖尿病小鼠,纳入实验。中药组按7.7g/(kg·d)灌服益消方,模型组、正常组灌服同等体积蒸馏水。给药4、8周后进行Morris水迷宫测试。
水迷宫为一直径1.2m、高0.5m、深0.3m的不锈钢圆形水池,水池第一象限内放入直径9cm的圆台,置于水面下1cm。池水中加入钛白粉,混匀呈乳白色,以使动物视觉无法辨认池内站台位置,池内水温25~27℃。计算机摄像系统自动监测小鼠在水池中的游泳情况,并通过软件分析获取实验数据。整个水迷宫测试连续6d,分定位航行实验和空间探索实验2个阶段。
定位航行试验历时5d,第1天为适应性训练,再进行水迷宫实验。第2天至第5天为定位航行实验,每天训练2次,4个象限的入水点每次随机选一处将小鼠面朝池壁放入池水,记录120s内小鼠从入水到寻到圆台所用的时间为逃避潜伏期。若小鼠在120s内未能找到圆台,引导至站台放置30s,引导其学习和记忆,此时逃避潜伏期记为120s。在训练及测试过程中圆台位置保持不变。
第6天进行空间探索试验。第6天撤除圆台,随机选一入水点将小鼠面朝池壁入水,系统自动记录120s内小鼠:1)游泳轨迹;2)目标象限(第一象限)滞留时间占总时间百分比;3)初始角度:小鼠躯体长轴指向与站台中心的夹角(°),数值越小表示学习记忆能力越高;4)穿越圆台位置的次数,评估小鼠空间记忆能力。
Morris水迷宫实验结果见表9和表10。结果显示,定位航行试验中,给药8周后,益消方组逃避潜伏期在训练第4、5天时与模型组比较明显缩短(P<0.05)。空间探索试验中,给药8周后,益消方组初始角度与穿越圆台次数较模型组有一定改善。
表9 3组小鼠定位航行试验中逃避潜伏期(n=6)
注:与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,ΔP<0.05。
表10初始角度和穿越圆台次数(n=6)
注:与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,ΔP<0.05。
3.4.2益消方对糖尿病小鼠海马组织的影响
实验动物、分组及给药同3.1。海马组织各项指标的检测方法参见2。
给药12周后,对海马组织进行HE染色,结果见图5和图6。结果显示,模型组小鼠海马CA1区及CA3区自干预第4周起神经细胞排列疏松,胞膜和核仁较模糊,可见部分固缩、深染的凋亡细胞及坏死细胞,且随着疾病的发展,可发展为成片细胞坏死区域,益消方干预后可以不同程度缓解上述病理改变。
给药12周后,各组小鼠海马组织蛋白表达及mRNA表达水平见图7。结果显示,益消方组TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3水平较模型组明显降低(P<0.05),Smad7水平较模型组显著升高(P<0.01)。
3.5益消方对糖尿病小鼠肾脏病变的影响
实验动物、分组及给药同3.1。肾脏组织各项指标的检测方法参见2。
给药12周后,各组小鼠肾脏组织的HE染色和Masson染色结果见图8和图9。结果显示,给药12周后,益消方可改善肾小球肥大,肾小球基底膜增厚,细胞外膜基质增加,肾小管上皮细胞肿胀等病变;益消方组在给药12周后肾小球及肾小管间质胶原纤维的沉积显著降低。
3.6益消方对糖尿病小鼠肝脏病变的影响
实验动物、分组及给药同3.1。肝脏组织各项指标的检测方法参见2。
各组小鼠的肝脏指数水平见表11,模型组、益消方组小鼠于给药0、4、8周肝脏指数水平与对照组比较均较高(p<0.05);益消方组小鼠肝脏指数水平于给药第8周较模型组相比显著下降(p<0.05)。
表11各组小鼠肝体比(%)
注:与对照组相比,*p<0.05,与模型组相比,▲p<0.05。
采用全自动生化分析仪检测检测血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT),结果见表12。结果显示,给药8周后,模型组小鼠AST水平较对照组显著升高(p<0.05),中药组较模型组水平显著降低(p<0.05)。
表12各组小鼠肝功能比较
注:与对照组相比,*p<0.05,与模型组相比,▲p<0.05。
给药12周后,各组小鼠肝脏组织的HE染色和Masson染色结果见图10和图11。结果显示,给药12周后,益消方可改善肝细胞肿胀,细胞核间距离增大,脂肪空泡,窦周及中央静脉周纤维组织增生等病变;益消方组在给药12周后窦周及中央静脉周胶原纤维的沉积显著降低。
4实验结论
上述动物实验证实本发明提供的益消方对糖尿病心脏病、肾脏病变、脑病及肝脏病变的病理学表现及器官功能均有一定的改善作用,并且这种改善与由高血糖刺激诱发RAAS激活的下游通路密切相关。具体地,
益消方可显著降低自发性2型糖尿病KKAy小鼠的空腹血糖水平;显著改善自发性2型糖尿病KKAy小鼠的脂质代谢水平。
益消方可抑制KKAy小鼠舒张期左室前壁厚度和舒张期左室后壁厚度的增加,抑制糖尿病心肌病小鼠心室肌重构进程,并显著改善糖尿病心肌病小鼠的心脏舒张功能;明显减轻KKAy糖尿病心脏病小鼠心肌细胞肥大和心肌坏死程度,改善KKAy糖尿病心脏病小鼠心肌纤维化程度,且与TGF-β/Smads信号通路密切相关。
益消方可缩短糖尿病动物模型小鼠逃避潜伏期,增加原圆台穿越次数及目标象限游泳时间,具有一定延缓糖尿病小鼠认知功能障碍发生进程的功效,并改善其学习记忆行为;显著改善糖尿病小鼠海马组织病理损伤,并抑制其TGF-β信号通路相关蛋白和基因的表达。
益消方可改善自发性糖尿病动物模型KKAy小鼠肾脏病理学改变,对糖尿病模型动物的肾脏具有一定的保护作用。
益消方可显著改善糖尿病自发性糖尿病动物模型KKAy小鼠肝脏指数及脂质代谢水平;改善肝脏病理损伤及肝脏纤维化程度。
上述实验结论表明益消方可通过多靶点,同时作用于不同组织器官的微血管及神经,协同发挥效应,对全身多处组织器官均有一定的疗效。与目前临床控制血糖、血压、血脂及针对不同靶器官进行对症治疗的化学药品相比,益消方不仅副作用小,治疗成本低,且对于早期治疗疾病、延缓疾病发展、改善患者临床症状均具有显著的疗效。
Claims (11)
1.一种用于治疗和/或预防糖尿病微血管并发症和/或神经并发症的中药组合物,由以下原料药组成:太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣,或者
由以下原料药制成:太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣,
其中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为(25~35):(5~15):(5~15):(5~15):(5~15):(5~15):(10~20):(5~15):(5~15):(5~15):(2~10):(1~5)。
2.权利要求1所述的中药组合物,其中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为(27~33):(8~12):(8~12):(8~12):(8~12):(8~12):(11~19):(8~12):(8~12):(8~12):(3~9):(2~4)。
3.权利要求1或2所述的中药组合物,其中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为(28~32):(9~11):(9~11):(9~11):(9~11):(9~11):(12~18):(9~11):(9~11):(9~11):(4~8):(2.5~3.5)。
4.权利要求3所述的中药组合物,其中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为(29~31):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(14~16):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(9.5~10.5):(5~7):(2.5~3.5)。
5.权利要求4所述的中药组合物,其中太子参,黄芪,麦冬,醋五味子,丹参,当归,赤芍,鬼箭羽,浙贝母,夏枯草,三七,蜈蚣的重量比为:太子参30:10:10:10:10:10:15:10:10:10:6:3。
6.制备权利要求1-5任一项所述的中药组合物的方法,包括:
将原料药混合,得到原料药混合物;
用水浸提所得原料药混合物。
7.一种药物,包括权利要求1-5任一项所述的中药组合物,和药学可接受的辅料。
8.权利要求7所述的药物,其中所述的药学可接受的辅料为赋形剂。
9.权利要求1-5任一项所述的中药组合物在制备用于治疗和/或预防糖尿病微血管并发症和/或神经并发症的药物中的用途。
10.权利要求9所述的用途,其中所述的糖尿病微血管并发症和/或神经并发症为2型糖尿病微血管并发症和/或神经并发症。
11.权利要求1-5任一项所述的中药组合物在制备用于治疗和/或预防糖尿病心脏病、糖尿病脑病、糖尿病肾病、糖尿病神经病变或糖尿病肝脏病变的药物中的用途。
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活血化瘀法治疗糖尿病周围神经病变;田悦等;吉林中医药;-;第25卷(第10期);第22页 * |
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