CN102669195A - 一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于采用如下具体工艺步骤：a.制备九里香粉末；b.浸泡九里香粉末，进行超声波提取；c.减压抽滤，脱色剂脱色，过滤，滤液减压浓缩；d.向上述浓缩液中加入自来水，在超声波上震荡；e.过滤，除去不溶物，滤液加入大孔树脂内，自来水洗脱；再用不同浓度的乙醇反复洗脱，用AlCl3显色，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性；f.减压浓缩乙醇的洗脱液，真空干燥得到总黄酮；g.以芦丁为标准对照，用紫外分光光度法测定总黄酮含量在50％以上。本发明具有九里香原料来源方便，提取方法简单，适合于工业化生产，节能环保的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种从植物中提取总黄酮的方法，属于农药技术领域，具体地讲是涉及一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法。
背景技术
九里香[Murraya paniculata (L.)]属芸香科(Rutaceae) 九里香属植物，别名千里香、满山香、七里香等。该属植物全世界约14种及2变种。其中亚洲热带及亚热带地区约有12种，我国有8种及1变种，主要产自中国云南、贵州、湖南、广东、广西、海南、福建、台湾等地。九里香是我国十大名花之一，也是一种中药材，现代药理研究表明，九里香具有抗生育和终止妊娠、抗菌消炎、降血糖、抗痉挛及局部麻醉等作用。近年农用活性研究表明，九里香粗提物具有较好的杀虫活性（湖北农业科学，2005；农药，2011；西北农业学报，2011）。
到目前为止，国内外学者已从本属植物中分离到10余种黄酮类化合物。分别为3',4', 5, 5',7,8-六甲氧基黄酮，命名为版纳九里香素(bannamurpanisin)。从九里香叶中分离得到5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮和5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮、5-羟基-6,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮、5,7,8,3′,4′-五甲氧基二氢黄酮、7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮、3′,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮。从九里香果实中分得两个新的黄酮类化合物5-羟基-3,7,8,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮，8-羟基-3,5,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮等。
专利《千里香叶总黄酮及其制备方法及用途，申请号200710147357.2》中，涉及到黄酮的提取方法，该方法使用大孔树脂、Al2O3柱、硅胶柱反复层析得到总黄酮。由于该专利提取总黄酮的过程复杂，不适合于工业化生产；且需要消耗大量有机溶剂，对环境有一定影响。加之九里香具有重要的药理和农用活性，为此，选择简便快捷的提取方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从九里香茎叶中简便提取总黄酮的方法，以及总黄酮显著的杀虫活性，有利开发成植物源农药。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于采用如下具体工艺步骤：
a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；
b.将九里香粉末浸泡在50-95％乙醇中5-7天，乙醇用量为九里香粉末重量的10-20倍，随后进行超声波提取30-60分钟；
c.减压抽滤，得滤液，加入滤液总量2-4％的脱色剂脱色，过滤，滤液减压浓缩至原来的1/10-1/20，温度控制在50-60℃，回收乙醇；
d.向上述浓缩液中加入其重量3-5倍的自来水，在超声波上震荡，温度控制在40-60℃，时间30-60分钟；
e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入大孔树脂内，大孔树脂用量为九里香粉末重量的1-1.5倍，使用20倍柱体积的自来水洗脱；再用10-20％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性；
f.减压浓缩50-75％乙醇的洗脱液，真空干燥得到总黄酮；
g.以芦丁为标准对照，用紫外分光光度法测定总黄酮含量在50％以上。
所述脱色剂选用硅燥土、白炭黑或活性炭。
所述大孔树脂选用D101大孔树脂、D140大孔树脂、AB-8大孔树脂或XAD16大孔树脂。
所述自来水的pH值为5-7。
本发明具体具有以下优点：
1、九里香原料来源方便。九里香在南方作为园林绿化植物，每年经过修枝整叶，将去除大量枝叶，为九里香黄酮提取提供大量原材料。
2、提取方法简单，适合于工业化生产。本案例采用乙醇渗漉提取，大孔树脂梯度洗脱分离黄酮化合物，操作流程简便，使用设备简单，洗脱剂常见，可以进行工业化生产。
3、节能环保。所用溶剂包含乙醇，可以回收利用，大孔树脂经活化后可以反复使用。
具体实施方法
下面结合优选实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明决不限于下述实施例。
实施例1
一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其具体工艺步骤如下：
a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；
b.取2kg九里香粉末，室温浸泡在30kg 50％乙醇中7天，随后进行超声波提取60分钟；
c.减压抽滤，得滤液，加入0.6 kg的活性炭脱色，过滤，滤液减压浓缩至3kg，温度控制在50℃，回收乙醇；
d.向3kg浓缩液中加入9kg自来水，自来水pH值为5，在超声波上震荡，温度控制在60℃，时间30分钟；
e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入2kg D101大孔树脂内，使用20L的自来水洗脱，自来水pH值为5；再用10-20％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性；
f.减压浓缩50-75％乙醇洗脱液，真空干燥得到总黄酮；
g.以芦丁为标准对照样品，用紫外分光光度法测定总黄酮含量为56.4％。
实施例2
一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其具体工艺步骤如下：
a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；
b.取2kg九里香粉末，室温浸泡在25kg 75％乙醇中5天，随后进行超声波提取45分钟；
c.减压抽滤，得滤液，加入0.6 kg的硅藻土脱色，过滤，滤液减压浓缩至2.5kg，温度控制在55℃，回收乙醇；
d.向2.5kg浓缩液中加入8L自来水，自来水pH值为6，在超声波上震荡，温度控制在55℃，时间40分钟；
e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入2kg D140大孔树脂内，使用20L的自来水洗脱，自来水pH值为6；再用10-20％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性。
f.减压浓缩50-75％的乙醇洗脱液，真空干燥得到总黄酮。
g.以芦丁为标准对照样品，用紫外分光光度法测定总黄酮含量为64.7％。
实施例3
一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其具体工艺步骤如下：
a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；
b.取2kg九里香粉末，室温浸泡在20kg 95％的乙醇中6天，随后进行超声波提取50分钟。
c.减压抽滤，得滤液；加入0.6 kg的白炭黑脱色，过滤，滤液减压浓缩至2 kg，温度控制在50℃，回收乙醇。
d.向2kg浓缩液中加入6L自来水，在超声波上震荡，温度控制在50℃，时间50分钟。
e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入3kg AB-8大孔树脂内，使用20L的自来水洗脱；再用10-20％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75％的乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性。
f.减压浓缩50-75％的乙醇洗脱液，真空干燥得到总黄酮。
g.以芦丁为标准对照样品，用紫外分光光度法测定总黄酮含量为67.3％。
实施例4
一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其具体工艺步骤如下：
a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；
b.取2kg九里香粉末，室温浸泡在40kg 50％的乙醇中7天，随后进行超声波提取30分钟。
c.减压抽滤，得滤液，加入1.6 kg的硅燥土脱色，过滤，滤液减压浓缩至2 kg，温度控制在50℃，回收乙醇。
d.向2kg浓缩液中加入10L自来水，在超声波上震荡，温度控制在40℃，时间60分钟。
e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入3kg XAD16大孔树脂内，使用20L的自来水洗脱；再用10-20％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75％的乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性。
f.减压浓缩50-75％的乙醇洗脱液，真空干燥得到总黄酮。
g.以芦丁为标准对照样品，用紫外分光光度法测定总黄酮含量为66.9％。
杀虫活性测定实施例
本发明所得总黄酮的杀虫活性毒力测定结果如下：
1、供试昆虫
家蝇(Muscadomestica)成虫：按照麦麸250.0g、面粉12.5g、奶粉8.0g、酵母粉2.5g，水500mL饲料配方进行家蝇幼虫饲养，经过化蛹，羽化转化成成虫供试。
萝卜蚜[Lipaphis erysimi(Kaltenbach)]：直接从田间采集。
斜纹夜蛾(Predenia liture)：从田间采集斜纹夜蛾卵块，于室内以新鲜蓖麻叶饲养繁殖，试验时挑选健康、整体大小一致的3龄、5龄幼虫。
2、对家蝇的触杀活性（点滴法）
用无水乙醚将家蝇麻醉1分钟，使试虫处于麻醉状态，然后用微量注射器取5μL的药液点滴到家蝇的前胸背板，放入养虫盒内，同时放入成虫饲料和保湿的脱脂棉。标准对照药剂为0.7%印楝素悬浮剂(河南鹤壁陶英陶生物科技有限公司)，清水为空白对照。每处理20头试虫，重复3次。24h后观察死亡情况，计算死亡率或校正死亡率。
死亡率(%) =(死亡虫数/试虫数)×100；
校正死亡率(%) = [(药剂处理死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)] ×100。
3、对萝卜蚜的触杀活性（喷雾法）
将辣椒叶片剪至6cm塑料培养皿大小，背面朝上，置于培养皿内，皿底垫一层保湿滤纸。用毛笔选取无翅若蚜25头，放入培养皿叶蝶上。置于POTTER喷雾塔下喷雾(1mL)。标准对照药剂为0.7%印楝素悬浮剂(河南鹤壁陶英陶生物科技有限公司)，清水为空白对照。喷雾后加盖，标记后置于室温下，每个处理重复3次。48h后检查结果，计算死亡率或校正死亡率。
死亡率(%) = (死亡虫数/试虫数)×100；
校正死亡率(%) = [(药剂处理死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)] ×100。
4、对斜纹夜蛾的毒杀活性
将3龄或5龄斜纹夜蛾幼虫，在药液中浸渍5s，取出后用吸水纸去除多余药液，然后放入直径为9cm的培养皿中，每皿放入10头试虫，饲喂新鲜的甘蓝叶片，皿内放入一团保湿脱脂棉。标准对照药剂为0.7%印楝素悬浮剂(河南鹤壁陶英陶生物科技有限公司)，清水为空白对照。每处理30头试虫，重复3次。视取食情况及时添加新鲜甘蓝叶片。48h后调查死亡数，计算死亡率或校正死亡率。
死亡率(%) =(死亡虫数/试虫数)×100；
校正死亡率(%) = [(药剂处理死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)] ×100。
表1黄酮类化合物对供试害虫的杀虫活性
注：总黄酮的浓度为0.2 mg/mL，0.7%印楝素悬浮剂的浓度为稀释500倍。小写字母表示在0.05水平差异显著。
由表1可知，在0.2 mg/mL的质量浓度下，总黄酮对供试靶标害虫有显著的杀虫活性。对萝卜蚜和家蝇的触杀活性在90％以上，与0.7%印楝素悬浮剂的杀虫活性对比，差异不显著；总黄酮对斜纹夜蛾3龄幼虫的触杀作用强于5龄幼虫，活性优于0.7%印楝素悬浮剂。尽管印楝素具有很好的杀虫活性，由于原料来源受到限制，而总黄酮来源广泛，活性与印楝素相当，因此，该类物质具有广阔的应用前景。
将总黄酮配制成0.2mg/mL、0.15 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.01 mg/mL五个质量浓度。进一步测试了该类物质对供试害虫的毒力。结果如下：
表2 总黄酮对供试害虫的毒力测定结果
由表2可知，总黄酮对供试昆虫的毒杀作用与浓度呈正相关，随着浓度的增加，毒杀作用越强。通过对LC50的比较，发现化合物对萝卜蚜的毒力最小，为0.0236mg/mL，其对家蝇的毒力，LC50为0.0280mg/mL，对斜纹夜蛾5龄幼虫的毒力最大，为0.0618mg/mL。可见，总黄酮具有很强的毒力。
综上所述，由此可见本发明从九里香茎叶中提取总黄酮的方法所得的总黄酮对供试昆虫的毒杀作用与浓度呈正相关，随着浓度的增加，毒杀作用越强。具有突出的实质性特点和显著的进步性。
以上揭露仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明的权利范围，凡其他未脱离本发明的实质范围下，所完成的润饰及其等效的修改或修饰是允许的，其专利保护范围应当视为包含在本专利申请范围及其等同领域中。
Claims (4)
1.一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于采用如下具体工艺步骤：
a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；
b.将九里香粉末浸泡在50-95％乙醇中5-7天，乙醇用量为九里香粉末重量的10-20倍，随后进行超声波提取30-60分钟；
c.减压抽滤，得滤液，加入滤液总量2-4％的脱色剂脱色，过滤，滤液减压浓缩至原来的1/10-1/20，温度控制在50-60℃，回收乙醇；
d.向上述浓缩液中加入其重量3-5倍的自来水，在超声波上震荡，温度控制在40-60℃，时间30-60分钟；
e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入大孔树脂内，大孔树脂用量为九里香粉末重量的1-1.5倍，使用20倍柱体积的自来水洗脱；再用10-20％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75％乙醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性；
f.减压浓缩50-75％乙醇的洗脱液，真空干燥得到总黄酮；
g.以芦丁为标准对照，用紫外分光光度法测定总黄酮含量在50％以上。
2.根据权利要求1所述的从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于：所述脱色剂选用硅燥土、白炭黑或活性炭。
3.根据权利要求1所述的从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于：所述大孔树脂选用D101大孔树脂、D140大孔树脂、AB-8大孔树脂或XAD16大孔树脂。
4.根据权利要求1所述的从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于：所述自来水的pH值为5-7。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120919 |