CN113768944A - 矢车菊素-3-o-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在提高睾丸热耐受性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷和/或原儿茶酸在提高睾丸热耐受性中的应用，其能够改善睾丸曲细精管萎缩、生精上皮空泡化以及睾丸管腔直径与厚度减小等现象。C3G和/或其代谢产物PCA可通过降低睾丸遭受的外界应激压力，而降低eIF2α磷酸化水平和应激颗粒的表达以增加睾丸热耐受性，同时改善睾丸抗氧化系统和调节IRE1α‑XBP1途径以缓解氧化应激和内质网应激介导的细胞凋亡，以减轻热应激诱发的精子发生障碍和睾丸损伤。本发明为未来C3G和/或其代谢产物PCA改善因不良生活习惯、职业因素以及病理性原因使睾丸处于热应激状态诱导的男性生殖损伤提供可靠的理论依据，具有重要意义。

Description

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在提高睾丸热耐受性 中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在提高睾丸热耐受性中的应用。
背景技术
热应激(Heat Stress，HS)指机体处于高温暴露等不利条件下所产生的应激反应。现有研究数据表明，机体的不同部位对温度的敏感程度不同，其中睾丸对于温度的变化极为敏感。一般而言，睾丸作为精子发生的场所处于阴囊内，其阴囊温度低于核心体温2～8℃，以维持精子发生的最佳微环境。睾丸温度升高可引起生精障碍，从而使雄性生育能力下降甚至不育。日常生活中，不良生活习惯如桑拿，职业暴露，病理性原因如隐睾以及精索静脉曲张等都可使睾丸长期暴露于高温环境中，造成精子质量和生育能力下降。
中国专利CN201910277833.5公开了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备治疗和/或预防激素紊乱疾病的药物中的应用；CN202010772872.5矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备治疗和/或预防子宫内膜增生疾病的药物中的应用；CN201710550506.3矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备3-氯-1,2-丙二醇引发的疾病药物中的应用；CN201510411125.8矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对1,3-二氯-2-丙醇的生殖毒性的干预作用；CN201910961372.3矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备治疗/或预防镉引发的精子质量下降的药物中的应用。综上，上述发明主要针对于化学性因素诱发的毒性，而未对物理性因素直接造成的损伤进行研究。化学性因素引起的雄性生殖损伤一般是诱导性的，通常需要较长的时间才能诱发得到结局性指标，而物理性因素是直接造成雄性生殖损伤。应激颗粒为细胞在受外界环境刺激时，细胞质中大量蛋白和RNA聚集形成的、无包膜的结构(McCormick,C.,Khaperskyy,D.Translation inhibitionand stress granules in the antiviral immune response.Nat Rev Immunol 17,647–660(2017).https://doi.org/10.1038/nri.2017.63)。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术主要针对于化学性因素诱发的损伤的保护，而未对物理性因素直接造成的损伤的保护进行研究的上述不足，提供矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在提高睾丸热耐受性中的应用。
本发明的第一个目的是提供矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备防治热应激诱发的男性生殖损伤的药物或产品中的应用。
本发明的第二个目的是提供矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备提高睾丸热耐受性的药物或产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备改善睾丸抗氧化系统的药物或产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备调节IRE1α-XBP1途径以缓解氧化应激的药物中或产品的应用。
本发明的第五个目的是提供矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备缓解细胞凋亡的药物或产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)是一种广泛分布于果蔬中且具有强抗氧化性及抗炎等药理作用的黄酮类化合物，是潜在的保护雄性生殖损伤的功能活性成分。而原儿茶酸(PCA)是C3G被肠道微生物代谢的主要酚酸类代谢物，更易被机体所吸收利用，同样具有抗氧化、抗炎和缓解生殖能力损伤等生理作用。
本发明建立热应激生殖损伤模型，采取热水浴(43℃，30min)模拟热应激状态，发现矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其代谢产物原儿茶酸均可以作为雄性生殖损伤保护成分，并以抗坏血酸作为阳性对照，评价矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或其代谢产物原儿茶酸在制备治疗和/或预防热应激诱发的男性生殖损伤的作用。本发明以应激颗粒为切入点，不仅为相关机制的探讨提供了新思路，而且为后续矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及其代谢产物原儿茶酸在热应激相关诱因致使的雄性生殖损伤的防护或治疗方法提供一种有效的方法。
具体地，利用HE染色和曲细精管外径、厚度评价睾丸组织病理学情况。利用蛋白质免疫印迹(Western blot)，免疫荧光以及PCR技术，探讨矢车菊素-3-O-葡萄糖苷或其代谢产物原儿茶酸对生精细胞的保护作用，其主要评价对内质网应激相关基因的表达和细胞自噬及凋亡情况。同时，利用试剂盒对睾丸组织中相关抗氧化酶含量及脂质过氧化产物含量，评价对抗氧化系统的保护作用。
研究发现，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或其代谢产物原儿茶酸可有效缓解热应激导致的睾丸组织损伤，改善曲细精管萎缩、生精上皮空泡化以及睾丸管腔直径与厚度减小等现象。C3G和/或其代谢产物PCA可通过降低睾丸遭受的外界应激压力，而降低eIF2α磷酸化水平和应激颗粒的表达以增加睾丸热耐受性，同时改善睾丸抗氧化系统和调节IRE1α-XBP1途径以缓解氧化应激和内质网应激介导的细胞凋亡，以减轻热应激诱发的精子发生障碍和睾丸损伤。
因此本发明要求保护以下内容：
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备防治热应激诱发的男性生殖损伤的药物中或产品的应用。
优选地，所述男性生殖损伤为精子发生障碍、生精细胞凋亡、睾丸组织损伤、曲细精管萎缩、空泡和/或管腔直径与厚度减小中的一种或几种。
以及，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备提高睾丸热耐受性的药物或产品中的应用。
优选地，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸通过降低eIF2α磷酸化水平和应激颗粒的表达提高睾丸热耐受性。
以及，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备改善睾丸抗氧化系统的药物或产品中的应用。
以及，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备调节IRE1α-XBP1途径以缓解氧化应激的药物或产品中的应用。
优选地，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸备调节IRE1α-XBP1途径缓解氧化应激。
以及，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备缓解细胞凋亡的药物或产品中的应用。
优选地，所述细胞为生精细胞。
优选地，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸备调节IRE1α-XBP1途径缓解细胞凋亡。
更优选地，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或其代谢产物原儿茶酸的剂量为50-150mg/kg。
所述药物可制备成负载矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或其代谢产物原儿茶酸的任何形式的制剂，如片剂、胶囊、颗粒等，用以治疗和/或预防热应激诱发的男性生殖损伤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或其代谢产物原儿茶酸可有效缓解热应激导致的睾丸组织损伤，改善曲细精管萎缩、生精上皮空泡化以及睾丸管腔直径与厚度减小等现象，解决了目前尚无针对物理因素引起的男性生殖损伤的保护剂。C3G和/或其代谢产物PCA可通过降低睾丸遭受的外界应激压力，而降低eIF2α磷酸化水平和应激颗粒的表达以增加睾丸热耐受性，同时改善睾丸抗氧化系统和调节IRE1α-XBP1途径以缓解氧化应激和内质网应激介导的细胞凋亡，以减轻热应激诱发的精子发生障碍和睾丸损伤。本发明为未来C3G和/或其代谢产物PCA改善因不良生活习惯、职业因素以及病理性原因使睾丸处于热应激状态诱导的男性生殖损伤提供可靠的理论依据，具有重要意义。
附图说明
图1为睾丸及附睾组织切片H&E染色观察；(A)睾丸H&E染色图片；(B)附睾尾H&E染色图片。
图2为睾丸组织eIF2α和p-eIF2α的蛋白水平表达(0day)；(A)eIF2α和p-eIF2α的灰度分析；(B)eIF2α的蛋白表达；(C)p-eIF2α的蛋白表达。
图3为IF检测DAZL在睾丸中的表达(0day)；(A)DAZL的免疫荧光分析；(B)DAZL的表达。
图4为睾丸组织LC3Ⅱ/Ⅱ和p62的蛋白水平表达(0day)；(A)LC3Ⅱ/Ⅱ和p62的灰度分析；(B)LC3Ⅱ/Ⅱ的蛋白表达；(C)p62的蛋白表达。
图5为睾丸组织p-JNK的蛋白水平表达(0day)；(A)p-JNK的灰度分析；(B)p-JNK的蛋白表达。
图6为睾丸组织Cleaved-PARP和PARP的蛋白水平表达(0day)；(A)Cleaved-PARP和PARP的灰度分析；(B)PARP的蛋白表达；(C)Cleaved-PARP的蛋白表达。
图7为睾丸组织Bcl-2和Bax的蛋白水平表达(0day)；(A)Bcl-2和Bax的灰度分析；(B)Bcl-2的蛋白表达；(C)Bax的蛋白表达；(D)Bcl-2/Bax的蛋白表达量。
图8为各个时期睾丸组织丙二醛(MDA)水平；(A)0day睾丸组织MDA水平；(B)2day睾丸组织MDA水平；(C)7day睾丸组织MDA水平；(D)14day睾丸组织MDA水平。
图9为各个时期睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)水平；(A)0day睾丸组织SOD水平；(B)2day睾丸组织SOD水平；(C)7day睾丸组织SOD水平；(D)14day睾丸组织SOD水平。
图10为各个时期睾丸组织谷胱甘肽(GSH)水平；(A)0day睾丸组织GSH水平；(B)2day睾丸组织GSH水平；(C)7day睾丸组织GSH水平；(D)14day睾丸组织GSH水平；(A)0day睾丸组织GSH/GSSG水平；(B)2day睾丸组织GSH/GSSG水平；(C)7day睾丸组织GSH/GSSG水平；(D)14day睾丸组织GSH/GSSG水平。
图11为睾丸组织中IRE1α的mRNA表达水平；(A)0day睾丸组织中IRE1α的mRNA表达水平；(B)2day睾丸组织中IRE1α的mRNA表达水平；(C)7day睾丸组织中IRE1α的mRNA表达水平；(D)14day睾丸组织中IRE1α的mRNA表达水平。
图12为睾丸组织中XBP1的mRNA表达水平；(A)0day睾丸组织中XBP1的mRNA表达水平；(B)2day睾丸组织中XBP1的mRNA表达水平；(C)7day睾丸组织中XBP1的mRNA表达水平；(D)14day睾丸组织中XBP1的mRNA表达水平。
图13为睾丸中细胞凋亡TUNEL染色(2day)。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、实验动物
CD-
Figure BDA0003159311600000051
(ICR)雄性小鼠，7～8周龄250只，体重为34～40g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证编号：20200819Abzz0619000491)。在环境为光照时间昼夜12h交替，温度为20-25℃，相对湿度为50±5％的暨南大学实验动物中心适应性饲养，自由摄食。实验操作均按照《暨南大学实验动物伦理委员会》相关要求进行。
实施例一 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或其代谢产物原儿茶酸对热应激诱发的男性生殖损伤的保护作用
一、实验方法
1、实验动物分组及处理
采用普通饲料对CD-
Figure BDA0003159311600000052
(ICR)雄性小鼠进行适应性喂养，利用体重分层法对250只小鼠随机分组：共5个时间点(0day、2day、7day、14day和21day)，每个时间点5组；共25组。同一个时间点的5组小鼠，根据干预物不同分别为：Control组，HS组(100g/kg·bw)，C3G+HS组(100g/kg·bw)，PCA+HS组(100g/kg·bw)和Vit C+HS组(100g/kg·bw)。其中0day和2day组每组7只，其他时间点每组各12只。
具体操作如下：
(1)所有六个时间点的所有组别小鼠均在造模前7天进行预干预，且干预至实验结束：其中Control组和HS组灌胃相应体积的生理盐水，而C3G+HS组，PCA+HS组和VitC+HS组分别灌胃相应体积的干预物：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)、原儿茶酸(PCA)和维生素C(VitC)。
(2)除Control组外，预干预结束后，对其余组别进行43℃，30min水浴处理，造模过程中确保其睾丸下降到阴囊并处于43℃水浴中。
(3)单次热应激结束后，将小鼠擦干后放回笼盒中，直至麻药药效结束后自然苏醒。各组小鼠给予相同的饮水与饲料并自由饮食，每3天称量并记录体重，以调整灌胃计量。分别在各个时间点，给予麻药并脱颈处死相应组别的小鼠，采集血清、睾丸和精子，进行后续指标的测定。
2、苏木素-伊红染色
(1)取睾丸组织石蜡包埋蜡块按5μm厚度切片。
(2)将切片放在烘箱中以70℃烤片2h。
(3)脱蜡至水：二甲苯浸泡10min×3次；无水乙醇浸泡5min×2次；90％乙醇浸泡5min；80％乙醇浸泡5min；70％乙醇浸泡5min；去离子水浸泡5min。
(4)使用苏木素快速染色35s，流水冲洗5min。
(5)使用伊红快速染色3s，流水快速冲洗。
(6)脱水透明：70％乙醇浸泡2min；80％乙醇浸泡2min；90％乙醇浸泡2min；无水乙醇浸泡3min；二甲苯浸泡5min×2次。
(7)将中性树胶和新鲜二甲苯以4:1的比例混合后封片，自然晾干。
(8)镜检，拍照分析。
3、睾丸曲细精管直径及管腔厚度分析
利用显微镜对曲细精管和管腔厚度进行分析，其中以4倍物镜，10倍目镜下的1cm长度作为基准，测量曲细精管的直径及内径，并获得管腔厚度，每只小鼠分析不少于50个曲细精管。
二、实验结果
热应激后，小鼠睾丸曲细精管萎缩、生精上皮空泡化等现象，而生精细胞以及以支持细胞和间质细胞为主的体细胞同样表现出排列紊乱、脱落等情况。C3G和代谢产物PCA干预后，曲细精管损伤有显著改善，减少了生精细胞的丢失，缓解了曲细精管的空泡化和萎缩等现象，同时促进了热应激反应后机体对睾丸的自我修复功能，降低热应激诱发的生殖损伤。同时C3G和代谢产物PCA干预后附睾尾中的精子数量下降和形态损伤有所改善，缓解了附睾尾的炎症和均质化样现象。Vit C作为阳性对照与C3G和PCA干预组一样可有效缓解热应激诱导的睾丸损伤和附睾尾中精子数量下降、形态异常(图1)。
热应激造模组，在0day和2day组别中，曲细精管直径未发现明显变化，7day和14day曲细精管直径显著降低，而C3G、PCA和Vit C干预均可有效改善曲细精管直径降低，且C3G和PCA分别在7day和14day有显著效果。对于21day组，HS诱导的生精细胞丢失有所改善，但曲细精管直径未观察到良好的恢复效果，C3G、PCA和Vit C干预后有所改善，具有显著性差异(表1)。伴随着管腔厚度的降低到自我恢复的上升，C3G、PCA和Vit C干预可有效加快管腔厚度的自我恢复进程，尤其是PCA从2day起便表现出良好的修复效果，具有显著性差异(表2)。
表1
Figure BDA0003159311600000071
表2
Figure BDA0003159311600000072
实施例二 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或其代谢产物原儿茶酸可增加睾丸热耐受性
一、实验方法
1、实验动物分组及处理
同实施例1。
2、蛋白提取及免疫印迹
组织蛋白提取：
(1)准确称取睾丸组织，根据组织与裂解液为1:9的比例添加裂解液(RIPA:cocktail:PMSF＝100:1:1)，加入两颗磁珠，在组织研磨器中以60Hz，60s条件匀浆至无肉眼可见固体(匀浆前模块预冷，匀浆时配平并压紧盖子)。
(2)将匀浆后的样品在4℃、14000g条件下离心10min，取上清液。
(3)重复(2)的步骤，获得上清液。
(4)利用BCA试剂盒对上清液进行蛋白浓度的测定。
(5)根据测定所得原液蛋白浓度，以2.5μg/mL为蛋白终浓度对上清原液稀释，稀释使用1/5终体积Protein Buffer(5×)，用pH 7.4PBS溶液补充剩余体积。
(6)稀释后的样品涡旋震荡混匀后，金属浴(100℃)煮沸7min，以每管200μL分装，除立即使用外置于-20℃，其余均置于-80℃存放待用。
组织蛋白浓度测定：
(1)室温溶解蛋白标准品，利用pH 7.4PBS溶液将4mg/mL的蛋白标准品稀释至终浓度为1mg/mL。
(2)依据样品数量，以A:B＝50:1配制BCA工作液，充分混匀。
(3)利用pH 7.4PBS溶液将1mg/mL的蛋白标准品依次稀释为0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg/mL。
(4)将2.2.9.1(3)获得的上清原液稀释10倍，加10.0μL到96孔板中，每个样品3个复孔。
(5)各孔加入200μL BCA工作液，震荡，37℃恒温孵育20min。
(6)用酶标仪测定562nm下的吸光值，根据标准曲线和稀释倍数计算蛋白浓度。
蛋白免疫印迹：
(1)SDS-PAGE胶配制
配胶所用试剂均来自于碧云天试剂盒。根据目的蛋白的分子量大小选择适合的分离胶浓度，按照表3依次准确吸取超纯水，30％Arc-Bis，Tris-HCl(pH 8.8或pH 6.8)，10％SDS，10％过硫酸铵，临用前加入TEMED，分别进行分离胶及浓缩胶的配制。
表3 PAGE-SDS的组成
Figure BDA0003159311600000081
(2)蛋白电泳
将已凝固的分离胶和浓缩胶加入电泳槽，加入新鲜配制的1×SDS-PAGE电泳缓冲液拔梳子，依次加入蛋白样品及Protein Ladder开启恒压电泳，浓缩胶45V约45min，分离胶110V约75min，待溴酚蓝抵达胶底部时即可停止电泳。
(3)湿法转膜
将裁剪后的PVDF膜(0.22μm)置于溶液中活化平衡，依次为甲醇活化15s，超纯水平衡2min，1×SDS-PAGE转膜缓冲液(4℃预冷)平衡2min。取出已结束电泳的胶，切去浓缩胶及多余部分，在转膜液中打开转膜夹，黑色阴极朝下，依次放入海绵、滤纸(3层)、胶、PVDF膜、滤纸(3层)、海绵，即黑胶白膜。排气泡，合上转膜夹，置于电转槽中，加入4℃预冷的转膜液。根据不同分子量需求设定转膜条件，恒流转膜，转膜全程在冰浴中进行，一般条件为300mA，60min，若分子量过大可延长转膜时间，分子量小，则反之。
(4)封闭
取出PVDF膜，TBST缓冲液水平摇床洗涤5min后，加入5％脱脂奶粉封闭，室温垂直摇床封闭90min。
(5)一抗孵育
弃去封闭液，TBST缓冲液水平摇床洗涤3次，每次10min，弃去缓冲液后，加入稀释至合适比例的一抗，4℃垂直摇床孵育过夜。
(6)二抗孵育
回收一抗，TBST缓冲液水平摇床洗涤3次，每次10min，加入稀释后至合适比例的相应种属二抗，于垂直摇床室温孵育1h。
(7)显影
弃去二抗，TBST缓冲液水平摇床洗涤3次，每次10min。加入超敏ECL发光液，于自动显影曝光仪(预冷至-30℃)中显影。使用Clinx Chemi Analysis软件进行条带灰度分析。
3、免疫荧光
(1)取睾丸组织石蜡包埋蜡块按5μm厚度切片。
(2)将切片放在烘箱中以70℃烤片2h。
(3)脱蜡至水：二甲苯浸泡10min×3次；无水乙醇浸泡5min×2次；90％乙醇浸泡5min；80％乙醇浸泡5min；70％乙醇浸泡5min；去离子水浸泡5min。
(4)抗原修复：组织切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液中(pH 6.0)，于微波炉中进行抗原修复。中火8min至修复液沸腾，停火8min保温再转中低火7min，全程防止缓冲液过度蒸发，保持切片湿润。自然冷却后，玻片用PBS(pH 7.4)摇床洗涤3次，每次5min。
(5)采用免疫组化笔圈出组织位置，加入自发荧光猝灭剂5min，流水冲洗10min。
(6)滴加3％BSA，室温封闭5min。
(7)弃去封闭液后，滴加按一定比例稀释后的一抗，将切片置于湿盒中4℃孵育过夜。
(8)回收一抗，玻片用PBS(pH 7.4)摇床洗涤3次，每次5min。滴加相应种属荧光二抗，室温避光孵育50min。
(9)弃去二抗，玻片用PBS(pH 7.4)摇床洗涤3次，每次5min。滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
(10)玻片用PBS(pH＝7.4)摇床洗涤3次，每次5min。滴加抗荧光猝灭封片剂封片。
(11)将切片置于荧光显微镜下，用相应激发波长进行激发，观察并采集图像。
二、实验结果
热应激(43℃，30min)不影响eIF2α蛋白的表达(图2)，但会激活eIF2α上游激酶引起其磷酸化，而C3G及其代谢产物PCA，Vit C组可显著降低eIF2α的磷酸化水平(图3)。
生精细胞遭受热应激后，DAZL表达增强，且主要在基底膜的精原细胞、前细线期和早期粗线期精母细胞中特异性表达，而C3G及其代谢产物，Vit C组显著降低了DAZL的表达(图4)。
应激颗粒可在0day热应激后产生，并诱发睾丸组织发生自噬保护生精细胞。而C3G及其代谢产物PCA，Vit C等可减少翻译阻滞并减少应激颗粒的形成，增强睾丸的热耐受性，以自身抗氧化性替代应激颗粒的作用而发生自噬作用，避免凋亡的产生保护雄性生殖能力(图5)。
与Control组相比，HS暴露、C3G及其代谢产物PCA和Vit C组的PARP和Cleaved-PARP蛋白表达水平未发生显著的改变。表明，0day应激后产生的应激颗粒可保护生精细胞免于热应激诱发的损伤，同时C3G及其代谢产物PCA和Vit C组可在一定程度上降低外界应激压力对睾丸的作用，提高睾丸内生精细胞的耐热性(图6)。
热应激在0day热应激后诱发的应激颗粒存在下未诱发细胞发生凋亡，而C3G及其代谢产物PCA，Vit C处理后Bcl-2蛋白家族表达也无显著性差异(图7)。
实施例三 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或其代谢产物原儿茶酸缓解氧化应激和内质网应激介导的细胞凋亡。
一、实验方法：
1、实验动物分组及处理
同实施例1。
2、MDA含量测定
(1)样品上清的制备：准确称取并记录睾丸组织重量，根据每1.0mg睾丸组织加入9.0μL的pH 7.4PBS溶液，加入两颗磁珠，置于组织研磨仪中以60HZ，60s的条件低温研磨，离心10min(4℃、14000g)，取上清液用于后续指标的测定。
(2)主要试剂配制：
a.TBA储备液的配制：准确称取25mg TBA，用6.76mL TBA配制液成浓度为0.37％的TBA储备液，加热至70℃并剧烈Vortex以促进溶解，室温避光存放。
b.MDA检测工作液的配制：依据TBA储存液：抗氧化剂＝150μL:50μL:3μL的比例充分混匀，加热至70℃并剧烈Vortex以促进溶解，获得MDA检测工作液。
(3)样品测定
按照表4在离心管中加入样品及试剂。
表4 MDA含量测定
Figure BDA0003159311600000111
涡旋混匀后，置于金属浴中100C加热15min，水浴冷却至室温，1000g室温离心10min，取100μL上清液加入96孔板中，在532nm波长下测定吸光值，并以450nm作为参考波长进行双波长测定。
(4)组织蛋白浓度测定。
(5)MDA含量计算：直接依据所获得的标准曲线和稀释倍数获得样品中MDA含量，在通过直接根据标准曲线计算获得样品的MDA含量，再通过单位重量的蛋白含量来表示样品中的MDA 含量。
3、SOD活力测定
(1)组织上清制备：准确称取并记录睾丸组织重量，根据每1.0mg睾丸组织加入9.0μL的pH 7.4PBS溶液，加入两颗磁珠，置于组织研磨仪中以60HZ，60s的条件低温研磨，离心10min(4℃、14000g)，取上清液用于后续指标的测定。
(2)主要试剂配制：
a.WST-8/酶工作液的配制：依据SOD检测缓冲液:WST-8:酶溶液＝151μL:8μL:1μL的比例充分混匀，WST-8/酶工作液，置于冰浴存放，现配现用。
b.反应启动工作液的配制：依据40×反应启动液:SOD检测缓冲液＝1μL:39μL的比例充分混匀，获得反应启动工作液，置于冰浴存放，现配现用。
(3)SOD活力测定
按表5在96孔板中依次加入样品和试剂。
表5 SOD活力测定
Figure BDA0003159311600000121
混匀后于37C孵育30min，在450nm处测定吸光度，可设置600nm作为参比波长设置双波长检测，其实测读数为450nm吸光度的读数扣除参比波长的吸光度读数。
(4)组织蛋白浓度测定。
(5)SOD活力计算
Figure BDA0003159311600000122
Figure BDA0003159311600000123
4、GSH含量测定
(1)组织上清制备：
a.总谷胱甘肽测定样品制备：准确称取睾丸组织，根据每10mg睾丸组织加入30μL蛋白去除试剂M溶液，充分Vortex，加入70μL蛋白去除试剂M溶液，加入两颗磁珠，置于组织研磨仪中以60HZ，60s的条件低温研磨，匀浆至无肉眼可见的组织块，匀浆液以4℃、14000g条件离心10min，取上清用于后续测定。
b.GSSG测定样品制备：取上述处理所得上清加入GSH清除液，具体比例为样品：GSH辅助去除液＝10μL:2μL，立即涡旋混匀，再以10μL样品加入0.4μL GSH清除工作液的比例加入工作液，立即涡旋混匀，25℃反应60min，所得样品可用于GSSG含量测定。
(2)主要试剂配制：
总谷胱甘肽检测工作液配制：依据5倍稀释谷胱甘肽还原酶:DTNB储备液:总谷胱甘肽检测缓冲液＝6.6μL:6.6μL:150μL的比例充分混匀，获得总谷胱甘肽检测工作液。
(3)总谷胱甘肽和GSSG含量测定
按表6在96孔板中依次加入样品和试剂。
表6总谷胱甘肽含量测定
Figure BDA0003159311600000131
充分混匀，置于室温下孵育25min，测定412nm除的吸光值。
若同时进行总谷胱甘肽和GSSG含量测定，需对标准品进行去除GSH操作，并且需单独做标准曲线。
(4)样品中总谷胱甘肽、GSSG及GSH含量计算
总谷胱甘肽含量：直接依据所获得的标准曲线和稀释倍数获得样品中GSSG浓度根乘以2，即为总谷胱甘肽含量。
GSSG含量：直接依据所获得的标准曲线和稀释倍数获得样品中GSSG的含量
GSH含量(μM)＝总谷胱甘肽含量-2×GSSG含量
5、RNA提取及qRT-PCR
睾丸组织RNA提取：
(1)向睾丸组织中加入1.0mL Trizol以及两颗氧化锆研磨磁珠，利用组织研磨仪60Hz，60s低温研磨，匀浆至无肉眼可见固体(模块-20℃预冷)。
(2)加入200μL氯仿，涡旋混匀静置10min。
(3)12000g，4℃离心10min，取上层水相(尽量远离中间蛋白质层)200μL置于新的EP管中。
(4)加入200μL异丙醇，轻柔摇匀15s，静置10min。
(5)12000g，4℃离心15min，获得沉淀。
(6)用DEPC水新配制的75％乙醇加入沉淀中，涡旋洗涤沉淀。
(7)12000g，4℃离心15min，获得沉淀。
(8)重复上述(6)、(7)步骤，获得沉淀。
(9)弃去EP管中的液体，置于干净的架子上，通风橱中晾干，约1h。
(10)根据沉淀量，加入适量DEPC水使其浓度处于300-400μg/mL，溶解沉淀。
(11)取2.0μL RNA母液，在Nanodrop上测定RNA的浓度及A260/280纯度。
RNA逆转录：
RNA逆转录所用试剂均来自于艾科瑞生物试剂盒。
(1)去DNA反应
按照表7将5×gDNA Eraser Buffer及gDNA Eraser预先混合，再加入RNA和DEPC水。在PCR仪中，42℃反应2min。
表7去DNA反应体系
Figure BDA0003159311600000141
(2)逆转录反应
按照表8，在上一步反应液中加入预先按比例混合好的Evo M-MLV RTaseEnzymeMix、RT Primer MixⅠ、5×RTase Reaction Buffer MixⅠ及DEPC水。在PCR仪中以37℃，15min；85℃，5s；4℃，5min进行逆转录反应，反应结束后，分装置于-80℃保存待用。
表8 RNA逆转录反应体系
Figure BDA0003159311600000142
实时荧光定量PCR：
根据表9配制反应体系，并按照以下条件进行扩增。预变性(Repeat:1)：95℃，30s；PCR反应(Repeat:40)：95℃，5s；60℃，30s；Dissociation。
表9 Real Time PCR反应体系
Figure BDA0003159311600000151
引物序列见表10。
表10 PCR引物信息
Figure BDA0003159311600000152
qPCR结果处理：
根据反应所得Ct值求Ct(目的)-Ct(内参)＝ΔCt，再通过组间计算求得ΔΔCt及2-ΔΔCt。
二、实验结果
睾丸组织受热应激后除7day外MDA水平明显上升，而三种干预物都可降低MDA水平，其中C3G及其代谢产物PCA在0day有显著效果，Vit C在14day表现出明显效果(图8)。
热应激后睾丸组织中SOD水平明显下降，在7day和14day表现出显著性差异。而在C3G及其代谢产物PCA、Vit C组的SOD水平有了明显恢复，尤其在14day组中3种干预物均对提高SOD水平有显著性效果(图9)。
热应激暴露7天后小鼠睾丸组织的还原型谷胱甘肽(GSH)水平显著性下调，且GSH/GSSG比例也下降。而在C3G及其代谢产物PCA和Vit C干预后，可有效改善热应激对睾丸非酶抗氧化系统的损伤(图10)。
急性应激(0day)可降低IRE1α和XBP1的表达，主要归因于UPR反应的负反馈系统的启动和应激颗粒的形成。而C3G及其代谢产物PCA和Vit C由于其抗氧化性以替代应激颗粒的作用同样可下调IRE1α和XBP1 mRNA水平，与HS组结果一致。当机体持续处于氧化应激状态时(2、7、14day)时，热应激后IRE1α和XBP1的表达上调，触发细胞凋亡。而C3G及其代谢产物PCA和Vit C在不同时期内可有效降低IRE1α和XBP1水平，避免生精细胞的大量凋亡，且长时期摄入C3G、PCA和Vit C表现出更好的改善功效(图11、图12)。
HS组的生精细胞出现了明显的凋亡，且凋亡的主要细胞类型为粗前期后的精母细胞及精子细胞。C3G及其代谢产物PCA、Vit C组均可有效缓解特定类型的生精细胞的凋亡(图13)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备防治热应激诱发的男性生殖损伤的药物或产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述男性生殖损伤为精子发生障碍、睾丸组织损伤、生精细胞凋亡、曲细精管萎缩、生精上皮空泡化和/或睾丸管腔直径与厚度减小中的一种或几种。
3.矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备提高睾丸热耐受性的药物或产品中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸通过降低eIF2α磷酸化水平和应激颗粒的表达提高睾丸热耐受性。
5.矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备改善睾丸抗氧化系统的药物或产品中的应用。
6.矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备调节IRE1α-XBP1途径以缓解氧化应激的药物或产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸备调节IRE1α-XBP1途径缓解氧化应激。
8.矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸在制备缓解细胞凋亡的药物或产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和/或原儿茶酸备调节IRE1α-XBP1途径缓解细胞凋亡。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞为生精细胞。
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