CN103333955B

CN103333955B - 一种非诊断目的的rna的一步裂解一管法rt-pcr检测方法

Info

Publication number: CN103333955B
Application number: CN201310205275.4A
Authority: CN
Inventors: 陈燃; 金晓铮
Original assignee: ZHEJIANG JFK BIOLOGICAL TECHNOLOGY Inc
Current assignee: ZHEJIANG JFK BIOLOGICAL TECHNOLOGY Inc
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN103333955A

Abstract

本发明提供了一种RNA的一步裂解一管RT-PCR（one-Step-lysis and One-tube RT-PCR，SORT-PCR）检测方法。本发明方法与采用传统的RT-PCR方法相比，不需要纯化抽提RNA，在细胞裂解后把RNA杂交结合到固定的特异引物或Oligo(dT)引物上，洗涤去除细胞裂解液上清的其他成分，然后加入逆转录（RT）反应体系进行RT反应，再次吸干后，加入PCR反应体系，进行PCR反应，结果检测可采用荧光实时定量分析。本发明将原本长达3个小时以上的RNA检测过程缩短为约2个小时，操作简便易行，具有较高的检测的灵敏度和特异性，适合对各种来源的样品裂解得到RNA进行检测。

Description

一种非诊断目的的RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法

（一）技术领域

本发明涉及一种RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法。

（二）背景技术

RNA是遗传信息传递的载体。RT-PCR（reverse transcription–polymerase chainreaction），指将RT（Reverse Transcription，逆转录）和PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）反应组合在一起的方法.RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成，即RT，同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RNA的RT-PCR检测或定量分析，比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作，已发展成为进行基因表达水平的检测分析，病原体的检测分析等方面的有力手段。

RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+RNA。RT需要用RT酶（如MMLV,AMV等），可以用随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT和PCR可以在两个反应管中分步先后进行（两管法），也可以在一个反应管中先后进行（一管法）。两管法比较常见，在两管法RT-PCR中，每一步都可以尽量在最佳条件下进行，但由于RT体系中含有PCR抑制物，所以一般只能取出约5%的RT产物进行PCR，这限制了最终检测的灵敏度。在使用一个样品检测多个目标RNA时，二管法比较很有用——因为一个RT产物可以分别用于很多个PCR反应。一管法指的是RT和PCR在一只管中进行，必须尽可能地提供同时为RT和PCR优化的条件。一管法在处理大量样品时易于操作，并有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一管法优化成功的话，可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增--理论上灵敏度可以比两管法提高20倍。然而，由于RT反应和PCR反应的最优反应条件是不一致的，现在市场上的一管法RT-PCR的条件优化较难掌控，经常会产生严重的非特异扩增，而且成本/售价上比传统的二管法有较大提升。

虽然RT-PCR在科研领域的推广普及程度很高，但在临床检测应用方面，仍存在很大的改进空间；主要问题包括:RNA提取和纯化的步骤繁琐，一般需要额外的DNase酶消化去除痕量的基因组DNA的步骤；2种酶促反应（RT和PCR）具有不同的最优反应条件，容易受到各种抑制物质的影响，也容易受到非特异扩增和假阳性等困扰；因此，总体上操作的复杂度和难度较高，不利于临床检测推广应用。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种操作简单、特异性强、效率和成功率高的用于RNA检测的一步裂解一管RT-PCR方法。

本发明采用的技术方案是：

一种RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法，所述方法包括：

（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25～40mer的单链寡核苷酸DNA，记为引物A；该引物的GC含量为40～60%，解链温度为70～85℃；或者，若目标RNA为带poly(A)末端的mRNA，则引物A选用长度为29～50mer的Oligo(dT)；将引物A固定在PCR管内，得到固定PCR管；引物A的固定可以采用本领域常规方法进行，用于固定引物A的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质；

（2）取待测样本，加入添加有表面活性剂和RNA酶抑制剂的裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；所述裂解液为本领域常规添加有表面活性剂（如：脱氧胆酸钠、Triton X-100、NP-40等）和RNA酶抑制剂、用于细胞或组织裂解的缓冲液；待测样本可来自组织或细胞，或者临床标本如痰液、血液等；

待测样本来自痰液时，裂解上清液获得方法如下：1～5ml痰液+5～10ml痰融解液，37℃振荡10min，4℃、5000rpm离心10min，弃上清，取沉淀+200ul裂解液，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；痰溶解液组成:PBS+0.1%（w/vol）DTT。

待测样本来自细胞时，裂解上清液获得方法如下：24孔板细胞培养，吸去培养液，加入200ul裂解液，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；

待测样本来自组织时，裂解上清液获得方法如下：取约0.1cm³大小的组织块放入1.5ml离心管中，+200ul裂解液，用吸头捣碎组织，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；

（3）取裂解上清液20uL至固定PCR管中，50～60℃保温10～30min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤1次，吸干，加入20uL由RT酶、dNTP和RT缓冲液配制的RT反应液，42℃保温0.5～1小时；所述缓冲液为RT反应常规缓冲液；所述洗涤液可为本领域常规含有表面活性剂（如Triton X-100、Tween20、NP-40等）的缓冲液。在杂交反应之后，通过洗涤，在洗去未杂交结合的核酸的同时，也洗去了其他可能干扰RT反应的物质，从而保证了RT反应的效率和成功率；

（4）吸干管内液体，加入20uL由耐热DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析或琼脂糖凝胶电泳分析；所述缓冲液为PCR反应常规缓冲液，如果是进行荧光定量分析，则反应液中需加入特异荧光探针或SYBR green I荧光染料。在RT反应之后，吸干RT反应液，去除了可能干扰PCR反应的物质，从而保证了PCR反应的效率和成功率；

（5）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（1）～（4）的方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。

本发明方法原理如下：（1）因为引物A是被固定在PCR管壁，磁珠或其他可吸附结合核酸的固体介质上的，因此引物A结合目标RNA，可以把目标RNA选择性地固定在固体介质上；一般情况下，引物A可以是与目标RNA特异互补结合的特异引物A；若目标RNA是真核生物mRNA，则也可以采用固定的Oligo(dT)作为引物A，来结合固定所有的Poly(A)+mRNA；（2）然后经过洗涤，只有能与引物A互补杂交结合的目标RNA分子留在反应管中，若是使用Oligo(dT)作为引物A，则所有的Poly(A)+mRNA分子被留在反应管中，其他RNA、基因组DNA和蛋白质等可能的特异RT反应的干扰物质都会被去除掉；（3）加入RT反应液后，引物A引导RT反应；由于可能的干扰物质已经在上一步的洗涤过程中被去除掉了，因此，RT反应的效率和成功率得到了保证；（4）RT反应完成后，吸去RT反应液，再加入PCR反应液，进行PCR反应；由于可能由RT反应体系带来的干扰物质会随着RT反应液的吸去被去除掉了，只有cDNA还保留在管中，这样，用作PCR模板的cDNA量相当于传统的一管法，而PCR反应体系优化还是专门为PCR优化的，不需要兼顾RT反应，这又相当于传统的二管法，因此，PCR反应的效率和成功率得到了最佳保证。

优选的，所述裂解液组成如下：4.0mol/L异硫氰酸胍，350mmol/L NaCl，1%(vol/vol)Triton X-100，10mmol/L2-巯基乙醇，0.1mg/ml(w/vol)鱼精DNA（市购），溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。

优选的，所述RT反应液组成如下：75mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，10mmol/LDTT，0.5mmol/L dNTP,5U/20ul MMLV RT酶，溶剂为50mM、pH8.3的Tris-HCl。

优选的，所述PCR反应液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/LdNTP，0.05%（vol/vol）Tween20，0.4×SYBR Green I（浓度0.4×的含义是，其中各组分在反应液中的终浓度为1×SYBR Green I中的0.4倍，市购生产商Microprobe的SYBR Green I原液为10000×，使用时按体积比稀释至PCR缓冲液中终浓度为0.4×即可），0.5U/20ul Taq酶，0.2umol/L PCR引物，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。

优选的，所述洗涤液为TBST缓冲液，其终浓度组成如下：150mmol/L NaCl，0.05%Tween20，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。

优选的，所述方法用于人/鼠等真核生物基因mRNA检测时，所述的Oligo(dT)引物A为Oligo(dT)₂₉，序列为：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTT-3’。

所述方法用于检测人端粒酶催化亚基（hTERT）时，所述PCR引物序列为：

5’-AAGTCCTACGTCCAGTGCCAGGGGA-3’和5’-GCTTGTT CTCCATGTCGCCGTAGC-3’，所述的特异引物A序列为：5’-GGCCTCAG CCGGACACTCAG CCTTCAGCCG-3’。TaqMan探针序列为：5’FAM-CAGCGTGGAGAGGATGGAGCCCTG-BHQ1-3’。

所述方法用于检测人GUSB基因mRNA时，所述PCR引物序列为：5’-CGATTGCAGGGT TT CACCAGGATC-3’和5’-GCTCTCCAACCACGTATTTTCTGCG-3’。

所述方法用于检测人Bcl-2基因mRNA时，所述PCR引物序列为：5’-ACGCCCCATCCAGCCGCAT-3’和5’-CACAGGTGGCACCGGGCTGA-3’。

所述方法用于检测人PAR-2基因mRNA时，所述PCR引物序列为：5’-AGGAGGAT GCGGAGCCCCA-3’和5’-CCAGTGACGTGGGATGTGCCA-3’。

所述方法用于检测人hRPLP0基因mRNA时，所述PCR引物序列为：5’-CACTGTG CCAG CCCAGAACACTG-3’和5’-GTGCCCCTGGAGATTTTAGTGGTGA-3’。

所述方法用于检测人hGAPDH基因mRNA时，所述PCR引物序列为：5’-CGTCAAGGCT G A GAACGGGAAGC-3’和5’-GCTCCTGGAAGATGGTGATGGGA-3’。

所述方法用于检测小鼠beta-actin基因mRNA时，所述PCR引物序列为：5’-AAGAG G AGGATGGTCGCGTCCA-3’和5’-ACAGAA GCAATGCTGTCACCTTCCC-3’。

所述方法用于检测人hTERC基因时，所述的特异引物A序列为：5’-GCATGTGTGA GCCGAGTCCTGGGTGCACGTCC-3’；所述PCR引物序列为：5’-CCGCCTTCCACCGTTCATTCTAG-3’和5’-AACTCTTCGCGGTGGCAGTGG-3’。

所述方法用于检测大肠杆菌中氨苄青霉素抗性基因时，所述特异引物A的序列为:5’-CGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGT-3’，所述PCR引物序列为：5’-CAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCA-3’和5’-TGCGGCATTTTGCCTTCCTG-3’。

本发明采用最新的一步裂解一管RT-PCR（one-Step-lysis and One-tube RT-PCR，SORT-PCR）技术，整个RNA样品的准备处理流程，由传统的包括：裂解、提纯（包含酚：氯仿抽提、乙醇沉淀、再溶解等过程，或过柱、洗涤等过程）、消化去除DNA、再提纯（包含酚：氯仿抽提、乙醇沉淀、再溶解等过程，或过柱、洗涤、洗脱等过程）等多个步骤，被简化成：一步裂解、保温、洗涤、吸干等连续的简单操作，然后加液进行RT反应，完成RT反应后，再次吸干后加液进行PCR反应，这样整个RT-PCR的耗时由常规的3～5个小时，减少到约2个小时，由于不需要纯化RNA，不需要进行额外的以DNase酶消化去除DNA的步骤，不需要对RNA进行特别的保护，因此，操作简单、快速、标准化程度高。同时，洗涤和吸干换液步骤可以有效地去除影响RT反应和PCR反应的干扰物质，确保2种反应都在各自最优条件下进行，从而大大提高了RT-PCR的反应效率和成功率，并减少了非特异反应的发生几率。

（四）附图说明

图1为本发明方法流程示意图；

主要步骤图示，

S0：引物A的固定；

S1：细胞裂解释放出RNA；

S2：引物A结合目标RNA，其他物质被吸除；

S3：合成cDNA；

S4：PCR，cDNA模板区域被扩增。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：洗涤去除细胞裂解液上清中的基因组DNA

用于检测hTERT mRNA的引物A为Oligo(dT)₂₉，PCR引物序列为：

5’-AAGTCCTACGTCCAGTGCCAGGGGA-3’和5’-GCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAGC-3’。

人肺癌细胞株A549细胞于24孔板中进行细胞培养，1000个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，+200ul裂解液，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到细胞裂解上清液；裂解液组成如下：4.0mol/L异硫氰酸胍，350mmol/L NaCl，1%Triton X-100，10mmol/L2-巯基乙醇，0.1mg/ml鱼精DNA（Sigma公司），溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。

取20ul的上述的细胞裂解液上清，加到0.2ml的PCR薄壁管中，50℃保温30min，再吸干管内液体，直接加入20ul PCR反应液（含20ul PCR缓冲液、0.5U Taq酶、0.2mmol/L dNTP、0.2umol/L引物对和0.4×SYBR green I），或以TBST缓冲液和RT缓冲液各洗涤1次之后，再加入20ul PCR反应液（含20ul PCR缓冲液、0.5U Taq酶、0.2mmol/L dNTP、0.2umol/L引物对和0.4×SYBR green I），进行PCR程序（95℃3min预变性，然后40个循环的95℃5s、66℃30s，二步法），以SYBR green I荧光定量分析；同时以空白裂解液进行同样的操作作为空白对照，结果显示在经过TBST缓冲液和RT缓冲液各洗涤1次之后，细胞裂解液上清样品不再有强于空白对照的扩增信号（Ct值与空白相当），表明在经过TBST缓冲液和RT缓冲液各洗涤1次洗涤步骤可以完全洗掉细胞裂解液上清中所含的基因组DNA。

空白对照的Ct值（来源于引物二聚体）在29.77～29.11之间。未经洗涤步骤的细胞样品的Ct值在26.85-27.33之间，说明吸干后，仍有痕量的基因组DNA残留在反应管中；在经过TBST缓冲液和RT缓冲液各洗涤1次之后（洗涤次数1+1，其中RT缓冲液为模拟RT反应的步骤），细胞裂解液上清样品的Ct值（Ct-细胞样品）为29.79～29.34，与空白对照的值相当（荧光信号来源于引物聚合体），不再有特异扩增，说明痕量的基因组DNA已经被洗涤去掉。

TBST缓冲液组成:150mmol/L NaCl，0.05%Tween20，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl；

PCR反应液（SYBR green I荧光定量）组成:50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，0.05%Tween20，0.4×SYBR Green I，0.2mmol/L dNTP，0.5U/20ul Taq酶，0.2umol/L引物对，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。

实施例2：磁珠法固定引物A

引物A为Oligo(dT)₂₉。PCR引物为hTERT特异的引物：

5’-AAGTCCTACGTCCAGTGCCAGGGGA-3’和

5’-GCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAGC-3’。TBST缓冲液20ul，含有10ugM-280链霉亲和素磁珠和2pmol生物素化的引物A（生物素化的引物A由合成时直接修饰加在5’端），装入0.2ml的PCR薄壁管中，室温1hr，以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，加50ul TBST缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共6次，最后吸干；加50ul TE缓冲液，备用。

细胞裂解:24孔板细胞培养，吸去培养液，+200ul裂解液（同实施例1），反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到细胞裂解上清。然后以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，加入20ul细胞裂解上清，50℃保温30min，再以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤1次，加入20ul RT反应液（含20ul RT缓冲液、0.5mmol/LdNTP、5U MMLV RT酶），42℃保温30min，再以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，加入20ul PCR反应液（SYBR green I荧光定量），进行PCR程序（95℃2min预变性，然后40个循环的95℃3s、66℃30s，二步法），SYBR green I荧光定量分析。用这种方法，对100～10000个A549细胞进行检测，可以得到阳性结果（细胞样品的Ct值小于空白裂解液的Ct值，且相减的绝对值≥1）。

TE缓冲液组成:1mmol/L EDTA-Na，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl；

RT反应液的组成：75mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.5mmol/LdNTP,5U/20ul MMLV RT酶，溶剂为50mM、pH8.3的Tris-HCl。

实施例3：直接PCR管内偶联固定引物A

TBST缓冲液50ul，含有5pmol生物素化的Oligo(dT)₂₉（参见实施例2），装入链霉亲和素包被的0.2ml PCR薄壁管中，室温1hr，吸干管内液体，加100ul TBST缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共3次，最后吸干；加100ul TE缓冲液，然后，吸干管内液体，加入50ul细胞裂解液上清（同实施例1），50℃保温30min，吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤1次，加入50ul RT反应液（含50ul RT缓冲液、0.5mmol/LdNTP、10U MMLV RT酶），42℃保温30min，吸干管内液体，加入50ul PCR反应液（SYBR green I荧光定量），进行PCR程序（95℃2min预变性，然后40个循环的95℃3s、66℃30s，二步法），SYBR green I荧光定量分析。用这种方法，对100～10000个A549细胞进行检测，可以得到阳性结果（细胞样品的Ct值小于空白裂解液的Ct值，且差的绝对值≥1）。

实施例4：微球法制作锚定管

1ml的50mmol/L MES pH6.1缓冲液中含有:1%羧基化的橡胶微球（Latex beads，carboxylate-modified polystyrene，Sigma CLB9），0.1mmol/L氨基修饰的Oligo(dT)₂₉和0.15mmol/L新鲜配制的EDAC（偶联剂），室温反应1hr，然后离心3min（15000rpm），用1ml的TBST缓冲液洗涤3次，微球重新悬浮在1ml TE中。取1ul微球，加入50ul细胞裂解液上清（同实施例1），50℃保温30min，再离心3min（15000rpm），用100ul的TBST缓冲液洗涤1次，加入20ul RT反应液（同实施例2），42℃保温30min，吸干，加入20ul PCR反应液（SYBR green I荧光定量），进行PCR程序（95℃3min预变性，然后40个循环的95℃3s，60℃30s，二步法），SYBR green I荧光定量分析。对100-10000个A549细胞进行检测，得到阳性结果。

实施例5：特异引物A与Oligo(dT)引物A的比较

目标RNA为hTERT mRNA；PCR引物序列同实施例1；特异引物A的序列为：5’-GGCCTCAGCCGGACACTCAGCCTTCAGCCG-3’；Oligo(dT)引物为Oligo(dT)₂₉。

按实施例3的方法分别制作hTERT特异引物A或Oligo(dT)₂₉固定的PCR管。然后，吸干管内液体，加入50ul细胞裂解液上清（同实施例1），50℃保温30min，吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤1次，加入50ul RT反应液（含50ul RT缓冲液、0.5mmol/L dNTP、10U MMLV RT酶），42℃保温30min，吸干管内液体，加入50ul PCR反应液（SYBR green I荧光定量），进行PCR程序（95℃2min预变性，然后40个循环的95℃3s、66℃30s，二步法），SYBR green I荧光定量分析。分别采用上述固定有特异引物A或Oligo(dT)₂₉的反应管，对10～10000个A549细胞进行检测，Ct1代表特异引物A的反应管，Ct2代表Oligo(dT)₂₉的反应管，结果见下表，2种方法得到了相似结果。

实施例6：裂解液与细胞体积比的影响

目标RNA为hTERT mRNA；PCR引物序列同实施例1；Oligo(dT)引物为Oligo(dT)₂₉；固定Oligo(dT)₂₉的反应管的制备同实施例2。

在24孔板中培养人肺癌细胞株A549细胞，从10000个细胞/孔，10倍稀释至10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，加入200ul裂解液（配方同实施例1）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温10min，4℃、15000rpm离心20min，以下操作同实施例2，SYBR green I荧光定量分析。结果显示100-10000个细胞的裂解液上清，都能得到阳性结果（细胞样品的Ct值小于空白裂解液的Ct值，且差的绝对值≥1）：

实施例7：以TaqMan探针替代SYBR Green I染料，不影响SORT-PCR的检测效果

目标RNA为hTERT mRNA；PCR引物序列同实施例1；Oligo(dT)引物为Oligo(dT)₂₉；固定Oligo(dT)₂₉的反应管的制备同实施例2。TaqMan探针序列为：

5’FAM-CAGCGTGGAGAGGATGGAGCCCTG-3’BHQ1。

在24孔板中培养人肺癌细胞株A549细胞，从10000个细胞/孔，10倍稀释至10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，加入200ul裂解液/孔（裂解液配方同实施例1），反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温10’，4℃、15000rpm离心20min，得到上清；分别取20ul上清，按实施例2的方法进行，但以TaqMan探针替代SYBR green I加入到PCR反应液中，FAM荧光定量分析。结果显示10-10000个细胞的裂解液上清，都能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct，无Ct值的情况记作Ct>40）。

PCR反应液组成：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，0.05%Tween20，0.2umol/L TaqMan探针，0.5U/20ul Taq酶，0.2umol/L引物对，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。

实施例8：人肺癌细胞株H1299细胞hTERT mRNA的检测

在24孔板中培养人肺癌细胞株H1299细胞，从10000个细胞/孔，10倍稀释至10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，加入200ul裂解液（配方同实施例1）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温10min，4℃、15000rpm离心20min，以下操作同实施例2，SYBR green I荧光定量分析。结果显示100-10000个细胞的裂解液上清，都能得到阳性结果（细胞样品的Ct值小于空白裂解液的Ct值，且差的绝对值≥1）：

实施例9：人皮肤癌细胞株A431细胞hTERT mRNA的检测

在24孔板中培养人皮肤癌细胞株A431细胞，从10000个细胞/孔，10倍稀释至10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，加入200ul裂解液（配方同实施例1）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温10min，4℃、15000rpm离心20min，以下操作同实施例2，SYBR荧光定量分析。结果显示100-10000个细胞的裂解液上清，都能得到阳性结果（细胞样品的Ct值小于空白裂解液的Ct值，且差的绝对值≥1）：

实施例10：人肺癌组织hTERT mRNA的检测

确诊的肺癌患者20例，其中男性16例，女性4例，年龄39-71岁，平均60.2岁，鳞癌9例，腺癌4例，大细胞癌3例，小细胞癌4例。

肺癌组织织切下后，立即液氮保存。癌组织经过病理验证。取约0.1mmol/L³大小的组织块放入1.5ml离心管中，加入200ul裂解液（同实施例2），用吸头捣碎组织块，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，得到上清，分别取20ul上清按实施例2的方法操作，结果采用SYBR荧光定量分析。结果显示18例肺癌组织的Ct值（在20.36～25.52之间）显著小于裂解液对照的Ct值（>29），判断为端粒酶阳性，检出率为90%。

实施例10：痰液标本中hTERT mRNA的检测

清晨收集上述的肺癌患者的痰液共约5ml，冻存于-20oC。5ml痰液+10ml痰溶解液（PBS+0.1%DTT），37℃振荡10min，4℃、5000rpm离心10min，弃上清，沉淀+500ul裂解液（同实施例1），反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温10min，4℃、15000rpm离心20min，得到上清，分装冻存于-80℃。分别取20ul上清至固定有Oligo(dT)₂₉的反应管中，以下按实施例2的方法操作，SYBR荧光定量分析。结果显示20例肺癌患者中检测阳性结果为15例（Ct≤28），阴性5例（Ct≥29），检出率为75%；3例正常人对照的检测结果均为阴性（Ct≥29）。

实施例11：以SORT-PCR检测GUSB基因的表达

目标RNA为人GUSB mRNA，引物A为Oligo(dT)₂₉，PCR引物序列为：

5’-CGATTGCAGGGTTTCACCAGGATC-3’和

5’-GCTCTCCAACCACGTATTTTCTGCG-3’。固定Oligo(dT)₂₉的反应管的制备同实施例2。

在24孔板中培养人肺癌细胞株A549细胞，从10000个细胞/孔，10倍稀释至10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，加入200ul裂解液（配方同实施例1）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温10min，4℃、15000rpm离心20min，以下操作同实施例2，SYBR green I荧光定量分析。结果显示10～10000个细胞的裂解液上清，都能得到阳性结果（细胞样品的Ct值小于空白裂解液的Ct值，且差的绝对值≥1）：

实施例12：以SORT-PCR检测Bcl-2基因的表达

目标RNA为人Bcl-2mRNA，引物A为Oligo(dT)₂₉，PCR引物序列为：

5’-ACGCCCCATCCAGCCGCAT-3’和5’-CACAGGTGGCACCGGGCTGA-3’。固定Oligo(dT)₂₉反应管的制备同实施例2。Bcl-2ASO序列:TCTCCCAGCGTGCGCCAT。

在24孔板中培养人肺癌细胞株H1299细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，进行Bcl2的反义寡核苷酸（ASO）转染或无转染对照，48hr后，加入200ul裂解液（配方同实施例1）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4℃15000rpm离心20’，得到上清；以下操作按实施例2的方法进行，SYBR green I荧光定量分析。结果显示无转染和ASO转染的细胞上清，都能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）。ASO转染的细胞，Bcl-2mRNA的量显著下降（Ct值变大）。

实施例13：以SORT-PCR检测PAR-2基因的表达

目标RNA为人PAR-2mRNA，引物A为Oligo(dT)₂₉，PCR引物序列为：

5’-AGGAGGATGCGGAGCCCCA-3’和5’-CCAGTGACGTGGGATGTGCCA-3。固定Oligo(dT)₂₉反应管的制备同实施例2。PAR-2ASO序列:TCCGCATCCTCCTGGAA。

在24孔板中培养人皮肤癌细胞株A431细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，进行PAR-2的反义寡核苷酸（ASO）转染或无转染对照，48hr后，加入200ul裂解液（配方同实施例1）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4℃15000rpm离心20’，得到上清；以下操作按实施例2的方法进行；采用SYBR green I荧光定量分析。结果显示无转染和ASO转染的细胞上清，都能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）。ASO转染的细胞，PAR-2mRNA的量显著下降（Ct值变大）。

实施例14：以SORT-PCR检测hRPLP0基因的表达

目标RNA为人RPLP0mRNA，引物A为Oligo(dT)₂₉，PCR引物序列为：

5’-CACTGTGCCAGCCCAGAACACTG-3’和

5’-GTGCCCCTGGAGATTTTAGTGGTGA-3’。固定Oligo(dT)₂₉反应管的制备同实施例2。

在24孔板中培养人肺癌细胞株A549细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，加入200ul裂解液（配方同实施例1）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4℃15000rpm离心20’，得到上清；以下操作按实施例2的方法进行，采用SYBRgreen I荧光定量分析，结果显示能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）。

实施例15：以SORT-PCR检测hGAPDH基因的表达

目标RNA为人GAPDH mRNA，引物A为Oligo(dT)₂₉，PCR引物序列为：

5’-CGTCAAGGCTGAGAACGGGAAGC-3’和

5’-GCTCCTGGAAGATGGTGATGGGA-3’。固定Oligo(dT)₂₉反应管的制备同实施例2。

实施例16：以SORT-PCR检测小鼠beta-actin mRNA

目标RNA为小鼠beta-actin mRNA，引物A为Oligo(dT)₂₉，PCR引物序列为：

5’-AAGAGGAGGATGGTCGCGTCCA-3’和

5’-ACAGAAGCAATGCTGTCACCTTCCC-3’。固定Oligo(dT)₂₉反应管的制备同实施例2。

在24孔板中培养小鼠成纤维细胞株NIH-3T3细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，加入200ul裂解液（配方同实施例1）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4℃15000rpm离心20’，得到上清；以下操作按实施例2的方法进行，采用SYBR green I荧光定量分析，结果显示能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）。

实施例17：以SORT-PCR检测hTERC基因的表达

目标RNA为人hTERC RNA，所述PCR引物序列为：

5’-CCGCCTTCCACCGTTCATTCTAG-3’和5’-AACTCTTCGCGGTGGCAGTGG-3’。

所述的特异引物A序列为：5’-GCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGGTGCACGTCC-3’；固定引物A反应管的制备同实施例2。

实施例18：以SORT-PCR检测大肠杆菌中氨苄青霉素抗性基因（APr）的表达

目标RNA为大肠杆菌中氨苄青霉素抗性基因mRNA，所述特异引物A的序列为:

5’-CGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGT-3’，所述PCR引物序列为：

5’-CAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCA-3’和5’-TGCGGCATTTTGCCTTCCTG-3’；固定引物A反应管的制备同实施例2。

大肠杆菌，进行pUC19质粒转化，在LB+氨苄青霉素（50ug/ml）的培养基上过夜培养后，挑克隆在50ul裂解液（配方同实施例1）中，66℃10min，15000rpm离心取上清，为转化克隆的上清；同样地，未进行转化的大肠杆菌，在无氨苄青霉素的LB培养基上过夜培养，按同样的方法得到原始克隆的上清。分别取20ul至上述固定有引物A的0.2ml反应管中，以下操作按实施例2的方法进行，SYBR green I荧光定量分析。结果显示转化克隆能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct），而原始克隆的结果为阴性（Ct值与空白裂解液相当）。证明SORT-PCR可以用于微生物的分子检测。

Claims

1.一种非诊断目的的RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法，所述方法包括：

（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25～40mer的单链寡核苷酸DNA，记为引物A；该引物的GC含量为40～60%，解链温度为70～85℃；或者，若目标RNA为带poly(A)末端的mRNA，则引物A选用长度为29～50mer的Oligo(dT)；将引物A固定在PCR管内，得到固定PCR管；

（2）取待测样本，加入添加有表面活性剂和RNA酶抑制剂的裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；

（3）取裂解上清液20uL至固定PCR管中，50～60℃保温10～30min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤1次，吸干，加入20uL由RT酶、dNTP和RT缓冲液配制的RT反应液，42℃保温0.5～1小时；

（4）吸干管内液体，加入20uL由耐热DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析或琼脂糖凝胶电泳分析；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述裂解液组成如下：4.0mol/L异硫氰酸胍，350mmol/L NaCl，1%Triton X-100，10mmol/L2-巯基乙醇，0.1mg/ml鱼精DNA，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）所述RT反应液组成如下：75mmol/LKCl，3mmol/L MgCl₂，10mmol/L DTT，0.5mmol/L dNTP,5U/20ul MMLV RT酶，溶剂为50mM、pH8.3的Tris-HCl。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述PCR反应液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP，0.05%Tween20，0.4×SYBRGreen I，0.5U/20ul Taq酶，0.2umol/L PCR引物，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。