CN101897786A - 九里香叶总黄酮在制备预防与治疗糖尿病肾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了九里香叶总黄酮的一种新的医药用途，即从九里香叶中获得的5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮和5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮的含量之和大于50％的九里香叶总黄酮对糖尿病肾病具有显著的预防与治疗作用。

Description

九里香叶总黄酮在制备预防与治疗糖尿病肾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及对糖尿病肾病具有预防与治疗作用的中药有效部位，提供的是一种植物提取物的新的医药用途，即九里香叶总黄酮在制备预防与治疗糖尿病肾病药物中的应用，属于中医中药领域。

背景技术

随着社会的进步，人民生活水平的不断提高和饮食结构的改变，2型糖尿病的发病率正在逐年迅速增长，并且发病呈低龄化发展趋势，严重地影响了人们的健康水平。约有40％的糖尿病患者并发糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，越来越多的糖尿病肾病患者最终将进入致死率最高的终末期肾病(End Stage Renal disease，ESRD)阶段。根据中华肾脏病协会的统计数据显示，在我国DN是终末期肾病的第二大病因，而在西方国家，DN早已成为终末期肾病发病的首要因素。糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是糖尿病患者致死、致残的主要原因。如何预防和改善DN的发生发展，提高糖尿病患者的生活质量，早已经成为科研工作者们研究的热点。

近些年随着DN发病率的增高，对其发病机制的研究也取得了较大的进展。一般认为主要由血流动力学改变、生化代谢紊乱、氧化应激损伤、细胞生长因子异常增多和遗传因素等多种原因相互影响共同导致DN的发生。

九里香[Murraya paniculata(L.)Jack]为芸香科九里香属植物，又名千里香，主要产自我国云南、贵州、湖南、广东、广西、福建、台湾等地。到目前为止从九里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]叶中分得的黄酮类化合物有3，5，6，7，8，3′，4′，5′-八甲氧基黄酮(3，5，6，7，8，3′，4′，5′-octamethoxyflavone)、3，5，6，7，3′，4′，5′--七甲氧基黄酮(3，5，6，7，3′，4′，5′-heptamethoxyflavone)(江苏新医学院，中药大辞典，上册，上海人民出版社，1977：44-45)；5，7，8，3′，4′，5′-六甲氧基黄酮(5，7，8，3′，4′，5′-hexamethoxyflavone)、3，5，7，8，3′，4′，5′-七甲氧基黄酮(3，5，7，8，3′，4′，5′-heptamethoxyflavone)(植物学报1984，26(2)：184-186)；5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮(5，7，3′，4′，5′-pentamethoxyflavone)(化学学报1984，42，1308-1311)以及5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3′，4′-三甲氧基黄酮以及3′-羟基-5，7，4′-三甲氧基黄酮(中国专利《千里香叶总黄酮及其制备方法及应用》，申请号200710147357.2)。

发明内容

本发明提供的是一种植物提取物的新的医药用途，即九里香叶总黄酮在制备预防与治疗糖尿病肾病药物中的应用。所述九里香叶总黄酮其特征在于其中至少含有5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3′，4′-三甲氧基黄酮中的两种或两种以上。而且其中5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3′，4′-三甲氧基黄酮的含量之和大于50％，或者5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮和5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮的含量之和大于50％。本发明所述的药物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等口服剂型，也可以是注射剂等非口服剂型。另外本发明所述的九里香叶总黄酮可以与其他药物包括化学药、中药以及天然药物组成复方药物用于糖尿病的治疗。

我们的前期研究证明，九里香叶总黄酮对实验性2型糖尿病具有治疗作用，但有关九里香叶总黄酮对2型糖尿病肾病的预防与治疗作用尚未见研究报道。

本发明通过高糖高脂饮食伴小剂量链脲佐菌素建立大鼠实验性2型糖尿病肾病(T2DN)模型，观察了九里香叶总黄酮对大鼠的血糖、血脂代谢、自由基氧化损伤、炎性因子和肾功能等方面的影响。结果表明，灌胃给予九里香叶总黄酮35、70mg/kg 13周，可明显改善糖尿病大鼠的肾脏功能和结构损伤，纠正T2DN大鼠的血糖、血脂代谢紊乱，对抗自由基的氧化损伤及炎性因子的异常增加，证明九里香叶总黄酮对2型糖尿病肾病具有明显预防与治疗作用。

附图说明

图1Normal组肾小球HE染色照片(×400倍)

图2Model组肾小球HE染色照片(×400倍)

图3TFMP 70mg/kg组肾小球HE染色照片(×400倍)

图4TFMP 30mg/kg组肾小球HE染色照片(×400倍)

图5Captopril组肾小球HE染色照片(×400倍)

图6C+T组肾小球HE染色照片(×400倍)

图7Normal组肾小球PAS染色照片(×400倍)

图8Model组肾小球PAS染色照片(×400倍)

图9TFMP 70mg/kg组肾小球PAS染色照片(×400倍)

图10TFMP 35mg/kg组肾小球PAS染色照片(×400倍)

图11Captopril组肾小球PAS染色照片(×400倍)

图12C+T组肾小球PAS染色照片(×400倍)

图13Normal组肾小球免疫组化TGF-β₁表达照片(×400倍)

图14Model组肾小球免疫组化TGF-β₁表达照片(×400倍)

图15TFMP 70mg/kg组肾小球免疫组化TGF-β₁表达照片(×400倍)

图16TFMP 35mg/kg组肾小球免疫组化TGF-β₁表达照片(×400倍)

图17Captopril组肾小球免疫组化TGF-β₁表达照片(×400倍)

图18C+T组肾小球免疫组化TGF-β₁表达照片(×400倍)

图19Normal组肾小球免疫组化CTGF表达照片(×400倍)

图20Model组肾小球免疫组化CTGF表达照片(×400倍)

图21TFMP 70mg/kg组肾小球免疫组化CTGF表达照片(×400倍)

图22TFMP 35mg/kg组肾小球免疫组化CTGF表达照片(×400倍)

图23Captopril组肾小球免疫组化CTGF表达照片(×400倍)

图24C+T组肾小球免疫组化CTGF表达照片(×400倍)

图25Normal组肾小球电镜照片(×15000倍)

图26Model组肾小球电镜照片(×15000倍)

图27TFMP 70mg/kg组肾小球电镜照片(×15000倍)

图28TFMP 35mg/kg组肾小球电镜照片(×15000倍)

图29Captopril组肾小球电镜照片(×15000倍)

图30C+T组肾小球电镜照片(×15000倍)

图31Normal组胰岛HE染色照片(×400倍)

图32Model组胰岛HE染色照片(×400倍

图33TFMP 70mg/kg组胰岛HE染色照片(×400倍

图34TFMP 35mg/kg组胰岛HE染色照片(×400倍

图35Captopril组胰岛HE染色照片(×400倍

图36C+T组胰岛HE染色照片(×400倍

具体实施方式

实施例1

九里香叶总黄酮的制备：取九里香叶10公斤，85％乙醇回流提取3次，乙醇量分别为6、6、6倍，回流时间分别为60、45、30分钟，滤过，合并提取液，减压浓缩至无乙醇味，加水稀释，过AB-8大孔吸附树脂吸附，水洗至中性，85％乙醇洗脱至薄层层析检测不到5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮为止，洗脱液减压回收乙醇，得九里香叶提取物。取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱，收集黄酮部分，回收溶剂，得九里香叶总黄酮296克。经HPLC检测，其中5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮以及5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮含量之和大于65％。

实施例2

取九里香叶总黄酮100克，加淀粉适量，制粒，装入胶囊，制成1000粒，得九里香叶总黄酮胶囊。

实施例3

取九里香叶总黄酮100克，加预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠适量，制粒，压片，制成1000粒，得九里香叶总黄酮片。

实施例4

取九里香叶总黄酮100克，加吐温80适量，加10升加热溶解，高温灭菌，分装成1000瓶，得九里香叶总黄酮口服液。

实施例5

取九里香叶总黄酮10克，加入1000ml丙二醇和1000ml注射用水，搅拌溶解，过滤，灭菌，罐装，每支2ml，得九里香叶总黄酮注射液。

实验实施例

九里香叶总黄酮对大鼠实验性2型糖尿病肾病的预防与治疗作用实验研究

本实验所用英文缩写词如下。

英文缩写词表

英文缩写  英文全称                          中文全称

                                                          

DN        Diabetic nephropathy              糖尿病肾病

ECM       Extracellular matrix              细胞外基质

ESRD    End-stage renal diseas                      终末期肾病

FBG     Fasting blood glucose                       空腹血糖

GBM     Glomerular basement membrane                肾小球基底膜

GFR     Glomerular filtration rate                  肾小球滤过率

GSH-Px  Glutathione peroxidase                      谷胱甘肽过氧化物酶

HDL-c   High-density lipoprotein cholesterol        高密度脂蛋白胆固醇

IL-6    Interleukin-6                               白介素-6

LDL-c   Low-density lipoprotein cholesterol         低密度脂蛋白胆固醇

MDA     Maleic dialdehyde                           丙二醛

Scr     Serum creatinine                            血肌酐

SOD     Superoxide dismutase                        超氧化物歧化酶

STZ     Streptozocin                                链脲佐菌素

TFMP    Total flavonoids ofmurrayapaniculata leaves 九里香叶总黄酮

                                                                          

TGF-β₁ Transforming growth factor-β₁              转化生长因子-β₁

TC      Total cholesterol                           总胆固醇

TG      Triglyceride                                甘油三酯

T2DN    type 2diabetic nephropathy                  2型糖尿病肾病

UAER    Urinary albumin excretion rate              尿蛋白排泄率

UAlb    Urinary albumin                             尿微量白蛋白

本发明的实验方法及实验结果如下。

2.1实验材料

2.1.1实验动物

Wistar大鼠，雄性，体重160～180g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，质量合格证号：SCXK-(吉)2007-0003。

2.1.2药品与试剂

九里香叶总黄酮(TFMP)     按照实施例1之方法制备

卡托普利(Captopril)      上海普康药业有限公司                批号：081003

链脲佐菌素(STZ)          美国Sigma化学公司                   批号：087k1403

胆固醇                   北京鼎国生物技术有限责任公司        批号：96L104100

丙硫氧嘧啶               上海复星朝晖药业有限公司            批号：090103

胆酸钠                   美国Sigma化学公司                   批号：028K0012

TC测试盒                 北京北化康泰临床试剂有限公司        批号：20091023

HDL-c测试盒              北京北化康泰临床试剂有限公司        批号：20091027

LDL-c测试盒              北京北化康泰临床试剂有限公司        批号：20090909

TG测试盒                 北京北化康泰临床试剂有限公司        批号：20090925

SOD测试盒                南京建成生物研究所                  批号：20091210

MDA测试盒                南京建成生物研究所                  批号：20091210

GSH-Px测试盒             南京建成生物研究所                  批号：20091210

糖化血红蛋白(GSP)测试盒  南京建成生物研究所                  批号：20091204

血、尿肌酐测定试剂盒     南京建成生物研究所                  批号：20091204

考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒 南京建成生物研究所                  批号：20091217

血尿素氮(BUN)测试盒      南京建成生物研究所                  批号：20091204

尿蛋白定量试剂           南京建成生物研究所                  批号：20091204

碘I¹²⁵ IL-6放射免疫分析药 北京普尔伟业生物科技有限公司       批号：20091225

盒

(以下将九里香叶总黄酮简称为TFMP)。

2.1.3实验仪器

血糖仪                            优克糖

DY89-I型电动玻璃匀浆机            宁波新芝科器研究所

LDZ5-2型普通离心机                北京医用离心机厂

DR-HW-1电热恒温水温箱             北京西城区医疗器械厂

7202B型可见分光光度计             尤尼柯(上海)仪器有限公司

QL-901 Vortex混悬器               海门市其林贝尔仪器制造

FJ-2003/018 I¹²⁵免疫测量仪        国营二六厂

2.2实验方法

2.2.1药物配制

高糖高脂饮食配方：蔗糖20％，猪油10％，鸡蛋10％，胆酸钠0.1％，胆固醇1％，丙硫氧嘧啶0.2％，正常大鼠饲料。

高糖高脂饮食的制备：将大鼠饲料、蔗糖、猪油、鸡蛋、胆酸钠、胆固醇及丙硫氧嘧啶按上述配方比例加热水充分混匀后，手制成团。

链脲佐菌素(STZ)：-20度以下保存。临用时以0.1mol/L，PH4.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成1％的链脲佐菌素溶液。

将九里香叶总黄酮用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成0.35％和0.7％的溶液。卡托普利用研钵磨碎，用0.5％的CMC-Na配成0.1％的溶液。将含0.7％九里香叶总黄酮CMC-Na溶液和0.2％卡托普利CMC-Na溶液按50∶50混合得到0.1％卡托普利+0.35％九里香叶总黄酮CMC-Na溶液(C+T组)。

2.2.2实验模型的建立及给药方法

将180只Wistar大鼠适应性喂养7天后随机分为正常组(20只)和模型组(160只)。正常组大鼠每日正常饮食，模型组大鼠每天给予高糖高脂饮食，8周后，正常组和模型组随机各取12只大鼠尾静脉取血检测血清TC、TG和FFA的含量。待确证模型组大鼠FFA明显升高产生胰岛素抵抗后，各组动物禁食不禁水12h，模型组舌下注射STZ(30mg/kg)，正常组舌下注射等体积的上述缓冲液。给予STZ 2周后大鼠尾静脉取血用血糖仪检测空腹血糖。将空腹血糖值＞11.1mmol/L的大鼠列入2型糖尿病肾病动物。成模后的2型糖尿病肾病大鼠改为隔日给予一次高糖高脂饮食。

将成模的2型糖尿病大鼠按血糖和体重随机分为5组，即：Model组、九里香叶总黄酮70mg/kg组、九里香叶总黄酮35mg/kg组、Captopril组及0.1％卡托普利+0.35％九里香叶总黄酮(C+T组)，每组20只。另选10只正常组大鼠作为Normal组。具体的给药方案为：

Normal组：                 灌胃0.5％CMC-Na 10mL/kg

Model组：                  灌胃0.5％CMC-Na 10mL/kg

九里香叶总黄酮70mg/kg组：  灌胃九里香叶总黄酮70mg/kg

九里香叶总黄酮35mg/kg组：  灌胃九里香叶总黄酮35mg/kg

Captopril组：              灌胃卡托普利10mg/kg

C+T组：                    灌胃卡托普利10mg/kg+九里香总黄酮35mg/kg

各组动物每日按照上述方案灌胃(ig)给药，连续13周。每周记录体重，每三周尾静脉取血，用血糖仪测定空腹血糖值1次。于实验结束前1天将大鼠放入代谢笼内，禁食不禁水，收集24h尿液。测定空腹血糖，ig给药1h后，腹腔注射10％水合氯醛30mg/kg麻醉，腹主动脉采血，离心分离血清，进行各项生化指标和放免指标的测定。采集各鼠肾脏、胰腺，进行形态学观察。

2.3观察指标及标本采集

2.3.1一般指标的观察

监测实验过程中各组大鼠的一般状态、血糖、体重、摄食及摄水量等变化，并记录各组大鼠每日的摄食、摄水量。

2.3.2尿蛋白的测定

于实验结束前一天收集各组大鼠24h尿样，留尿期间禁食，不禁水，将大鼠放入洗净的金属代谢笼内，记录尿量后取5ml，700rpm离心5min，去除沉渣，分装于Eppendorf管中，-80℃冰箱保存。用试剂盒检测尿蛋白浓度，尿蛋白浓度乘以24h尿量既为尿蛋白排泄率。

2.3.3血清生化指标的测定

大鼠经腹腔注射10％水合氯醛30mg/kg麻醉，腹主动脉采血，注入干净的试管内4℃，2000rpm离心10min，分离血清后分装于Eppendorf管中，-80℃冰箱保存，用分光光度计测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)的含量，用放射免疫法测定血清白细胞介素6(IL-6)含量。

2.3.4形态学观察

大鼠腹主动脉采血处死后，分别取胰腺及两侧肾脏去除包膜后立刻用生理盐水清洗，用滤纸吸干，左侧肾脏称重并计算肾重/体重。

光镜标本：左侧肾脏称重后纵向对半剖开，立即置入10％福尔马林溶液中固定，进行HE、PAS及免疫组化染色。观察大鼠系膜细胞增生及PAS阳性物质表达情况。用免疫组化方法检测大鼠肾脏转化生长因子-β₁(TGF-β₁)和结缔组织生长因子(CTGF)的表达情况。胰腺进行HE染色，观察胰岛及细胞的改变情况。

电镜标本：取大鼠左侧肾脏另一半皮质约1平方毫米大小的组织1～2块，放入缓冲液内固定。用透射电镜观察肾脏基底膜，系膜基质，系膜细胞，上皮细胞足突的变化。

2.3.5抗氧化指标的测定

组织匀浆制备：剪取大鼠右侧肾脏皮质部分，在冰生理盐水中反复漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重。按1∶9浓度(W∶V＝1g∶9ml)加入生理盐水。在4℃环境下，用DY89-I型电动玻璃匀浆机制备组织匀浆。3500r/min离心15min后吸取上清液分装于Eppendorf管中，-80℃冰箱保存。

大鼠肾脏组织匀浆制备完成后，用试剂盒检测肾脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。

2.4统计方法

实验数据，计数资料用百分数表示，计量资料用

表示，计量资料进行组间t检验，P＜0.05为具有显著性统计学意义。

2.5实验结果

2.5.1高糖高脂饮食对大鼠血脂的影响

与正常组比较，模型组大鼠连续给予高糖高脂饮食8周后出现明显血脂代谢紊乱：TC、TG及FFA含量均显著增高(P＜0.01)。说明模型组大鼠产生胰岛素抵抗，有类似临床2型糖尿病病人的特征。实验结果见Tab.1。

Tab.1.Effect of highly fatted food on serum lipid in normal rats(

n＝12)

^##P＜0.01 vs normal

2.5.2一般状态观察

Model组大鼠舌下静脉注射STZ 2周后，一般状态表现为：活动减少；多饮，平均饮水量是Normal组的三倍；多尿，垫料明显潮湿，每日需更换2～3次；体重逐渐下降；精神萎靡，毛色灰暗、粗糙。与Model组比较，TFMP 70、35mg/kg组，Captopril组及C+T组大鼠的饮水量、尿量增多，体重下降及精神状态等均有所改善。

2.5.3TFMP对T2DN大鼠血糖的影响

与Normal组比较，Model组大鼠第0、3、6、9、13周血糖值均显著升高(P＜0.01)。与Model组比较，TFMP 70、35mg/kg剂量组和C+T组于药后第3周血糖值均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，并持续到13周末；Captopril组血糖值无统计学意义(P＞0.05)。实验结果见Tab.2。

Tab.2.Effect of TFMP on blood glucose in T2DN rats

^#P＜0.05，^##P＜0.01 vs normal；^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs model

2.5.4TFMP对T2DN大鼠GSP的影响

与Normal组比较，Model组的糖化血红蛋白(GSP)含量显著升高(P＜0.01)。与Model组比较，TFMP70、35mg/kg剂量组的GSP含量显著降低(P＜0.05)，Captopril组及C+T组无统计学意义(P＜0.05)。实验结果见Tab.3。

Tab.3.Effect of TFMP on GSP in T2DN rats

^##P＜0.01vs normal；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs model

2.5.5TFMP对T2DN大鼠TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的影响

与Nornal组比较，Model组TG、TC及LDL-c含量值均显著升高，HDL-c含量显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。与Model组比较，TFMP 70mg/kg组的TG、TC及LDL-c含量值显著降低，HDL-c含量显著升高(P＜0.05)；TFMP 35mg/kg组LDL-c含量值显著降低，HDL-c含量显著升高(P＜0.05)，TC和TG含量值无统计学意义(P＞0.05)；Captopril组TG、TC、LDL-c、HDL-c含量值差异无统计学意义(P＞0.05)；C+T组TC和TG含量值显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，LDL-c、HDL-c含量值无统计学意义(P＞0.05)。实验结果见Tab.4。

Tab.4.Effect of TFMP on content of lipid in T2DN rats

^#P＜0.05，^##P＜0.01vs normal；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs model

2.5.6TFMP对T2DN大鼠肾脏组织SOD、MDA、GSH-Px的影响

与Normal组比较，Model组SOD、GSH-Px活性显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，MDA含量显著增加(P＜0.01)。与Model组比较，TFMP 70mg/kg剂量组SOD、GSH-Px活性显著提高(P＜0.05或P＜0.01)，MDA含量显著降低(P＜0.01)；TFMP 35mg/kg剂量组SOD、MDA及GSH-Px值均无统计学意义(P＞0.05)；Captopril组SOD、GSH-Px活性显著升高(P＜0.05)，MDA含量显著降低(P＜0.05)；C+T组SOD、GSH-Px活性显著增高(P＜0.01)，MDA含量显著降低(P＜0.01)。实验结果见Tab.5。

Tab.5.Effect of TFMP on SOD、MDA、GSH-Px in T2DN rats

^#P＜0.05，^##P＜0.01vs normal；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs model

2.5.7TFMP对T2DN大鼠血清IL-6的影响

与Normal组比较，Model组大鼠血清IL-6含量显著升高(P＜0.01)。与Model组比较，TFMP70mg/kg剂量组、Captopril及C+T组IL-6含量值均显著下降(P＜0.05)；TFMP 35mg/kg剂量组IL-6含量值无统计学意义(P＞0.05)。实验结果见Tab.6。

Tab.6.Effect of TFMP on content of IL-6 in T2DN rats

^##P＜0.01vs normal；^*P＜0.05vs model

2.5.8TFMP对T2DN肾重/体重的影响

与Normal组比较，Model组肾重/体重(KW/BW)显著增大(P＜0.01)。与Model组比较，TFMP 70、35mg/kg剂量组、Captopril组和C+T组KW/BW显著减小(P＜0.05)。实验结果见Tab.7。

Tab.7.Effect of TFMP on KW/BW in T2DN rats

^##P＜0.01vs normal；^*P＜0.05vs model

2.5.9TFMP对T2DN大鼠尿蛋白及蛋白排泄率的影响

与Normal组比较，Model组尿蛋白排泄率(UAER)和尿蛋白(UAlb)浓度值均显著升高(P＜0.01)。与Model组比较，TFMP 70、35mg/kg剂量组、Captopril组及C+T组UAER和UAlb浓度值显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。实验结果见Tab.8。

Tab.8.Effect of TFMP on UAER and content of UAlb and in T2DN rats

^##P＜0.01vs normal；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs model

2.5.10TFMP对T2DN大鼠BUN、Scr和CCr的影响

与Normal组比较，Model组大鼠血清BUN、SCr含量显著增高(P＜0.05或P＜0.01)，内生肌酐清除率(CCr)显著降低(P＜0.05)。与Model组比较，TFMP 70、35mg/kg剂量组、Captopril组及C+T组大鼠血清BUN和Scr含量显著下降(P＜0.05或P＜0.01)，CCr显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。实验结果见Tab.9。

Tab.9.Effect of TMPF on BUN、Scr and CCr in T2DN rats

^#P＜0.05，^##P＜0.01vs normal；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs model

2.5.11形态学及免疫组化观察

2.5.11.1肾脏HE、PAS染色观察

Normal组：肾小球及肾小管结构正常，肾小球基底膜和毛细血管襻开放良好，肾小球囊无渗出，系膜基质无增生，间质偶见炎细胞浸润，未见明显肾小球硬化的病理改变。Model组：肾小球系膜区PAS阳性物质增多，呈不均匀红染，可见肾小球毛细血管丛明显缩小，大部分毛细血管袢皱缩塌陷，肾小球体积下降，球囊腔扩张，系膜区荒废明显，间质炎细胞浸润，部分扩张小管内可见蛋白样管型，周围肾小管出现透明样变性及空泡变。TFMP 35、70mg/kg剂量组、Captopril组及C+T组：均有轻微病变出现，肾小球形态基本正常，大部分毛细血管开放良好，偶见肾小管透明变性、局部间质炎性细胞侵润，与Model组比较，各组系膜区PAS阳性物质明显减少，肾脏病变均明显减轻(图1～12)。

2.5.11.2肾脏TGF-β₁和CTGF免疫组化观察

TGF-β₁和CTGF在肾小球血管内皮、系膜细胞及肾小管上皮部分间质细胞都有所表达，阳性颗粒主要位于胞浆中，呈棕黄色。Normal组：肾小球及血管内皮细胞上有少量TGF-β₁和CTGF表达，着色浅，含量较少。Model组：肾小球TGF-β₁和CTGF表达明显增加，含量增多，染色较深，明显强于Normal组。与Model组比较，TFMP 35、70mg/kg剂量组、Captopril组及C+T组的肾小球TGF-β₁和CTGF表达均明显减轻，颜色较浅。(图13～24)。

2.5.11.3肾脏透射电镜下观察

Normal组：肾小球滤过膜三层结构清晰，可见内皮细胞孔，基底膜薄厚均匀，足突呈梳齿状分布。Model组：基膜呈不规则阶段性增厚，足突细胞广泛融合，滤过膜结构模糊。TFMP35、70mg/kg剂量组、Captopril组、C+T组，滤过膜三层结构基本清晰，仍有部分基底膜轻度增厚，足突细胞呈梳齿状轻度微绒毛化，偶见足突细胞轻度融合，但病变明显轻于Model组。(图25～30)。

2.5.11.4胰岛HE染色观察

Normal组：胰岛数目较多，体积较大，呈圆形或椭圆形细胞团状。胰岛内细胞丰富，排列整齐，核多为圆形。Model组：胰岛数目稀少，体积萎缩，边界不清。胰岛内细胞数目减少、排列不规则，胰岛细胞核大小、形态不规则。残存的胰岛细胞显现明显空泡变性。TFMP35、70mg/kg剂量组及C+T组：偶见胰岛细胞空泡变性，胰岛边界不清，但胰岛体积及胰岛细胞形态基本正常，病变与Model组比较均明显减轻。与Model组比较Captopril组胰岛病变改善不明显。(图31～36)。

Claims (5)

1.九里香叶总黄酮在制备预防与治疗糖尿病肾病药物中的应用。

2.权利要求1所述的九里香叶总黄酮，其特征在于其中至少含有5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3′，4′-三甲氧基黄酮中的两种或两种以上。

3.权利要求1所述的九里香叶总黄酮，其特征在于其中5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3′，4′-三甲氧基黄酮的含量之和大于50％。

4.权利要求1所述的九里香叶总黄酮，其特征在于其中5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮和5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮的含量之和大于50％。

5.九里香叶总黄酮与化学药或中药或天然药物组成的治疗糖尿病肾病的复方药物。

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