JP2003527846A

JP2003527846A - 新規なｄｎａチップ

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Publication number: JP2003527846A
Application number: JP2001563632A
Authority: JP
Inventors: カイユ，ファブリス
Original assignee: ニュクレイカ
Priority date: 2000-03-01
Filing date: 2001-03-01
Publication date: 2003-09-24
Also published as: CA2401867A1; FR2805826A1; WO2001064945A3; US20030186262A1; AU2001240743A1; FR2805826B1; EP1259644A2; WO2001064945A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＤＮＡチップシステムに関するものであって、標的核酸における突然変異を検出し、手順の後に突然変異を含むＤＮＡだけがチップに残るようにするためのものである。本発明が対象とする方法は、該突然変異の相補的αＳ−ホスホチオエートデオキシヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼによって、標的核酸でハイブリダイズしたプローブの３’末端に付加し、そこにエキソヌクレアーゼを添加し、延長されたプローブだけが分解しないようにするものである。突然変異の有無の検出は、チップの所与の部位におけるＤＮＡの有無の直接的または間接的な測定によってなされる。有利には、該チップはＩＳＦＥＴ型のトランジスタ、または圧電変換器を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＤＮＡチップシステムに関するものであって、標的核酸における突
然変異を検出し、手順の後にチップに残るものが該突然変異を含むＤＮＡだけに
するためのものである。本発明が対象とする方法は、その突然変異に相補的なα
Ｓ−ホスホチオエートデオキシヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼによって、
標的核酸とハイブリダイズしたプローブの３’末端に付加し、そこにエキソヌク
レアーゼを添加し、延長されたプローブだけが分解しないようにするものである
。突然変異の有無の検出は、チップの所与の部位におけるＤＮＡの有無の直接的
または間接的な測定によってなされる。有利には、チップはＩＳＦＥＴ型のトラ
ンジスタ、または圧電変換器を含む。

【０００２】生殖細胞または体細胞系列における突然変異は、遺伝性の遺伝子疾患や癌の発
生などを引き起こすような、恐るべき結果を生体にもたらし得る。突然変異の影
響は、ＤＮＡ中のその位置づけに密接に依存している。コード領域での突然変異
の場合には、コードされたタンパク質の機能の損失を観察できる。突然変異が調
節領域でみられる場合には、ＤＮＡの発現がなくなったり、あるいは増大したり
することもある。生殖系列の部位で癌に関連する遺伝子中の突然変異は、必ずし
も対象となる個体が実際に腫瘍を生じさせるということではなく、単にその危険
性が増すだけのことである。さらに、すでに出来上がった腫瘍の侵襲の可能性を
診断しようとする際には、どのような突然変異を予期すべきかはわからない、と
いうのは、該突然変異は複数の遺伝子上で、もしくは同一遺伝子の複数の場所で
発生しうるからである。したがって、多くの突然変異を同時に検出できるように
する必要があると思われる。

【０００３】突然変異の検出、類型、あるいはさらに多形性の研究の方法における必要性は
、産業界においてますます痛感されているところであるが、それは重要性のある
新しい生物学的標的の発見を可能にするため、あるいはある腫瘍またはある患者
の遺伝的プロフィールを詳細に知り、そして適した治療法を検討するためである
。このような必要性が、ＬＣＲ、ＳＳＣＰそしてＲＦＬＰのようなさまざまな技
術の開発を導いたが、それらの技術によって、あるサンプル内の多くの突然変異
についての体系的な研究を可能にするのではない。

【０００４】本発明の根底にある目的は、識別対象のいくつものヌクレオチドを同時に決定
して、結果として、遺伝子の突然変異や多形性の診断、あるいは病原性の、もし
くは遺伝的に改変した微生物の識別を可能にする技術を開発することである。さ
らに具体的には、問題は、生化学的、電子工学的または光学的なさまざまな技術
を同一装置中に集成することであって、該装置は、特に使いやすく、小さなノイ
ズ／信号比で信号を生成することができるが、だからといって面倒な処理や複雑
な解読を必要としないようなものである。また重要なことは、可能なかぎり集積
度を高くし、値段の安い装置を提供することである。

【０００５】ＤＮＡチップは以上のような問題に対応できるが、技術の現状において提案さ
れているままでは、該チップの大規模な活用を抑制する固有の限界がある。

【０００６】一つのチップは、ある固体基板に規定された場所に精密に固定された多数の核
のプローブからなっており、その形状はこのような固定を可能にする様々な材料
を組み合わせた、平らな、あるいは多孔質の表面を呈している。

【０００７】現在までのところ、基板の選択は、プローブを固定できる容量に条件付けられ
ていた。ガラス、シリコンあるいは重合体のような材料は、技術の現状において
一般に使われている。該プローブをこれら表面に貼り付けるのは、「機能化」と
呼ばれる第一手順の際であり、該手順において、該プローブをとらえまたは固定
するために、反応性分子の中間層を添加する。

【０００８】ガラスは格好の材料であるが、それは不活性で、極性がなく、機械的に安定し
ているからである。ガラスは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社が開発した光化学ターゲ
ッティングによってオリゴヌクレオチドをインシトゥで合成する方法で用いられ
ている。この技術はＮＨ₂またはＯＨ基を有するシランの添加によって活性化さ
れたガラスの表面を使用することからなる；ＳｈｅｌｄｏｎＥ．Ｌ．（１９９
３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９（４），７１８−７１９参照。

【０００９】もう一つの方法はポリ−Ｌ−リジンによってガラスの表面を覆い、プローブを
置き、つぎに紫外線にさらして貼り付けることからなる。また引用できるのは、
ＣＩＳバイオインターナショナルによって開発されたポリピロールのような重合
体である。

【００１０】固体基板にプローブを一度取り付ければ、サンプルから採取したＤＮＡを規定
の条件でハイブリダイズさせることができる。二本鎖を主体とする組成物は、溶
解温度（Ｔｍ）と密接に依存するその安定性に影響を与える必須の要素である。
一時的な突然変異を検出しようとする際には、不適合がＴｍの低下をもたらし、
その結果、洗浄手順の際に完全にはハイブリダイズしない核酸を排除することと
なる。そういうわけで、問題の複数の遺伝子における複数の突然変異を同時に検
出しようとすることはほとんど不可能であるが、それはＴｍが二本鎖の部位ごと
に変化するからである。更に、プローブの長さが、無視できない技術的問題にな
るのは、長さの異なる様々なプローブを使って数多くの突然変異を同時に検出す
ることを望むときである。

【００１１】ハイブリダイゼーションの検出手順に関しては、フルオレセインのような蛍光
性分子を用いることが、最も一般に行われている標識の方法をなしている。この
方法により、ハイブリダイゼーションを直接的または間接的に示すこと、および
同一の実験で様々な蛍光色素を使用することができる。しかしながら、それは依
然として高価である、というのは、発信される波長を読み取るために、そして信
号を解読するために、かなり大がかりの装置の使用が必要であるからである。

【００１２】ハイブリダイゼーションの検出はまた、放射性マーカーを使用して実現されう
る。しかしながら、この技術によっては、チップを小型化しようとする際に満足
のいく説明が得られない。

【００１３】それに代わるもう一つの取り組み方は、半導体材料の特性を利用することから
なる。例えば、プローブを固定した誘電体（ＳｉＯ₂）で覆われたシリコン（Ｓ
ｉ）を主体とする固体基板を選んでもよい。適切な分極条件において、半導体の
電荷の変化に敏感に反応する電流が、ソースからドレインへと正常に循環する。
プローブとサンプルのＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションは、境界面Ｓｉ／
ＳｉＯ₂での半導体の電荷の密度の変化をもたらす。この変化は測定可能であり
、かつプローブと標的核酸間の特定のハイブリダイゼーションを検出することを
可能にする；Ｓｏｕｔｅｙｒａｎｄｅｔａｌ．（１９９５）Ｌｅｔｔｒｅ
ｄｅｓＳｃｉｅｎｃｅｓＣｈｉｍｉｑｕｅｓ５４，９−１１参照。この技
術はリヨン中央学校ＩＦＯＳ研究所で使用されている。

【００１４】もう一つの可能性は、ＢｅｃｈｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓが開発したチ
ップ（ＰｅｒｍｉｔｔｉｖｉｔｙＣｈｉｐｓ登録商標）の使用であるが、それ
はヌクレオチドの骨格構造に存在するリン酸基のマイナス電荷が引き起こす誘電
体の分散に助けられる。この現象はＤＮＡ分子の長さに左右されており、分子の
弛緩頻度によって定量化されうる。この大きさは、ＤＮＡ量が係数１０で変化す
る場合に、実際には係数１００で変化する；ＢｅａｔｔｉｅＫ．ｅｔａｌ（
１９９３）ＣｌｉｎＣｈｅｍ３９（４），７１９−７２１参照。この化学技
術ではインピーダンス分析器を使用しており、それは、プローブが対になってい
る場合に、プローブが吸収するエネルギーを測定するものである。

【００１５】突然変異を分析するためのチップは、すでに知られた配列の各塩基をプローブ
によって分析、もしくは前もって識別された突然変異を癌のような疾患と関係す
るものとして検出できるものでなければならない。

【００１６】技術の現状においては、これらプローブは、野生型の配列に相同な部分、およ
び配列の中程に位置づけられてハイブリダイゼーションの条件を標準化するため
の改変（置換、欠失、添加）を含むものとして、説明されている。塩基置換の分
析の場合には、プローブの四分子、すなわち四つの要素のユニットを組織し、そ
こではプローブのうちの一つは中央の位置に野生型の配列に見られるヌクレオチ
ドと相同の塩基を有し、他の三つのプローブは他の可能な三つの塩基を含む。こ
の分析はもれなく、ＣｈｅｅＭ．ｅｔａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７４，６１０−６１３に説明されている。この技術によれば、ＤＮＡチップが
開発されたのは、蛍光の測定によって、遺伝子ＢＲＣＡ１中のヘテロ接合体の突
然変異を検出するためである。このシステムは約１０⁵個のオリゴヌクレオチド
からなっており、それにより、単一塩基の置換と挿入、ならびに１から５個のヌ
クレオチドの長さの欠失を検出することを可能にする。ハイブリダイゼーション
分析システムは、二色（フルオレセインによる緑とフィコエリトリンとストレプ
トアビジンの結合による赤）で標識することに基づく；ＨａｃｉａＪＧｅｔ
ａｌ．（１９９６）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ１４，４４１−４４７参照。

【００１７】以上に言及したように、チップの組成を改善しなければならないのは、不純物
を発生させる光化学ターゲッティング、およびヘテロ二本鎖の安定性の変化によ
って、ハイブリダイゼーションの分析が難しくなるからである。更に、実際に市
販で入手できる装置は比較的高価である。結局、このシステムは、検出可能な信
号を得たい場合に、サンプルを増幅する手順が必要になるという事実によって制
限されるのである。ＤＮＡチップについての検討は、次の文献に記載されている
：ＧｒａｍｓｅｙＧｒａｈａｍ≪ＤＮＡＣｈｉｐｓＳｔａｔｅｏｆｔ
ｈｅＡｒｔ≫ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｖｏｌ．１６，１
９９８年１月、ＨｉｎｆｒａｙＧ．≪ＤＮＡチップ（Ｌｅｓｐｕｃｅｓａ
ＡＤＮ）≫Ｂｉｏｆｕｔｕｒ，１９９７年４月，Ｎｏ１６６，ｃａｈｉｅｒ
Ｎｏ．９１、ＭａｒｓｈａｌｌＡ．ａｎｄＨｏｄｇｓｏｎＪ．；Ｎａｔｕ
ｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｖｏｌ．１６，１９９８年１月。

【００１８】本発明の範囲内において、ＤＮＡチップを開発したが、これは標的ＤＮＡによ
る（この場合にはオリゴヌクレオチドのプライマーの役目を果たす）プローブと
の特異的なハイブリダイゼーションに基づくものであり、該プローブの延長は、
標的ＤＮＡに相補的なプライマーの３’末端に、オリゴヌクレオチド誘導体の少
なくとも一つを選択的に添加することにより；そのようにして延長されたプライ
マーは、エキソヌクレアーゼ、特にエキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化に抵抗
力がある。ＤＮＡポリメラーゼのおかげで、例えば的αＳ−ホスホチオエートデ
オキシヌクレオチドを添加することもでき、このことが、エキソヌクレアーゼＩ
ＩＩが二本鎖を消化してしまうのを防ぐ。

【００１９】そのようにして、ＤＮＡは、以下の条件が満たされる場合にのみ、チップ上の
所定の部位に依然として存在することになる。ａ）プローブとサンプルの標的ＤＮＡとの間でのハイブリダイゼーション、そし
てｂ）標的ＤＮＡ中の相補的塩基の存在が、プローブにおけるαＳ─ホスホチオエ
ートデオキシヌクレオチドの組み込みを可能にし；それにより、ヌクレアーゼに
よる分解を防止する。

【００２０】プローブが標的ＤＮＡとハイブリダイズしない場合には、（マイクロウェルな
どの）所定の部位でプローブが除去される。同様に、標的ＤＮＡが所定のαＳ─
ホスホチオエートデオキシヌクレオチドの相補的塩基を含まない場合には、該α
Ｓ─ホスホチオエートデオキシヌクレオチドは組み込まれず、プローブはそれか
らヌクレアーゼによって消化される。

【００２１】そのようにして、解釈するのに簡単な結果が入手できるが、それは以下の二つ
のタイプしかないからである。・ＤＮＡがある（１）・あるいはＤＮＡがない（０）

【００２２】固体電子基板と結合させたこの技術が測定可能にするのは、電荷、コンダクタ
ンス、抵抗、インピーダンスの違い、または電気変化、電界の効果の変化の他の
あらゆる効果、あるいは、さらに固体基板上での電気変化を引き起こす（圧電変
換器）あらゆる質量変化である。例えば、そのような基板は半導体システム、特
にＩＳＦＥＴ（イオン感応性電界効果型トランジスタ）でありうる。それゆえこ
のシステムは、二進法型の単純信号０（ＤＮＡなし）または１（ＤＮＡあり）を
感知し、該信号を直接、データ処理システム、特にあるコンピュータに伝達する
ことができる。

【００２３】また、光学読み取り（屈折、密度の変化または蛍光の測定のような基板の光学的
特性の変化のような）によって、チップの所定の部位におけるＤＮＡの存在を検
出することもでき、それは例えば該装置をＣＣＤカメラに結合させることによる
。このようなシステムにおいては、結果の解釈は容易であるが、それはそれらの
結果が結局のところ、ＤＮＡがある（１）またはＤＮＡがない（０）という結果
に集約され、技術の現状で現在までに得られている１と０との間の一切の信号が
排除されるからである。

【００２４】このシステムの重要な利点は、単純信号を必ずしもマーカーを使う必要なく検
出できること、検出感度が高まること、マイナスまたはプラスの狂いが生じる危
険性が低くなること、信号の解釈に過度に複雑なアルゴリズムが必要ないことで
ある。他の利点は、以下、本発明の詳細な説明において明らかになっていく。

【００２５】そのようなわけで、本発明は、標的核酸において位置ｎへの突然変異を検出す
る方法に関するもので、以下の手順を含むことを特徴とする：ａ）ＤＮＡチップ型の固体基板に５’で連結されたプローブを、標的核酸とハイ
ブリダイズし、前記プローブの３’末端は、標的核酸のヌクレオチドｎ−１に至
るまで最大限ハイブリダイズする。ｂ）手順ａ）でハイブリダイズされたプローブを、取り込みによって、前記標的
核酸の相補的ヌクレオチドの５’から３’の方向に延長するが、それはエキソヌ
クレアーゼとＤＮＡポリメラーゼによる分解に抵抗力のあるヌクレオチド誘導体
を少なくとも一つ含む、反応混合物による。ｃ）前記エキソヌクレアーゼにより、前記手順ｂ）で延長されたプローブのみが
分解しないように、消化、洗浄する。ｄ）ＤＮＡの有無を、直接または間接的に測定することによって、突然変異の有
無を検出する。

【００２６】この方法の鍵となる手順を、以下図１に示される例で明らかにしていく。

【００２７】「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、ポリメラーゼ活性を有する天然のまたは修飾さ
れたすべての酵素を意味する。例として挙げられるのは、ＤＮＡｐｏｌｅｘ
ｏ−、特にＴ７またはクレノウ断片である。

【００２８】「エキソヌクレアーゼ」とは、エキソヌクレアーゼ活性を有する天然のまたは
修飾されたあらゆる酵素を意味する。例として挙げられるのは、エキソヌクレア
ーゼＩＩＩである。加ピロリン酸分解活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用も
検討できる（ピロリン酸塩が高い濃度で存在する場合には、この酵素が最後のホ
スホジエステル結合にピロリン酸塩を添加し、３’におけるヌクレオチドを弛緩
させる。この製品は、ＲＥＡＤＩＴ（登録商標）という商品名でＰｒｏｍｅｇａ
社から入手可能であり、また、ルシフェラーゼで示すシステムを用いる変形例は
、ＲＥＡＤａｓｅ（登録商標）という商品名で入手可能である。

【００２９】手順ｄ）の際に、第一の実施例において、ＤＮＡの有無に関連する固体基板の
特性の変化を測定することにより、突然変異の有無を明らかにする事ができる。

【００３０】もう一つの解決法は、ＤＮＡの有無を光学的に読み取ることにより、突然変異
の有無を検出することからなる。光学的読み取りというのは、場合によっては特
定の波長（例えば２６０ｎｍ）となりうる光の吸収、透過もしくは放出、あるい
はＤＮＡを直接、あるいはプローブに連結したあらゆる分子マーカーを、測定す
るあらゆる手段を意味する。この定義にはまた、マーカー（フルオレセインおよ
び／またはフィコエリトリン）が放出する蛍光を測定するあらゆる手段も含まれ
る。

【００３１】「ヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレアーゼによる分解に抵抗するヌクレオチ
ドのあらゆる類似物を意味する。例として挙げられるのは、αＳ─ｄＡＴＰ、α
Ｓ─ｄＴＴＰ、αＳ─ｄＣＴＰ、αＳ─ｄＧＴＰ，αＳ─ｄＵＴＰおよびαＳ─
ｄＩＴＰのような、αＳ─ホスホチオエートデオキシヌクレオチドである。これ
らのヌクレオチド誘導体は、特に蛍光マーカーによって標識されうる。

【００３２】「プローブ」は、例えば１０から１００個のヌクレオチド、特に１５から３５
個のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片で、所定の条件下でハイブリダイゼー
ションの特異性を有して、標的核酸とともにハイブリダイゼーション複合体を形
成するものと定義される。本発明によるプローブは、特異性を有するか否かを問
わず、固体基板に直接的ないし間接的に固定可能なものであり、および該プルー
ブの検出を可能に、もしくは改善する標識剤を帯びることのできるものである。

【００３３】言うまでもなく、プローブは本発明の枠内でプライマーの役割を果たすが、そ
れは目的が、研究対象の突然変異の位置に対応する位置ｎへと変更されたヌクレ
オチドを組み入れることだからである。それゆえ、プローブの３’末端は、最大
限に、好ましくはｎ─１に至る。

【００３４】プローブを固体基板に固定するのは、あらゆる適切な手段によるが、例えば共
有結合、吸着、あるいは固体基板への直接合成などによる。これらの技術は、特
に特許出願ＷＯ９２／１００９２に記載されている。

【００３５】プローブを標識できるのは、選択されたマーカーによるが、それは、例えば放
射性同位元素、酵素、特にクロモゲン、蛍光性、発光性の基質に作用しうる酵素
（特にペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、あるいはさらに、陽
子を生成しまたは使用する酵素（オキシダーゼまたはヒドロラーゼ）；発色団の
化学化合物、クロモゲン、蛍光性、発光性の化合物、ヌクレオチド塩基の類似物
、そしてビオチンのようなリガンドである。本発明におけるプローブの標識は、
以下から選ばれる要素によって実現されるが、それは、ビオチン、アビジン、ス
トレプトアビジン、ジオキシゲニンのようなリガンド、あるいはハプテン、ある
いは色素、あるいは放射線発光物質、化学発光物質、生物発光物質、蛍光物質、
リン光物質のような発光物質である。もう一つの可能性は、所定の抗体が認識す
るエピトープを有するペプチドでプローブを標識することである。この抗体の存
在は、標識された第二の抗体によって明らかにされうる。

【００３６】以上で言及した第一の代替手段によると、手順ｄ）は、固体基板の物理化学的
、電気的、光学的または機械的な特徴の変化を測定することを含むが、特に該基
板は、電荷、ドーピング、導電率、抵抗、インピーダンス、または他の電気的変
化のあらゆる効果、電界の効果、あるいはさらに場、共振周波数あるいは電気音
響的なアドミタンスの変化を引き起こす質量のあらゆる変化から選ばれる。

【００３７】そのような意味において、固体基板を構成するＤＮＡチップに含まれうるのは
、半導体、誘電体そして圧電変換器または金プリズム構造物から選択された材質
である。そこで思い出されうるのが、Ｓｉ／ＳｉＯ₂型の塩基構造物、金属酸化
膜半導体（ＭＯＳ）、もしくは好ましくは電解質−酸化膜−半導体（ＥＯＳ）型
の構造物である。このような構造物は、Ｊａｆｆｒｅｚｉｃ−Ｒｅｎａｕｌｔ
Ｎ．ＩＳＦＥＴ−ＥＮＦＥＴ，ＭｉｃｒｏｃａｐｔｅｕｒｓｅｔＭｉｃｒｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２５−２３５に記載されている。要するに、電界効果
トランジスタ（ＦＥＴ）、特にＩＳＦＥＴ型トランジスタ、あるいは好ましくは
ＥＮＦＥＴ（酵素電界効果型トランジスタ）のことである。ＥＮＦＥＴ基板の場
合、プローブに、陽子を消費しまたは生成する、ヒドロラーゼまたはオキシダー
ゼ型の酵素を結合させることが有利である。これら酵素の基質をさらに加え、ｐ
Ｈの変化を測定する。

【００３８】検出を改善し、および／または単純化することのできる分子間で、金属原子を
含む基、特にフェロセン基が、プローブに接がれることができる。

【００３９】基板の光学的特性の変化の測定とは、固体基板の光学的特性の変化のあらゆる
測定を意味するが、前記基板はＤＮＡの有無に関連する。例として挙げられるの
は、Ｂｉａｃｏｒｅ社の技術で、特にＷＯ９７／３８１３２に記載されている。
それゆえ、本発明のこの実施態様には、基板の屈折率の測定が含まれる。この技
術によって、内外反射を測定することが可能となるが、それは例えば偏光解析法
や、ＳＰＲ（表面プラスモン共鳴）、ブルースターの屈折角、反射臨界角、ＦＴ
Ｒ（無効全面反射）、またはＳＴＩＲ（分散全面内部反射）の測定を含む一過性
の波についてである。これらの分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（登録商標）に
よって行うことができる。

【００４０】以上に言及した二番目の可能性によると、手順ｄ）は、透過し、吸着され、あ
るいは放出された光の量を測定することからなる。このような場合、基板は、透
明な材料、特にガラスで作られる。プローブをガラスに留める技術は、当業者に
は周知である。例えば予め標識したプローブの蛍光を測定し、そしてＣＣＤカメ
ラで光学的読み取りを行うことができる。

【００４１】望ましい実施態様においては、αＳ─ｄＡＴＰ、αＳ─ｄＴＴＰ、αＳ─ｄＣ
ＴＰ、αＳ─ｄＧＴＰ、αＳ─ｄＵＴＰおよびαＳ─ｄＩＴＰのようなαＳ−ホ
スホチオエートデオキシヌクレオチドを、プローブの３’末端に組み入れられる
。

【００４２】これを、例えばＬＣＲ、または好ましくは非対称ＰＣＲで行うこともできるが
、このときプローブは、場合ごとに、固体相の所定の部位に５’末端で化学的に
結合するプライマーの役目を果たす。ポリヌクレオチドにαＳ−ホスホチオエー
トデオキシヌクレオチドを容易に組み入れられるが、それはあらゆるポリメラー
ゼや試験済の逆転写酵素によってでき、このことが、他の突然変異検出方法にお
けるよりも、よる有利な原価となるＤＮＡポリメラーゼを使用することを可能に
する。

【００４３】チップの所定の部位にプローブを予め固定しておくことは、Ｏｒｃｈｉｄ社が
開発したマイクロ流体のターゲッティング技術、あるいはＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ
社の光化学的技術、あるいはさらに、Ｃｉｓ─バイオインターナショナルによる
電子ターゲッティング技術によって行うことができ、前記技術は当業者の守備範
囲内にある。

【００４４】本発明によると、標的ＤＮＡをプローブとハイブリダイズさせ、それにより、
その３’末端が識別対象のヌクレオチドの直前に来るようにする。αＳ−ホスホ
チオエートデオキシヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼを用いてプローブの３
’末端にさらに付加し、そして結果として、識別対象のヌクレオチドに相補的に
なる。

【００４５】手順ｂ）は、各プローブごとに４つの部位（四分子）で平行して行われるが、
部位ごとに異なるαＳ─ホスホチオエートデオキシヌクレオチドを含む反応混合
物の添加を伴う。そのようにして、塩基置換の性質がどのようなものであろうと
、標的ＤＮＡの所定の位置への突然変異を検出することが可能となる。手順ｃ）
におけるＤＮＡの消化に関しては、エキソヌクレアーゼＩＩＩを好適に使用でき
る。

【００４６】本発明の方法は特に、疾患にかかわる遺伝子における突然変異を検出するため
のものである。特に例として挙げられるのは、特にヘモクロマトーシス、鎌状
赤血球貧血、βおよびαサラセミア、嚢胞性線維症、血友病といった遺伝性の
遺伝子疾患、および癌に関わる遺伝子における、例えば遺伝子Ｒａｓ，ｐ５３，
ＢＲＣＡ１における突然変異である。これら遺伝子における突然変異の完全なリ
ストはつぎのインターネットサイトで提示されている：ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ＯＭＩＭ／ｍｏｒｂｉｄｍａ
ｐ

【００４７】さらに、本発明の方法が有益であるのは、遺伝子の多形性、あるいは遺伝子領
域全体の研究の際であり、および遺伝子改変生物（ＧＭＯ）の検出、および／ま
たは識別のためである。

【００４８】本発明のもう一つの側面は、上記のような方法を活用することのできる装置に
関するものである。そのような装置が含みうるのは、あるチップの所定の部位に
おけるＤＮＡの有無の検出システムで、特に圧電変換器、電界効果トランジスタ
、光学的密度または蛍光の読み取り器である。それをデータ処理システム、特に
コンピュータに結合してもよい。

【００４９】本発明のもう一つの側面は、ＤＮＡチップを含むキットに関するものであり、
該チップには、プローブと、つぎから選択された少なくとも一つの要素が固定さ
れている：・αＳ─ｄＡＴＰ、αＳ─ｄＴＴＰ、αＳ─ｄＣＴＰ、αＳ─ｄＧＴＰから選択
されたそれぞれ異なるαＳ─ホスホチオエートデオキシヌクレオチドを含む、４
つの反応混合物を一セット、・ＤＮＡポリメラーゼ、・エキソヌクレアーゼ、特にエキソヌクレアーゼＩＩＩ、・これら酵素が凍結乾燥した粉状の形態を呈する場合、ＤＮＡポリメラーゼおよ
び／またはエキソヌクレアーゼを可溶化するための溶液を一セット。

【００５０】有利には、このキットのチップは、ＩＳＦＥＴ、ＥＮＦＥＴ型の固体基板を含
むものである。

【００５１】このキットは、特に遺伝性の遺伝子疾患と癌における、疾患に関する遺伝子の
突然変異を検出するためのものである。それはまた、遺伝子の類型や遺伝子の多
形性（ＳＮＰｓ（一塩基多型）検出のため）の研究、そして遺伝子改変生物（Ｇ
ＭＯ）の検出かつ／または識別のためにも役立ちうる。

【００５２】図の凡例

【００５３】図１：本発明による方法の特殊な実施様態の概略図ａ）標的核酸とＤＮＡチップ型の固体基板に５’で連結されたプローブをハイブ
リダイズするが、それは前記プローブの３’末端は、標的核酸のヌクレオチドｎ
−１に至るまでハイブリダイズすること。ｂ）αＳ−ｄＡＴＰを５’から３’の方向に組み入れること。ｃ）エキソヌクレアーゼＩＩＩで、手順ｂ）で延長されたプローブのみが分解し
ないように消化、および洗浄すること。ｄ）ＤＮＡの有無を直接または間接的に測定することで、突然変異の有無を検出
すること。

【００５４】図２：金属酸化膜半導体（ＭＯＳ）型の基板の従来の構造Ｊａｆｆｒｅｚｉｃ−Ｒｅｎａｕｌｔから引用した図

【００５５】図３：ＩＦＳＥＴ型の構造Ａ−ＩＦＳＥＴＪａｆｆｒｅｚｉｃ−Ｒｅｎａｕｌｔからの引用Ｂ−ＤＮＡＦＥＴ

【００５６】図４：ヘマクロマトーシスの遺伝子における突然変異を検出するために、一連
の四分子を備えた本発明によるチップの原理

【００５７】例１：本発明の特殊な実施態様

【００５８】識別対象の位置ｎへの突然変異Ｔ→Ｇを含んだＤＮＡ断片を有する標的ＤＮＡ
を、チップの表面に添加する。前記ＤＮＡ断片を、ＦＩＴＣ（イソチオシアン酸
フルオレセイン）で標識され、チップの基板上の規定された部位に固定された相
補的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。後にポリメラーゼと
反応させる際に、組み込まれたホスホチオエートデオキシヌクレオチド（αＳｄ
ＡＴＰ）は、位置ｎのヌクレオチドＴに対して相補的位置にある。反応混合物に
あるホスホチオエートデオキシヌクレオチドが、識別対象のヌクレオチド（αＳ
ｄＡＴＰとは異なる）に対して相補的でなければ、プローブは３’に延長されな
い。続いて、エキソヌクレアーゼＩＩＩが分解するのは、ホスホチオエートデオ
キシヌクレオチドで延長されなかったすべてのプローブである。つぎに、ペルオ
キシダーゼと共役した共役抗ＦＩＴＣの結合によって検出を行う。酵素−基質反
応が一度おきると、それにより強い測定信号が、識別対象のヌクレオチド（Ｔ）
が、ポリメラーゼとの反応のために反応混合物に添加されたホスホチオエートデ
オキシヌクレオチド（αＳｄＡＴＰ）に対して相補的であるかどうかを示すこと
になる。

【００５９】例２：ＩＳＦＥＴまたはＥＮＦＥＴ型基板の使用（Ｊａｆｆｒｅｚｉｃ−Ｒｅ
ｎａｕｌｔＮ．，ＭｉｃｒｏｃａｐｔｅｕｒｓｅｔＭｉｃｒｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ２２５−２３５）。

【００６０】図３Ａ（Ｊａｆｆｒｅｚｉｃ−Ｒｅｎａｕｌｔから引用）は、ＩＳＦＥＴ構造
を概略的に示したものである。これは、金属グリッドを電解質と基準電極で置き
換えるという意味で、ＭＯＳＦＥＴ構造（図２参照；Ｊａｆｆｒｅｚｉｃ−Ｒｅ
ｎａｕｌｔ）に由来するものである。

【００６１】閾値電圧の式は：Ｖ_T＝Ｗｓｃ−Ｗｒｅｆ＋ψ₀−（Ｑ_S＋Ｑ_F）／Ｃｉ−２ψ_b
であり、Ｖ_Tは、溶液の化学的特性の関数である（ψ₀は、感知膜と溶液との間の
電位差）。図３Ａに示された回路においては、ドレイン電流は一定に保たれ、ψ₀ に比例する電圧Ｖ_Gの変化が測定される。

【００６２】ｐＨに対する感知膜は、Ａｌ₂０₃、Ｔａ₂Ｏ₅、Ｓｉ₃Ｎ₄の薄い層からなる。イ
オンＫ⁺、Ｎａ⁺、Ａｇ⁺、Ｆ^-、Ｂｒ^-、Ｉ^-、Ｃａ²⁺そしてＮＯ₃ ^-に対する感知性
の他の膜も、同様に入手可能である。

【００６３】本発明の枠内において、標識されたプローブを、陽子を生成する酵素で、基板
に固定することが可能である、ＥＮＦＥＴシステム（図３Ｂ）。このようにして
担体におけるＤＮＡの有無の測定をするが、それは電圧Ｖ_Tの変化として直接現
れる溶液のｐＨ変化の測定を介するエキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化に続い
て得られる。このシステムは、場合によっては、一つまたは複数の増幅器に結合
することができる。それゆえ、電圧の変化はＤＮＡの存在を示している。システ
ムを、一連の増幅器とトランジスタにより電圧の閾値の変化によって電流が通っ
たり通らなかったりするようにし、そして終わりには、二進法型の信号を出すよ
うにすることが可能である。（１）トランジスタの閾値以上の電圧の変化（ＤＮＡが存在し突然変異が検出さ
れる）（０）トランジスタの閾値を下回る変化（ＤＮＡは不在で、それゆえ突然変異は
ない）

【００６４】つぎに、これらの結果がデータ処理システムにインポートされ、それによりチ
ップにおける所定の部位のそれぞれについて得られた結果をコンパイルする。

【００６５】例３：圧電変換器型の固体基板の使用

【００６６】ＳｉＯ₂、ＴｉＯ₃Ｂａ、ＬｉＮｂＯ₃や圧電重合体（ＰＶＦ２）のような材料
には、物理的応力が加えられた際に変形するという特性がある；Ｐｅｒｒｏｔ
Ｈ．ｅｔＨｏｕｍｍａｄｙＭ．，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｕｒｓｐｉｅｚｏ
−ｅｌｅｃｔｒｉｑｕｅ参照。その場合に出現する測定可能な電位は、ＤＮＡの
分子の質量によって加えられる圧力に起因する。この測定は、共振周波数あるい
は共振周波数の周辺のアドミタンスでもよい。本発明の場合には、ＤＮＡは液体
環境にある。したがって、また測定しうるのは、電気音響的なアドミタンス、ま
たは電解質を含む溶液の密度と粘性に特に依存する導電率である。そのようにし
て、液体環境で１００ｐｇの差を検出することができる。

【００６７】例４：ヘモクロマトーシスに関連する局所的な突然変異を検出するための本発
明による方法の使用

【００６８】ＵＳ５，７５３，４３８において指定された、ＨＨＰ−１、ＨＨＰ−１９そし
てＨＨＰ−２９の局所的な突然変異は、その３’末端が突然変異の位置ｎ−１に
いたるプローブを用いる本発明の方法によって検出可能である：ＨＨＰ−１：正常な配列５’ＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＴＣＡＣＧ₆₄ＣＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧ
ＡＧＣＣＴ３’（ＳＥＱＩＤＮｏ１）変異配列ＡＧ６４５’ＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡ₆₄ＣＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧ
ＡＧＣＣＴ３’（ＳＥＱＩＤＮｏ２）

【００６９】それゆえ使用するプローブの配列は、５’ＡＧＡＡＡＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＡ
ＧＴＧ₆₃３’（ＳＥＱＩＤＮｏ３）であり、チップの予め規定された４つの
部位（部位Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）に付けられている。αＳ−ｄＴＴＰ（部位Ｔ）を含
む反応混合物を施す部位において、サンプルからのＤＮＡにおいて実際に突然変
異がある場合には、一つの信号が得られる。他の部位Ａ、ＧおよびＣにおいては
、いかなる信号も得られないが、それはＤＮＡがエキソヌクレアーゼＩＩＩに消
化されるからである。

【００７０】ＨＨＰ−１９（Ａ→Ｇ）については、以下のプローブを用いることができる：
５’ＴＡＴＡＴＡＧＡＴＡＴＴＡＧＡＴＡＴＡＡＡＧＡＡ３’（ＳＥＱＩＤ
Ｎｏ４）ＨＨＰ−２９（Ａ→Ｇ））については、以下のプローブを用いることができる：
５’ＡＡＣＣＣＣＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＡＡＡＡＴ３’（ＳＥＱＩＤＮｏ５
）

【００７１】センス鎖でシステインをグアニンに置き換えることによる突然変異Ｈ６３Ｄも、
プローブＳＥＤＩＤＮｏ６およびＮｏ７を用いて、検出可能である。

【００７２】

【表１】

【００７３】センス鎖でグアニンをアデニンに置き換えることによる突然変異Ｃ２８２Ｙも、
プローブＳＥＤＩＤＮｏ８およびＮｏ９を用いて、検出可能である。

【００７４】

【表２】

【００７５】四つのオリゴヌクレオチドＳＥＤＩＤＮｏ６からＮｏ９を使用しうるのは
、これらオリゴヌクレオチドの３’末端の直後にあるヌクレオチドを識別するた
めである。そのため、四分子システムを用意することができる（図４参照）。

【００７６】例５：癌に関わる遺伝子における突然変異の検出

【００７７】ａ）大腸癌の出現に結びつくＭＬＨ１ＥＳＴ遺伝子における突然変異。今日
までにＭＬＨ１における６０個の局所的突然変異が、大腸癌に関連するものとし
て識別されている；Ｂｒｏｎｎｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８，２５８
，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３，１６２５。

【００７８】例として挙げられるのは以下の突然変異である。

【表３】

【００７９】完全なリストは、ｗｗｗ．ｕｗｃｍ．ａｃ．ｕｋ／ｕｗｃｍ／ｍｇ／ｎｓ／ｌ／２４９６１７．ｈｔｍｌでオンライン提供されている。

【００８０】同一の遺伝子についての突然変異の非常に多い数をみると、本発明による検出
方法は、上記の突然変異のそれぞれについて特異なプローブを有するチップを用
いており、そのため、患者に正確な診断を保証するには、不可欠のものと思われ
る。

【００８１】ｂ）Ｋ−ｒａｓ遺伝子における突然変異の検出ＷＯ９１／１３０７５の示すプローブは、Ｋ−ｒａｓのコドン１２における局
所的突然変異を検出できるようにする。本発明の枠内において、以下のプローブ
をチップに貼り付けることができ、従って、考えられる突然変異のすべてを完全
に検出することを保証する： ‐５’ＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡ３’（ＳＥＱＩＤＮｏ
１０） ‐５’ＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣ３’（ＳＥＱＩＤＮｏ
１１） ‐５’ＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮｏ
１２） ‐５’ＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮｏ
１３） ‐５’ＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮｏ
１４）

【００８２】例６：１）目的この作業の目的は、バイオチップの新技術を用いることによって、あるＤＮＡ
の遺伝的多形性を、決定することである。

【００８３】この技術を構成するのは、対象となる遺伝子増幅、共有結合の方法でのプローブ
の固定により予め準備された固体基板（基質）で得られた増幅産物のハイブリダ
イゼーション、改変したヌクレオチドでのプローブの延長、プローブの分解ある
いは保護を明らかにすることである。

【００８４】以下に記載されたプロトコルを、ヘモクロマトーシスの遺伝子の遺伝子型Ｃ２
８２ＹとＨ６３Ｄを決定するのに適用する。

【００８５】２）プロトコルａ）ＤＮＡの調製遺伝子型Ｃ２８２ＹとＨ６３Ｄに対応する対象となるゲノム領域を増幅するた
めのプライマー付ＰＣＲ。

【００８６】使用されるプライマーの配列：Ｃ２８２ＹＦｏｒ：ｇｇｇＣＴｇｇＡＴＡＡＣＣＴＴｇｇＣＴ（ＳＥＱＩＤ
Ｎｏ１５）Ｃ２８２ＹＲｅｖ：ｇＴＣＡＣＡＴＡＣＣＣＣＡｇＡＴＣＡＣＡ（ＳＥＱＩ
ＤＮｏ１６）Ｈ６３ＤＦｏｒ：ＣＣＴＴｇｇＴＣＴＴＴＣＣＴＴｇＴＴＴｇＡ（ＳＥＱＩ
ＤＮｏ１７）Ｈ６３ＤＲｅｖ：ＴＣＴｇｇＣＴＴｇＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴｇｇ（ＳＥＱＩ
ＤＮｏ１８）

【００８７】これらプライマーが、蛍光マーカーＣｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の付加でその
５’末端で修飾される。

【００８８】各場合に予想される増幅断片のサイズは、約１００ｂｐである。得られた増幅
産物を、アガロース１．５％のゲルで検証する。

【００８９】Ｃ２８２ＹおよびＨ６３Ｄについて用いられるプローブは、例４に記載されて
いるものであり：すなわち、決定すべき遺伝子型のそれぞれにつき二つのプロー
ブである。

【００９０】ｂ）固体基板の調製プローブの固定は、表面を化学的に修飾してプローブのオリゴヌクレオチドの
５’末端を反応性にした後に行われる。決定される遺伝子型それぞれにつき、２
つのプローブが、増幅のセンスおよびアンチセンス鎖のハイブリダイゼーション
ができるように設計され、また明らかにすべき塩基のちょうど上流側に位置づけ
られる。例４の説明参照。

【００９１】ｃ）チップにおけるハイブリダイゼーション１増幅容量の希釈：ＴＥ１Ｘを含む容量２１００℃で５分間ＰＣＲを変性させ、つぎに氷に１分間置く３ＰＣＲのハイブリダイゼーション： ‐ハイブリダイゼーションバッファーで希釈された増幅産物（ＳＳＣ５Ｘ、Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ１Ｘ） ‐ＰＣＲのシリコン基質の上に置く ‐基質を、湿潤室に３７℃のシャーレに４５分間、３００ｒｐｍで置く。 ‐ＳＳＣ５Ｘで洗浄する。

【００９２】４多形性の検出ａ）ｄＧＴＰのみでの伸張各チップ用になされた混合物Ｂｓｔｐｏｌ８Ｕ／μｌ（Ｂｉｏｌａｂｓ）：０．８μｌ（即ち０．０１６
Ｕ／μｌ）緩衝液Ｂｓｔｐｏｌ１０Ｘ（Ｂｉｏｌａｂｓ）：４０μｌアルファ‐チオｄＧＴＰ(Ａｍｅｒｓｈａｍ)１ｍＭ：４μｌ滅菌水：３５５．２μｌ ‐各チップに混合物を４００μｌ置く ‐５０℃で２０分間、３００ｒｐｍで培養する ‐ＳＳＣ５Ｘで洗浄するｂ）消化チップ３個用になされた混合物滅菌水：１３５０μｌ緩衝液ＥｘｏＩＩＩ１０ｘ（Ｂｉｏｌａｂｓ）：１５０μｌＥｘｏＩＩＩ１００Ｕ／μｌ（Ｂｉｏｌａｂｓ）：０．３μｌ ‐各チップにつき混合物を４００μｌ置く ‐３７℃で１０分間、３００ｒｐｍで培養する ‐ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する

【００９３】ｄ）解明Ｃｙ３による蛍光の放出を、各埋込電極／チップの上で測定する（例えばスキ
ャナーによる読み取り）。

【００９４】３）結果Ｃ２８２ＹおよびＨ６３Ｄについて、陽性の信号が得られた（結果は表示して
いない）。

【００９５】様々な試験済のＤＮＡにつき、さまざまな遺伝子型について２つの固定接点電
極のうち１つで、Ｃｙ３による蛍光の消失が観察される。

【００９６】結論として、ＥｘｏＩＩＩによる幾つかのプローブの分解が観察され、そし
てこの分解はチオｄＧＴＰを組み込まなかった鎖についてのみ観察された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による方法の特殊な実施様態の概略図である。

【図２】金属酸化膜半導体（ＭＯＳ）型の基板の従来の構造である。

【図３Ａ】ＩＳＦＥＴ構造を概略的に示したもので、Ｊａｆｆｒｅｚｉｃ−
Ｒｅｎａｕｌｔからの引用である。

【図３Ｂ】ＩＳＦＥＴ構造を概略的に示したもので、ＤＮＡの有無を測定す
るＦＥＴシステムである。

【図４】一連の四分子を備えた本発明によるチップの原理を示したものであ
る。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 27/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 27/327 33/566 27/414 37/00 １０２ 27/416 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３０１Ｌ 33/566 ３５３Ｚ 37/00 １０２ 27/46 ＳＭ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G043 BA16 DA02 EA01 EA17 GA07 GB01 KA03 KA05 2G060 AA08 AD06 AE40 AF02 AF06 AF07 AF08 AG11 GA04 HA01 HC07 HC13 HC19 HC21 HE01 KA09 4B024 AA20 CA04 CA09 HA19 4B029 AA23 BB20 CC08 4B063 QA01 QA12 QA13 QQ43 QR32 QR55 QS34 QX02 QX05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的核酸において、位置ｎへの突然変異を検出する方法であって
、以下の手順：ａ）ＤＮＡチップ型の固体基板に５’で連結されたプローブを、標的核酸とハイ
ブリダイズし、前記プローブの３’末端は、標的核酸のヌクレオチドｎ−１に至
るまで最大限ハイブリダイズすること、ｂ）手順ａ）でハイブリダイズされたプローブを、取り込みによって、前記標的
核酸の相補的ヌクレオチドの５’から３’の方向に延長するが、それはエキソヌ
クレアーゼとＤＮＡポリメラーゼによる分解に抵抗力のあるヌクレオチド誘導体
を少なくとも一つ含む、反応混合物によること、ｃ）前記エキソヌクレアーゼにより、前記手順ｂ）で延長されたプローブのみが
分解しないように、消化、洗浄すること、ｄ）ＤＮＡの有無を、直接または間接的に測定することによって、突然変異の有
無を検出することを含むことを特徴とする検出方法。
【請求項２】ＤＮＡの有無に関連する固体基板の特性の変化を測定することに
よって、突然変異の有無を手順ｄ）で検出することを特徴とする、請求項１に記
載の方法。
【請求項３】ＤＮＡの有無を光学読み取りすることによって、突然変異の有無
を手順ｄ）で検出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】手順ｄ）で、固体基板の物理化学的、電気的、光学的または機械的
な特徴の変化を測定するが、特に該基板は電荷、ドーピング、導電率、抵抗、イ
ンピーダンスまたは他の電気的変化のあらゆる効果、電界の効果、あるいはさら
に場、共振周波数、電気音響的なアドミタンス、特に偏光解析法の基板の屈折率
、ＳＰＲ（表面プラスモン共鳴）の測定を含む一過性の波、ブルースターの屈折
角、反射臨界角、ＦＴＲ（無効全面反射）、ＳＴＩＲ（分散全面内部反射）など
の変化を引き起こす質量、などのあらゆる変化から選ばれることを特徴とする、
請求項２に記載の方法。
【請求項５】固体基板は、半導体、誘電体および圧電変換器または金プリズム
構造物から選択された材質からなるＤＮＡチップからなることを特徴とする、請
求項２に記載の方法。
【請求項６】固体基板は、金属酸化膜半導体（ＭＯＳ）、好ましくは電解質−
酸化膜−半導体（ＥＯＳ）型の構造物からなるものであることを特徴とする、請
求項５に記載の方法。
【請求項７】固体基板は、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）、特にＩＳＦＥＴ
またはＥＮＦＥＴ型のトランジスタを有することを特徴とする、請求項５に記載
の方法。
【請求項８】金属原子を含む基、特にフェロセン基がプローブに接がれること
を特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】手順ｄ）は、固体基板を通して透過する光の量を測定するという
ことからなり、前記固体基板は、透明な材料、特にガラス製であることを特徴と
する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】手順ｄ）は、予め標識されたプローブの蛍光を測定することか
らなることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】光学的読み取りは、ＣＣＤカメラで行うことを特徴とする、請
求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】手順ｂ）で、αＳ─ホスホチオエートデオキシヌクレオチド、
好ましくはαＳ─ｄＡＴＰ、αＳ─ｄＴＴＰ、αＳ─ｄＣＴＰ、αＳ─ｄＧＴＰ
、αＳ─ｄＵＴＰまたはαＳ─ｄＩＴＰを用いることを特徴とする、請求項１か
ら１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】手順ｃ）で、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いることを特徴と
する、請求項１から１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】手順ｂ）は、各プローブごとに４つの部位で平行して行われる
が、部位ごとに異なるαＳ─ホスホチオエートデオキシヌクレオチドを含む反応
混合物の添加を伴うことを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一つに記載
の方法。
【請求項１５】特にヘモクロマトーシス、鎌状赤血球貧血、βおよびαサラセ
ミア、嚢胞性線維症、血友病といった遺伝性の遺伝子疾患のような疾患に関わる
遺伝子の突然変異、および癌に関わる遺伝子における突然変異を検出するための
、請求項１から１４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】遺伝子の多形性または遺伝子領域全体の研究のための、請求項
１から１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】遺伝子改変生物（ＧＭＯ）の検出、および／または識別のため
の、請求項１から１６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】請求項１から１７のいずれか一つに記載の方法を活用できるよ
うにする装置。
【請求項１９】一つのチップの所定の部位におけるＤＮＡの有無の検出システ
ム、特に圧電変換器、電界効果トランジスタ、光学的密度または蛍光の読み取り
器を有することを特徴とする、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】ＤＮＡチップからなるキットであって、プローブと、以下から
選択された少なくとも一つの要素が固定されているキット。・αＳ─ｄＡＴＰ、αＳ─ｄＴＴＰ、αＳ─ｄＣＴＰ、αＳ─ｄＧＴＰ、αＳ─
ｄＵＴＰおよびαＳ─ｄＩＴＰから選択されたそれぞれ異なるαＳ─ホスホチオ
エートデオキシヌクレオチドを含む、４つの反応混合物を一セット、・ＤＮＡポリメラーゼ、・エキソヌクレアーゼ、特にエキソヌクレアーゼＩＩＩ、・これら酵素が凍結乾燥した粉状の形態を呈する場合、ＤＮＡポリメラーゼおよ
び／またはエキソヌクレアーゼを可溶化するための溶液を一セット。
【請求項２１】チップが、ＩＳＦＥＴ、ＥＮＦＥＴ型の固体基板を含むことを
特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】特に遺伝性の遺伝子疾患と癌における、疾患に関連する遺伝子
の突然変異を検出するためであることを特徴とする、請求項２０または２１のい
ずれかに記載のキット。
【請求項２３】ＳＮＰｓ（一塩基多型）の検出のためであることを特徴とする
、請求項２０または２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２４】遺伝子改変生物（ＧＭＯ）の検出、かつ／または識別のためで
あることを特徴とする、請求項２０または２１のいずれかに記載キット。