CN110117644A - 一种用于生物样本中rna的基因检测方法 - Google Patents

一种用于生物样本中rna的基因检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医疗技术领域，尤其为一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，检测试剂盒中主要包括(1)样本处理液；(2)漂洗液；(3)洗脱液；(4)反应液A；(5)反应液B；本发明方法将生物体的组织或体液在样本处理液中进行剧烈震荡后在50℃～80℃范围内进行保温消化，消化后的悬浊液经酚氯仿进行分离，含有RNA的上清液经吸附柱进行分离，经过洗涤和洗脱后，将反应液A加入洗脱液进行37℃～50℃保温，保温后产物与反应液B混匀进行PCR扩增，PCR反应结果通过实时荧光定量PCR仪或数字PCR仪进行分析，本发明在解决传统RNA易降解的难题的同时将传统上对RNA样本处理到PCR分析的时间从大于8小时减少至3小时。

Description

一种用于生物样本中RNA的基因检测方法
技术领域
本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种用于生物样本中RNA的基因检测方法。
背景技术
RNA是遗传信息的载体，通常以单链线性形式存在，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达。mRNA一直是分子生物学的重要环节，现有的mRNA定量研究的方法有：Northernbolt、原位杂交、RT-PCR。目前Northern bolt 的方法定量较为准确，但要求样品含有较多RNA，对于一些难得的样本和低丰度的样品的mRNA检测上难以应用。RT-PCR是将目的mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，RT-PCR借助实时荧光定量PCR仪实现高灵敏、高特异定量检测mRNA。RT-PCR技术在医学领域一直得到广泛的应用，RT-PCR是以样本RNA为模板，利用随机引物或特异性引物在逆转录酶的作用下将RNA转录为cDNA，而合成的cDNA作为下一步PCR扩增的模板。
RT-PCR技术在最基因表达上应用比较成熟，但在样本的RNA提取和纯化上存在步骤繁琐、RNA易降解的难题，同时在PCR扩增时对样本量和纯度有着较大的要求，在医学检测时难以得到有效的推广。
发明内容
为了解决快速对生物组织及体液细胞的RNA检测问题，本发明提供了一种用于生物样本中RNA的基因检测方法。本发明目的是通过以下技术方案来实现对生物组织及体液细胞的RNA荧光定量检测：
样本处理：
组织样本处理：取一定量的组织样本(0.01g～0.5g)可在液氮或冰上碾磨器皿中进行碾磨破碎，碾磨时加入0.5～2ml的样本处理液。碾磨后的混合样转移至5ml、10ml或50ml的离心管中，加入0.5ml氯仿，等体积的水饱和酚，充分混匀后50℃～70℃消化5～20分钟。上下颠倒充分混匀，12000rpm离心3～5分钟；
生物体液样本处理：取含有靶基因的体液0.5～2ml，加入0.5ml样本处理液，漩涡震荡1～2分钟，加入0.3ml氯仿，1ml水饱和酚充分混匀后50℃～70℃消化5～20分钟。上下颠倒充分混匀，12000rpm离心3～5分钟。
核酸富集洗脱：
取上清液转移至核酸吸附柱，12000rpm离心1分钟，弃流出液，加入漂洗液0.6ml，室温静置0.5～1分钟，12000rpm离心30秒，弃流出液，吸附管空置离心30秒；
逆转录：
吸附柱转移至新的1.5ml离心管中，加洗脱液50μl，室温静置5分钟， 12000rpm离心1分钟，弃吸附柱，加入5μl反应液A，42℃温浴10分钟；
实时荧光定量PCR分析：
取逆转录后的反应液20μl加入PCR管中，加入10μl反应液后吹打混匀，PCR板微离心后进行实时荧光定量PCR扩增，PCR反应程序如下：94℃5 分钟；94℃15秒，65℃35秒(35个循环)；PCR反应程序中收集荧光信号在65℃时。
具体实施方式
具体实施案例：
优选的样本处理液1组分如下：PH6.4 1mmol/L的乙磺酸，1mmol的乙酸钠，5mol/L的异硫氰酸胍；PH8.0 0.05mol/L的EDTA，0.01mg/ml的蛋白酶 K，1％的NP-40，3％的Triton X-100，100mmol/L的DTT。
优选的样本处理液2组分如下：PH6.0 100mmol/L的Tris-HCl，6mol/L的盐酸胍，PH8.00.05mol/L的EDTA，0.01mg/ml的蛋白酶K，1％的NP-40，3％的Triton X-100。
优选的样本处理液3组分如下：PH6.4 1mmol/L的乙磺酸，1mmol的乙酸钠，4mol/L的异硫氰酸胍，0.01mg/ml的蛋白酶K，3％的Triton X-100，2％的NP-40。
优选的样本处理液4组分如下：PH6.5 50mmol/L的Tris-HCl，1mmol的乙酸钠，6mol/L的异硫氰酸胍，0.01mg/ml的蛋白酶K，3％的Triton X-100， 2％的NP-40。
优选的样本处理液5组分如下：PH6.0 50mmol/L的Tris-HCl，1mmol的乙酸钠，6mol/L的异硫氰酸胍，0.01mg/ml的蛋白酶K，10％的β-巯基乙醇， 1％的Triton X-100，2％的NP-40。
优选的样本处理液6组分如下：PH6.0 50mmol/L的MES，1mmol的乙酸钠，6mol/L的盐酸胍，0.01mg/ml的蛋白酶K，0.05mol/L的EDTA，5％的β- 巯基乙醇，1％的Triton X-100，1％的NP-40。
优选的洗涤液1组分如下：50mmol/L NaCl，2mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/LKH2PO4，0.1mg/ml～5mg/ml皂土，70～80％无水乙醇。
优选的洗涤液2组分如下：100mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L Na2HPO4，5mmol/LKH2PO4，0.1％Tween-20，70～80％无水乙醇。
优选的洗涤液3组分如下：100mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L Na2HPO4，5mmol/LKH2PO4，2mmol/L 2-巯基乙醇，70～80％无水乙醇。
优选的洗脱液1组分如下：pH8.0 50mmol/L的Tris-HCl，50mmol/L KCl， 50mmol/LNaCl，10mmol/L MgCl2，5％甲酰胺，0.5μg特异性寡核苷酸引物。
优选的洗脱液2组分如下：pH8.5 50mmol/L的HEPES，50mmol/L NaCl， 50mmol/L KCl，10mmol/L MgCl2，5％甲酰胺，0.5μg特异性寡核苷酸引物。
优选的洗脱液3组分如下：pH8.5 50mmol/L的Tris-HCl，1mmol/L的 EDTA-Na2，50mmol/L KCl，50mmol/L NaCl，8mmol/L MgCl2，0.5μg特异性寡核苷酸引物，0.05mg/ml皂土。
优选的洗脱液4组分如下：pH8.0 50mmol/L的Tris-HCl，50mmol/L KCl， 50mmol/LNaCl，10mmol/L MgCl2，5％甲酰胺，1％的2-巯基乙醇，0.5μg特异性寡核苷酸引物HDY。
优选的洗脱液5组分如下：pH8.8 50mM的Tris-HCl，1mmol/L的 EDTA-Na2，80mmol/LNaCl，4％甲酰胺，0.5mM dNTP，0.1mg/ml皂土。
优选的反应液A1组分如下：5U/μl逆转录酶MMLV，pH8.0 50mmol/L的 Tris-HCl，25％甘油。
优选的反应液A2组分如下：5U/μl逆转录酶MMLV，1U/μl RNasin，pH8.0 50mmol/L的Tris-HCl，25％甘油。
优选的反应液B1组分如下：50mmol/L的Tris-HCl pH8.0，50mmol/L KCl， 0.25μmol/LhT1-F，hT1-R，0.2U/μl Taq DNA聚合酶，0.5mmol/L dNTP，1× SYBR，1mg/ml BSA，20％甘油。
优选的反应液B2组分如下：50mmol/L的Tris-HCl pH8.5，20mmol/L KCl， 25mmol/LNaCl，0.25μmol/L hT1-F，hT1-R，0.25U/μl Taq DNA聚合酶， 0.5mmol/L dNTP，1×SYBR，1mg/ml BSA，0.01mmol/L EDTA-Na2，0.05％ Tween 20，15％甘油。
优选的反应液B3组分如下：50mmol/L的Tris-HCl pH8.8，20mmol/L KCl， 0.2μmol/LhT2-F，hT2-R，0.5U/μl Taq DNA聚合酶，0.5mmol/L dNTP，1× SYBR，1mg/ml BSA，0.01mmol/L EDTA-Na2，0.1％Tween 20，20mmol/L MgSO4，160mmol/L(NH4)2HSO4，15％甘油。
优选的反应液B4组分如下：50mmol/L的Tris-HCl pH8.8，50mmol/L KCl， 0.2μmol/LhT2-F，hT2-R，0.5U/μl Taq DNA聚合酶，0.5mmol/L dNTP，1× SYBR，0.01mg/ml BSA，0.01mmol/L EDTA-Na2，160mmol/L(NH4)2HSO4，15％甘油。
优选的反应液B4组分如下：50mmol/L的Tris-HCl pH8.8，50mmol/L KCl，0.2μmol/LhT2-F，hT2-R，0.5U/μl Taq DNA聚合酶，0.5mmol/L dNTP，hTP， 0.01mg/ml BSA，0.01mmol/L EDTA-Na2，160mmol/L(NH4)2HSO4，15％甘油。
对人类端粒酶逆转录酶TERT基因检测，但本发明的使用保护范围不仅限于此；用于检测TERA mRNA的引物：
实施案例1：对人肺癌A549细胞的TERT mRNA基因进行检测。
样本处理：培养后浓度为106Cell/ml的A549细胞经过PBS洗涤，3000rpm 离心5分钟，弃上清。用0.3ml的样本处理液重悬A549细胞，漩涡震荡2～3 分钟，使用样本处理液作为稀释液将重悬处理后的细胞液进行10倍梯度稀释至102Cell/ml。稀释后的样本加入1ml水饱和酚，漩涡震荡1分钟，60℃温浴 10分钟，加入300μl氯仿，上下颠倒充分混匀，以12000rpm离心3分钟。
阴性对照设置：
核酸富集洗脱：取上清液转移至核酸吸附柱，12000rpm离心1分钟，弃流出液，加入漂洗液0.6ml，12000rpm离心30秒，弃流出液，再次加入漂洗液0.5ml，12000rpm离心1分钟；将吸附柱转移至新1.5ml离心管中，加入约50μl洗脱液，室温静置3分钟，12000rpm离心1分钟。
逆转录：取5μl反应液A加入洗脱后的样本中，混匀，短暂离心后42℃保温5～10分钟。
实时荧光定量PCR分析：取逆转录反应液20μl转移至PCR管中，加入 10μl反应液B，轻轻吹打混匀后在荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增程序为： 94℃5min；然后35个循环的94℃15s，65℃35s(荧光信号采集)
实施案例2：以探针替代SYBR Green染料，探针序列为：
样本处理：培养后浓度为106Cell/ml的A549细胞经过PBS洗涤，3000rpm 离心5分钟，弃上清。用0.3ml的样本处理液重悬A549细胞，漩涡震荡2～3 分钟，使用样本处理液作为稀释液将重悬处理后的细胞液进行10倍梯度稀释至102Cell/ml。稀释后的样本加入1ml水饱和酚，漩涡震荡1分钟，60℃温浴 10分钟，加入300μl氯仿，上下颠倒充分混匀，以12000rpm离心3分钟。
核酸富集洗脱：取上清液转移至核酸吸附柱，12000rpm离心1分钟，弃流出液，加入漂洗液0.6ml，12000rpm离心30秒，弃流出液，再次加入漂洗液0.5ml，12000rpm离心1分钟；将吸附柱转移至新1.5ml离心管中，加入约50μl洗脱液，室温静置3分钟，12000rpm离心1分钟。
逆转录：取5μl反应液A加入洗脱后的样本中，混匀，短暂离心后42℃保温5～10分钟。
实时荧光定量PCR分析：取逆转录反应液20μl转移至PCR管中，加入 10μl反应液B，反应液B中的SYBR Green被探针替代，轻轻吹打混匀后在荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增程序为：94℃5min；然后35个循环的94℃ 15s，65℃35s(荧光信号采集)
实施案例3：人肺部灌洗液TERT mRNA基因表达水平检测。
样本处理：取2名确诊肺癌患者肺部灌洗液各2ml，2名确诊非肺癌患者肺部灌洗液各2ml，4000rpm离心3分钟，弃上清液，加300μl样本处理液重悬沉淀后漩涡震荡1～2分钟，加2ml水饱和酚，漩涡震荡后60℃水浴温浴10 分钟；加0.5ml的氯仿，上下颠倒充分混匀，取2ml混合液移至2ml离心管中，12000rpm离心2分钟。
核酸富集洗脱：取上清液转移至核酸吸附柱，12000rpm离心1分钟，弃流出液，加入漂洗液0.6ml，12000rpm离心30秒，弃流出液，再次加入漂洗液0.5ml，12000rpm离心1分钟；将吸附柱转移至新1.5ml离心管中，加入约50μl洗脱液，室温静置3分钟，12000rpm离心1分钟。
逆转录：取5μl反应液A加入洗脱后的样本中，混匀，短暂离心后42℃保温5～10分钟。
实时荧光定量PCR分析：取逆转录反应液20μl转移至PCR管中，加入 10μl反应液B，轻轻吹打混匀后在荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增程序为： 94℃5min；然后35个循环的94℃15s，65℃35s(荧光信号采集)
实施案例4：人肺部灌洗液TERT mRNA基因表达水平检测(Taqman)。
样本处理：取收集液2ml，4000rpm离心3分钟，弃上清液，加400μl样本处理液重悬沉淀后漩涡震荡1～2分钟，加2ml水饱和酚，漩涡震荡后60℃水浴温浴10分钟；加0.5ml的氯仿，上下颠倒充分混匀，取2ml混合液移至 2ml离心管中，12000rpm离心2分钟。
核酸富集洗脱：取上清液转移至核酸吸附柱，12000rpm离心1分钟，弃流出液，加入漂洗液0.6ml，12000rpm离心30秒，弃流出液，再次加入漂洗液0.5ml，12000rpm离心1分钟；将吸附柱转移至新1.5ml离心管中，加入约50μl洗脱液，室温静置3分钟，12000rpm离心1分钟。
逆转录：取5μl反应液A加入洗脱后的样本中，混匀，短暂离心后42℃保温5～10分钟。
实时荧光定量PCR分析：取逆转录反应液20μl转移至PCR管中，加入 10μl反应液B(含taqman探针)，轻轻吹打混匀后在荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增程序为：94℃
备选的特异性引物如下：
Products on intended target Homo sapiens telomerase reverse transcriptase(TERT),mRNA
特异性寡核苷酸引物：
Primer1：5’-CGGTTGAAGGTGAGAC-3’或Oligo(dT)；
Primer2：5’-FAM-AACGCAGGAGCAGCCCGTCCCGCCG-3’BHQ1
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，采用4步法进行RT-PCR检测方法，所述方法包括：
S1：设计与目标基因互补匹配的特异性寡核苷酸单链引物、一对特异性引物及探针；
S2：取待测样本，加入样本处理液后进行剧烈震荡1～2min，再加入0.5～2倍样本体积的水饱和酚，剧烈震荡1～2min，混合样本在50℃～70℃中保温5～20min；
S3：保温后的混合样≥12000rpm离心1～5min，取上清加入核酸吸附柱；
S4：≥12000rpm离心1～2min，弃流出液，加入300～800μl漂洗液漂洗，室温静置1～2min，≥12000rpm离心1～2min，弃流出液，漂洗1～2次；
S5：加洗脱液30～50μl，吸附柱在50～70℃下温浴3～10min；
S6：将吸附柱转移到新的1.5ml或2ml离心管中，12000rpm离心1～2min，收集流出液；
S7：步骤(6)离心管中加入5μl反应液A，42℃温浴10min；
S8：步骤(7)离心管中加入20μl反应液B，进行实时荧光定量PCR扩增分析或PCR产物进行电泳分析。
2.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述样本处理液中组分如下：1mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，20mmol/L～100mmol/L NaCl，20mmol/L～100mmol/L KCl，0.1mmol/L～10mmol/L Tris-HCl，3mol/L～7mol/L GuHCl或3～6mol/L异硫氰酸胍，0.01％～1％Triton X-100，1μg/ml～0.1mg/ml蛋白酶K，0.1mg/ml～10mg/ml皂土。
3.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述漂洗液：100mmol/L～300mmol/L NaCl，1～5mmol/L KCl，1～20mmol/LNa2HPO4，1～5mmol/LKH2PO4，1mmol/L 2-巯基乙醇，0.1mg/ml～5mg/ml皂土，70～80％无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述洗脱液组成如下:10mmol/L～50mmol/L PH8.0 Tris-HCl，10mmol/L～50mmol/L KCl，200mMNaCl，1～10mM MgCl2，10mM2-ME，0.4mM dNTP，10％甲酰胺，1～6％RNAsecure。
5.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述反应液A组分如下：50mmol/L PH8.0Tris-HCl，0.5μg OligodT或特异性寡核苷酸引物，2U/μl M-MuLV逆转录酶，1U/μl RNasin，50mM DTT，0.4mM dNTP，0.1‰NP-40，200mM NaCl，20％甘油。
6.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述反应液B组分如下：50mM pH8.0 Tris-HCl，75mM KCl，25％甘油，0.2μM PCR上下游引物，0.5U/μl Taq DNA聚合酶，0.4mM dNTP，2％～10％甲酰胺，1×SYBR或0.2μM探针，0.01mMEDTA-Na2，1μg/ml BSA，0.05％Triton X-100。
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