CN111793673A - 一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111793673A
CN111793673A CN202010539650.9A CN202010539650A CN111793673A CN 111793673 A CN111793673 A CN 111793673A CN 202010539650 A CN202010539650 A CN 202010539650A CN 111793673 A CN111793673 A CN 111793673A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
telomerase
cytochrome
chain
apoptosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010539650.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111793673B (zh
Inventor
宋春元
董晨
张晶晶
汪联辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University of Posts and Telecommunications
Original Assignee
Nanjing University of Posts and Telecommunications
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing University of Posts and Telecommunications filed Critical Nanjing University of Posts and Telecommunications
Priority to CN202010539650.9A priority Critical patent/CN111793673B/zh
Publication of CN111793673A publication Critical patent/CN111793673A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111793673B publication Critical patent/CN111793673B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用，所述荧光探针包括具有三个探针结合臂的DNA四面体核酸框架纳米结构、Cy3修饰的DNA单链作为定位探针、细胞色素c探针和端粒酶探针，所述定位探针、细胞色素c探针、端粒酶探针与DNA四面体核酸框架纳米结构的三个探针结合臂通过核酸互补杂交结合，所述细胞色素c探针包含细胞色素c适配体链和细胞色素c捕获链的杂交双链，所述端粒酶探针包含端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链的杂交双链。本发明所述DNA四面体核酸框架型细胞凋亡全程监控荧光探具有灵敏度性高、稳定性好、选择性强、低毒性的特点，在细胞凋亡监控和药物评价筛选等方面表现出很好地应用性能。

Description

一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
含有金属蛋白的细胞色素c位于线粒体膜间隙，在病理条件下释放到血液中。线粒体释放细胞色素c是激活细胞死亡途径的关键主动步骤，通常认为细胞色素c外泄是细胞凋亡的早期事件，同时表明细胞凋亡的开始，因此细胞色素c的检测对于细胞早期凋亡监控具有重要意义。端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶，负责维持细胞端粒长度。在细胞凋亡晚期，随着核膜的破碎，端粒酶从细胞核向外释放，因而可以作为一种细胞晚期标志物。此外，端粒酶在几乎所有恶性肿瘤细胞中均有表达，已成为一种很有前途的生物标志物。因此，准确和有效地实现端粒酶原位成像是非常必要的医学诊断。目前还没有一种探针能够实现细胞早期和晚期标志物的联合检测。为了实现细胞凋亡全过程的监控，有必要实现对细胞色素c和端粒酶的实时、原位检测。
目前有很多方法分别用于细胞色素c或端粒酶检测，比如电化学法、拉曼光谱法和荧光光谱法等。在这些已发展的方法中，荧光法具有高灵敏度、简单并且仪器成本低等特点，使得基于荧光的方法在应用前景方面展现出明显优势。然而，目前的方法只能用于细胞色素c或端粒酶中的单一标志物检测，未见用于二者同时检测探针的报道，因而就难以实现细胞凋亡全过程的检测。除此之外，多标志物的联合检测也提高了检测的可靠性，保证检测的准确度。
DNA可根据碱基互补配对的原则进行自组装，空间结构具有较高的可控度和精密度，故易于组装成多种形态的DNA纳米材料，表现出许多独特的优点：(1)基于DNA组成的纳米材料易穿透带负电的细胞膜；(2)相较于其它纳米材料普遍具有细胞毒性的问题，DNA纳米材料几乎没有细胞毒性；(3)该类材料能较好地抵抗核酶作用，具有高稳定性；(4)该类材料功能化修饰位点丰富，可根据不同需要修饰生物分子或荧光染料等。目前，以DNA为基础元件的DNA纳米技术备受关注。不同于复杂的DNA多面体结构，功能化的DNA四面体纳米材料自组装简单、成本低廉，是最理想的生物载体之一。
发明内容
发明目的：本发明基于DNA四面体结合多个双链探针构建得到了细胞色素c和端粒酶双元检测探针，实现了细胞凋亡全过程的监控，并基于此可以对凋亡药物进行效果评估与筛选，具有广泛的应用前景。
本发明的荧光探针能够同时检测细胞色素c和端粒酶，所述方法包括：先利用六根DNA单链杂交得到DNA四面体核酸框架，同时将细胞色素c适配体与细胞色素c捕获链杂交获得细胞色素c探针；将端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链杂交获得端粒酶探针。上述制备完成后，将DNA四面体核酸框架、细胞色素c探针、端粒酶探针与定位探针等量混匀杂交，构建得到具有FAM、Cy3和Cy5三信号发射的细胞凋亡荧光探针，可实现对细胞色素c和端粒酶的同时检测。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种用于细胞凋亡监控的荧光探针的制备方法。本发明先利用六根DNA单链杂交得到DNA四面体核酸框架，同时将细胞色素c适配体与细胞色素c捕获链杂交获得细胞色素c探针；将端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链杂交获得端粒酶探针。上述制备完成后，将DNA四面体核酸框架、细胞色素c探针、端粒酶探针与定位探针等量混匀杂交，构建得到具有FAM、Cy3和Cy5三信号发射的细胞凋亡荧光探针，可实现对细胞色素c和端粒酶的同时检测。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针在细胞凋亡全过程监控中的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针在药效评价和药物筛选中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于细胞凋亡监控的荧光探针，所述荧光探针包括具有三个探针结合臂的DNA四面体核酸框架纳米结构、Cy3修饰的DNA单链作为定位探针、细胞色素c探针和端粒酶探针，所述定位探针、细胞色素c探针、端粒酶探针与DNA四面体核酸框架纳米结构的三个探针结合臂通过核酸互补杂交结合，所述细胞色素c探针包含细胞色素c适配体链和细胞色素c捕获链的杂交双链，所述端粒酶探针包含端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链的杂交双链。
其中，所述具有三个探针结合臂的DNA四面体核酸框架纳米结构是由六条核苷酸单链通过相互之间的碱基互补配对杂交而形成，三个探针结合臂位于四面体结构中的三条棱的中间，六条核苷酸单链的碱基序列分别如下：
ssDNA A：
Figure BDA0002536723600000031
ssDNA B：
Figure BDA0002536723600000032
ssDNA C：
Figure BDA0002536723600000033
ssDNA D：
Figure BDA0002536723600000034
ssDNA E：
Figure BDA0002536723600000035
ssDNA F：
Figure BDA0002536723600000036
其中，所述定位探针的核苷酸碱基序列如下：
Figure BDA0002536723600000037
其中，所述细胞色素c适配体链和细胞色素c捕获链的核苷酸碱基序列如下：
细胞色素c适配体链：
Figure BDA0002536723600000038
细胞色素c捕获链：
Figure BDA0002536723600000039
其中，所述端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链的杂交双链的核苷酸碱基序列如下：
端粒酶捕获链：
Figure BDA00025367236000000310
Figure BDA00025367236000000311
端粒酶模板链：
Figure BDA00025367236000000312
端粒酶染料链：
Figure BDA00025367236000000313
本发明内容还包括所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
1)构建DNA四面体核酸框架纳米结构：将等量的ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C、ssDNAD、ssDNA E、ssDNA F混合于PBS缓冲液中退火、冷却，获得DNA四面体核酸框架结构；
2)构建细胞色素c探针：将等量的细胞色素c捕获链和细胞色素c适配体混合于PBS缓冲液中、退火并冷却；
3)构建端粒酶探针：将等量的端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链混合于PBS缓冲液、退火，最后冷却；
4)将上述DNA四面体核酸框架结构、细胞色素c探针、端粒酶探针与定位探针混匀，进行孵育反应，形成细胞色素c与端粒酶双元检测探针即用于细胞凋亡监控的荧光探针。
其中，所述步骤1)、2)和3)中，PBS缓冲液为2×PBS缓冲液，所述2×PBS即磷酸盐缓冲液的浓度优选为20mM，pH优选为7.4。
其中，所述步骤1)、2)和3)中，退火反应条件具体为：95℃10min。
其中，所述步骤1)、2)和3)中，冷却反应条件具体为：37℃，反应1小时。
本发明内容还包括所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针在细胞色素c检测、端粒酶活性检测或细胞凋亡全过程监控中的应用。
本发明内容还包括所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针在药效评价和药物筛选中的应用。
本发明内容还包括所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针在肿瘤治疗药物筛选过程中的应用。
本发明还所述基于DNA四面体核酸框架构建的细胞凋亡全程监控荧光探针在检测细胞色素c中的应用，所述细胞色素c检测具体步骤为：
细胞色素c检测：取5μL 1μM上述步骤制备得到的细胞凋亡探针用1×PBS缓冲液稀释到90μL，加入10μL不同浓度的细胞色素c，然后以激发波长为640nm测量溶液的荧光强度。随着加入浓度的增加，Cy5的红色荧光强度不断增强，细胞色素c浓度和Cy5荧光信号在20nM-2μM范围内呈现良好线性，检测限为85.93nM，可用于细胞色素c的高效检测。
其中，所述1×PBS缓冲液的浓度优选为10mM，pH优选为7.4。
本发明还提供了所述基于DNA四面体核酸框架构建的细胞凋亡全程监控荧光探针在检测端粒酶活性中的应用，所述端粒酶检测具体步骤为：
端粒酶活性检测：取5μL 1μM上述步骤制备得到的细胞凋亡探针用1×PBS缓冲液稀释到90μL，加入10μL不同浓度的端粒酶(HeLa细胞裂解液)，然后以激发波长为494nm测量溶液的荧光强度。随着加入浓度的增加，FAM的绿色荧光强度不断增强，端粒酶浓度和FAM荧光信号在0.625-70cells/μL范围内展现良好线性，检测限为1.54cells/μL，可用于端粒酶的高灵敏检测。
其中，所述1×PBS缓冲液的浓度优选为10mM，pH优选为7.4。
本发明还提供了所述基于DNA四面体核酸框架构建的细胞凋亡全程监控荧光探针在监控细胞凋亡方面的应用，所述监控细胞凋亡步骤具体为：
细胞凋亡过程监控：向共聚焦皿中加入10000个HeLa细胞，生长过夜后细胞贴壁，用1×PBS冲洗三次，加入1ml 50nM溶于DMEM培养液孵育2小时后，再加入2μL 1mM的STS立即将共聚焦皿置于共聚焦荧光显微镜下，实时观察细胞内代表探针位置信号的Cy3、细胞色素c信号的Cy5信号和代表端粒酶信号的FAM信号。其中，Cy3信号使用559nm激光激发，Cy5信号使用635nm激光激发，FAM信号使用488nm激光激发。
本发明还提供了所述基于DNA四面体构建的细胞凋亡探针在药物评价和筛选方面的应用，所述药物评价和筛选步骤具体为：
药物评价和筛选：向共聚焦皿中加入10000个HeLa细胞，生长过夜后细胞贴壁，用1×PBS冲洗三次，加入1ml 50nM溶于DMEM培养液孵育2小时后，再加入终浓度为2μM的抗癌药物孵育2h后，将共聚焦皿置于共聚焦荧光显微镜下，观察细胞内代表细胞色素c信号的Cy5信号和代表端粒酶信号的FAM信号。同样的，Cy3信号使用559nm激光激发，Cy5信号使用635nm激光激发，FAM信号使用488nm激光激发。
其中，所述Cy3具有探针定位作用。
其中，所述Cy5或红色荧光具有细胞色素c监控作用，具有对细胞色素c特异性响应的特性。
其中，所述FAM或绿色荧光具有端粒酶监控作用，具有对端粒酶特异性响应的特性。
反应机理：本发明的六条DNA单链A、B、C、D、E、F通过简单的退火杂交得到一种多臂DNA四面体核酸框架。通过同样的方法，修饰了淬灭剂BHQ-2的细胞色素c捕获链(CC)可以与修饰有染料Cy5细胞色素c适配体(CA)杂交得到细胞色素c探针，Cy5荧光信号将被BHQ-2淬灭。类似的，修饰有淬灭剂BHQ-1的端粒酶捕获链(TC)、端粒酶模板链(TP)和带有染料FAM修饰的端粒酶染料链(TD)三者杂交得到端粒酶探针，靠近BHQ-1的FAM荧光将被淬灭。随后，将DNA四面体核酸框架、细胞色素c探针和端粒酶探针与荧光定位链(FT)共孵育，即可形成一种DNA四面体核酸框架型细胞凋亡全程监控荧光探针。荧光定位链(FT)上的Cy3能够对探针进行示踪，在细胞内准确定位探针位置。当细胞色素c存在时，细胞凋亡探针上的细胞色素c适配体(CA)会与细胞色素c结合从探针脱离，原本淬灭的染料Cy5得以恢复。当端粒酶存在时，端粒酶模板链(TP)能够在端粒酶的作用下延伸，并将端粒酶染料链(TD)置换下来，原本淬灭的染料FAM得以恢复。综上所述，DNA四面体核酸框架型细胞凋亡全程监控荧光探针能够对细胞色素c和端粒酶实现联合检测，并基于此实现细胞凋亡监控与药物评价筛选。
本发明所述DNA四面体核酸框架型细胞凋亡全程监控荧光探针具有选择性好、多物质同时检测的优点，当溶液中存在细胞色素c时，细胞色素c适配体将与细胞色素c结合从细胞色素c捕获链上解离下来，细胞色素c适配体上的Cy5与细胞色素c捕获链上的BHQ-2距离拉远，实现红色荧光信号恢复。随着细胞色素c浓度的增加，Cy5荧光发射强度逐渐增强；类似的，当溶液中存在端粒酶，端粒酶模板链在端粒酶的作用下延伸将端粒酶染料链从端粒酶捕获链上置换下来，因而端粒酶染料链上的FAM与端粒酶捕获链上的BHQ-1远离，实现绿色荧光信号的恢复。随着端粒酶浓度的增加，FAM的荧光发射强度逐渐增强。当探针进入细胞后，能够观察到细胞中存在明亮的探针定位信号，随后外加细胞凋亡诱导剂STS，凋亡早期伴随着细胞色素c从线粒体外泄，能够先观察到细胞色素c所对应的红色荧光信号，随着时间的推移，属于端粒酶的细胞凋亡晚期绿色荧光信号也逐渐增强。通过这两种标志物的荧光信号，实现了细胞凋亡全过程的监控。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优势：本发明首先合成了带有三个捕获段的DNA四面体核酸框架、具有细胞色素c响应能力的细胞色素c探针、具有端粒酶响应能力的端粒酶探针和具有定位能力的荧光定位探针，然后利用碱基互补配对的方式将三部分活性组分连接到DNA四面体核酸框架上，构建一种新型细胞凋亡监控荧光探针。此探针具有Cy3、Cy5和FAM三荧光信号，可在细胞内精准定位探针位置，能够实现对细胞色素c和端粒酶定量分析，实现二者的同时检测，并基于此实现细胞凋亡全过程的监控，此外根据细胞凋亡情况可以对肿瘤治疗药物疗效进行评估。本发明所述细胞凋亡荧光探针具有灵敏度性高、稳定性好、选择性强、低毒性等优点。
附图说明
图1为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针的工作原理图；
图2为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针的PAGE凝胶电泳表征构建及其工作机制；
图3为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针对细胞色素c和端粒酶的工作曲线；
图4为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针特异性表征；
图5为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针稳定性表征；
图6为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针与普通双链探针抗酶降解能力对比；
图7为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针细胞凋亡实时原位荧光成像；
图8为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针对不同浓度STS诱导的细胞凋亡荧光成像；
图9为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针对多种药物诱导的细胞凋亡荧光成像；
图10为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针对不同浓度EGCG诱导的细胞凋亡荧光成像；
图11为本发明用于细胞凋亡监控的荧光探针对光热引发的细胞凋亡荧光成像。
具体实施方式
如前所述，细胞凋亡对生物体的生长、发育、衰老具有重要的意义。然而，发明人发现，大部分细胞凋亡探针只能够对一种细胞凋亡标志物进行检测、成像，单一的标志物对于细胞凋亡情况具有一定的局限性，目前仍缺乏一种探针能够实现对细胞凋亡全过程的监控。
有鉴于此，本发明开发了一种用于细胞凋亡监控的荧光探针，探针由6条DNA单链构建并具有三条捕获链，三个捕获链连接细胞色素c探针、端粒酶探针和荧光定位链。该荧光探针本身的荧光是被淬灭的，存在细胞色素c才能恢复Cy5的荧光信号，存在端粒酶才能恢复FAM的荧光信号，能够基于这两种分别对应于细胞凋亡早期和晚期的标志物的联合检测实现细胞凋亡过程的监控并筛选肿瘤治疗药物。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。本发明所用的DNA序列及探针序列如下：
ssDNA A：
Figure BDA0002536723600000081
ssDNA B：
Figure BDA0002536723600000082
Figure BDA0002536723600000083
ssDNA C：
Figure BDA0002536723600000084
Figure BDA0002536723600000085
ssDNA D：
Figure BDA0002536723600000086
Figure BDA0002536723600000087
ssDNA E：
Figure BDA0002536723600000088
ssDNA F：
Figure BDA0002536723600000089
Figure BDA00025367236000000810
端粒酶捕获链：
Figure BDA00025367236000000811
端粒酶模板链：
Figure BDA00025367236000000812
端粒酶染料链：
Figure BDA00025367236000000813
细胞色素c适配体链：
Figure BDA00025367236000000814
细胞色素c捕获链：
Figure BDA00025367236000000815
荧光定位链：
Figure BDA00025367236000000816
以上DNA链均由Takara Biotechnology(Dalian，China)宝日医生物技术有限公司合成。
DMSO：南京凯基生物有限公司；
STS：购买于J&K Chemical Ltd.(Shanghai，China)强生化学有限公司；
DOX、MTX、PTX：购买于北京华丰科技有限公司；
EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯，购买于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
实施例1
一种DNA四面体核酸框架型细胞凋亡全程监控荧光探针的制备过程如下：
S1、DNA四面体核酸框架的制备：
将等量的ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C、ssDNA D、ssDNA E、ssDNAF混合于2×PBS缓冲液中、95℃10min退火，然后37℃冷却1h获得所述的DNA四面体核酸框架结构。
S2、双链探针制备：
1)细胞色素c探针：将等量的细胞色素c捕获链和细胞色素c适配体混合于2×PBS缓冲液中、95℃10min退火，最后37℃冷却1h。
2)端粒酶探针：将等量的端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链混合于2×PBS缓冲液、95℃10min退火，最后37℃冷却1h。
S3、细胞凋亡探针组装：
将步骤S1和步骤S2中制备的等量的DNA四面体核酸框架、细胞色素c探针、端粒酶探针和荧光定位探针四部分混合于2×PBS缓冲液，37℃恒温孵育2h，四部分组装到一起探针即制备完成。
实施例2 DNA四面体核酸框架组装过程及其反应机理表征
DNA四面体的工作原理如图1所示，为了验证机理的正确性使用PAGE胶进行凝胶电泳实验，取5μLDNA样品与1μL的6×DNA loading buffer混匀，80V电压下运行85min后成像。PAGE凝胶电泳表征DNA四面体核酸框架型细胞凋亡全程监控荧光探针构建及其工作机制。
除了上述DNA链外，还使用了两条DNA四面体核酸框架的延伸链，用于模拟探针结合，其序列如下：
ssDNA C延伸端：
Figure BDA0002536723600000091
ssDNA E延伸端：
Figure BDA0002536723600000092
首先对DNA四面体核酸框架的形成使用5％PAGE表征。如图2A所示，1-6号泳道的不同条带分别对应于6条组装DNA四面体的DNA单链。第7-11泳道显示的电泳条带分别是两条(A B)、三条(A B C)、四条(A B C D)、五条(A B C D E)和六条(A B C D E F)DNA单链杂交的产物。随着杂交DNA链数量的增加，杂交产物的主要条带迁移率逐渐降低，这表明ssDNA之间的能够实现特异性杂交，并且DNA四面体核酸框架的产率较高。
图2B是10％PAGE胶分析细胞色素c探针形成和其与细胞色素c分子识别的电泳结果。1-3号泳道分别是ssDNA E延伸端、细胞色素c捕获链和细胞色素c适配体链的电泳条带。泳道4：ssDNA E延伸端和细胞色素c适配体链的杂交结果；泳道5：ssDNA E延伸端和细胞色素c捕获链的杂交结果；泳道6：细胞色素c捕获链和细胞色素c适配体链的杂交结果；泳道7：ssDNA E延伸端、细胞色素c捕获链和细胞色素c适配体链的杂交结果；泳道8：泳道7的杂交产物与细胞色素c共孵育。ssDNA E延伸端可以有效的与细胞色素c捕获链(5号泳道)杂交，而不与细胞色素c适配体链(4号泳道)结合，并且泳道6中的单一条带证实了细胞色素c捕获链和细胞色素c适配体链具有良好的杂交效果。泳道7表明，通过ssDNA E延伸端、细胞色素c捕获链和细胞色素c适配体链的杂交，细胞色素c探针产率很高。在泳道8中细胞色素c探针与细胞色素c共孵育得到了和条带5相同位置的一个新条带，这表明细胞色素c探针成功地通过细胞色素c适配体链识别了细胞色素c分子，并释放了ssDNA E延伸端与细胞色素c捕获链的杂交双链。这些结果证实了细胞色素c探针对传感细胞色素c是可行的。
同样的，图2C显示了端粒酶探针的形成特征，并通过10％的PAGE分析进一步其识别端粒酶的过程。1-4号泳道分别为端粒酶捕获链、ssDNA C延伸端(C臂)、端粒酶引物链和端粒酶染料链的电泳条带。泳道5：C臂与端粒酶捕获链的杂交产物；泳道6：C臂、端粒酶捕获链和端粒酶引物链的杂交产物；泳道7：C臂、端粒酶捕获链、端粒酶引物链和端粒酶染料链的杂交产物；泳道8：泳道7的杂交产物与端粒酶，dNTP共孵育的结果；泳道9：泳道7的杂交产物与灭活端粒酶，dNTP共孵育的结果；泳道10：端粒酶染料链与端粒酶，dNTP共孵育的结果。由于端粒酶染料链只有6个DNA碱基，所以该条带不是很清楚(4号泳道)。通过在C臂中依次加入端粒酶捕获链、端粒酶引物链和端粒酶染料链，结果如5-7条带所示，条带迁移逐渐减少，这证明了端粒酶探针的形成具有较高的产率。第8和第9条带分别是端粒酶探针与活性端粒酶(HeLa细胞中新鲜提取)和灭活端粒酶(退火处理端粒酶)混合的电泳条。条带8的变化证明了端粒酶探针可以有效地识别活性端粒酶，并启动端粒酶引物链序列的延伸，相较于条带7、9出现的新条带对应于10号泳道中端粒酶染料链的延伸条带，这意味着端粒酶染料链成功被置换了下来。
实施例3细胞凋亡探针检测细胞凋亡标志物
向实施例1构建好的细胞凋亡探针中，加入终浓度为0、20、50、100、200、500、1000、2000nM的细胞色素c或0、0.625、2.5、5、12.5、25、37.5、50、62.5、70cells/μL的端粒酶，探针终浓度为50nM，37℃孵育两个小时后，使用荧光光谱仪测试其荧光强度，其中FAM激发光为495nm，Cy5激发光为640nm。图3B、D分别取图3A、C中660nm和520nm处荧光强度作图。
图3A中，对细胞色素c浓度依赖的Cy5的荧光发射谱线会随着细胞色素c浓度的增加而增强。图3B是Cy5的荧光强度(660nm)随着细胞色素c浓度变化的线性函数，即ICyt c＝0.07CCyt c+52.61，R2＝0.998，LOD＝85.93nm，线性范围为20nm～2000nm。图3C和3D中，细胞凋亡探针检测端粒酶显示出了相似的特性，线性校准曲线为ITS＝2.86CTS+16.85(R2＝0.995，LOD＝1.54cells/μL)，线性范围为0.625cells/μL～62.5cells/μL。细胞凋亡探针对细胞色素c和端粒酶活性检测的效果与先前报道的单独检测单个细胞色素c或端粒酶激活的策略相当。
实施例4细胞凋亡探针特异性与稳定性
向实施例1制备好的细胞凋亡探针中加入终浓度为2μM细胞色素c或70cells/μL的端粒酶作为实验组，同样的，向细胞凋亡探针中加入终浓度为200μM的抗坏血酸(AA)、牛血清白蛋白(BSA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、甲胎蛋白(AFP)、免疫球蛋白G(IgG)、谷胱甘肽(GSH)和癌胚抗原(CEA)作为对照组，图4A是上述所有组别中得到的Cy5的荧光光谱，B是所有组别中测得的FAM的荧光光谱，C为相应的荧光峰值统计。对照组均没有出现荧光恢复现象，表明所提出细胞凋亡探针具有良好的特异性，在使用环境中可能存在生物分子对实验均没有干扰。
将新鲜制备好的细胞凋亡探针置于1×PBS、CHAPS裂解缓冲液、DMEM和RPMI-1640每天测试其荧光恢复情况，同时在将放置7天的探针与2μM细胞色素c或70cells·μL-1端粒酶共孵育，比较其与新鲜制备探针检测结果的差异。图5中Cy5和FAM的荧光图谱显示了细胞凋亡探针在不同介质中的稳定性表征。结果表明细胞凋亡探针在1×PBS、CHAPS裂解缓冲液、DMEM和RPMI-1640等多种常用介质中保存时，具有良好的稳定性，无非特异性荧光恢复。此外，还对检测细胞色素c和端粒酶的七天存储探针的重现性进行了研究，图5的插图表明，存储七天的探针仍具有良好的目标响应，能够检测到与新鲜探针相同的高重现性目标。
此外，考虑到探针在细胞中可能的酶降解，将细胞凋亡探针与细胞色素c活性单位、端粒酶活性单位置于相同的DNase I(5U/ml)环境下的对比他们的抗酶降解能力。DNaseI是一种常用的内切酶，可以消化单或双链DNA。如图6所示，与DNase I溶液中的细胞色素c活性单位和端粒酶活性单位相比，由于DNA双链的降解，显示出了与孵化时间相关的荧光恢复，组装在DNA四面体核算框架上的细胞色素c活性单位和端粒酶活性单位由于三维DNA纳米结构而表现出明显的抗降解能力。因此，所提出的细胞凋亡探针在复杂的环境介质中具有良好的特异性和稳定性。
实施例5细胞凋亡探针对STS引发的细胞凋亡过程监控
1、细胞培养
HeLa细胞在DMEM培养液(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)中培养，将培养瓶放置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，每1-2天换一次培养液，保证细胞生长良好。当细胞生长到密度约为瓶底80％时，用胰蛋白酶消化贴壁的HeLa细胞。
2、共聚焦成像
取对数生长期的HeLa强胞胰蛋白酶消化后，计数，细胞浓度为1×103个/ml，以1ml接种于共聚焦培养皿中，次日，先加入细胞凋亡探针孵育4h，随后加入凋亡诱导剂，进行共聚焦荧光测试，FAM荧光信号使用488nm激光激发；Cy3荧光信号使用559nm激光激发；Cy5荧光信号使用635nm激光激发。按照上述细胞实验中共聚焦成像的方法，对于原位实时可视化监测细胞凋亡，采用2μM stauroporine(STS，一种强有力的凋亡诱导剂，强生化学有限公司(上海)购买)诱导HeLa细胞凋亡，然后动态监测Cy3、Cy5和FAM荧光信号图像，分别用于定位探针、监控细胞色素c和端粒酶。随着孵育时间的增加，示踪剂的荧光信号几乎不变，而Cy5信号在15min后迅速增强，60min后达到饱和点(图7)。同时，FAM的荧光在90min内变化不大，随后信号增强直到120min达到相对稳定的状态。
在不同浓度(0.5-4μM)的STS处理HeLa 2h后，随着STS浓度的增加(如图8所示)，观察到增强的红色Cy5和绿色FAM荧光信号。这是由于STS在细胞凋亡过程中触发了细胞色素c和端粒酶的释放。这些结果表明，细胞凋亡探针具有对细胞内细胞色素c和端粒酶敏感和特异的反应能力。同时，随着STS浓度的增加，HeLa细胞的形态从拉伸/粘附状态转变为收缩状态。
实施例6细胞凋亡探针药物评估
抗肿瘤药物治疗被称为化疗，通过介导癌细胞凋亡来杀死癌细胞。因此，药物治疗肿瘤的疗效可以通过表征癌细胞在药物作用下的凋亡来评价。在此，五种相同浓度的化学物质，即DMSO、STS、DOX、MTX和PTX处理HeLa细胞，用细胞凋亡探针成像细胞凋亡。将细胞与细胞凋亡探针孵育4h后，将每种药物(2μM)加入到细胞中，然后进行额外的2h孵育，用荧光图像评价这些物质诱导的凋亡。如图9所示，与做药物处理的对照组相比，DMSO处理的细胞没有显示出清晰的信号，但STS给出了最高的荧光信号，表明DMSO几乎是无毒的，STS具有相对较高的诱导凋亡的功效，这与先前的报道是一致的。其他三种抗癌药物在孵育后DMSO和STS之间表现出不同程度的信号。对于DOX和MTX，它们本身所包含的荧光信号会影响探针信号的采集。有趣的是，因为细胞凋亡探针具有的双重检测能力，我们还可以实现治疗效果的评估。因此，设计的细胞凋亡探针为筛选活细胞中的凋亡诱导剂提供了可能。
与上述药物不同的是，EGCG被报道为端粒酶活性的有效抑制剂，它可以通过抑制细胞内端粒酶活性来诱导癌细胞株凋亡和杀伤细胞。图10在不同浓度的EGCG处理48h后，再与50nM细胞凋亡探针孵育2h，对HeLa细胞进行荧光图像。随着EGCG浓度从0增加到8μg/mL，FAM的细胞内荧光逐渐减弱，证实了EGCG对端粒酶活性的有效抑制作用，并根据增强的Cy5信号表明了细胞凋亡的发生。
除了上述常规化学药物外，本课题组先前报道的等离子体光热治疗药物金纳米星(AuNSs)也被提出的细胞凋亡探针评估(C.Song，F.Li，X.Guo，W.Chen，C.Dong，J.Zhang，J.Zhang and L.Wang，Journal of Materials Chemistry B，2019，7，2001-2008.)。根据先前文章的描述，将HeLa细胞与不同浓度(0.1、0.2、0.5和1mg/mL AuNSs)的AuNSs一起孵育。PBS冲洗三次后，对其中一组使用近红外光(785nm，390mW·cm-2，6min)照射。根据图11，AuNSs随着浓度的增加而表现出更大的细胞毒性，而与相同浓度的AuNSs相比，在近红外光处理下，细胞凋亡程度要显著得多，这与我们先前论文中的MTT表征有很好的一致性。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> ssDNA A(Artificial Sequence)
<400> 1
gtctgaggca gttgagagat ctcgaacatt ccatcgtacg atcatagatc aat 53
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> ssDNA B(Artificial Sequence)
<400> 2
taagtctgaa gatccattta tcaccagctg ctgcacgcca tagtagacgt atcacctgtc 60
c 61
<210> 3
<211> 114
<212> DNA
<213> ssDNA C(Artificial Sequence)
<400> 3
agctacttgc tacacgagga tcttcagact taggaatgtt cgagatcaca tgcgaggact 60
cggtccaata ccgtactaac gattacagat caaattctag acgttactta acat 114
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> ssDNA D(Artificial Sequence)
<400> 4
agctggtgat aaaacgtgta gcaagtagct ttgatctgta atcgactcta cgggaagagc 60
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> ssDNA E(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcccatcc ggctcactac tatggcgtgc agccataccg ccatttccaa cta 53
<210> 6
<211> 93
<212> DNA
<213> ssDNA F(Artificial Sequence)
<400> 6
cgagtcctcg catgactcaa ctgcctcaga cggacaggtg atacgagagc cggatgggca 60
tgctcttccc gtagagatag tacggtattg gac 93
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 荧光定位链(Artificial Sequence)
<400> 7
attgatctat gatcgtacga t 21
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 细胞色素c适配体链(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgtgtctgg ggccgaccgg cgcattgggt acgttgttgc 40
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 细胞色素c适配体链(Artificial Sequence)
<400> 9
gcaacaacgt ttagttggaa atggcggtat gg 32
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 端粒酶捕获链(Artificial Sequence)
<400> 10
aaccctaacc ctaactctgc tcgacggatt atgttaagta acgtctagaa t 51
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 端粒酶模板链(Artificial Sequence)
<400> 11
aatccgtcga gcagagtt 18
<210> 12
<211> 12
<212> DNA
<213> 端粒酶染料链(Artificial Sequence)
<400> 12
agggttaggg tt 12
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> ssDNA C延伸端(Artificial Sequence)
<400> 13
attctagacg ttacttaaca t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> ssDNA E延伸端(Artificial Sequence)
<400> 14
ccataccgcc atttccaact a 21

Claims (10)

1.一种用于细胞凋亡监控的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括具有三个探针结合臂的DNA四面体核酸框架纳米结构、Cy3修饰的DNA单链作为定位探针、细胞色素c探针和端粒酶探针，所述定位探针、细胞色素c探针、端粒酶探针与DNA四面体核酸框架纳米结构的三个探针结合臂通过核酸互补杂交结合，所述细胞色素c探针包含细胞色素c适配体链和细胞色素c捕获链的杂交双链，所述端粒酶探针包含端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链的杂交双链。
2.根据权利要求1所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针，其特征在于，所述具有三个探针结合臂的DNA四面体核酸框架纳米结构是由六条核苷酸单链通过相互之间的碱基互补配对杂交而形成，三个探针结合臂位于四面体结构中的三条棱的中间，六条核苷酸单链的碱基序列分别如下：
ssDNA A：
Figure FDA0002536723590000011
ssDNA B：
Figure FDA0002536723590000012
ssDNA C：
Figure FDA0002536723590000013
ssDNA D：
Figure FDA0002536723590000014
ssDNA E：
Figure FDA0002536723590000015
ssDNA F：
Figure FDA0002536723590000016
3.根据权利要求1所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针，其特征在于，所述定位探针的核苷酸碱基序列如下：
Figure FDA0002536723590000021
4.根据权利要求1所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针，其特征在于，所述细胞色素c适配体链和细胞色素c捕获链的核苷酸碱基序列如下：
细胞色素c适配体链：
Figure FDA0002536723590000022
细胞色素c捕获链：
Figure FDA0002536723590000023
5.根据权利要求1所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针，其特征在于，所述端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链的杂交双链的核苷酸碱基序列如下：
端粒酶捕获链：5’-BHQ1-AACCCTAACCCTAACTCTGCTCGACGGATTATGTTAAGTAACTCTAGAAT-3’
端粒酶模板链：5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’
端粒酶染料链：5’-AGGGTTAGGGTT-FAM-3’。
6.权利要求1～5任一项所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建DNA四面体核酸框架纳米结构：将等量的ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C、ssDNA D、ssDNA E、ssDNA F混合于PBS缓冲液中退火、冷却，获得DNA四面体核酸框架结构；
2)构建细胞色素c探针：将等量的细胞色素c捕获链和细胞色素c适配体混合于PBS缓冲液中、退火并冷却；
3)构建端粒酶探针：将等量的端粒酶捕获链、端粒酶模板链和端粒酶染料链混合于PBS缓冲液、退火，最后冷却；
4)将上述DNA四面体核酸框架结构、细胞色素c探针、端粒酶探针与定位探针混匀，进行孵育反应，形成细胞色素c与端粒酶双元检测探针即用于细胞凋亡监控的荧光探针。
7.根据权利要求6所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1)、2)和3)中，退火反应条件具体为：95℃ 10min。
8.根据权利要求6所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1)、2)、3)中，冷却反应条件具体为：37℃，反应1小时。
9.权利要求1～5任一项所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针在细胞色素c检测、端粒酶活性检测或细胞凋亡全过程监控中的应用。
10.权利要求1～5任一项所述的用于细胞凋亡监控的荧光探针在药效评价和药物筛选中的应用。
CN202010539650.9A 2020-06-12 2020-06-12 一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用 Active CN111793673B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010539650.9A CN111793673B (zh) 2020-06-12 2020-06-12 一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010539650.9A CN111793673B (zh) 2020-06-12 2020-06-12 一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111793673A true CN111793673A (zh) 2020-10-20
CN111793673B CN111793673B (zh) 2022-11-08

Family

ID=72804328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010539650.9A Active CN111793673B (zh) 2020-06-12 2020-06-12 一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111793673B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112458151A (zh) * 2020-12-22 2021-03-09 闽江学院 加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用
CN113624823A (zh) * 2021-08-04 2021-11-09 中国科学院上海高等研究院 基于四面体纳米结构dna的信号探针、其制备方法和用途
CN115453121A (zh) * 2022-11-11 2022-12-09 北京理工大学 实时监测活细胞内atp动态变化的纳米传感器及其应用
CN117866622A (zh) * 2024-03-11 2024-04-12 东南大学 一种基于多价空间模式识别的dna四面体荧光探针及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012205568A (ja) * 2011-03-30 2012-10-25 Panasonic Corp テロメラーゼ活性の検出方法
CN104263725A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 上海市计量测试技术研究院 塔尖四面体dna纳米结构探针及端粒酶电化学检测

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012205568A (ja) * 2011-03-30 2012-10-25 Panasonic Corp テロメラーゼ活性の検出方法
CN104263725A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 上海市计量测试技术研究院 塔尖四面体dna纳米结构探针及端粒酶电化学检测

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAROENPHOL P等: "Aptamer-targeted DNA nanostructures for therapeutic delivery", 《MOLECULAR PHARMACEUTICS》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112458151A (zh) * 2020-12-22 2021-03-09 闽江学院 加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用
CN112458151B (zh) * 2020-12-22 2022-09-13 闽江学院 加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用
CN113624823A (zh) * 2021-08-04 2021-11-09 中国科学院上海高等研究院 基于四面体纳米结构dna的信号探针、其制备方法和用途
CN113624823B (zh) * 2021-08-04 2023-06-06 中国科学院上海高等研究院 基于四面体纳米结构dna的信号探针、其制备方法和用途
CN115453121A (zh) * 2022-11-11 2022-12-09 北京理工大学 实时监测活细胞内atp动态变化的纳米传感器及其应用
CN115453121B (zh) * 2022-11-11 2023-03-14 北京理工大学 实时监测活细胞内atp动态变化的纳米传感器及其应用
CN117866622A (zh) * 2024-03-11 2024-04-12 东南大学 一种基于多价空间模式识别的dna四面体荧光探针及应用
CN117866622B (zh) * 2024-03-11 2024-05-28 东南大学 一种基于多价空间模式识别的dna四面体荧光探针及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111793673B (zh) 2022-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111793673B (zh) 一种用于细胞凋亡监控的荧光探针及其制备方法和应用
CN107574227B (zh) 一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法
US7790896B2 (en) RNA-selective probes for live cell imaging of nuclear structure and function
Sun et al. A repeatable assembling and disassembling electrochemical aptamer cytosensor for ultrasensitive and highly selective detection of human liver cancer cells
Zhang et al. A ratiometric fluorescent biosensor based on conjugated polymers for sensitive detection of nitroreductase and hypoxia diagnosis in tumor cells
Ji et al. Label-free and rapid detection of ATP based on structure switching of aptamers
CN107723338A (zh) 一种在单分子水平同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用
Han et al. Colorimetric hydrazine detection and fluorescent hydrogen peroxide imaging by using a multifunctional chemical probe
Li et al. A label-free fluorometric aptasensor for adenosine triphosphate (ATP) detection based on aggregation-induced emission probe
Yang et al. Fluorescent imaging of Au3+ in living cells with two new high selective Au3+ probes
CN108299438B (zh) pH响应性近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用
CN104597021A (zh) 一种基于谷胱甘肽功能化的金纳米团簇荧光探针快速检测dna浓度的方法
Wang et al. Multiple-targeted graphene-based nanocarrier for intracellular imaging of mRNAs
Li et al. Highly sensitive detection of cancer cells via split aptamer mediated proximity-induced hybridization chain reaction
Qie et al. High photoluminescence nitrogen, phosphorus co-doped carbon nanodots for assessment of microbial viability
Han et al. An amine-functionalized metal-organic framework and triple-helix molecular beacons as a sensing platform for miRNA ratiometric detection
Li et al. Red-light-responsive coordination polymers nanorods: New strategy for ultrasensitive photothermal detection of targeted cancer cells
Xue et al. Multi-stimuli-responsive molecular fluorescent probes for bioapplications
Zhang et al. A benzothiophene-quinoline-based targetable fluorescent chemosensor for detection of viscosity and mitochondrial imaging in live cells
Wang et al. Enzyme-embedded ZIF-8/DNA nanocomposite probe for live cells imaging and sensitive detection of ATP
Fang et al. A multi-photon fluorescence “on-off-on” probe based on organotin (IV) complex for high-sensitive detection of Cu2+
Shen et al. Target-triggered Au NPs self-assembled for fluorescence-SERS dual-mode monitoring of telomerase in living cells and in vivo
Mo et al. Simultaneous detection and imaging of two specific miRNAs using DNA tetrahedron-based catalytic hairpin assembly
Chen et al. A mitochondria-specific fluorescent probe for rapidly assessing cell viability
Jiang et al. A near-infrared cationic fluorescent probe based on thieno [3, 2-b] thiophene for RNA imaging and long-term cellular tracing

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant