CN105188707A - 包含PI3Kβ抑制剂和RAF抑制剂以克服癌细胞抵抗的抗肿瘤组合物 - Google Patents

包含PI3Kβ抑制剂和RAF抑制剂以克服癌细胞抵抗的抗肿瘤组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗抵抗至少一种RAF抑制剂的患者的PI3Kβ抑制剂与RAF抑制剂的组合、包含该组合的试剂盒、其药物用途以及当给药至患者时监测所述组合功效的方法。

Description

包含PI3Kβ抑制剂和RAF抑制剂以克服癌细胞抵抗的抗肿瘤组合物
本发明涉及用于治疗抵抗至少一种RAF抑制剂的患者的PI3Kβ抑制剂与RAF抑制剂的组合、其药物用途以及当给药至患者时监测所述组合功效的方法。
磷酸肌醇3-激酶(Pl3K)是涉及诸如细胞周期、细胞运动和细胞凋亡等诸多细胞功能的信号传导分子。PI3K是产生活化若干靶蛋白的第二信使分子的脂质激酶，其包括丝氨酸/苏氨酸激酶，例如PDK1和AKT(也称为PKB)。PI3K分为三个种类且种类I包含称为PI3Kα、PI3Kβ(PI3Kβ)、PI3Kδ和PI3Kγ的四种不同PI3K。
2-{2-[(2S)-2-甲基-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基]-2-氧代乙基}-6-(吗啉-4-基)嘧啶-4(3H)-酮(下称化合物(I))是PI3Kβ同工型的一种选择性抑制剂。在使用此化合物处理之后，具有活化PI3K/AKT通道的癌细胞(例如缺失PTEN的肿瘤细胞(磷酸酶及张力蛋白同源基因，还被认为是在多种晚期癌症基因1中突变的磷酸酶及张力蛋白同源体))通常经由抑制Akt以及Akt下游效应子的磷酸化、抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤细胞死亡诱导来产生应答。若干研究显示PI3Kβ同工型是涉及PTEN-缺失肿瘤的致肿瘤性的PI3K同工型(V.Certal等人，J.Med.Chem.2012，55，4788-4805和V.Certal等人，Bioorganics&MedicinalChemistryLetters，22，(2012)6381-6384；V.Certal等人，JMedChem.57(2014):903-20)。
RAF激酶参与RAS-RAF-MEK-ERK信号转导级联，其还称作丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联。RAF激酶家族的三个成员是A-RAF、B-RAF和C-RAF。使用RAF激酶抑制剂处理的癌细胞通常经由抑制MEK和ERK的磷酸化、下调细胞周期蛋白D、诱导G1停止来产生应答，且最终发生细胞凋亡。因此，RAF已成为极受关注的用于研发癌症疗法的靶点。
1-丙烷磺酰胺,N-[3-[[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]羰基]-2,4-二氟苯基](下称化合物(II)是RAF激酶的抑制剂。此化合物(下称化合物(II)，还称为PLX-4032或威罗菲尼(Vemurafenib))是可口服利用的小分子，其经研发用于治疗具有活化BRAF突变的癌症。更具体地，其针对具有BRAFV600E突变的黑素瘤细胞系具有明显抗肿瘤效应，但针对具有野生型BRAF并非如此。具有BRAFV600E突变的黑素瘤代表超过50％的黑素瘤。它们结构性活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，促进细胞增殖并预防凋亡。
在一项近期的威罗菲尼I期临床试验中，81％的具有BRAF突变黑素瘤的患者通过实体瘤治疗响应评价标准(ResponseEvaluationCriteriainSolidTumors)(RECIST)确认经历了至少30％的肿瘤收缩，并且在两名患者中具有完全响应(FlahertyKT等人，N.EnglJMed363:809-819，2010)。
然而，尽管存在此类有希望的响应，但已出现了威罗菲尼抵抗。
药物抗性是癌症化疗失败的主要原因。抗性可为先前存在的(固有抗性)或由药物诱导的(获得性抗性)。获得性抗性出现在对于治疗的瞬态响应后，其通常复发。对于靶向激酶抑制剂的获得性抗性的基因机制通常是影响靶向激酶的突变或靶向信号通路内可补偿或旁路靶向肿瘤蛋白抑制的其它基因的改变。
已研究了癌细胞对于RAF抑制剂的固有抗性。据显示，虽然PTEN表达状态不能预测对于威罗菲尼生长抑制效应的敏感性，但PTEN缺失/BRAF突变黑素瘤细胞系相比于表达PTEN的细胞系显示出显著更少的凋亡(KimH.T.Paraiso等人，CancerRes.2011；71:2750-2760)。BRAF突变和PTEN表达沉默的共同出现在人类黑素瘤中相对常见(约20-30％)。
然而，RAF抑制剂抵抗中涉及若干机制。事实上，一些BRAF突变/PTEN缺失黑素瘤细胞系对于RAF抑制剂敏感而一些其它细胞系对RAF抑制剂不敏感。
造成对威罗菲尼固有抗性或获得性抗性的机制仍在研究之中。
现有数据显示MAPK通路的再活化通过出现BRAF的截短过活形式，NRAS(成神经细胞瘤RAS病毒致癌基因同源物)或MEK中的继发突变。例如，已确认了在相应预治疗肿瘤中不存在的在下游激酶MEK1中密码子1221处的活化突变。所述MEK1C121S突变显示出在体外增加激酶活性并赋予对于RAF抑制的强力抵抗(NikhilWagle等人，JClinOncol29:3085-3096，2011)。虽然MAPK再活化出现在许多复发病例中，但增加的PI3K信号转导出现在其它病例中。
此外，已描述了在抵抗RAF或MEK抑制剂的黑素瘤中，采用RAF或MEK抑制剂治疗后TORC1(TOR复合体1)活性仍然维持，尽管在一些情况下强烈抑制了MAPK信号转导。如通过减少的pS6(核糖体蛋白S6，当磷酸化时还称作pS6)所测量的响应RAF或MEK抑制剂的TORC1抑制可有效预测BRAF突变黑素瘤细胞中通过RAF抑制剂诱导的细胞死亡。
在体内小鼠模型中，MAPK抑制后的TORC1活性抑制对于凋亡诱导和肿瘤响应而言是必需的。在治疗之前和启动RAF抑制疗法之后获得自具有BRAF突变黑素瘤的患者的成对活检中，pS6抑制预测了显著改善的无进展生存期(PFS)。可通过连续细针穿刺活检实时监测此pS6变化，量化pS6成为有价值的生物标记以指导BRAF突变黑素瘤治疗(RyanB.Corcoran等人，Sci.Transl.Med.5:196ra98，2013)。
因此，存在对于癌症治疗，特别是黑素瘤治疗的需求，其克服对于RAF抑制剂的抵抗。还存在提供癌症例如黑素瘤的治疗的需求，所述治疗更有效地抑制肿瘤细胞增殖并增强肿瘤细胞凋亡。还存在最小化对于患者的毒性的需求。
特别需要与其它靶向疗法组合使用的RAF抑制剂疗法，其会导致更高效率且不会实质上增加，或甚至维持或降低通常使用的RAF抑制剂的剂量。
还存在提供生物标记以监测癌症治疗功效的需求。
本发明的一个目标是提供针对具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者的治疗。
本发明的一个目标是提供针对具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者的治疗，其克服了对所述至少一种RAF抑制剂的抵抗。
本发明的一个目标是提供一种组合，其用于治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者。
本发明的一个进一步目标是提供一种试剂盒以治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者。
本发明的一个目标是提供一种药物以治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者。
本发明的另一目标是提供一种治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者的方法。
本发明的一个目标是提供一种生物标记以及监测治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者的功效的方法。
因此，本发明涉及PI3Kβ抑制剂与RAF抑制剂的组合，其用于治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者。
本发明还涉及包含用于其如上所述用途的上述组合的试剂盒，用于同时、分开或相继给药。
本发明还涉及包含本发明所述组合的药物组合物，其用于治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者。
本发明还涉及一种治疗方法，其包括给药上述组合至具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者。
本发明还涉及生物标记以及使用所述生物标记以监测当给药至具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者时如上所述组合的功效的方法。
令人惊奇地，发明人发现RAF抑制剂连同PI3Kβ抑制剂的组合克服了癌细胞对至少一种RAF抑制剂的抵抗，特别是在RAF抑制剂抵抗性黑素瘤细胞中，例如对至少一种RAF抑制剂不敏感的人黑素瘤A2058细胞系。
甚至更惊奇地，如上定义的组合显示出对抵抗至少一种RAF抑制剂的细胞系的协同效应。
在一个实施方案中，协同效应理解为组合的效应大于其个体组分的预期加和效应。更特别地，可通过如R.Straetemans中所述的射线方法设计测定协同效应(BiometricalJournal，47，2005，299-308)。
在另一实施方案中，协同效应还可理解为组合的效应大于两个个体组分中的一个的最佳效应。
在另一实施方案中，可根据T.H.CORBETT等人，定义协同为：若组合在治疗上优于以其最优剂量使用的一种或另一种组分，则所述组合显示治疗协同(T.H.CORBETT等人，CancerTreatmentReports，66，1187(1982))。根据此定义，为证明组合的功效，可能需要比较所考虑研究中的组合的最大耐受剂量与各单独成分的最大耐受剂量。此功效的量化可通过例如计算log10细胞杀灭或任意其它已知方法。
在一个实施方案中，关于以下效应中的一项可获得根据本发明的协同：
-抗增殖活性；和/或
-促凋亡活性。
在一个实施方案中，关于S6磷酸化抑制可获得增强效应。“增强效应”或“增强抑制”是指组合的抑制效应大于两个个体组分中的一个的最佳抑制效应。
在一个实施方案中，关于以下效应中的一项可获得根据本发明的协同：
-肿瘤生长抑制(肿瘤停滞)；和/或
-部分肿瘤消退；和/或；
-完全肿瘤消退。
可在对于至少一种RAF抑制剂敏感或具有抗性的细胞系中获得此一或多个效应。
本发明的一个优势是提供了用于具有显示RAF抑制剂抵抗的肿瘤(其治疗可能性很少)的患者的新疗法。
本发明的另一优势在于由于如上所述的组合协同效应，可需要更少的各活性成分剂量以克服RAF抑制剂抵抗和/或可减小药物毒性。
在根据本发明各目标的一个实施方案中，PI3Kβ抑制剂是对PI3Kβ呈现抑制效应的化合物。更具体地，它们通常对PI3Kβ呈现抑制效应而对其它PI3K同工型(即Pl3Kα、PI3Kδ和PI3Kγ)具有适中的或无抑制效应。
在一个实施方案中，它们选择性针对PI3Kβ同工型。“选择性PI3Kβ抑制剂”可理解为PI3Kβ抑制剂优先于其它同工型Pl3Kα、PI3Kδ和PI3Kγ而影响特定PI3Kβ同工型的能力。PI3Kβ选择性抑制剂可具有辨别这些同工型的能力，并从而实质上影响PI3Kβ同工型。在一个实施方案中，所述选择性PI3Kβ抑制剂不是pan-PI3K抑制剂。此PI3Kβ同工型选择性相比于pan-PI3K抑制剂可呈现出更好的安全特性(safetyprofiles)。
更特别地，在生化和细胞测定中，选择性PI3Kβ抑制剂可靶向PI3Kβ同工型(IC50≤300nM)并可相比其它PI3K同工型(Pl3Kα、PI3Kδ和PI3Kγ)具有选择性(IC50≥250nM)。在一个实施方案中，它们可呈现出PI3Kβ相比其它同工型至少2倍的抑制比。
在一个实施方案中，所述PI3Kβ抑制剂不抑制mTOR。
在一个实施方案中，所述PI3Kβ抑制剂具有如下定义的结构式(I)：
根据式(I)的PI3Kβ抑制剂在本文中称作“化合物(I)”。化合物(I)是I类PI3K的PI3Kβ同工型的选择性抑制剂。“选择性抑制剂”可理解为化合物(I)优先于其它同工型Pl3Kα、PI3Kδ和PI3Kγ而影响特定PI3Kβ同工型的能力。化合物(I)可具有辨别这些同工型的能力，并从而仅影响PI3Kβ同工型。更特别地，化合物(I)对PI3Kβ同工型具有的抑制活性可十倍优于其对于其它同工型α、δ和γ的抑制活性。
在生化测定中，化合物(I)可靶向PI3Kβ同工型(IC5065nM)并可相比其它PI3K同工型具有选择性(对于Pl3Kα、PI3Kδ和PI3Kγ的IC50分别为1188nM、465nM和大于10000nM)。
化合物(I)可不抑制mTOR，更特别地，可不抑制mTOR直至10μM。
还可通过针对一大板脂质和蛋白激酶(包含超过400种激酶)对化合物(I)作图来控制其选择性。除了PI3Kδ和PI3Kβ同工型，VPS34脂质激酶是仅有的显示抑制的激酶，其亚微摩尔IC50为180nM；然而，使用功能性VPS34细胞分析，此针对VPS34的生化活性水平未转入为细胞活性(IC50大于10,000nM)。
在生化设置中观测到的高水平PI3Kβ-同工型选择性在细胞测定中得到确证。
为特异性研究式(I)化合物分别对各I类PI3K同工型的细胞选择性，如同已经描述的(CertalV，HalleyF，Virone-OddosA，DelormeC，KarlssonA，RakA等人，DiscoveryandOptimizationofNewBenzimidazole-andBenzoxazole-PyrimidoneSelectivePI3KβInhibitorsfortheTreatmentofPhosphataseandTENsinhomologue(PTEN)-DeficientCancersJ.Med.Chem.2012；55:4788-4805)，在适当细胞系统中评估丝氨酸473残基上的AKT磷酸化(pAkt-S473)抑制(Pl3Kα为PIK3CA-突变H460肺肿瘤细胞、PI3Kβ为过表达活化p110β的MEF-3T3-myrp110β小鼠成纤维细胞，PI3Kδ为过表达活化p110δ的MEF-3T3-myrp110δ小鼠成纤维细胞且PI3Kγ为RAW264.7小鼠巨噬细胞(通过C5a刺激AKT磷酸化后))。
式(I)化合物可在PI3Kβ依赖性细胞系中抑制PI3Kβ同工型，效力比PI3Kδ(IC50：823nM)高26倍(IC50：32nM)。
式(I)化合物可在细胞和生化分析中对Pl3Kα和PI3Kγ同工型呈现相同水平活性(IC50分别为2,825和>3,000nM)。
式(I)化合物可为细胞中的PI3Kβ选择性抑制剂。式(I)化合物对PI3Kβ的效力可分别为对PI3Kδ、Pl3Kα和PI3Kγ的效力的26倍、88倍和超过94倍数。
化合物(I)的制备、性质和PI3Kβ抑制能力提供于例如国际专利公开WO2011/001114，特别是其中的实施例117和表p216中。WO2011/001114的全部内容以引用方式并入本文中。式(I)化合物的中性和盐形式皆在本文中考虑。
在根据本发明各目标的一个实施方案中，RAF抑制剂是对RAF蛋白呈现抑制效应的化合物。更特别地，它们在生化测定和细胞中通常呈现针对RAF蛋白小于500nM的IC50。
更具体地，RAF抑制剂是BRAF抑制剂。以下化合物可被引用为BRAF抑制剂：索拉菲尼(Nexavar)、威罗菲尼(PLX-4032)、达拉菲尼(GSK2118436)、PLX-4720、GDC-0879、瑞格非尼(BAY73-4506)、RAF265(CHIR-265)、SB590885、AZ628、ZM336372、NVP-BHG712、Raf265衍生物和GSK2118436。
在一个实施方案中，所述RAF抑制剂具有如下定义的结构式(II)：
根据式(II)的RAF抑制剂在本文中称为“化合物(II)”且也称为PLX4032或威罗菲尼。
化合物(II)的制备、性质和RAF抑制能力提供于例如国际专利公开WO2007/002325中，具体地其中的实施例44化合物P-0956和表2a、2b、2c、2d、2e和2h。WO2007/002325的全部内容通过引用并入本文中。式(II)化合物的中性和盐形式皆在本文中考虑。
在一些实施方案中，上述化合物可为非溶剂化或溶剂化形式。如本领域所知，溶剂化物可为任何药学上可接受的溶剂，例如水、乙醇等。一般而言，溶剂化物的存在或其缺乏对于上述RAF或PI3Kβ抑制剂的功效并不具有实质影响。
在一些实施方案中，这些化合物是以药用盐的形式使用。可通过本领域公知的任何方法来获得盐，例如详尽说明于WO2011/001114(通过引用并入本文中)中的任何方法和盐形式。
化合物的“药用盐”是指药学上可接受且保留药理学活性的盐。应理解，药用盐是无毒的。关于适宜的药用盐的附加信息可见于Remington'sPharmaceuticalSciences，第17版，Mack出版公司，Easton，PA，1985，或S.M.Berge等人，"PharmaceuticalSalts,"J.Pharm.Sci.，1977；66:1-19，二者皆通过引用并入本文中。
药学上可接受的酸加成盐的实例包括与无机酸形成的那些盐，所述无机酸为例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸；以及与有机酸形成的那些盐，所述有机酸为例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、丙酮酸、乳酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基二-(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸、对甲苯磺酸和水杨酸。
在一个实施方案中，根据本发明的用于其用途的组合可抑制肿瘤细胞生长或实现部分或完全的肿瘤细胞消退。
根据一个实施方案，本发明涉及用于其如上所定义用途的组合，其中所述PI3Kβ抑制剂和RAF抑制剂为产生如上所定义的协同效应的量。
在一个实施方案中，根据本发明的用于其用途的组合对于患者癌细胞增强抗增殖活性和促凋亡活性。
根据一个实施方案，本发明涉及用于其如上所定义用途的组合，其中所述PI3Kβ抑制剂和RAF抑制剂为针对对于患者癌细胞的抗增殖活性和促凋亡活性产生协同效应和/或刺激效应的量。在一个实施方案中，以浓度依赖性方式获得针对对于患者癌细胞的促凋亡活性的所述协同效应和/或刺激效应。
在一个特别实施方案中，可以包含自1/16至26/1的化合物(I)/化合物(II)比率实现所述对于抗增殖活性的协同效应。
在一个特别实施方案中，对于与10μM浓度化合物(I)组合的1μM-10μM化合物(II)浓度可实现所述对于促凋亡活性的刺激效应。
在一个特别实施方案中，对于与10μM浓度化合物(I)组合的10μM或1μM化合物(II)浓度可实现所述对于促凋亡活性的刺激效应。
在一个特别实施方案中，对于与0.1μM至10μM浓度化合物(I)组合的0.1μM至10μM化合物(II)浓度可实现所述对于促凋亡活性的刺激效应。
在一个特别实施方案中，对于0.1μM、1μM或10μM化合物(II)与0.1μM、1μM或10μM化合物(I)浓度可实现所述对于促凋亡活性的刺激效应。
在一个特别实施方案中，对于10μM化合物(II)与10μM化合物(I)浓度可实现所述对于促凋亡活性的刺激效应。
在一个特别实施方案中，对于10μM化合物(II)与1μM化合物(I)浓度可实现所述对于促凋亡活性的刺激效应。
在一个特别实施方案中，对于1μM化合物(II)与10μM化合物(I)浓度可实现所述对于促凋亡活性的刺激效应。
在一个特别实施方案中，对于1μM化合物(II)与1μM化合物(I)浓度可实现所述对于促凋亡活性的刺激效应。
在一个特别实施方案中，对于0.1μM化合物(II)与10μM化合物(I)浓度可实现所述对于促凋亡活性的刺激效应。
在一个特别实施方案中，对于与0.1μM至10μM浓度化合物(I)组合的0.1μM至10μM化合物(II)浓度可实现所述对于S6磷酸化的抑制效应。
在一个特别实施方案中，对于0.1μM、1μM或10μM化合物(II)与0.1μM、1μM或10μM化合物(I)浓度可实现所述对于S6磷酸化的抑制效应。
在本发明各目标的一个实施方案中，抵抗至少一种RAF抑制剂的患者是抵抗所述组合的RAF抑制剂。在一个实施方案中，抵抗至少一种RAF抑制剂是固有抗性。在一个实施方案中，抵抗至少一种RAF抑制剂是获得性抗性。
在一个实施方案中，当如上所定义抵抗是获得性抗性时，其理解为抵抗至少一种RAF抑制剂的患者先前已通过所述RAF抑制剂治疗且不再响应所述治疗或者可能以所述RAF抑制剂的高的和过毒性剂量响应所述治疗。
在一个实施方案中，所述患者的抗性癌细胞对于所述RAF抑制剂具有相对抗性。在一个实施方案中，所述患者的抗性癌细胞对于所述RAF抑制剂是不敏感的。“不敏感的”可理解为癌细胞对于药学上可接受的剂量下的RAF抑制剂不响应。更特别地，所述RAF抑制剂对于不敏感性癌细胞相比于对于敏感性癌细胞可显示出至少10倍大的IC50。
例如，BRAF抑制剂威罗菲尼对于A2058不敏感性癌细胞可显示约4,200nM的IC50，且对于WM-266-4敏感性癌细胞可显示84nM的IC50。
在一个实施方案中，所述癌细胞存在活化BRAF突变，特别是BRAF-V600E突变或BRAF-V600K突变。
BRAF中的各种活化突变(即，体点突变)导致该蛋白变为过活。其触发可在特定恶性肿瘤中发挥作用的信号级联。约90％已知BRAF突变是V600E突变。其涉及在蛋白链的V600位点处取代缬氨酸(V)为谷氨酸(E)，导致结构性活化BRAF。此点突变的其它变体包括赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)和精氨酸(R)。该V600点突变使得BRAF可独立信号转导上游线索。由于结构性活化BRAF，经由MEK和ERK的过活下游信号转导导致不依赖于生长因子的过量细胞增殖和存活。
“活化BRAF突变”可理解为使得BRAF可独立信号转导上游线索和/或产生结构性活化BRAF蛋白的BRAF基因突变。
在另一实施方案中，所述癌细胞是PTEN缺失的。经治疗癌症因而可为BRAF-突变的，例如BRAF-V600E突变/PTEN缺失黑素瘤或BRAF-V600K突变/PTEN缺失黑素瘤。
根据本发明经治疗的癌症选自乳腺癌、肺癌、结肠癌、甲状腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌以及黑素瘤。在一个特别实施方案中，所述癌症是黑素瘤。
在一个特别实施方案中，经治疗患者具有突变MEK1激酶，更特别为突变MEK1C121S激酶。
在根据本发明各目标的一个实施方案中，PI3Kβ抑制剂和RAF抑制剂是在组合制剂中，其用于同时、分开或相继给药以用于治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者。
根据本发明，“同时”是指通过相同途径并在相同时间给药PI3Kβ抑制剂和RAF抑制剂(例如它们可经混合)，“分开”是指它们通过不同途径和/或在不同时间给药，且“相继”是指它们在不同时间分别给药。
同时给药通常是指两种化合物在完全相同的时间进入患者中。然而，同时给药也包括以下可能性：RAF抑制剂和PI3Kβ抑制剂在不同时间进入患者中，但时间差足够小，使得在第二所给药化合物进入之前第一所给药化合物没有时间对患者生效。这种延迟时间典型对应于小于1分钟，且更典型小于30秒。
在其它实施方案中，RAF和PI3Kβ抑制剂并不同时给药。就此而言，在给药第二所给药化合物之前，已将第一所给药化合物提供给患者一段时间以发挥作用。通常，时间差并不超过第一所给药化合物在患者中完成其效应的时间，或并不超过第一所给药化合物在患者中完全或实质上消除或失效的时间。
在一个特别实施方案中，所述给药是分开或相继的，且所述PI3Kβ抑制剂的给药后跟随所述RAF抑制剂的给药。
在另一特别实施方案中，所述给药是分开或相继的，且所述RAF抑制剂的给药后跟随所述PI3Kβ抑制剂的给药。
在另一实施方案中，如上所述经组合制剂包含在试剂盒中，其进一步包含使用说明。
根据本发明的各目标，在一个实施方案中：
-以包含自100-1600mg的剂量给药化合物(I)，并
-以包含自600-1100mg的剂量给药化合物(II)。
更特别地：
-所述化合物(I)以选自以下剂量的剂量给药：100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、1020、1040、1060、1080、1100、1120、1140、1160、1180、1200、1220、1240、1260、1280、1300、1320、1340、1360、1380、1400、1420、1440、1460、1480、1500、1520、1540、1560、1580和1600mg，典型选自以下剂量：100、200、400、600、800、1000、1200、1400和1600mg，且
-所述化合物(II)以720mg或960mg，典型960mg的剂量给药。
根据本发明各目标，在一另外实施方案中，一天两次给药化合物(I)和(II)。在一个实施方案中，口服给药化合物(I)和(II)。给药周期通常持续至少28天，典型28天。给药周期可重复，两个周期间可具有或不具有休息期(即不给药化合物(I)和(II)的时期)。更特别地，给药化合物(I)和(II)至少28天时期而无休息。
“剂量”是指给药剂量(例如在“以600-1100mg的剂量给药威罗菲尼”的表达中)。所述剂量并非必须为“单位剂量”，即可给药至患者并可轻易处理和包装，保持为物理和化学稳定单位剂量的单一剂量。作为实例，通常当威罗菲尼剂量为960mg(给药剂量)时，可给药4片240mg(单位剂量)。
当每天两次给药所述化合物或产品时，每日剂量为给药剂量(即，本申请中剂量)的两倍。例如，当每天两次给药960mg威罗菲尼剂量时，总日剂量为1,920mg。
在一个实施方案中，用于其如上所述用途的所述组合和/或试剂盒和/或药物包含至少一种另外的抗癌化合物。
在一个实施方案中，用于其如上所述用途的所述组合和/或试剂盒和/或药物组合物另外包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，本发明涉及如上所述组合用于制备药物以治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者的用途。
在另一方面中，本发明涉及治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者的方法，其包括给药至所述患者与RAF抑制剂组合的治疗有效量的PI3Kβ抑制剂。
在抵抗RAF抑制剂的癌细胞中，pS6水平可能不会降低，表明TORC1活性未被抑制。因此，S6磷酸化的抑制可用作生物标记以监测如上所定义组合的有益活性：
若给药如上所定义组合后S6磷酸化被抑制，则表明抗药癌细胞中pS6水平降低，其显示通过如上所定义组合可克服该抗性。
“pS6”是指磷酸化核糖体蛋白S6。
因此，在另一方面中，本发明涉及pS6蛋白作为包含PI3Kβ抑制剂和RAF抑制剂的组合对于抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的功效的生物标记的用途。在一个特别实施方案中，所述组合是根据本发明的组合。
在一个实施方案中，本发明涉及监测具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者对于如上所定义组合的响应的体外方法，所述方法包括：
i)在第一时间点测定所述患者的抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞中pS6蛋白的量，
ii)在之后时间点测定所述患者的抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞中pS6蛋白的量，
iii)比较步骤i)的pS6蛋白的量与步骤ii)中pS6蛋白的量，以及
iv)若步骤i)的pS6蛋白的量等于或高于步骤ii)中pS6蛋白的量，则确定患者响应所述组合。
“患者响应”是指本发明组合减少或抑制TORC1活性，导致S6磷酸化水平稳定化或降低，且特别是所述疾病的稳定化或降低。
在一个实施方案中，在步骤iv)中，步骤i)的pS6蛋白的量高于步骤ii)中pS6蛋白的量。更特别地，步骤i)的pS6蛋白的量高于步骤ii)中pS6蛋白的量至少30％，优选高于步骤ii)中pS6蛋白的量至少50％。
在一个实施方案中，在给药所述组合前进行步骤i)并在给药所述组合至患者后进行步骤ii)。在此特别实施方案中，若步骤i)的pS6蛋白的量高于步骤ii)中pS6蛋白的量，则可在步骤iv)中确定患者响应所述组合。
在另一实施方案中，步骤i)和ii)均在给药所述组合至所述患者后的不同时间点进行。在此特别实施方案中，若步骤i)的pS6蛋白的量等于或高于步骤ii)中pS6蛋白的量，则可在步骤iv)中确定患者响应所述组合。
在一个实施方案中，可通过免疫印迹测定pS6蛋白的量。可使用其它方法监测pS6抑制水平。
在一个实施方案中，所述患者的抵抗性癌细胞是对至少一种RAF抑制剂不敏感的癌细胞。
通常，PI3Kβ和RAF抑制化合物或其药用盐或溶剂化物形式(呈纯形式或适当的药物组合物形式)可经由本领域已知的任何可接受给药模式或试剂来给药。可例如口服、经鼻、肠胃外(静脉内、肌内或皮下)、局部、透皮、阴道内、膀胱内、脑池内或经直肠给药化合物。剂型可为例如固体、半固体、冻干粉末或液体剂型，例如片剂、丸剂、软质弹性或硬质明胶胶囊剂、粉末剂、溶液剂、混悬剂、栓剂、气溶胶等，更特别地呈适于简单给药精确剂量的单位剂型。一种特定给药途径是口服，特别是这样的口服：其中可根据拟治疗疾病的严重程度来调节便利日剂量方案。
助剂和辅料可包括例如防腐剂、润湿剂、助悬剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、乳化剂和分散剂。通常通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来提供对微生物作用的预防。也可包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可通过使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。助剂还可包括润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂和抗氧化剂，例如柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
适于肠胃外注射的剂型可包含生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液和用于再构成为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)及其适宜混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。合适的流动性可例如通过以下方法维持：使用诸如卵磷酯等包衣，在分散液的情况中维持所需粒径，和使用表面活性剂。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉末剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性常规赋形剂(或载体)如柠檬酸钠或磷酸二钙或以下物质混合：(a)填充剂或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂，例如纤维素衍生物、淀粉、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖和阿拉伯树胶，(c)保湿剂，例如甘油，(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、交联羧甲基纤维素钠、复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂，例如石蜡，(f)吸收促进剂，例如，季铵化合物，(g)润湿剂，例如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯、硬脂酸镁等，(h)吸附剂，例如，高岭土和膨润土，和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠或其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情形下，此类剂型还可包含缓冲剂。
如上所述固体剂型可使用包衣和外壳(例如肠溶包衣和其它本领域公知的)来制备。其可含有安抚剂，且可具有这样的组成：使得它们在肠道某一部分中以延迟方式释放一种或多种活性化合物。可使用的包埋组合物的实例为聚合物质和蜡。若合适，则活性化合物也可呈具有一种或多种上述赋形剂的微囊化形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。这类剂型例如通过以下方法制备：将本文所述的RAF或PI3Kβ抑制剂化合物或其药用盐和任选的药物辅料溶解、分散(等等)于以下物质中以由此形成溶液或悬浮液：载体，例如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等；增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄基酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺；油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油；甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯；或这些物质的混合物等。
除活性化合物外，混悬剂可含有助悬剂，例如，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶，或这些物质的混合物等。
用于直肠给药的组合物为例如可通过混合本文所述化合物与例如适宜非刺激性赋形剂或载体(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)制得的栓剂，其在常温下为固体但在体温下为液体且因此在处于适宜体腔内时熔化并在其中释放活性组分。
用于局部给予的剂型可包括例如软膏剂、粉末剂、喷雾剂和吸入剂。在无菌条件下将活性组分与生理学上可接受的载体和任一可需防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。还可采用眼用制剂、眼部软膏剂、粉末剂和溶液剂。
通常，取决于预期给药模式，药学上可接受的组合物将含有约1重量％至约99重量％本文所述化合物或其药用盐和99重量％至1重量％药学上可接受的赋形剂。在一个实例中，组合物将具有介于约5重量％与约75重量％之间的本文所述化合物或其药用盐，且剩余部分是适宜的药物赋形剂。
本领域技术人员知晓或将明了此类剂型的实际制备方法。参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版，(Mack出版社，Easton，Pa.，1990)。
根据本发明，各实施方案可单独采用或以所有可能方式组合。
以下出于说明目的对实施例进行阐述并描述本发明的某些具体实施方案。然而，权利要求的范围并不以任意方式被本文所述的实施例限制。
附图简述
图1是化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系WM-266-4中的体外抗增殖活性的等效线图示。
图2是化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系A2058中的体外抗增殖活性的等效线图示。
实施例
进行若干体外实验以研究PI3Kβ抑制剂(化合物I)和RAF抑制剂(化合物II)之间对于人类黑素瘤细胞系WM-266-4和A2058(均BRAF突变和PTEN缺失)中的细胞增殖的抑制活性、细胞死亡的诱导以及S6磷酸化的相互作用。已显示黑素瘤细胞系A2058对于作为单一药物的化合物(II)不敏感，相比于敏感性细胞系如WM-266-4具有较低的抗增殖效应(IC40分别约1,200nM和60nM)。
使用如R.Straetemans(BiometricalJournal，47，2005)中所述的射线设计方式来表征化合物(I)和化合物(II)之间对于两种细胞系的相互作用，该射线设计方式可研究混合物中不同有效分数f的化合物的协同作用，每一射线的有效分数是恒定的。每一组合和每一细胞系的代表性实验呈现于下文中。使用免疫印迹法来表征由单独或组合的两种化合物诱导的细胞死亡，该方法可通过检测PARP蛋白的裂解来研究细胞凋亡。
使用免疫印迹法来表征通过单独或组合的两种化合物的对于核糖体S6蛋白磷酸化的抑制作用，其可通过检测Ser240/244位点磷酸化的核糖体蛋白S6(pS6)的表达来研究S6磷酸化。
实施例1：化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系WM-266-4 中的体外抗增殖活性
为评估PI3Kβ选择性抑制剂化合物(I)与BRAF抑制剂化合物(II)的组合的抗增殖活性，使用人类黑素瘤细胞系WM-266-4(BRAF突变和PTEN缺失)进行实验。在体外组合研究之前，使用WM-266-4细胞系研究单个药物的活性。测试单个药物的目的在于测定其作用的独立性和测定固定比率药物组合分析(FixedRatioDrugCombinationassay)的稀释设计。使用射线设计方法及相关统计分析来研究化合物(I)和化合物(II)之间相互作用的特性，其评估不同药物功效比率下的组合益处。
材料和方法
人类黑素瘤WM-266-4细胞系购自ATCC(参考号CRL-1676批次3272826)。在补充有10％FBS和2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中培养WM-266-4细胞。
以30mM的浓度将化合物(I)和化合物(II)溶于DMSO中。遵循3或3.3倍稀释步骤将其在DMSO中连续稀释以获得10mM至0.03μM溶液：然后在含有10％血清的培养基中稀释各溶液50倍，然后以20倍稀释因子添加于细胞上。通过射线设计来定义所测试的最终浓度，其可表征混合物中若干固定比例的两种化合物的相互作用。用于此实验的射线设计包括1条针对各单一药物的射线以及4条组合射线。所有射线具有10个浓度(参见表1)。对照和所有处理孔中的DMSO浓度为0.1％。
表1:实施例1的射线设计
表1提供了用于进行实施例1研究的射线设计。浓度以nM单位给出。
射线1:单独的化合物(I)
(I) 30000 10000 3000 1000 300 100 30 10 3 1
(II) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
射线2
(I) 30000 10000 3000 1000 300 100 30 10 3 1
(II) 3000 1000 300 100 30 10 3 1 0.0 0.1
射线3
(I) 30000 10000 3000 1000 300 100 30 10 3 1
(II) 1000 300 100 30 10 3 1 0.3 0.1 0.03
射线4
(I) 30000 10000 3000 1000 300 100 30 10 3 1
(II) 300 100 30 10 3 1 0.3 0.1 0.03 0.01
射线4二
(I) 30000 10000 3000 1000 300 100 30 10 3 1
(II) 100 30 10 3 1 0.3 0.1 0.03 0.01 0.003
射线5:单独的化合物(II)
(I) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(II) 10000 3000 1000 300 100 30 10 3 1 0.3
将WM-266-4细胞以2500个细胞/孔接种于适当培养基中的96孔板中并在37℃、5％CO2下孵育6小时。以网格方式使用浓度递增的化合物(I)(介于1nM至30,000nM之间)和浓度递增的化合物(II)(介于0.001nM至10,000nM之间)(取决于给定药物比率)来处理细胞，并孵育96小时。通过以下方法评估细胞生长：根据制造商的规程，使用试剂(Promega)测量细胞内ATP。简而言之，向每一板中添加孵育1小时，然后在MicroB发光板读取器上读取发光信号。在细胞系上进行三次实验。对于各次实验，可重复运行使用两个96孔板。
在使用一种化合物或化合物组合处理4天并将信号与使用媒介物(DMSO)处理的细胞进行比较之后估计细胞生长的抑制。
根据下列等式计算生长抑制百分比(GI％)：
GI％＝100*(1-((X-BG)/(TC-BG))
其中各值定义如下：
X＝单独的化合物(I)或(II)或其组合存在下的含有细胞的孔的值
BG＝具有培养基且不具有细胞的孔的值
TC＝媒介物(DMSO)存在下的含有细胞的孔的值。
由所述生长抑制百分比，绝对IC40定义为GI％等于40％下的化合物浓度。
此测量使得可使用下述统计学方法来确定潜在协同组合。
首先将相对功效ρ估算为其中IC40(1)是化合物(I)的IC40而IC40(2)是化合物(II)的IC40。
然后将射线i的此有效分数计算为其中是混合物中化合物(I)和(II)浓度的恒定比率。
应用使用SASV9.2软件的NLMIXED程序的整体非线性模型来同时拟合各射线的浓度-响应曲线。所用模型是对应于以下等式的4参数逻辑模型：
Y i k j = Emin i + ( Emax i - Emin i ) 1 + exp [ - m i log ( Conc i j I C 50 i ) ] + ϵ i j k
Yijk是第i条射线中第j个浓度的第k次重复的抑制百分比
Concij是第i条射线中第j个混合物浓度(化合物(I)和化合物(II)浓度的总和)
Emini是获得自第i条射线的最小效应
Emaxi是获得自第i条射线的最大效应
IC50i是获得自第i条射线的IC50
mi是采用来自第i条射线的数据调整的曲线斜率
εijk是第i条射线中第j个浓度的第k次重复的残余，εijk～N(0，σ2)
只要可能且不降低拟合质量，则共享Emin、Emax和/或斜率。
然后基于Loewe加和模型使用以下等式估算各射线的组合指数Ki及其95％置信区间：
C ( 1 ) I C 40 ( 1 ) + C ( 2 ) I C 40 ( 2 ) = K i
其中IC40(1)和IC40(2)是获得每一单独化合物的40％抑制所需的化合物(I)和化合物(II)的浓度，且C(1)和C(2)是获得40％抑制所需的混合物中的化合物(I)和化合物(II)的浓度。
当组合指数(Ki)的置信区间包括1时，则推断出具有加和作用，当Ki的置信区间上限小于1时，推断出具有显著协同，且当Ki的置信区间下限高于1时，推断出具有显著拮抗。
等效线图示使得可根据由连接点(0,1)至点(1,0)的直线所代表的加和作用情形看到每一射线的位置。位于此线下方的所有射线对应于潜在协同情形，而位于此线上方的所有射线对应于潜在拮抗情形。
体外研究的结果
化合物(I)(作为单一药物)以6,688nM的IC40抑制WM-266-4细胞的增殖。化合物(II)(作为单一药物)以35nM的IC40抑制WM-266-4细胞的增殖(参见下表2)。
表2:实施例1中各单独化合物的绝对IC40估算值
使用4参数逻辑模型估算单一药物的绝对IC40
绝对IC40(nM)
化合物(I) 6,687[1,809；11,566]
化合物(II) 34.9[28.6；41.3]
从等效线图示(图1)和表3，对于混合物中化合物(I)介于0.05和0.62之间的有效分数f而言观测到了显著协同，Ki范围为0.28至0.55，所述有效分数f对应于混合物中存在的化合物(I)等于或少于化合物(II)的情形。
表3:实施例1中的相互作用表征
相互作用指数(Ki)使得我们可定义在两种化合物之间所观察到的相互作用。
f值 Ki(95％置信区间) 相互作用表征
射线2 0.05 0.5545[0.4155；0.6936] 协同
射线3 0.14 0.2795[0.1923；0.3668] 协同
射线4 0.34 0.3279[0.2033；0.4526] 协同
射线4二 0.62 0.3562[0.1693；0.5431] 协同
这些数据对应于3个独立实验中的代表性研究。对于这三个实验而言，在有效分数f介于0.04和0.62之间时观察到协同作用或具有协同作用趋势的加和作用。
实施例2:化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系WM-266-4 中的体外促凋亡活性
为评估PI3Kβ选择性抑制剂化合物(I)与BRAF抑制剂化合物(II)的组合的促凋亡活性，使用人类黑素瘤细胞系WM-266-4(BRAF突变和PTEN缺失)进行实验。使用测量经裂解PARP表达的免疫印迹法研究化合物(I)和化合物(II)之间相互作用的特性，其可通过检测PARP蛋白的裂解来研究凋亡。
材料和方法
人类黑素瘤WM-266-4细胞系购自ATCC(参考号CRL-1676批次3272826)。在补充有10％FBS和2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中培养WM-266-4细胞。
以10mM的浓度将化合物(I)和化合物(II)溶于DMSO中。遵循10倍步骤稀释将其在DMSO中稀释以获得1mM溶液：然后在含有10％血清的培养基中50倍稀释10mM和1mM的各溶液，然后以20倍稀释因子添加于细胞上以达到10,000nM和1,000nM的最终浓度。对照和所有处理孔中的最终DMSO浓度为0.1％。
以1000000个细胞/孔将WM-266-4细胞接种于完全培养基中的6-孔微孔板中并在37℃、5％CO2下孵育过夜。然后，在37℃以及5％CO2存在下，在存在或不存在化合物(I)以及存在或不存在化合物(II)的情况下培养细胞24小时。
在细胞处理期的末期，裂解贴壁细胞以及细胞培养上清液中的细胞以用于制备蛋白。在含有Hepes50mM、NaCl150mM、甘油10％、Triton1％，pH＝7.5的裂解缓冲液中裂解细胞，临时加入100倍稀释的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物。根据制造商说明使用microBCA技术测定各样本中的蛋白浓度。在各胶孔中装载20μg蛋白并根据操作程序进行免疫印迹。使用经裂解PARP(asp214)兔多克隆抗体，然后是抗-兔IgGHRP共轭抗体显示PARP裂解。在对照中使用抗-GAPDH兔单克隆抗体14C10，然后是抗-兔IgGHRP共轭抗体显示GAPDH。根据操作程序指令进行免疫印迹显示后，使用FujiFilm(射线检验)装置读取发光。
此仪器测量在Fujifilm机器上获得的针对各选定条带的总发光信号(AU)。然后，其减去与所选条带或区域大小相称的背景值(BG)。该背景由在免疫印迹特异背景上取得的条带计算，以获得各条带的特异信号或(AU-BG)。使用下式进行针对采用化合物或化合物组合的各处理的倍数诱导(foldinduction)的计算：倍数诱导＝((AU-BG)t/(AU-BG)st)*100
其中各值定义如下：
(AU-BG)t＝含有采用单独的化合物(I)或(II)或其组合处理的细胞的孔的值
(AU-BG)st＝含有采用溶剂(DMSO)处理的细胞的孔的值。
体外研究的结果
相比于未处理细胞，作为单一药物的化合物(I)或化合物(II)在10,000nM浓度未诱导任何显著的WM-266-4细胞凋亡，其中PARP裂解的倍数诱导分别为0.71和1.38。在采用10,000nM化合物(I)和10,000nM化合物(II)处理细胞的组合组(combinationarm)中，相比于未处理细胞，组合处理以3.26的PARP裂解倍数诱导来诱导WM-266-4细胞凋亡。在采用10,000nM化合物(I)和1,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，相比于未处理细胞，组合处理以4.31的倍数诱导来诱导细胞凋亡。泰素帝(Taxotere)显示为凋亡诱导的阳性对照，其PARP裂解倍数诱导为2.88(参见表4)。
这些数据对应于2个独立实验中的代表性研究。
控制GAPDH表达在免疫印迹的下游板中作为加载对照。
表4:实施例2中各单独或组合化合物的WM-266-4细胞凋亡诱导
实施例3:化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系A2058中 的体外抗增殖活性
为评估PI3Kβ选择性抑制剂化合物(I)与BRAF抑制剂化合物(II)的组合的抗增殖活性，使用人类黑素瘤细胞系A2058(BRAF突变，PTEN-缺失且对所述BRAF抑制剂不敏感)进行实验。使用射线设计方法及相关统计分析来研究化合物(I)和化合物(II)之间相互作用的特性，其评估不同药物功效比率下的组合益处。
材料和方法
人类黑色素瘤A2058细胞系购自ATCC(参考号CRL-11147批次5074651)。在补充有10％FBS和2mML-谷氨酰胺的DMEM高葡萄糖培养基中培养A2058细胞。
根据实施例1中的材料和方法制备化合物(I)和(II)稀释液。通过下述射线设计方法来定义所测试的最终浓度。对照和所有处理孔中的DMSO浓度为0.1％。
使用射线设计可表征混合物中若干固定比例的两种化合物的相互作用。所述射线设计包括针对各单一药物的1条射线以及19条组合射线。单独化合物(I)的射线具有14个浓度，单独化合物(II)的射线具有18个浓度，且组合射线具有介于7-14个之间的浓度。
将A2058细胞以4,000个细胞/孔接种于适当培养基中的384孔板中并在37℃、5％CO2下孵育6小时。以网格方式使用浓度递增的化合物(I)(0.01至30,000nM范围)和浓度递增的化合物(II)(0.0001至30,000nM范围)来处理细胞，并孵育96小时。通过以下方法评估细胞生长：根据制造商的规程，使用试剂(Promega)测量细胞内ATP。简而言之，向每一板中添加孵育1小时，然后在MicroB发光板读取器上读取发光信号。
在此细胞系上进行四次实验。对于各次实验，针对组合射线可重复运行使用两个384孔板，针对单一药物射线可运行四次。
在使用单一化合物或化合物组合处理4天并将信号与使用媒介物(DMSO)处理的细胞进行比较之后，按照实施例1中所述等式评估细胞生长的抑制。
这些测量使得可使用实施例1中所述统计学方法来确定潜在协同组合。
体外研究的结果
化合物(I)(作为单一药物)以11,500nM的IC40抑制A2058细胞的增殖。化合物(II)(作为单一药物)以1,890nM的IC40抑制A2058细胞的增殖(参见下表5)。
表5:实施例3中各单独化合物的绝对IC40评估值
使用4参数逻辑模型评估单一药物的绝对IC40
绝对IC40(nM)
化合物(I) 11,500[7,720；17,300]
化合物(II) 1,890[1,520；2,350]
从等效线图示(图2)和表6，对于混合物中化合物(I)介于0.05和0.94之间的所有有效分数f而言观测到了显著协同，Ki范围为0.23至0.55。
表6:实施例3中的相互作用表征
相互作用指数(Ki)使得我们可定义在两种化合物之间所观察到的相互作用。
f值 Ki(95％置信区间) 相互作用表征
射线7 0.05 0.3549[0.2456；0.5128] 协同
射线8 0.14 0.2795[0.1958；0.3991] 协同
射线9 0.33 0.2351[0.164；0.3371] 协同
射线10 0.62 0.2257[0.1497；0.3404] 协同
射线11 0.83 0.268[0.1668；0.4306] 协同
射线12 0.94 0.5474[0.3245；0.9232] 协同
这些数据对应于4个独立实验中的代表性研究。
对于这四个实验而言，针对混合物中化合物(I)介于0.05和0.94之间的所有有效分数f观察到显著协同作用或具有协同作用趋势的加和作用。
实施例4:化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系A2058中 的体外促凋亡活性
为评估PI3Kβ选择性抑制剂化合物(I)与RAF抑制剂化合物(II)的组合的促凋亡活性，使用人类黑素瘤细胞系A2058(BRAF突变、PTEN缺失且对所述BRAF抑制剂不敏感)进行实验。使用免疫印迹法来研究化合物(I)和化合物(II)之间相互作用的特性，其可通过检测PARP蛋白的裂解来研究凋亡。
材料和方法
人类黑素瘤A2058细胞系购自ATCC(参考号CRL-11147批次5074651)。在补充有10％FBS和2mML-谷氨酰胺的DMEM高葡萄糖培养基中培养A2058细胞。
根据实施例1中材料和方法制备化合物(I)和化合物(II)。
根据实施例2中所述材料和方法进行细胞处理、免疫印迹实验和凋亡倍数诱导计算。
体外研究的结果
相比于未处理细胞，作为单一药物的化合物(I)或化合物(II)在10,000nM浓度未诱导显著的A2058细胞凋亡，其中PARP裂解的倍数诱导分别为1.17和1.00。在采用10,000nM化合物(I)和10,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理以1.44的PARP裂解倍数诱导来诱导A2058细胞凋亡。在采用10,000nM化合物(I)和1,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理以1.61的倍数诱导来诱导A2058细胞凋亡。泰素帝显示为凋亡诱导的阳性对照，其PARP裂解倍数诱导为1.66(参见表7)。
这些数据对应于2个独立实验中的代表性研究。
控制GAPDH表达在免疫印迹的下游板中作为加载对照。
表7:实施例4中各单独或组合化合物的A2058细胞凋亡诱导
实施例5:化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系WM-266-4 中以浓度依赖性方式的体外促凋亡活性
为评估PI3Kβ选择性抑制剂化合物(I)与RAF抑制剂化合物(II)的组合的促凋亡活性，使用人类黑素瘤细胞系WM-266-4(BRAF突变、PTEN-缺失、对BRAF抑制剂敏感)进行实验。使用免疫印迹法来研究化合物(I)和化合物(II)之间相互作用的特性，其可通过检测PARP蛋白的裂解来研究凋亡。
材料和方法
人类黑素瘤WM-266-4细胞系购自ATCC(参考号CRL-1676批次3272826)。在补充有10％FBS和2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中培养WM-266-4细胞。
以10mM的浓度将化合物(I)和化合物(II)溶于DMSO中。遵循两个10倍步骤稀释将其在DMSO中稀释以获得1mM溶液和0.1mM溶液。然后在含有10％血清的培养基中50倍稀释10mM、1mM或0.1mM的各溶液，之后以20倍稀释因子添加于细胞上以达到10,000nM、1,000nM和100nM的最终浓度。对照和所有处理孔中的最终DMSO浓度为0.1％。
根据实施例2中所述材料和方法进行细胞处理、免疫印迹实验和凋亡倍数诱导计算。
体外研究的结果
相比于未处理细胞，作为单一药物的化合物(I)或化合物(II)以浓度依赖性方式诱导WM-266-4细胞凋亡，其中在10,000、1,000和100nM浓度的PARP裂解的倍数诱导分别为6.86、1.96、0.94(化合物I)和3.42、2.59、1.62(化合物II)。
在采用增加浓度的化合物(I)和10,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000nM、1,000nM和100nM化合物(I)浓度分别以31.06、11.69和4.69的PARP裂解倍数诱导来诱导WM-266-4细胞凋亡。
在采用增加浓度的化合物(I)和1,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000nM、1,000nM和100nM化合物(I)浓度分别以44.37、12.56和3.76的PARP裂解倍数诱导来诱导WM-266-4细胞凋亡。
在采用增加浓度的化合物(I)和100nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000nM、1,000nM和100nM化合物(I)浓度分别以19.68、3.84和1.65的PARP裂解倍数诱导来诱导WM-266-4细胞凋亡。
总而言之，这些数据显示对于所有经评估分数的化合物(I)和(II)而言，组合处理相比于单一药物观测到了更好的凋亡诱导。
泰素帝显示为凋亡诱导的阳性对照，其PARP裂解倍数诱导为1.56(参见表8)。
这些数据对应于2个独立实验中的代表性研究。
控制GAPDH表达在免疫印迹的下游板中作为加载对照。
表8:实施例5中各单独或组合化合物的WM-266-4细胞凋亡诱导
实施例6:化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系A2058中 以浓度依赖性方式的体外促凋亡活性
为评估PI3Kβ选择性抑制剂化合物(I)与RAF抑制剂化合物(II)的组合的促凋亡活性，使用人类黑素瘤细胞系A2058(BRAF突变、PTEN-缺失、对BRAF抑制剂不敏感)进行实验。使用免疫印迹法来研究化合物(I)和化合物(II)之间相互作用的特性，其可通过检测PARP蛋白的裂解来研究凋亡。
材料和方法
人类黑素瘤A2058细胞系购自ATCC(参考号CRL-11147批次5074651)。在补充有10％FBS和2mML-谷氨酰胺的DMEM高葡萄糖培养基中培养A2058细胞。
根据实施例5的材料和方法制备化合物(I)和化合物(II)。
根据实施例2中所述材料和方法进行细胞处理、免疫印迹实验和凋亡倍数诱导计算。
体外研究的结果
相比于未处理细胞，作为单一药物的化合物(I)或化合物(II)以浓度依赖性方式诱导A2058细胞凋亡，在10,000、1,000和100nM浓度的PARP裂解的倍数诱导分别为2.43、1.26、1.12(化合物I)和2.44、2.13、1.14(化合物II)。
在采用增加浓度的化合物(I)和10,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000nM、1,000nM和100nM化合物(I)浓度分别以4.42、4.05和2.97的PARP裂解倍数诱导来诱导A2058细胞凋亡。
在采用增加浓度的化合物(I)和1,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000nM、1,000nM和100nM化合物(I)浓度分别以6.73、4.41和2.86的PARP裂解倍数诱导来诱导A2058细胞凋亡。
在采用增加浓度的化合物(I)和100nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000nM、1,000nM和100nM化合物(I)浓度分别以3.83、2.04和1.28的PARP裂解倍数诱导来诱导A2058细胞凋亡。
总而言之，这些数据显示对于所有经评估分数的化合物(I)和(II)而言，组合处理相比于单一药物观测到了更好的凋亡诱导。
泰素帝显示为凋亡诱导的阳性对照，其PARP裂解倍数诱导为6.79(参见表9)。
这些数据对应于2个独立实验中的代表性研究。
控制GAPDH表达在免疫印迹的下游板中作为加载对照。
表9:实施例6中各单独或组合化合物的A2058细胞凋亡诱导
实施例7:化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系WM-266-4 中的体外S6磷酸化抑制
为评估PI3Kβ选择性抑制剂化合物(I)与BRAF抑制剂化合物(II)的组合的S6磷酸化抑制，使用人类黑素瘤细胞系WM-266-4(BRAF突变且PTEN-缺失)进行实验。使用测量pS6表达的免疫印迹法来研究化合物(I)和化合物(II)之间相互作用的特性。
材料和方法
人类黑素瘤WM-266-4细胞系购自ATCC(参考号CRL-1676批次3272826)。在补充有10％FBS和2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中培养WM-266-4细胞。
根据实施例5的材料和方法制备化合物(I)和化合物(II)。
以1000000个细胞/孔将WM-266-4细胞接种于完全培养基中的6-孔微孔板中并在37℃、5％CO2下培养过夜。然后，在37℃以及5％CO2存在下，在存在或不存在化合物(I)以及存在或不存在化合物(II)的情况下培养细胞24小时。
在细胞处理期的末期，裂解贴壁细胞以及细胞培养上清液中的细胞以用于制备蛋白。在含有Hepes50mM、NaCl150mM、甘油10％、Triton1％，pH＝7.5的裂解缓冲液中裂解细胞，临时加入100倍稀释的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物。根据制造商说明使用microBCA技术测定各样本中的蛋白浓度。在各胶孔中装载20μg蛋白并根据操作程序进行免疫印迹。使用检测磷酸化S6核糖体蛋白(Ser240/244)的pS6兔多克隆抗体，然后是抗-兔IgGHRP共轭抗体显示pS6。在对照中使用抗-GAPDH兔单克隆抗体14C10，然后是抗-兔IgGHRP共轭抗体显示GAPDH。根据操作程序指令进行免疫印迹显示后，使用FujiFilm(射线检验)装置读取发光。
此仪器测量在Fujifilm机器上获得的针对各选定条带的总发光信号(AU)。然后，其减去与所选条带或区域大小相称的背景值(BG)。该背景由在免疫印迹特异背景上取得的条带计算，以获得各条带的特异信号或(AU-BG)。使用下式进行针对采用化合物或化合物组合的各处理的抑制百分数的计算：抑制％＝1-(((AU-BG)t/(AU-BG)st))*100
其中各值定义如下：
(AU-BG)t＝含有采用单独的化合物(I)或(II)或其组合处理的细胞的孔的值
(AU-BG)st＝含有采用溶剂(DMSO)处理的细胞的孔的值。
体外研究的结果
相比于未处理细胞，作为单一药物的化合物(I)或化合物(II)以浓度依赖性方式显著抑制WM-266-4中S6磷酸化，在10,000、1,000和100nM浓度的抑制百分数分别为94、90和69(化合物I)或94、92和76(化合物II)。
在采用增加浓度的化合物(I)和10,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000、1,000和100nM化合物(I)浓度分别以97、97和96的抑制百分数显著抑制WM-266-4中S6磷酸化。
在采用增加浓度的化合物(I)和1,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000、1,000和100nM化合物(I)浓度分别以96、96和95的抑制百分数显著抑制WM-266-4中S6磷酸化。
在采用增加浓度的化合物(I)和100nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000、1,000和100nM化合物(I)浓度分别以97、94和88的抑制百分数显著抑制WM-266-4中S6磷酸化(参加表10)。
总而言之，这些数据显示相比于单一药物，组合处理即便在最低浓度也可持续抑制(>88％抑制)pS6。
这些数据对应于2个独立实验中的代表性研究。
控制GAPDH表达在免疫印迹的下游板中作为加载对照。
表10:实施例7中各单独或组合化合物的WM-266-4细胞中S6磷酸化抑制
实施例8:化合物(I)与化合物(II)的组合在人类黑素瘤细胞系A2058中 的体外S6磷酸化抑制
为评估PI3Kβ选择性抑制剂化合物(I)与BRAF抑制剂化合物(II)的组合的S6磷酸化抑制，使用人类黑素瘤细胞系A2058(BRAF突变且PTEN-缺失)进行实验。使用测量pS6表达的免疫印迹法来研究化合物(I)和化合物(II)之间相互作用的特性。
材料和方法
人类黑素瘤A2058细胞系购自ATCC(参考号CRL-11147批次5074651)。在补充有10％FBS和2mML-谷氨酰胺的DMEM高葡萄糖培养基中培养A2058细胞。
根据实施例5的材料和方法制备化合物(I)和化合物(II)。
根据实施例7中所述材料和方法进行细胞处理、免疫印迹实验和pS6抑制百分数计算。
体外研究的结果
相比于未处理细胞，作为单一药物的化合物(I)或化合物(II)以浓度依赖性方式显著抑制A2058中S6磷酸化，在10,000、1,000和100nM浓度的抑制百分数分别为73、42和8(化合物I)或62、40和27(化合物II)。
在采用增加浓度的化合物(I)和10,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000、1,000和100nM化合物(I)浓度分别以87、60和63的抑制百分数显著抑制A2058中S6磷酸化。
在采用增加浓度的化合物(I)和1,000nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000、1,000和100nM化合物(I)浓度分别以86、65和59的抑制百分数显著抑制A2058中S6磷酸化。
在采用增加浓度的化合物(I)和100nM化合物(II)处理细胞的组合组中，组合处理在10,000、1,000和100nM化合物(I)浓度分别以86、69和34的抑制百分数显著抑制A2058中S6磷酸化(参见表11)。
总而言之，这些数据显示相比于单一药物，组合处理在测试浓度可增加pS6抑制。
这些数据对应于2个独立实验中的代表性研究。
控制GAPDH表达在免疫印迹的下游板中作为加载对照。
表11:实施例8中各单独或组合化合物的A2058细胞中S6磷酸化抑制
体外结果汇总(实施例1至8)
通过以上数据证实了选择性PI3Kβ抑制剂(化合物I)可与BRAF抑制剂如威罗菲尼(化合物II)协同以增加黑素瘤细胞中的细胞增殖抑制活性以及细胞死亡诱导，所述黑素瘤细胞响应(本申请WM-266-4细胞系)或不敏感(本申请A2058细胞系)于BRAF抑制剂(本申请威罗菲尼)并展现PI3K通路活化(通过PTEN缺失)和MAPK通路活化(特别通过BRAF活化突变)。
图1和2:实施例1和3的等效线图示：化合物(I)与化合物(II)的组合 在人类黑素瘤细胞系WM-266.4和A2058中的体外抗增殖活性
等效线图示允许根据由连接点(0,1)至点(1,0)的直线所代表的加和作用情形观察到每一射线的位置。位于此线下方的所有射线对应于潜在协同情形，而位于此线上方的所有射线对应于潜在拮抗情形。
对于实施例1试验，根据等效线图示，有效分数f介于0.05和0.62之间的射线在加和线以下，所有射线具有显著协同(参见图1)。对于实施例3试验，根据等效线图示，有效分数f介于0.05和0.94之间的射线在加和线以下，所有射线具有显著协同(参见图2)。

Claims (13)

1.一种PI3Kβ抑制剂与RAF抑制剂的组合，其用于治疗具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者。
2.根据权利要求1的用于其用途的所述组合，其中所述抵抗至少一种RAF抑制剂是抵抗所述组合的所述RAF抑制剂。
3.根据权利要求1或2任一项的用于其用途的所述组合，其中所述患者患有黑素瘤。
4.根据权利要求1至3任一项的用于其用途的所述组合，其中所述黑素瘤细胞呈现活化BRAF突变，例如BRAF-V600E突变或BRAF-V600K突变。
5.根据权利要求1至4任一项的用于其用途的所述组合，其中所述黑素瘤细胞是PTEN缺失的。
6.根据权利要求1至5任一项的用于其用途的所述组合，其中所述PI3Kβ抑制剂为式(I)：
或一种其药用盐。
7.根据权利要求1至6任一项的用于其用途的所述组合，其中所述RAF抑制剂为式(II)：
或一种其药用盐。
8.根据权利要求1至7任一项的用于其用途的所述组合，其中所述组合可抑制肿瘤细胞生长。
9.根据权利要求1至8任一项的用于其用途的所述组合，其中所述PI3Kβ抑制剂和RAF抑制剂的给药是同时、分开或相继给药。
10.根据权利要求9的用于其用途的所述组合，其中所述给药是分开或相继的，且其中所述PI3Kβ抑制剂的给药后跟随所述RAF抑制剂的给药。
11.根据权利要求9的用于其用途的所述组合，其中所述给药是分开或相继的，且其中所述RAF抑制剂的给药后跟随所述PI3Kβ抑制剂的给药。
12.磷酸化核糖体蛋白S6(pS6)作为如权利要求1至11任一项中所定义组合对抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的功效的生物标记的用途。
13.一种监测具有抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞的患者对于如权利要求1至11任一项中所定义组合的响应的体外方法，所述方法包括：
i)在第一时间点测定所述患者的抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞中pS6蛋白的量，
ii)在之后时间点测定所述患者的抵抗至少一种RAF抑制剂的癌细胞中pS6蛋白的量，
iii)比较步骤i)的pS6蛋白的量与步骤ii)中pS6蛋白的量，以及
iv)若步骤i)的pS6蛋白的量等于或高于步骤ii)中pS6蛋白的量，则确定所述患者响应所述组合。
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