CN102864233B - 一种非诊断目的的rna的pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种RNA的预备模板PCR（Template-Ready PCR，TRPCR）检测方法。本发明方法与采用传统的RT-PCR方法相比，不需要纯化抽提RNA，不需要进行逆转录反应，将原本长达3个小时以上的PCR前处理过程缩短为约50分钟，因此，操作简便快速易行，具有较高的RNA检测的灵敏度和特异性，适合对各种来源的样品裂解得到RNA进行检测。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种RNA的预备模板PCR（Template-Ready PCR，TRPCR）检测方法。
（二）背景技术
RNA是遗传信息传递的载体。RT-PCR（reverse transcription逆转录-聚合酶链反应），指将逆转录反应（Reverse Transcription，RT）和PCR（Polymerase Chain Reaction）反应组合在一起的方法.RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成，即RT，同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RNA的RT-PCR检测或定量分析，比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作，已发展成为进行基因表达水平的检测分析，病原体的检测分析等有力的手段。
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly（A）+RNA.其中RT需要用逆转录酶，可以用随机引物、oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）起始.RT和PCR可以在两个反应管中分步先后进行（两管法），也可以在一个反应管中先后进行（一管法）。两管法比较常见，在两管法RT-PCR中，每一步都可以尽量在最佳条件下进行，但由于RT体系中含有PCR抑制物，所以一般只能取出约5%的RT产物进行PCR，这限制了最终检测的灵敏度，但在使用一个样品检测多个目标RNA时比较很有用——因为一个RT产物可以分别用于很多个PCR反应。一管法RT-PCR中，RT和PCR在一只管中进行，必须尽可能地提供同时为逆转录和PCR优化的条件.一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖.一步法优化成功的话，可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增–理论上灵敏度可以比两管法提高20倍.然而，为一步法RT-PCR优化的条件很难掌控，经常会带来严重的非特异扩增，而且成本上有很大提升.
虽然RT-PCR在科研领域的推广普及程度很高，但在临床检测应用方面，仍存在很大的改进空间.主要问题包括:步骤繁琐，对操作要求高，特别是2种酶促反应（RT和PCR）的最优反应条件是有差异的，容易受到各种抑制物质的影响，也容易受到非特异扩增和假阳性的困扰，最后，逆转录酶的价格居高不下，操作成本很难降下来.
（三）发明内容
本发明目的是提供一种操作简单快速、特异性强的用于RNA检测的预备模板PC检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一种RNA的预备模板PCR检测方法，所述方法包括：
（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25～40mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A；探针A的GC含量为40-60%，解链温度（Tm值）为70-85°C；将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管；探针A的锚定可以采用本领域常规方法进行，用于锚定探针A的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质；
（2）设计部分序列与目标RNA上任意的另一段序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为:两端是特异的长度为20～30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25～40merbp的序列，记为探针B；探针B的GC含量为40-60%，解链温度（Tm值）为70-85°C，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠。
（3）取待测样本，加入探针B和裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；所述裂解液为本领域常规含有表面活性剂（如吐温20、NP-40等）、用于细胞或组织裂解的缓冲液；
待测样本可来自组织或细胞，或者临床标本如痰液、血液等；
待测样本来自痰液时，裂解上清液获得方法如下：1～5ml痰液+5～10ml痰融液，37℃振荡10min，4℃、5000rpm离心10min，弃上清，取沉淀+200ul裂解液（其中探针B浓度为1nmol/L），反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上放置20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液组成:PBS+0.1%（w/vol）DTT。
待测样本来自细胞时，裂解上清液获得方法如下：24孔板细胞培养，吸去培养液，+200ul裂解液（其中探针B浓度为1nmol/Lol/L），反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上放置20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；
待测样本来自组织时，裂解上清液获得方法如下：取约0.1mmol/L3大小的组织块放入1.5ml离心管中，+200ul裂解液（其中探针B浓度为1nmol/Lol/L），用吸头捣碎组织，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；
（4）取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，60～70℃保温5～15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3～9次，吸干，加入20uL由PCR缓冲液和PCR引物（该PCR引物即与探针B两端的PCR引物序列相同的引物对）配制的PCR反应液（PCR反应液中引物对浓度为0.2umol/Lol/L），进行PCR扩增，扩增产物进行SYBR荧光定量分析；所述缓冲液为PCR反应常规缓冲液；所述洗涤液可为本领域常规含有表面活性剂（如吐温20、NP-40等）的缓冲液。在杂交反应之后，通过多次反复的洗涤，在洗去未杂交结合的核酸的同时，也洗去了其他可能干扰PCR反应的物质，从而保证了PCR反应的特异性和成功率；
（5）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（1）和（2）方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。
本发明方法原理如下：（1）预先制备好与目标RNA上一段序列互补的锚定探针——探针A；探针A被固定在PCR管壁，磁珠或其他可吸附结合核酸的固体介质上，作用是通过特异性地结合目标RNA，将目标RNA选择性地吸附在固体介质上；（2）与目标RNA上另一段序列互补的模板探针——探针B；探针B两端带有PCR引物序列，使用时是添加在裂解液中的；当细胞被裂解后，探针B通过部分杂交与目标RNA结合，这样探针B也就被选择性地吸附在上述固体介质上；（3）在杂交反应之后，经过反复清洗，只有能与探针A互补杂交结合的目标RNA分子及与该RNA杂交结合的探针B留在反应管中；（4）由于探针B两端带有PCR引物序列，这样加入PCR反应液后，以探针B为模板，不需要RT，可直接进行PCR反应。
优选的，所述裂解液组成如下：1%（w/vol）SDS，500mmol/Lol/L NaCl，2mmol/Lol/L MgCl2，10mmol/Lol/L2-巯基乙醇，0.1mg/ml鱼精DNA（市购），0.1%（vol/vol）Tween20，1%（w/vol）脱脂奶粉，溶剂为10mmol/Lol/L、pH7.5的Tris-HCl。
优选的，所述PCR缓冲液组成如下：50mmol/Lol/L KCl，1.5mmol/Lol/L MgCl2，0.2mmol/Lol/L dNTP，5%（vol/vol）DMSO，0.05%（vol/vol）Tween20，0.4×SYBRGreen I（浓度0.4×的含义是，其中各组分在反应液中的终浓度为1×SYBR Green I中的0.4倍，市购生产商Microprobe的SYBR Green I原液为10000×，使用时按体积比稀释至PCR缓冲液中终浓度为0.4×即可），0.5U/20ul Taq酶，溶剂为10mmol/Lol/L、pH9.0的Tris-HCl。
优选的，所述洗涤液为TBST缓冲液，其终浓度组成如下：150mmol/L NaCl，0.05%Tween20，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl。
所述方法用于检测端粒酶催化亚基（hTERT）时，所述探针A序列如下：
5’-GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3’，所述探针B序列如下：
5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC
CTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGTTTCGGCG-3’；所述PCR引物为：NTP1：5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’和NTP2：
5’-CGCCGAAACCTCAACCGTCG-3’；
所述方法用于检测人Bcl-2基因时，所述探针A的序列为:
CCGCATCCCACTCGTAGCCCCTCTGCGACA，所述探针B的序列为：
CGCCGAAACCTCAACCGTCGCACACACATGACCCCACCGAACTCA
AAGAAGGCCACAATCGGTGTCCACGCTTTCCTCCGG，所述PCR引物序列为：
NTP1：5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’和NTP2：5’-
CGCCGAAACCTCAACCGTCG-3’；
所述方法用于检测人PAR-2基因时，所述探针A的序列为:
CAGGGCATAGACATGGCTCTGGCCCTGGCT，所述探针B的序列为：
CGCCGAAACCTCAACCGTCGCTTGGCAAACCCACCACAAACACAATTGTGTAGACAATTGGGTGTCCACGCTTTCCTCCGG，所述PCR引物序列为：NTP1：
5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’和NTP2：5’-CGCCGAAACCTCAACCGTCG-3’；或者，所述探针A序列为:CTCTCTCCAGCGCCGCGCGAGGCTCC，所述探针B序列为:
CGCCGAAACCTCAACCGTCGCCAAATCTTCTCACTCCTTCTGTTAACCACACCACTCCGGGGTGTCCACGCTTTCCTCCGG，所述PCR引物序列为：NTP1：
5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’和NTP2：5’-CGCCGAAACCTCAACCGTCG-3’；
所述方法用于检测人hRPLP0基因时，所述探针A的序列为:AGCCAAGAAGGCCTTGACCTTTTCAGCAAGTGGGAA，所述探针B的序列为：CCGGAGGAAAGCGTGGACACCTGCCCATCAGCACCACAGCCTTCCCGCGAAGGGACACGACGGTTGAGGTTTCGGCG，所述PCR引物序列为：NTP1：5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’和NTP2：5’-CGCCGAAACCTCAACCGTCG-3’；
所述方法用于检测人hGAPDH基因时，所述探针A的序列为:GGACTCCACGACGTACTCAGCGCCAGCATC，所述探针B的序列为：CAGGAGCAGCATTCCATCACGGAAGTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTAGCCCAGGCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG，所述PCR引物序列为：NTP1：5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’和NTP2：5’-CGCCGAAACCTCAACCGTCG-3’；
所述方法用于检测人hTERC基因时，所述探针A的序列为:GCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGGTGCAC，所述探针B的序列为：CAGGAGCAGCATTCCATCACGAGCACGGCGCCTACGCCCTTCTCAGTTAGGGTTAGACCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG，所述PCR引物序列为：NTP1：5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’和NTP2：5’-CGCCGAAACCTCAACCGTCG-3’；
所述方法用于检测大肠杆菌中氨苄青霉素抗性基因时，所述探针A的序列为:CGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGT，所述探针B的序列为：CAGGAGCAGCATTCCATCACGCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG，所述PCR引物序列为：NTP1：5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’和NTP2：5’-CGCCGAAACCTCAACCGTCG-3’。
本发明采用最新的预备模板PCR（Template-Ready PCR，TRPCR）技术，整个PCR的前处理流程被简化成裂解保温洗涤等3步简单操作，耗时由常规的3个小时以上，减少到50分钟以下，不需要纯化RNA，不需要去除DNA，不需要对RNA进行特别的保护，不需要进行逆转录反应，因此，操作简单，快速，标准化程度高。由于RNA的利用率高，引物是特别优化设计，且通过洗涤步骤能去除各种干扰因素，PCR的特异扩增效率得到了很大的增强。
（四）附图说明
图1为本发明原理示意图；A:探针A；B:探针B；C:固定介质；P1/P2:引物对；RNA:目标RNA；IIII:双链互补杂交结合；
图2为琼脂糖电泳结合EB染色检测结果；
图3为采用TRPCR与RT-PCR对hTERT mRNA的检测结果比较；1～4为TRPCR法；1.空白裂解液对照，2.大肠杆菌裂解对照，3.磁珠法50ul，4.偶联法50ul;5～8为RT-PCR法;5.MMOL/LLV，6.AMV，7.FD，8.Tth;M.Marker;"＞"指示特异扩增条带的位置;"＞＞"指示引物聚合体的位置。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:洗涤去除非固定的探针B
用于检测hTERTmRNA的探针B:
5'-CAGGAGCAGCATTCCATCACGCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG-3'，阴影部分为与mRNA结合的互补序列，
两端为PCR引物序列。PCR引物:TAB1:CAGGAGCAGCATTCCATCACG，TAB2:CCTTCTCTGGACCTGCGACG。
人肺癌细胞株A549细胞于24孔板中进行细胞培养，1000个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，+200ul裂解液B(裂解液添加探针B浓度为1nmol/L)，反复吸打，转移到1.5m1离心管中，冰上放置20min，4。C、15000rpm离心20min，取上清，得到细胞裂解上清液;裂解液B组成如下:1%SDS，500mmol/LNaCl，2mmol/LMgCl2，10mmol/L2-疏基乙醇，0.1mg/ml鱼精DNA(Sigma公司)，0.1%Tween201%脱脂奶粉，1nmol/L探针B，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl;
取50ul的上述的细胞裂解液上清，其中含有1nmol/L的探针B，加到0.2ml的PCR薄壁管中，66°C保温10min，再吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤1，3，5，7，9或12次，加入50ulPCR反应液(50ulPCR缓冲液+引物对0.2umol/L)，进行PCR程序(94°C3min预变性，然后40个循环的94°C3s、66°C30s，二步法)，以SYBR greenI荧光定量分析，结果显示洗涤次数达到及超过5次，探针B不再有强于空白对照的扩增信号(Ct值与空白相当)，表明洗涤步骤可以彻底洗掉不结合的探针DNA。
空白对照的Ct值（来源于引物二聚体）在28.24～29.31之间。当洗涤次数达到及超过5次，探针B的Ct值为27.25～28.63，与空白对照的值相当，说明不再有特异扩增。
TBST缓冲液组成:150mmol/L NaCl，0.05%Tween20，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl；
PCR反应液（SYBR荧光定量）组成:50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/LdNTP，5%DMSO，0.05%Tween20，0.4×SYBR Green I，0.5U/20ul Taq酶，0.2umol/L引物对，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。
实施例2：磁珠法制作锚定管
用于锚定hTERT mRNA的探针A:5'-GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA。TBST缓冲液20ul，含有10ug 
M-280链霉亲和素磁珠和2pmol生物素化的探针A（生物素化的探针A由合成时直接修饰加在5’端），装入0.2ml的PCR薄壁管中，室温1hr，以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，加50ul TBST缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共6次，最后吸干；加50ul TE缓冲液，备用。
细胞裂解:24孔板细胞培养，吸去培养液，+200ul裂解液B（同实施例1），反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到细胞裂解上清。然后以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，加入20ul细胞裂解上清，其中含有探针B，66℃保温5min，再以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤6次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（95℃2min预变性，然后40个循环的95℃3s、66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析。用这种方法，对10～10000个A549细胞进行检测，可以得到阳性结果（细胞裂解液上清的Ct值小于空白裂解液的Ct值）。
TE:1mmol/L EDTA-Na，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl；
实施例3：直接PCR管内偶联制作锚定管
TBST缓冲液50ul，含有5pmol生物素化的hTERT探针A（参见实施例2），装入链霉亲和素包被的0.2ml PCR薄壁管中，室温1hr，吸干管内液体，加100ul TBST缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共3次，最后吸干；加100ul TE缓冲液，然后，吸干管内液体，加入50ul细胞裂解液上清（同实施例1），64℃保温10min，再吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤7次，加入50ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后40个循环的93℃3s，62℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析.用这种方法，对10-10000个A549细胞进行检测，可以得到阳性结果（细胞裂解液上清的Ct值小于空白裂解液的Ct值）。
实施例4：微球法制作锚定管
1ml的50mmol/L MES pH6.1缓冲液中含有:1%羧基化的橡胶微球（Latex beads，carboxylate-modified polystyrene，Sigma CLB9），0.1mmol/L氨基修饰的hTERT探针A（参见实施例2）和0.15mmol/L新鲜配制的EDAC（偶联剂），室温反应1hr，然后离心3min（15000rpm），用1ml的TBST缓冲液洗涤3次，微球重新悬浮在1ml TE中.取1ul微球，加入50ul细胞裂解液上清（同实施例1），62℃保温15min，再离心3min（15000rpm），用100ul的TBST缓冲液洗涤8次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（92℃3min预变性，然后40个循环的92℃3s，60℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析.对10-10000个A549细胞进行检测，得到阳性结果。
实施例5:PCR引物的优化
用于锚定hTERTmRNA的探针A同实施例2。三对PCR引物，TAB1/2同实施例1，NTP1:CCGGAGGAAAGCGTGGACACC，NTP2:GCCGAAACCTCAACCGTCG;
PEG1:CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC,PEG2:
CTTGCTCACCATGGTGGCGAC。
对应的hTERT探针B序列
配合TAB1/2的探针B同实施例1，配合NTP1/2的探针B:
CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGTTTCGGCG，配合PEG1/2的探针B:
CGTCAGATCCGCTAGCGCTACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCGTGGCCACCATGGTGAGCAAG。
A549细胞于24孔板中进行细胞培养，10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，+200ul裂解液B(裂解液分别添加各引物对对应的探针B1nmol/L)，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上放置20min，4°C、15000rpm离心20min，取上清，分别得到细胞裂解上清液;
TBST缓冲液50ul，含有5pmol5’-生物素化的hTERT探针A，加入到链霉亲和素包被的0.2ml PCR薄壁管中，室温1hr，吸干管内液体，加100ul TBST缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共3次，最后吸干;加100ul TE缓冲液，然后，吸干管内液体，分别加入50ul A549细胞（10个细胞）裂解液上清，66度保温5min，再吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤7次，分别对应加入50ul TAB1/2，NTP1/2或PEG1/2的PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（92度3min预变性，然后35个循环的92度3s，66度30s，二步法），SYBR荧光定量分析.结果显示NTP1/2得到最小的Ct值，说明优化程度和灵敏度最好。
实施例6：裂解液与细胞体积比的影响
在24孔板中培养人肺癌细胞株A549细胞，从10000个细胞/孔，10倍稀释至10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，+200ul裂解液B（含配合NTP1/2的探针B1nmol/L）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管中，66度保温10min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤7次，加入20ul PCR反应液（含引物对NTP1/20.2umol/L）（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93度3min预变性，然后35个循环的93度3s，66度30s，二步法），SYBR荧光定量分析.结果显示10-10000个细胞的裂解液上清，都能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）：
实施例7：洗涤次数的影响
4孔1000个A549细胞，分别+200ul裂解液B（含配合NTP1/2的探针B1nmol/L）/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上20’，4°C15000rpm离心20’，取上清，得到上清B;取20ul至0.2ml锚定管中，66度保温10min，吸干管内液体，以T洗涤液分别洗涤3，5，7和9次，加入20ul PCR反应液（含引物对NTP1/20.2umol/L）（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93度3min预变性，然后35个循环的93度3s，66度30s，二步法），SYBR荧光定量分析.洗涤3-9次，都能得到阳性结果.
注Delta Ct=Ct-裂解液对照-Ct-1000个细胞
实施例8：人肺癌细胞株H1299细胞的检测
在24孔板中培养人肺癌细胞株H1299细胞，从10000个细胞/孔，10倍稀释至10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，+200ul裂解液B/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤7次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析.结果显示10-10000个细胞的裂解液上清，都能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）。
裂解液B组成:1%SDS，500mmol/LNaCl，2mmol/LMgCl2,10mmol/L2-疏基乙醇，0.1mg/ml鱼精DNA，0.1%Tween20，1%脱脂奶粉，1nmol/L探针B，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl；
洗涤液(TBST缓冲液)组成:150mmol/LNaCl，0.05%Tween20，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl；
PCR反应液组成:50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2,0.2mmol/LdNTP，5%DMSO，0.05%Tween20，0.4×SYBRGreenI，0.5U/20ulTaq酶，0.2umol/L引物对，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl；
探针:5'-GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3'；
探针B:5'-CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGA
CACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGTTTCGGCG-3'；
PCR引物:NTP15'-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3',NTP2:5'-CGCCGAAACCTCAACCGTCG-3'。
实施例9:人皮肤癌细胞株A431细胞的检测
在24孔板中培养A431细胞，从10000个细胞/孔，10倍稀释至10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，+200ul裂解液B(同实施例8)/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10min，4°C、15000rpm离心20min，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管中，66°C保温10min，吸干管内液体，以洗涤液(同实施例8)洗涤7次，加入20ulPCR反应液(同实施例8)(SYBR荧光定量)，进行PCR程序(93°C3min预变性，然后35个循环的93°C3s，66°C30s，二步法)，SYBR荧光定量分析。结果显示10-10000个细胞的裂解液上清，都能得到阳性结果(样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct).
实施例10：人肺癌组织的检测
确诊的肺癌患者20例，其中男性16例，女性4例，年龄39-71岁，平均60.2岁，鳞癌9例，腺癌4例，大细胞癌3例，小细胞癌4例。
肺癌组织织切下后，立即液氮保存.癌组织经过病理验证.取约0.1mmol/L3大小的组织块放入1.5ml离心管中，加入200ul裂解液B（同实施例8），用吸头捣碎组织块，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液（同实施例8）洗涤7次，加入20ul PCR反应液（同实施例8）（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析.结果显示18例肺癌组织的Ct值（在19.22～24.31之间）显著小于裂解液对照的Ct值（>25），判断为端粒酶阳性，检出率为90%。
实施例11：痰检
收集上述的肺癌患者的清晨第一口痰，1-5ml痰液+5-10ml痰融液（PBS+0.1%DTT。），37℃振荡10min，4℃、5000rpm离心10min，弃上清，沉淀+200ul裂解液B（同实施例8），反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到上清B。分别取20ul至0.2ml锚定管中，66度保温10min，吸干管内液体，以洗涤液（同实施例8）洗涤7次，加入20ul PCR反应液（同实施例8）（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析。结果显示20例肺癌患者中检测阳性结果为16例，阴性4例，检出率为80%;3例正常人对照的检测结果均为阴性。
实施例12：以TaqMan探针替代SYBR Green I染料，不影响TRPCR的检测效果.
在24孔板中培养人肺癌细胞株A549细胞，从10000个细胞/孔，10倍稀释至10个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，+200ul裂解液B/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上20’，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到上清B；分别取20ul上清B至0.2ml锚定管中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤7次，加入20ul PCR反应液（TaqMan探针），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），荧光定量分析.结果显示10-10000个细胞的裂解液上清，都能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）。
裂解液B和洗涤液组成同实施例8。
PCR反应液组成：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，5%DMSO，0.05%Tween20，0.2umol/L TaqMan探针，0.5U/20ul Taq酶，0.2umol/L引物对，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl；TaqMan探针的序列为:
FAM-TAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCC-TAMRA；
实施例13：琼脂糖电泳结合EB染色也可以用于TRPCR检测.
裂解液B、PCR反应液和洗涤液组成同实施例8。
肺癌患者的清晨第一口痰，1-5ml痰液+5-10ml痰融液，37℃振荡10min，4℃、5000rpm离心10min，弃上清，沉淀+200ul裂解液B，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到上清B；分别取20ul上清B至0.2ml锚定管中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤7次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），结果分析采用琼脂糖电泳结合EB染色，紫外分析仪上观测拍照。结果可见:肺癌样本:1，3，4，6，9-11，12，13，16，17，19-24的结果呈阳性:都有分子量较大的特异扩增条带（左边单箭头所指的位置）;正常人对照3例，只有分子量较小的引物二聚体条带（靠右边的双箭头所指的位置），无特异扩增条带，结果均为阴性，详见图2。
实施例13：采用TRPCR与RT-PCR对hTERT mRNA的检测结果比较
2孔10000个A549细胞/孔，第1孔细胞按TRPCR的前处理方法进行:+200ul裂解液B（同实施例8），反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到上清；分别取50ul至0.2ml锚定管（磁珠法或偶联法，参见实施例2，3）中，66℃保温10min，吸干管内液体，以TBST洗涤液洗涤7次，加入50ul PCR反应液（同实施例8），进行PCR反应（93℃3min预变性，然后40个循环的93℃3s，66℃30s，二步法）；
第2孔细胞按QIAGEN RNA抽提试剂盒，抽提纯化总RNA（以DNase I酶处理去除基因组DNA）.然后分别采用MMOL/LLV，AMV，FD，Tth等逆转录酶，在42℃进行RT反应1小时:10ul体系中，含1×酶反应缓冲液，0.1umol/L Oligo（dT）引物，2U酶和5ul总RNA。之后，将RT反应产物稀释10倍，取5ul为PCR模板，进行PCR反应（50ul体系）（93℃3min预变性，然后40个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），PCR引物序列为:CTGCGCGCTCTTTGTGCTGG和GCAGCGCCGAGCTGGTACAG。
结果可见，TRPCR与RT-PCR都能得到的特异扩增条带（图3）。
实施例14：裂解液中探针B的含量对TRPCR结果的影响
配制分别含有1nmol/L，0.1nmol/L，0.01nmol/L，0.001nmol/L探针B的裂解液（1%SDS，500mmol/L NaCl，2mmol/L MgCl2，10mmol/L2-巯基乙醇，0.1mg/ml鱼精DNA，0.1%Tween20，1%脱脂奶粉，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl），对4孔10000细胞/孔的A549细胞进行裂解，得到上清。其他操作同实施例3，结果如下：
Delta Ct=Ct-裂解液对照-Ct-1000个细胞.可见，探针B的含量在0.1nmol/L得到最大的Delta Ct，也即理论灵敏度最高。
实施例15：以TRPCR检测Bcl-2基因的表达
在24孔板中培养人肺癌细胞株H1299细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，进行Bcl2的反义寡核苷酸（ASO）转染或无转染对照，48hr后，+200ul裂解液/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4°C15000rpm离心20’，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管（探针A按实施例2方法锚定）中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液（TBST缓冲液）洗涤7次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析。结果显示无转染和ASO转染的细胞上清，都能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）。ASO转染的细胞，Bcl-2mRNA的量显著下降（Ct值上升）。
裂解液：1%SDS，500mmol/L NaCl，2mmol/L MgCl2，10mmol/L2-巯基乙醇，0.1mg/ml鱼精DNA，0.1%Tween20，1%脱脂奶粉，0.1nmol/L探针B，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl；
PCR反应液：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，5%DMSO，0.05%Tween20，0.4×SYBR Green I，0.5U/20ul Taq酶，0.2umol/LPCR引物对，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl；
ASO:TCTCCCAGCGTGCGCCAT，探针A:
CCGCATCCCACTCGTAGCCCCTCTGCGACA，探针B:
CGCCGAAACCTCAACCGTCGCACACACATGACCCCACCGAACTCAAAGAAGGCCACAATCGGTGTCCACGCTTTCCTCCGG
PCR引物为NTP1和NTP2，同实施例5。
实施例16：以TRPCR检测PAR-2基因的表达
在24孔板中培养人皮肤癌细胞株A431细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，进行PAR-2的反义寡核苷酸（ASO）转染或无转染对照，48hr后，+200ul裂解液/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4°C15000rpm离心20’，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管（探针A按实施例2方法锚定）中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液（TBST缓冲液）洗涤7次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析。结果显示无转染和ASO转染的细胞上清，都能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）。ASO转染的细胞，PAR-2mRNA的量显著下降（Ct值上升）。
裂解液和PCR反应液参照实施例15。
ASO:TCCGCATCCTCCTGGAA，探针A:
CAGGGCATAGACATGGCTCTGGCCCTGGCT，探针B:
CGCCGAAACCTCAACCGTCGCTTGGCAAACCCACCACAAACACAATTGTGTAGACAATTGGGTGTCCACGCTTTCCTCCGG
PCR引物为NTP1和NTP2，同实施例5。
实施例17：以TRPCR检测PAR-2基因的表达
在24孔板中培养人皮肤癌细胞株A431细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，进行ZO-1的反义寡核苷酸（ASO）转染或无转染对照，48hr后，+200ul裂解液/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4°C15000rpm离心20’，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管（探针A按实施例2方法锚定）中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液（TBST缓冲液）洗涤7次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析.结果显示无转染和ASO转染的细胞上清，都能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）.ASO转染的细胞，ZO-1mRNA的量显著下降（Ct值上升）。
裂解液和PCR反应液参照实施例15。
ASO:ACCGCTGGTCAGGAGATCGTG，探针A:
CTCTCTCCAGCGCCGCGCGAGGCTCC，探针B:
CGCCGAAACCTCAACCGTCGCCAAATCTTCTCACTCCTTCTGTTAACCACACCACTCCGGGGTGTCCACGCTTTCCTCCGG
PCR引物为NTP1和NTP2，同实施例5。
实施例18：以TRPCR检测hRPLP0基因的表达
在24孔板中培养人肺癌细胞株A549细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，+200ul裂解液/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4°C15000rpm离心20’，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管（探针A按实施例2方法锚定）中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液（TBST缓冲液）洗涤7次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析.结果显示能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）.
裂解液和PCR反应液参照实施例15。
探针A:AGCCAAGAAGGCCTTGACCTTTTCAGCAAGTGGGAA，
探针B:CCGGAGGAAAGCGTGGACACCTGCCCATCAGCACCACAGC
CTTCCCGCGAAGGGACACGACGGTTGAGGTTTCGGCG
PCR引物为NTP1和NTP2，同实施例5。
实施例19：以TRPCR检测hGAPDH基因的表达
在24孔板中培养人肺癌细胞株A549细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，+200ul裂解液/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4°C15000rpm离心20’，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管（探针A按实施例2方法锚定）中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液（TBST缓冲液）洗涤7次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析.结果显示能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）.
裂解液和PCR反应液参照实施例15。
A:GGACTCCACGACGTACTCAGCGCCAGCATC，
探针B:CAGGAGCAGCATTCCATCACGGAAGTCAGAGGAGACCAC
CTGGTGCTCAGTGTAGCCCAGGCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG
PCR引物为NTP1和NTP2，同实施例5。
实施例20：以TRPCR检测hTERC基因的表达
在24孔板中培养人肺癌细胞株A549细胞，10000个细胞/孔，过夜培养后，+200ul裂解液/孔，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10’，4°C15000rpm离心20’，取上清，得到上清B;分别取20ul至0.2ml锚定管（探针A按实施例2方法锚定）中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液（TBST缓冲液）洗涤7次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析.结果显示能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct）.
裂解液和PCR反应液参照实施例15。
探针A:GCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGGTGCAC，
探针B:CAGGAGCAGCATTCCATCACGAGCACGGCGCCTACG
CCCTTCTCAGTTAGGGTTAGACCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG
PCR引物为NTP1和NTP2，同实施例5。
实施例21：以TRPCR检测大肠杆菌中氨苄青霉素抗性基因（APr）的表达
大肠杆菌，进行pUC19质粒转化，在LB+氨苄青霉素的培养基上过夜培养后，挑克隆在50ul裂解液中，66°C10min，15000rpm离心取上清，为转化克隆的上清；同样地，未进行转化的大肠杆菌，在无氨苄青霉素的LB培养基上过夜培养，得到原始克隆的上清。分别取20ul至0.2ml锚定管（探针A按实施例2方法锚定）中，66℃保温10min，吸干管内液体，以洗涤液（TBST缓冲液）洗涤7次，加入20ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（93℃3min预变性，然后35个循环的93℃3s，66℃30s，二步法），SYBR荧光定量分析.结果显示转化克隆能得到阳性结果（样品的Ct值显著小于裂解液对照的Ct），而原始克隆的结果为阴性（Ct值与空白裂解液相当）。证明TRPCR可以用于微生物的分子检测。
裂解液和PCR反应液参照实施例15。
探针A:CGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGT，
探针B:CAGGAGCAGCATTCCATCACGCAACCAAGTCATTCTGAGA
ATAGTGTATGCGGCGACCGCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG，
PCR引物为NTP1和NTP2，同实施例5。
Claims (4)
1.一种非诊断目的的RNA的PCR检测方法，所述方法包括：
（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25～40mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A；探针A的GC含量为40～60%，解链温度为70～85℃；将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管；
（2）设计部分序列与目标RNA上另一段任意序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为:两端是特异的长度为20～30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25～40mer的序列，记为探针B；探针B的GC含量为40～60%，解链温度为70～85℃，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠；
（3）取待测样本，加入探针B和含表面活性剂的细胞裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；
（4）取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，60～70℃保温5～15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3～9次，吸干，加入20uL由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析；
（5）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（1）和（2）方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述裂解液组成如下：1%SDS，500mmol/LNaCl，2mmol/L MgCl2，10mmol/L2-巯基乙醇，0.1mg/ml鱼精DNA，0.1%Tween20，1%脱脂奶粉，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR缓冲液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，5%DMSO，0.05%Tween20，0.4×SYBR GreenI，0.5U/20ul Taq酶，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述洗涤液为TBST缓冲液。
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