EP1259644A2 - Nouvelles puces a adn - Google Patents

Nouvelles puces a adn

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Publication number
EP1259644A2
EP1259644A2 EP01911814A EP01911814A EP1259644A2 EP 1259644 A2 EP1259644 A2 EP 1259644A2 EP 01911814 A EP01911814 A EP 01911814A EP 01911814 A EP01911814 A EP 01911814A EP 1259644 A2 EP1259644 A2 EP 1259644A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
absence
solid support
probes
mutation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01911814A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fabrice Cailloux
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NUCLEICA
Original Assignee
NUCLEICA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NUCLEICA filed Critical NUCLEICA
Publication of EP1259644A2 publication Critical patent/EP1259644A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a DNA chip system for detecting a mutation in a target nucleic acid so that only the DNA carrying the mutation remains on the chip at the end of the method.
  • the invention relates to a method in which an ⁇ S-phosphothioatedésoxynucleotide complementary to the mutation is added by means of a DNA polymerase to the 3 'end of the probe hybridized to the target nucleic acid and in which an exonuclease is added so that only the extended probes are not degraded.
  • the presence or absence of the mutation is detected by direct or indirect measurement of the presence or absence of DNA at a given site on the chip.
  • the chip comprises transistors of the ISFET type or piezoelectric transducers.
  • Mutations in germ cells or in somatic lines can have dreadful consequences on the organism, for example by causing hereditary genetic diseases or the appearance of cancer.
  • the effect of a mutation is closely linked to its location in DNA. In the case of a mutation in a coding region, the loss of the function of the coded protein can be observed. If the mutation is in a regulatory region, DNA expression can be abolished or increased.
  • a mutation in a gene involved in cancer in the germ line does not necessarily mean that the individual concerned will actually contract a tumor, but only that the risk of it is increased.
  • the objective underlying the present invention has been to develop a technique allowing the simultaneous determination of several nucleotides to be identified and therefore the diagnosis of mutations and polymorphisms of genes, or the identification of pathogenic microorganisms or genetically modified. More specifically, the problem lies in a compilation of different biochemical, electronic or optical techniques within the same device which would be particularly easy to use, which could generate signals with a low noise / signal ratio without requiring any processing. tedious and complicated interpretation. It is also important to provide the most integrated device possible and at low cost.
  • DNA chips could solve the aforementioned problems, but as they are proposed in the state of the art, they have inherent limits which hamper their large-scale exploitation.
  • a chip consists of a multitude of nucleic probes precisely fixed at defined locations on a solid support in the form of flat or porous surfaces made of different materials allowing such fixing.
  • the choice of support was conditioned by its ability to allow the fixation of the probes.
  • Materials such as glass, silicon or polymers are commonly used in the prior art.
  • the probes are grafted onto these surfaces during a first step called “functionalization” in which an intermediate layer of reactive molecules is added to capture or fix the probes.
  • Glass is a material of choice since it is inert, non-polar and mechanically stable. It has been used in a process for the in situ synthesis of oligonucleotides by photochemical addressing developed by the company Affymetrix.
  • This technique consists in using a glass surface activated by the addition of silane carrying NH 2 or OH groups; Sheldon EL (1993) Clin. Chem. 39 (4), 718-719. Another method is to cover the glass surface with poly-L-lysine, deposit the probes and then perform the transplant by exposure to UN. Mention may also be made of polymers such as the polypyrroles developed by CIS Biointernational.
  • the AD ⁇ from the samples is allowed to hybridize under predefined conditions.
  • the basic composition of the duplex is an essential element influencing its stability which is closely dependent on the melting temperature (Tm).
  • Tm melting temperature
  • the mismatches cause a drop in Tm, which results in the elimination of nucleic acids which have not completely hybridized during the washing step.
  • the length of the probes represents a significant technical difficulty when it is desired to detect many mutations simultaneously using different probes of different length.
  • An alternative approach is to use the properties of semiconductor materials. For example, one can choose a solid support based on silicon (Si) covered with a dielectric (Si ⁇ 2) on which the probes are fixed. Under certain suitable polarization conditions, a current, sensitive to changes in the load of the semiconductor, normally flows from the source to the drain. Hybridization between the probes and the DNA of the sample leads to a modification of the charge density of the semiconductor at the Si / Si ⁇ 2 interface. This variation can be measured and makes it possible to detect the specific hybridization between probes and target nucleic acids; Souteyrand et al. (1995) Letter from the Chemical Sciences 54, 9-11. This technique is used by the IFOS laboratory of the isme Centrale de Lyon.
  • the chips intended for the analysis of mutations must be able to analyze using probes each base of an already known sequence or to detect mutations previously identified as being implicated in diseases such as cancer.
  • these probes are described as comprising a part homologous to the wild type sequence and a modification (substitution, deletion, addition) localized in the middle of the sequence in order to standardize the hybridization conditions.
  • the probes are organized in tetrads, sets of four elements in which one of the probes has in the central position the base homologous to the nucleotide found in the wild-type sequence; the other three probes containing the other three possible bases.
  • This full analysis is described in Chee M. et al. (1996) Science 274, 610-613. According to this technique, a DNA chip has been developed to detect heterozygous mutations in the BRCA1 gene by measuring fluorescence.
  • This system comprises approximately 10 5 oligonucleotides allowing the detection of substitutions and insertions of single bases, as well as long deletions of 1 to 5 nucleotides.
  • the hybridization analysis system is based on two-color labeling (green with fluorescein and red with a combination of phycoerythrin and streptavidin); Hacia JG et al. (1996) Nature Genêt 14, 441-447.
  • a DNA microarray system which is based on the specific hybridization of the probe (in this case serving as an oligonucleotide primer) with the target DNA, the extension la probe with selective addition of at least one oligonucleotide derivative to the 3 'end of the primer complementary to the target DNA; the primer thus elongated being resistant to digestion by an exonuclease, in particular by exonuclease III.
  • the primer thus elongated being resistant to digestion by an exonuclease, in particular by exonuclease III.
  • the DNA remains present at a given site on the chip only when the following conditions are met: a) hybridization between the probe and the target DNA of the sample, and b) presence of a complementary base in the Target DNA allowing the incorporation of the ⁇ S-phosphothioatedésoxynucleotide in the probe; which prevents its degradation by nuclease.
  • the probe does not hybridize with the target DNA, there is elimination of the probe at a given site (microwell or other). Likewise, if the target DNA does not contain the complementary base of the given ⁇ S-phosphothioatedésoxynucleotide, the latter is not incorporated and the probe is then digested by the nuclease.
  • This technique associated with an electronic solid support makes it possible to measure the difference in charge, conductance, resistance, impedance or any other effect of electrical variation, variation of field effect or any variation of mass causing an electrical variation.
  • piezoelectric transducer on the solid support.
  • a support can be a semiconductor system, in particular an ISFET system (Ion Sensitive Field Effect Transistor). This system therefore receives simple signals 0 (no DNA) or 1 (DNA) of the binary type which can be directly transmitted to a data processing system, in particular to a computer.
  • the present invention relates to a method for detecting a mutation in position n in a target nucleic acid, characterized in that it comprises the following steps: a) hybridization of a probe linked in 5 'to a support solid of the DNA chip type with a target nucleic acid, the 3 ′ end of said probe hybridizing at most to nucleotide n-1 of the target nucleic acid, b) elongation of the probe hybridized in step a) by incorporation in the 5'-3 'direction of nucleotides complementary to said target nucleic acid by means of a reaction mixture comprising at least one nucleotide derivative resistant to degradation by an exonuclease and a DNA polymerase, c) digestion by said exonuclease so that only the probes extended in step b) are not degraded, washing, d) detection of the presence or absence of the mutation by direct or indirect measurement of the presence or absence of DNA.
  • the key steps of this process are illustrated in the example presented in
  • DNA polymerase means any natural or modified enzyme having polymerase activity. Mention may be made, for example, of pol exo- DNAs, in particular T7 or the klenow fragment.
  • Exonuclease is understood to mean any natural or modified enzyme having an exonuclease activity. Mention may be made, for example, of exonuclease III.
  • DNA polymerase having a pyrophophorolysis activity in the presence of a high concentration of pyrophosphate, this enzyme adds a pyrophosphate on the last phosphodiester bond and therefore releases the nucleotide at 3 '.
  • This product is available from Promega under the brand READIT TM, and variants using a luciferase revealing system is available under the brand READase TM.
  • the presence or absence of the mutation can be demonstrated, according to a first embodiment, by measuring the modification of a property of the solid support linked to the presence or to the absence of DNA.
  • Another solution is to detect the presence or absence of the mutation by optical reading of the presence or absence of DNA.
  • optical reading means any measurement of absorption, transmission or emission of light which may possibly be at a specific wavelength (260 nm for example) either directly from DNA or from any marker molecule linked to the probe.
  • This definition also includes any measurement of the fluorescence emitted by markers (fluorescein and / or phycoerythrin).
  • nucleotide derivative means any nucleotide analog which resists degradation by a nuclease. Mention may be made, for example, of the ⁇ S-phosphothioatedesoxynucleotides such as ⁇ S-dATP, ⁇ S-dTTP, S-dCTP, ⁇ S-dGTP, ⁇ S-dUTP and ⁇ S-dITP. These nucleotide derivatives can be labeled in particular with a fluorescent label.
  • a “probe” is defined as being a nucleotide fragment comprising for example from 10 to 100 nucleotides, in particular from 15 to 35 nucleotides, having a specificity of hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleic acid.
  • the probes according to the invention whether specific or non-specific, can be immobilized, directly or indirectly, on a solid support and can carry a labeling agent allowing or improving their detection.
  • the probe serves as a primer in the context of the invention since the objective is to incorporate a nucleotide modified in position n corresponding to the position of the mutation that is sought.
  • the 3 ′ end of the probe therefore ends at the maximum and preferably at n ⁇ 1.
  • the probe can be immobilized on a solid support by any suitable means, for example by covalence, by adsorption, or by direct synthesis on a solid support. These techniques are described in particular in patent application WO 92/10092.
  • the probe can be marked by means of a marker chosen, for example, from radioactive isotopes, enzymes, in particular enzymes capable of acting on a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate (in particular a peroxidase or an alkaline phosphatase) or alternatively enzymes producing or using protons (oxidase or hydrolase); chromophoric chemical compounds, chromogenic, fluorigenic or luminescent compounds, nucleotitic base analogs, and ligands such as biotin.
  • a marker chosen, for example, from radioactive isotopes, enzymes, in particular enzymes capable of acting on a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate (in particular a peroxidase or an alkaline
  • the labeling of the probes according to the invention is carried out by elements selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent agents, fluorescent, phosphorescent.
  • ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent agents, fluorescent, phosphorescent.
  • luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent agents, fluorescent, phosphorescent.
  • Another possibility is to label the probe with a peptide comprising an epitope recognized by a given antibody. The presence of this antibody can be revealed by means of a second labeled antibody.
  • step d) comprises the measurement of a variation of a physico-chemical, electrical, optical or mechanical characteristic of the solid support in particular chosen from the charge, the doping, the conductivity, the resistance, impedance or any other electrical variation effect, the field effect or any mass variation resulting in a field variation, the resonant frequency or electroacoustic admittance.
  • the solid support consists of a DNA chip which may include a material selected from semiconductors, dielectrics and piezoelectric transducers or an or-prism structure.
  • a group containing a metal atom can be grafted onto the probes, in particular a ferrocene group.
  • any measure of the change in an optical property of the solid support related to the presence or absence of DNA on said support is meant any measure of the change in an optical property of the solid support related to the presence or absence of DNA on said support.
  • This embodiment of the invention therefore includes the measurement of the refractive index of the support. It is possible to measure by this technique the internal and external reflection, for example of ellipsometry, of the evanescent waves comprising the measurement of the SPR (surface plasmon resonance), Brewster's angle of refraction, critical angle of reflection, FTR (frustrated total reflection), or STIR (scattered total internai reflection).
  • SPR surface plasmon resonance
  • FTR frustrated total reflection
  • STIR sintered total internai reflection
  • step d) consists in measuring the quantity of light transmitted, absorbed or emitted.
  • the support is made of a transparent material, in particular glass.
  • the techniques for attaching the probes to the glass are well known to those skilled in the art. One can for example measure the fluorescence of the previously marked probes and carry out the optical reading with a CCD camera.
  • an ⁇ S-phosphothioatedésoxynucleotide such as ⁇ S-dATP, ⁇ S-dTTP, ⁇ S-dCTP, ⁇ S-dGTP, ⁇ S-dUTP or ⁇ S-dITP is incorporated at the 3 ′ end of the probe.
  • This can be done for example by LCR, or preferably by asymmetric PCR, the probe then serving as a primer being in each case chemically coupled at its 5 ′ end to the solid phase at a predetermined site.
  • the ⁇ S-phosphothioatedésoxynucleotides can be easily incorporated into polynucleotides by all the polymerases and reverse transcriptases tested, which makes it possible to use DNA polymerases at a more advantageous cost price than in other detection of mutations.
  • the prior fixing of the probes at a specific site on the chip can be carried out by microfluidic addressing techniques developed by the company Orchid or photochemical techniques by the company Aff ⁇ métrix or even electro-addressing by Cis-Bio international, said techniques being within reach of the skilled person.
  • the target DNA is hybridized with a probe so that its 3 'end ends immediately before the nucleotide to be identified.
  • An ⁇ S- phosphothioatedésoxynucleotide is added to the 3 'end of the probe by means of a DNA polymerase and is therefore complementary to the nucleotide to be identified.
  • Step b) can be carried out in parallel on 4 sites (in tetrads) for each probe, with the addition of a reaction mixture comprising a different ⁇ S- phosphothioated deoxynucleotide per site. It is thus possible to detect a mutation at a given position in the target DNA whatever the nature of the basic substitution.
  • the method according to the invention is particularly intended for the detection of mutations in genes involved in diseases. Mention may in particular be made of hereditary genetic diseases, in particular hemochromatosis, sickle cell anemia, ⁇ and ⁇ thalassemia, cystic fibrosis, hemophilia, and mutations in the genes involved in cancer, for example in the Ras, p53, BRCA1 genes. An exhaustive list of mutations in these genes is given on the following website: ftp: // ncbi .nlm .nih. O v / repository / OMIM / morbidmap
  • the method according to the invention is useful when studying the polymorphism of genes or of any genetic region and for the detection and / or identification of genetically modified organisms (GMOs).
  • GMOs genetically modified organisms
  • Such a method may include a system for detecting the presence or absence of DNA at a given site of a chip, in particular a piezoelectric transducer, a field effect transducer, an optical density reader or fluorescence. It can be coupled to a data processing system, in particular to a computer.
  • kits comprising a DNA chip on which probes are fixed and at least one of the elements chosen from: a batch of 4 reaction mixtures each comprising a different ⁇ S- phosphothioatedésoxynucleotide selected from ⁇ S-dATP, ⁇ S-dTTP, ⁇ S-dCTP and ⁇ S-dGTP, a DNA polymerase, an exonuclease, in particular exonuclease III, a batch of solutions for dissolve the DNA polymerase and / or the exonuclease in the case where these enzymes are in the form of lyophilized powder.
  • the chips of this kit comprise a solid support of the ISFET, ENFET type.
  • This kit is intended for the detection of gene mutations implicated in diseases, in particular in hereditary genetic diseases and in cancer. It can also be used for genetic typing and the study of gene polymorphism (for the detection of SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)) and for the detection and / or identification of genetically modified organisms (GMOs).
  • GMOs genetically modified organisms
  • Figure 1 schematic representation of a particular mode of implementation method according to the invention. a) hybridization of a probe linked in 5 ′ to a solid support of the DNA chip type with a target nucleic acid, the 3 ′ end of said probe hybridizing to nucleotide n-1 of the nucleic acid target, b) incorporation in the 5 '-3' direction of an ⁇ S-dATP c) digestion with exonuclease III so that only the probes elongated in step b) are not degraded and washed, d) detection the presence or absence of the mutation by direct or indirect measurement of the presence or absence of DNA.
  • Figure 2 classic structure of a support of the Metal-Oxide-Semiconductor (MOS) type.
  • MOS Metal-Oxide-Semiconductor
  • Figure 4 principle of the chips according to the invention with a series of tetrads for the detection of mutations in the hemochromatosis gene.
  • Example 1 particular embodiment of the invention
  • Target DNA comprising a DNA fragment which contains a T— »G mutation at position n to be identified, is added to the surface of the chip. Said DNA fragment hybridizes to the complementary oligonucleotide probe labeled with FITC (fluorescein isothiocyanate) immobilized at a site defined on the support of the chip.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • an incorporated phosphothioatedésoxynucleotide ( ⁇ SdATP) is found in position complementary to the nucleotide T in position n. If the phosphothioatedésoxynucleotide which is in the reaction mixture is not complementary to the nucleotide to be identified (different from ⁇ SdATP), the probe is not extended in 3 '.
  • Exonuclease III then degrades all the probes which have not been extended by a phosphothioatedésoxynucleotide. Detection is then carried out by binding an anti-FITC conjugate conjugated to peroxidase. Once the enzyme-substrate reaction has been carried out, a strong measurement signal therefore indicates whether the nucleotide to be identified (T) is complementary to the phosphothioatedésoxynucleotide ( ⁇ SdATP) which was added to the reaction mixture for the reaction with the polymerase.
  • T nucleotide to be identified
  • ⁇ SdATP phosphothioatedésoxynucleotide
  • Example 2 Use of an ISFET or ENFET type support (Jaffrezic-Renault N., Microsensors and Microtechnics 225-235).
  • Figure 3A (taken from Jaffrezic-Renault) schematically represents the ISFET structure. This derives from the MOSFET structure (see Figure 2; Jaffrezic-Renault) in the sense that the metal grid is replaced by the electrolytes and the reference electrode.
  • Vj is a function of the chemical characteristic of the solution ( ⁇ 0 is the potential difference between the sensitive membrane and the solution).
  • ⁇ 0 is the potential difference between the sensitive membrane and the solution.
  • the drain current is kept constant and the voltage variation VQ which is proportional to ⁇ 0 is measured .
  • the membrane sensitive to pH consists of thin layers of Al O 3 , Ta 2 O 5 , If 3 N 4 .
  • Other membranes sensitive to K + , Na + , Ag + , F “ , Br “ , I “ , Ca 2 + and NO 3 " ions are also available.
  • Example 3 Use of a solid support of the piezoelectric transducer type.
  • Certain materials such as Si0 2 , TiO Ba, LiNbO 3 and piezoelectric polymers (PVF2) have the property of being deformed when a physical stress is applied; Perrot H. and Hoummady M., Piezoelectric transducers. A measurable electrical potential then appears due to the pressure exerted by the mass of DNA molecules. This measurement can be the resonant frequency or the admittance around the resonant frequency.
  • the DNA is in a liquid medium. Therefore, one can also measure the electroacoustic admittance or conductivity which depends in particular on the density and viscosity of the solution containing the electrolytes. We can thus detect a difference of 100 pg in liquid medium.
  • the point mutations designated HHP-1, HHP-19 and HHP-29 in US 5,753,438 can be detected by means of the method according to the invention using a probe whose 3 'end ends at n-1 of the position of the mutation:
  • the following probe can be used: 5'TATATAGATATTAGATATAAAGAA3 '(SEQ ID N ° 4)
  • the following probe can be used: 5 ⁇ ACCCCTAAAATATCTAAAAT3' (SEQ ID # 5)
  • the four ohgonucleotides SED ID No. 6 to 9 can be used for the identification of the nucleotide which is located immediately after the 3 'end of these ohgonucleotides.
  • a tetrad system can be provided for this purpose (see Figure 4).
  • Example 5 detection of mutations in genes involved in cancer.
  • the detection method according to the invention with a chip comprising specific probes for each of the above mutations therefore appears essential to guarantee a patient an exact diagnosis.
  • WO 91/13075 presents probes making it possible to detect point mutations in codon 12 of K-ras.
  • the following probes can be grafted onto the chip and therefore guarantee complete detection of all possible mutations:
  • This work aims to determine the genetic polymorphism of DNA through the use of a new biochip technique.
  • This technique consists in the gene amplification of interest, the hybridization of the amplification products obtained on a solid support (substrate) previously prepared by fixing a probe covalently, extension of the probe with a modified nucleotide, revelation degradation or protection of the probe.
  • the size of the amplification fragments expected in each case is approximately 100 bp
  • the amplifications obtained are checked on 1.5% agarose gel
  • the probes used for C282Y and H63D are those described in Example 4: two probes for each genotype to be determined.
  • the probes are fixed following a chemical modification of the surface allowing the reactivity of the 5 'ends of the probe ohgonucleotides.
  • the measurement of the fluorescence emission due to Cy3 is carried out (reading on a scanner for example) on each pad / chip.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un système de puces à ADN pour détecter une mutation dans une acide nucléique cible de maniéreà ce que seul l'ADN comportant la mutation demeure sur la puce à l'issu du procédé. L'invention concerne un procédé dans lequel un alpha S-phosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de la mutation est ajouté au moyen d'une ADN polymérase à l'extrémité 3' de la sonde hybridée à l'acide nucléique cible et dans lequel une exonucléase est ajoutée de sorte que seules les sondes élongées ne sont pas dégradées. La détection de la présence ou de l'absence de la mutation est effectuée par mesure directe ou indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN en un site donné sur la puce. Avantageusement, la puce comprend des transistors du type ISFET ou des transducteurs piézo-électriques.

Description

NOUVELLES PUCES A ADN
La présente invention se rapporte à un système de puces à ADN pour détecter une mutation dans un acide nucléique cible de manière à ce que seul l'ADN comportant la mutation demeure sur la puce à l'issu du procédé. L'invention concerne un procédé dans lequel un αS-phosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de la mutation est ajouté au moyen d'une ADN polymérase à l'extrémité 3' de la sonde hybridée à l'acide nucléique cible et dans lequel une exonuclease est ajoutée de sorte que seules les sondes élongées ne sont pas dégradées. La détection de la présence ou de l'absence de la mutation est effectuée par mesure directe ou indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN en un site donné sur la puce. Avantageusement, la puce comprend des transistors du type ISFET ou des transducteurs piézo-électriques.
Les mutations dans les cellules germinales ou dans les lignées somatiques peuvent avoir des conséquences redoutables sur l'organisme en provoquant par exemple des maladies génétiques héréditaires ou l'apparition de cancer. L'effet d'une mutation dépend étroitement de sa localisation dans l'ADN. Dans le cas d'une mutation dans une région codante, on peut observer la perte de la fonction de la protéine codée. Si la mutation se trouve dans une région régulatrice, l'expression de l'ADN peut être abolit ou augmenter. Une mutation dans un gène impliqué dans le cancer au niveau de la lignée germinale ne signifie pas obligatoirement que l'individu concerné contractera effectivement une tumeur, mais seulement que le risque de celle-ci est accru. En outre, lorsque l'on cherche à diagnostiquer le potentiel invasif d'une tumeur déjà établie, on ne sait pas d'avance quelles mutations il faut attendre car celles-ci peuvent se trouver sur plusieurs gènes ou à plusieurs endroits d'un même gène. Dès lors, il apparaît nécessaire de pouvoir détecter simultanément de nombreuses mutations. Le besoin en une technique de détection de mutations, de typage ou encore d'étude du polymorphisme se fait de plus en plus ressentir dans l'industrie soit pour permettre la découverte de nouvelles cibles biologiques d'intérêts, soit pour connaître précisément le profil génétique d'une tumeur ou d'un patient et envisager des thérapies adaptées. Ce besoin a conduit au développement de diverses techniques telles que la LCR, la SSCP et la RFLP mais elles ne permettent pas une recherche systématique de nombreuses mutations au sein d'un échantillon.
L'objectif à la base de la présente invention a été de mettre au point une technique permettant la détermination simultanée de plusieurs nucléotides à identifier et par conséquent le diagnostic de mutations et de polymorphismes de gènes, ou l'identification de micro-organismes pathogènes ou génétiquement modifiés. Plus spécifiquement, le problème réside en une compilation de différentes techniques biochimiques, électroniques ou optiques au sein d'un même dispositif qui serait particulièrement facile d'utilisation, qui pourrait générer des signaux avec un faible ratio bruit/ signal sans pour autant nécessiter un traitement fastidieux et une interprétation compliquée. Il est également important de fournir un dispositif le plus intégré possible et de faible coût.
Les puces à ADN pourraient répondre aux problèmes précités, mais telles qu'elles sont proposées dans l'état de la technique, elles comportent des limites inhérentes qui freinent leur exploitation à grande échelle.
Une puce consiste en une multitude de sondes nucléiques fixées avec précision à des endroits définis sur un support solide se présentant sous la forme de surfaces planes ou poreuses composées de différents matériaux permettant une telle fixation. Jusqu'à présent, le choix du support était conditionné par sa capacité à permettre la fixation des sondes. Des matériaux comme le verre, le silicium ou des polymères sont couramment utilisés dans l'état de la technique. Les sondes sont greffées sur ces surfaces lors d'une première étape appelée « fonctionalisation » dans laquelle on ajoute une couche intermédiaire de molécules réactives pour capter ou fixer les sondes. Le verre est un matériau de choix puisqu'il est inerte, non polaire et mécaniquement stable. Il a été utilisé dans un procédé de synthèse in situ d'oligonucléotides par un adressage photochimique mis au point par la société Affymetrix. Cette technique consiste à utiliser une surface de verre activée par addition de silane portant des groupes NH2 ou OH; Sheldon E.L. (1993) Clin. Chem. 39 (4), 718-719. Une autre méthode consiste à recouvrir la surface de verre par de la poly-L-lysine, de déposer les sondes puis d'effectuer la greffe par exposition aux UN. On peut également citer les polymères tels que les polypyrroles développés par CIS Biointernational.
Une fois les sondes attachées au support solide, on permet à l'ADΝ provenant d'échantillons de s'hybrider dans des conditions prédéfinies. La composition en base du duplex est un élément essentiel influençant sa stabilité qui dépend étroitement de la température de fusion (Tm). Lorsque l'on cherche à détecter des mutations ponctuelles, les mésappariements entraînent une chute du Tm, ce qui a pour conséquence une élimination des acides nucléiques qui ne se sont pas totalement hybridées lors de l'étape de lavage. Ainsi, il quasiment impossible de rechercher à détecter simultanément plusieurs mutations dans plusieurs gènes d'intérêts car les Tm varient d'un duplex à l'autre. De plus, la longueur des sondes représentent une difficulté technique non négligeable lorsque l'on souhaite détecter simultanément de nombreuses mutations à l'aide de différentes sondes de longueur différente.
En ce qui concerne l'étape de détection des hybridations, l'utilisation de molécules fluorescentes, telles que la fluorescéine, constitue la méthode de marquage la plus courante. Cette méthode permet une révélation directe ou indirecte de l'hybridation et l'utilisation de différents fluorochromes au sein d'une même expérience. Cependant, elle reste coûteuse, car elle nécessite l'emploi de dispositifs assez lourds pour la lecture des longueurs émises et pour l'interprétation du signal. La détection de l'hybridation peut également être réalisée en utilisant des marqueurs radioactifs. Toutefois, cette technique ne permet pas d'obtenir une définition satisfaisante lorsque l'on recherche une miniaturiser les puces.
Une approche alternative consiste à utiliser les propriétés des matériaux semiconducteurs. Par exemple, on peut choisir un support solide à base de silicium (Si) recouvert d'un diélectrique (Siθ2) sur lequel on fixe les sondes. Dans certaines conditions de polarisation adéquates, un courant, sensible aux modifications de charge du semi-conducteur, circule normalement de la source vers le drain. L'hybridation entre les sondes et l'ADN de l'échantillon entraîne une modification de la densité de charge du semi-conducteur à l'interface Si/Siθ2- Cette variation peut être mesurée et permet de détecter l'hybridation spécifique entre sondes et acides nucléiques cibles ; Souteyrand et al. (1995) Lettre des Sciences Chimiques 54, 9-11. Cette technique est utilisée par le laboratoire IFOS de l'Ecole Centrale de Lyon.
Une autre possibilité est l'utilisation de la puce développée par Bechman Instruments (Permittivity Chips™) qui bénéficie de la dispersion diélectrique due aux charges négatives des groupements phosphates présents dans le squelette nucléotidique. Ce phénomène, dépendant de la longueur de la molécule d'ADN, peut être quantifié par la fréquence de relaxation de la molécule. Cette grandeur varie en effet d'un facteur 100 lorsque la quantité d'ADN varie d'un facteur 10 ; Beattie K. et al (1993) Clin Chem 39 (4), 719-721. Dans cette technologie, on utilise un analyseur d'impédance pour mesurer l'énergie absorbée par les sondes lorsque celles-ci se trouvent appariées.
Les puces destinées à l'analyse de mutations doivent être capables d'analyser à l'aide de sondes chaque base d'une séquence déjà connue ou de détecter des mutations identifiées au préalable comme étant impliquées dans des maladies telles que le cancer.
Dans l'état de la technique, ces sondes sont décrites comme comprenant une partie homologue à la séquence de type sauvage et une modification (substitution, délétion, addition) localisée en milieu de séquence afin de standardiser les conditions d'hybridation. Dans le cas d'une analyse de substitution de base, les sondes sont organisées en tétrades, ensembles de quatre éléments dans lesquels une des sondes possède en position centrale la base homologue au nucléotide se trouvant dans la séquence sauvage ; les trois autres sondes contenant les trois autres bases possibles. Cette analyse in extenso est décrite dans Chee M. et al. (1996) Science 274, 610-613. Selon cette technique, une puce à ADN a été mise au point pour détecter des mutations hétérozygotes dans le gène BRCA1 par mesure de la fluorescence. Ce système comporte environ 105 oligonucléotides permettant la détection de substitutions et d'insertions de bases uniques, ainsi que des délétions longues de 1 à 5 nucléotides. Le système d'analyse des hybridations repose sur un marquage par deux couleurs (vert par la fluorescéine et rouge par une association phycoérythrine et streptavidine) ; Hacia JG et al. (1996) Nature Genêt 14, 441-447.
Comme évoquée précédemment, la constitution des puces doit être améliorée car l'analyse des hybridations est rendue difficile par l'adressage photochimique qui produit des impuretés et par les variations de stabilité des hetéroduplex. De plus, les dispositifs actuellement disponibles dans le commerce sont relativement onéreux. Enfin, ce système est limité par le fait qu'une étape d'amplification des échantillons est nécessaire si l'on veut obtenir un signal détectable. Une revue sur les puces à ADN est présentée dans Gramsey Graham « DNA Chips State of the Art » Nature Biotechnology vol. 16, Janvier 1998, dans Hinfray G. « Les puces à ADN » Biofutur, avril 1997 n°166, cahier n°91 et dans Marshall A. and Hodgson J. ; Nature Biotechnology vol. 16, Janvier 1998.
Dans le cadre de la présente invention, on a mis au point un système de puces à ADN qui repose sur l'hybridation spécifique de la sonde (servant dans le cas présent d'amorce oligonucléotidique) avec l'ADN cible, l'extension la sonde avec addition sélective d'au moins un dérivé d'oligonucléotide à l'extrémité 3' de l'amorce complémentaire de l'ADN cible ; l'amorce ainsi allongée étant résistante à la digestion par une exonuclease, en particulier par l'exonucléase III. On peut par exemple ajouter un αS-phosphothioatedésoxynucléotide grâce à une ADN polymérase ce qui empêche l'exonucléase III de digérer le duplex.
Ainsi, l'ADN reste présent en un site donné sur la puce seulement lorsque les conditions suivantes sont réunies : a) hybridation entre la sonde et l'ADN cible de l'échantillon, et b) présence d'une base complémentaire dans l'ADN cible permettant l'incorporation du αS-phosphothioatedésoxynucléotide dans la sonde ; ce qui empêche sa dégradation par la nucléase.
Dans le cas où la sonde ne s'hybride pas avec l'ADN cible, il y a élimination de la sonde en un site donné (micropuits ou autre). De même, si l'ADN cible ne contient pas la base complémentaire du αS-phosphothioatedésoxynucléotide donné, ce dernier n'est pas incorporé et la sonde est ensuite digérée par la nucléase.
On obtient ainsi des résultats simples à interpréter puisqu'ils sont seulement de deux type :
- ADN présent (1) - ou ADN absent (0).
Cette technique associée avec un support solide électronique permet de mesurer la différence de charge, de conductance, de résistance, d'impédance ou tout autre effet de variation électrique, de variation d'effet de champ ou encore toute variation de masse entraînant une variation électrique (transducteur piézoélectrique) sur le support solide. Par exemple, un tel support peut être un système semiconducteur, notamment un système ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor). Ce système capte donc des signaux simples 0 (pas d'ADN) ou 1 (ADN) du type binaire qui peuvent être directement transmis à un système de traitement de donné, notamment à un ordinateur. Il est également possible de détecter la présence d'ADN en un site donné de la puce par lecture optique (modification des propriétés optiques du support telles que la réfraction, variation de la densité ou mesure de la fluorescence) par exemple en couplant le dispositif à une caméra CCD. Dans un tel système, les résultats sont faciles à interpréter car ils se résument à des résultats ADN présent (1) ou ADN absent (0) et tous les signaux entre 1 et 0 obtenus jusqu'à présent dans l'état de la technique sont éliminés.
Les avantages conséquents de ce système résident dans le fait qu'un signal simple est détecté sans avoir obligatoirement recours à des marqueurs, que la sensibilité de détection se trouve accrue, qu'il existe moins de risque d'obtenir des faux négatifs ou positifs et que l'interprétation des signaux ne nécessite pas d'algorithme excessivement compliqué. D'autres avantages apparaîtront ci-après dans la description détaillée de l'invention.
Ainsi, la présente invention se rapporte à un procédé de détection d'une mutation en position n dans un acide nucléique cible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) hybridation d'une sonde liée en 5' à un support solide du type puce à ADN avec un acide nucléique cible, l'extrémité 3' de ladite sonde s'hybridant au maximum jusqu'au nucléotide n-1 de l'acide nucléique cible , b) élongation de la sonde hybridée à l'étape a) par incorporation dans la direction 5'-3' de nucléotides complémentaires dudit acide nucléique cible au moyen d'un mélange réactionnel comprenant au moins un dérivé de nucléotide résistant à la dégradation par une exonuclease et une ADN polymérase, c) digestion par ladite exonuclease de sorte que seules les sondes élongées à l'étape b) ne sont pas dégradées, lavage, d) détection de la présence ou de l'absence de la mutation par mesure directe ou indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN. Les étapes clés de ce procédé sont illustrées dans l'exemple présenté à la figure 1 ci- après.
On entend par « ADN polymérase », tout enzyme naturel ou modifié ayant une activité polymerasique. On peut citer par exemple les ADN pol exo-, notamment la T7 ou le fragment de klenow.
On entend par « exonuclease » tout enzyme naturel ou modifié ayant une activité exonucléasique. On peut citer par exemple l'exonucléase III. On peut également envisager l'utilisation des ADN polymérase possédant une activité de pyrophophorolyse (en présence d'une forte concentration en pyrophosphate, cet enzyme ajoute un pyrophosphate sur la dernière liaison phosphodiester et relâche donc le nucléotide en 3'. Ce produit est disponible chez Promega sous la marque READIT™, et des variants utilisant un système de révélation à la luciférase est disponible sous la marque READase™.
Lors de l'étape d), la présence ou l'absence de la mutation peut être mise en évidence, selon une premier mode de réalisation, par la mesure de la modification d'une propriété du support solide liée à la présence ou à l'absence d'ADN. Une autre solution, consiste à détecter la présence ou l'absence de la mutation par lecture optique de la présence ou à l'absence d'ADN. On entend par lecture optique, toute mesure d'absorption, de transmission ou d'émission de lumière qui peut éventuellement se trouver à une longueur d'onde spécifique (260 nm par exemple) soit directement de l'ADN, soit de toute molécule marqueur liée à la sonde. Cette définition comprend également toute mesure de la fluorescence émise par des marqueurs (fluorescéine et/ou phycoérythrine).
On entend par « dérivé de nucléotides », tout analogue de nucléotides qui résiste à la dégradation par une nucléase. On peut citer par exemple les αS- phosphothioatedésoxynucléotides tels que αS-dATP, αS-dTTP, S-dCTP, αS-dGTP, αS-dUTP et αS-dITP. Ces dérivés de nucléotides peuvent être marqués notamment avec un marqueur fluorescent.
Une « sonde » se définie comme étant un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 10 à 100 nucléotides, notamment de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible. Les sondes selon l'invention, qu'elles soient spécifiques ou non-spécifiques, peuvent être immobilisées, directement ou indirectement, sur un support solide et peuvent porter un agent marqueur permettant ou améliorant leur détection.
Bien entendu, la sonde sert d'amorce dans le cadre de l'invention puisque l'objectif est d'incorporer un nucléotide modifié en position n correspondant à la position de la mutation que l'on recherche. L'extrémité 3' de la sonde se termine donc au maximum et de préférence à n- 1.
La sonde est immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un support solide. Ces techniques sont notamment décrites dans la demande de brevet WO 92/10092. La sonde peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline) ou encore des enzymes produisant ou utilisant des protons (oxydase ou hydrolase) ; des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotitiques, et des ligands tels que la biotine. Le marquage des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Une autre possibilité est de marquer la sonde avec un peptide comprenant un épitope reconnu par un anticorps donné. La présence de cet anticorps peut être révélé au moyen d'un second anticorps marqué.
Selon la première alternative évoquée ci-dessus, l'étape d) comporte la mesure d'une variation d'une caractéristique physico-chimique, électrique, optique ou mécanique du support solide notamment choisit parmi la charge, le dopage, la conductivité, la résistance, l'impédance ou tout autre effet de variation électrique, de l'effet de champ ou encore toute variation de masse entraînant une variation de champ, de la fréquence de résonance ou de l'admittance électroacoustique. En ce sens, le support solide consiste en une puce à ADN qui peut comporter un matériau sélectionné parmi les semiconducteurs, les diélectriques et les transducteurs piézo-électriques ou une structure or-prisme. On peut donc retrouver donc une structure de base du type Si/SiO2 , des structures du type Métal-Oxyde- Semiconducteur (MOS), de préférence Electrolyte-Oxyde-Semiconducteur (EOS). De telles structures sont décrites Jaffrezic-Renault N. ISFET-ENFET, Microcapteurs et Microtechniques 225-235. En résumé, il s'agit de transistors à effet de champ (FET), notamment des transistors du type ISFET ou de préférence ENFET (Enzymatic Field Effect Transistor). Dans le cas d'un support ENFET, il peut être avantageux de lier à la sonde des enzymes de types hydrolases ou oxydases qui consomment ou produisent des protons. On rajoute un substrat de ces enzymes et on mesure la variation de pH.
Parmi les molécules permettant d'améliorer et/ou de simplifier la détection, un groupe contenant un atome métallique peut être greffé sur les sondes, notamment un groupe ferrocène.
Par mesure d'une modification des propriétés optiques du support, on entend toute mesure de la variation d'une propriété optique du support solide liée à la présence ou à l'absence d'ADN sur ledit support. On peut citer par exemple la technologie de la société Biacore qui est notamment décrite dans WO 97/38132. Ce mode de réalisation de l'invention comprend donc la mesure d'indice de réfraction du support. On peut mesurer par cette technique la réflection interne et externe, par exemple de l'ellipsométrie, des ondes évanescentes comprenant la mesure de la SPR (surface plasmon résonance), de l'angle de réfraction de Brewster, de l'angle critique de réflection, de la FTR (frustrated total reflection), ou la STIR (scattered total internai reflection). Ces analyses peuvent être réalisées au moyen du Biacore 3000™.
Conformément à la deuxième possibilité évoquée précédemment, l'étape d) consiste à mesurer la quantité de lumière transmise, absorbée ou émise. Dans ce cas, le support est fait d'un matériau transparent, notamment du verre. Les techniques d'accrochage des sondes sur le verre sont bien connues de l'homme du métier. On peut par exemple mesurer la fluorescence des sondes préalablement marquées et effectuer la lecture optique avec une caméra CCD.
Dans un mode préféré de réalisation, un αS-phosphothioatedésoxynucléotide tel que αS-dATP, αS-dTTP, αS-dCTP, αS-dGTP, αS-dUTP ou αS-dITP est incorporé à l'extrémité 3 'de la sonde. Cela peut s'effectuer par exemple par LCR, ou de préférence par PCR asymétrique, la sonde servant alors d'amorce étant dans chaque cas couplée chimiquement à son extrémité 5' à la phase solide en un site prédéterminé. Les αS- phosphothioatedésoxynucléotides peuvent être aisément incorporés dans des polynucléotides par toutes les polymérases et transcriptases inverses testées, ce qui permet d'utiliser des ADN polymérases d'un prix de revient plus avantageux que dans d'autres détections de mutations.
La fixation préalable des sondes en un site déterminé sur la puce peut être réalisée par les techniques d'adressage microfluidique développée par la société Orchid ou photochimique de la société Affïmétrix ou encore d'electroadressage par Cis-Bio international, lesdites techniques étant à la portée de l'homme du métier.
Selon l'invention, l'ADN cible est hybride avec une sonde de manière à ce que son extrémité 3' se termine immédiatement avant le nucléotide à identifier. Un αS- phosphothioatedésoxynucléotide est rajouté à l'extrémité 3' de la sonde au moyen d'une ADN polymérase et est par conséquent complémentaire du nucléotide à identifier. L'étape b) peut être réalisée parallèlement sur 4 sites (en tétrades) pour chaque sonde, avec addition d'un mélange réactionnel comprenant un αS- phosphothioatedésoxynucléotide différent par site. Il est ainsi possible de détecter une mutation en une position donnée de l'ADN cible quelque soit la nature de la substitution de base. Concernant la digestion de l'ADN à l'étape c), on peut avantageusement utiliser l'exonucléase III.
Le procédé selon l'invention est particulièrement destiné à la détection de mutations dans des gènes impliquées dans des maladies. On peut notamment citer les maladies génétiques héréditaires, en particulier l'hémochromatose, l'anémie à hématies falciformes, les β et α thalassemies, la fîbrose kystique, l'hémophilie, et des mutations dans les gènes impliqués dans le cancer, par exemple dans les gènes Ras, p53, BRCA1. Une liste exhaustive des mutations dans ces gènes est donné sur le site internet suivant : ftp : //ncbi .nlm .nih. O v/repository/OMIM/morbidmap
En outre, le procédé selon l'invention est utile lors de l'étude du polymorphisme des gènes ou de toute région génétique et pour la détection et/ou l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
Un autre aspect de l'invention porte sur un dispositif permettant de mettre en œuvre le procédé tel que décrit ci-dessus. Un tel procédé peut comprendre un système de détection de la présence ou de l'absence d'ADN en un site donné d'une puce, notamment un transducteur piezo-électrique, un transducteur à effet de champ, un lecteur de densité optique ou de fluorescence. Il peut être couplé à système de traitement de données, notamment à un ordinateur.
Un autre aspect de l'invention concerne un kit comprenant une puce à ADN sur laquelle sont fixées des sondes et au moins un des éléments choisis parmi : un lot de 4 mélanges réactionnels comportant chacun un αS- phosphothioatedésoxynucléotide différent sélectionné parmi αS-dATP, αS-dTTP, αS-dCTP et αS-dGTP, une ADN polymérase, une exonuclease, en particulier l'exonucléase III, un lot de solutions pour solubiliser l'ADN polymérase et/ou l'exonucléase dans le cas où ces enzymes se présentent sous la forme de poudre lyophilisée. Avantageusement, les puces de ce kit comportent un support solide du type ISFET, ENFET.
Ce kit est destiné à la détection de mutations de gènes impliquées dans des maladies, notamment dans des maladies génétiques héréditaires et dans le cancer. Il peut également servir pour le typage génétique et l'étude du polymorphisme des gènes (pour la détection de SNPs (Single Nucléotide Polymorphisme)) et pour la détection et/ou l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
Légendes des figures
Figure 1 : représentation schématique d'un mode particulier de mise en œuvre procédé selon l'invention. a) hybridation d'une sonde liée en 5' à un support solide du type puce à ADN avec un acide nucléique cible, l'extrémité 3' de ladite sonde s 'hy bridant jusqu'au nucléotide n- 1 de l'acide nucléique cible, b) incorporation dans la direction 5 '-3' d'un αS-dATP c) digestion par l'exonucléase III de sorte que seules les sondes élongées à l'étape b) ne sont pas dégradées et lavage, d) détection de la présence ou de l'absence de la mutation par mesure directe ou indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN. Figure 2 : structure classique d'un support du type Métal-Oxyde-Semiconducteur (MOS).
Schémas tirés de Jaffrezic-Renault.
Figure 3 : structures du type IFSET.
A- IFSET tirée de Jaffrezic-Renault B- DNAFET
Figure 4 : principe des puces selon l'invention avec une série de tétrades pour la détection de mutations dans le gène de l'hémochromatose.
Exemple 1 : mode de réalisation particulier de l'invention
L'ADN cible comportant un fragment d'ADN qui contient une mutation T— »G en position n à identifier, est ajouté à la surface de la puce. Ledit fragment d'ADN s'hybride à la sonde oligonucléotidique complémentaire marquée au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) immobilisée en un site défini sur le support de la puce. Lors de la réaction subséquente avec la polymérase, un phosphothioatedésoxynucléotide (αSdATP) incorporé se trouve en position complémentaire par rapport au nucléotide T en position n. Si le phosphothioatedésoxynucléotide qui se trouve dans le mélange réactionnel n'est pas complémentaire du nucléotide à identifier (différent de αSdATP), la sonde n'est pas prolongée en 3'. L'exonucléase III dégrade ensuite toutes les sondes qui n'ont pas été prolongées par un phosphothioatedésoxynucléotide. On réalise ensuite la détection par la liaison d'un conjugué anti-FITC conjugué à la peroxydase. Une fois effectuée la réaction enzyme-substrat, un fort signal de mesure indique donc si le nucléotide à identifier (T) est complémentaire du phosphothioatedésoxynucléotide (αSdATP) qui a été ajouté au mélange réactionnel pour la réaction avec la polymérase. Exemple 2 : Utilisation d'un support de type ISFET ou ENFET (Jaffrezic-Renault N., Microcapteurs et Microtechniques 225-235).
La figure 3A (tirée de Jaffrezic-Renault) représente schématiquement la structure ISFET. Celle-ci dérive de la structure MOSFET (voir figure 2 ; Jaffrezic-Renault) en ce sens que la grille métallique est remplacée par les électrolytes et l'électrode de référence. L'expression de la tension de seuil est : Vj = Wsc - Wref + φ0 - (Qs + Q NCi - 2ψb
Vj est fonction des caractéristique chimique de la solution (φ0 est la différence de potentiel entre la membrane sensible et la solution). Dans le circuit présenté à la figure 3 A, le courant de drain est maintenu constant et on mesure la variation de tension VQ qui est proportionnel à φ0. La membrane sensible au pH consiste en des couches minces de Al O3, Ta2O5, Si3N4. D'autres membranes sensibles aux ions K+, Na+, Ag+, F", Br", I", Ca2 + et NO3 " sont également disponibles.
Dans le cadre de l'invention, on peut fixer sur le support les sondes marquées avec un enzyme qui produit des protons, système ENFET (Figure 3B). On obtient ainsi, une mesure de la présence ou de l'absence de l'ADN sur le support suite à la digestion par l'exonucléase III via une mesure de la variation du pH de la solution se traduisant directement par une variation de la tension Vγ. Ce système peut éventuellement être couplé à un ou plusieurs amplificateur(s). La variation de tension dénote donc de la présence d'ADN. Le système peut être conçu de manière à ce qu'une variation seuil de tension provoque ou non la passage du courant par une série d'amplificateurs et de transistors et donne in fine un signal de type binaire :
(1) variation de la tension supérieure ou égale au seuil du transistor (ADN présent et mutation détectée), (0) variation inférieure au seuil du transistor (ADN absent et donc pas de mutation). Ces résultats peuvent ensuite être importés dans un système de traitement de données afin de compiler les résultats obtenus pour chaque site donné sur la puce.
Exemple 3 : Utilisation d'un support solide du type transducteurs piézo- électrique.
Certains matériaux tels que Si02, TiO Ba, LiNbO3 et les polymères pièzo-électrique (PVF2) ont la propriété de se déformer lorsqu'une contrainte physique est appliquée ; Perrot H. et Hoummady M., Transducteurs piézo-électrique. Il apparaît alors un potentiel électrique mesurable du à la pression exercée par la masse des molécules d'ADN. Cette mesure peut être la fréquence de résonance ou l'admittance autour de la fréquence de résonance. Dans le cas de la présente invention, l'ADN se trouve en milieu liquide. Dès lors, on peut également mesurer l'admittance électroacoustique ou la conductivité qui dépend notamment de la densité et de la viscosité de la solution contenant les électrolytes. On peu ainsi détecter une différence de 100 pg en milieu liquide.
Exemple 4 : Utilisation du procédé selon l'invention pour la détection de mutations ponctuelles impliquées dans l'hémochromatose.
Les mutations ponctuelles désignées HHP-1, HHP-19 et HHP-29 dans US 5,753,438 peuvent être détecter au moyen du procédé selon l'invention en utilisant une sonde dont l'extémité 3' se termine à n-1 de la position de la mutation :
HHP-1 : séquence normale
5' TCTTTTCAGAGCCACTCACG64CTTCCAGAGAAAGAGCCT 3' (SEQ ID N° 1) séquence mutée AG64
5' TCTTTTCAGAGCCACTCACA64CTTCCAGAGAAAGAGCCT 3' (SEQ ID N°
2). On utilise donc une sonde de séquence 5' AGAAAAGTCTCGGTGAGTG63 3' (SEQ ID N°3) accroché en 4 sites prédéfini de la puce (site A, T, G, C). Sur le site où on applique le mélange réactionnel comprenant αS-dTTP (site T), on obtient un signal dans le cas où il y a effectivement mutation dans l'ADN provenant de l'échantillon. Sur les autres sites A, G, et C , aucun signal n'est obtenu puisque l'ADN est digéré par l'exonucléase III.
Pour HHP-19 (A→G), on peut utiliser la sonde suivante : 5'TATATAGATATTAGATATAAAGAA3' (SEQ ID N°4) Pour HHP-29 (A- G) ), on peut utiliser la sonde suivante : 5ΑACCCCTAAAATATCTAAAAT3' (SEQ ID N°5)
On peut également détecter la mutation H63D, qui est due au remplacement d'une cystéine par une guanine sur le brin sens, avec les sondes SED ID N°6 et N°7 : G SEQ ID N°6 t
5' C^GCTGTTCGTGTTCTATGA CATGAGAGTCGCCGTGTGGAGCCCCG 3'
3'GTCGACAAGCACAAGATACTAGI1ACTCTCAGCGGCACACCTC[GGGGC 5' i SEQ ID N°7 C
On peut également détecter la mutation C282Y, qui est due au remplacement d'une guanine par une adénine sur le brin sens, avec les sondes SED ID N°8 et N°9 :
A SEQ ID N°8 t
5'qGGAAGAGCAGAGATATACGTGCCAGGTGGAGCACCCAGGCCTGGAT 3'
3 ' CCCTTCTCGTCTCTATATGC ACTGGTCC ACCTCGTGGGTCCGOACCTA-5 ' i SEQ ID N°9
C
Les quatre ohgonucléotides SED ID N°6 à 9 peuvent être utilisés pour l'identification du nucléotide qui se trouve immédiatement après l'extrémité 3 'de ces ohgonucléotides. On peut prévoir à cet effet un système en tétrade (voir figure 4). Exemple 5 : détection de mutations dans des gènes impliqués dans le cancer.
a) Mutations dans le gène MLHl EST liées à l'apparition du cancer colorectal. II existe à ce jour 60 mutations ponctuelles identifiées dans MLHl comme étant impliquées dans le cancer colorectal ; Bronner (1994) Nature 368, 258, Papadopoulos
(1994) Science 263, 1625.
On peut citer par exemple les mutations suivantes :
Accession Codon Nucléotide acide aminé CM950799 62 CAA-TAA Gln-Term
CM960964 107 ATA-AGA Ile-Arg
La liste complète est donnée online à www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/ns/1/249617.html.
Au vu du nombre importants de mutations pour un même gène, le procédé de détection selon l'invention avec une puce comportant des sondes spécifiques pour chacune des mutations précitées apparaît donc indispensable pour garantir à un patient un diagnostic exact.
b) Détection de mutations dans le gène K-ras.
WO 91/13075 présente des sondes permettant de détecter des mutations ponctuelles dans le codon 12 de K-ras. Dans le cadre de l'invention, on peut greffé sur la puce les sondes suivantes et dès lors garantir une détection complète de toutes les mutations possibles :
- 5' AAGGCACTCTTGCCTACGCCA 3' (SEQ ID N°10)
- 5' AGGCACTCTTGCCTACGCCAC 3' (SEQ IDN°l1) - 5' AACTTGTGGTAGTTGGAGCT 3' (SEQ ID N°12)
- 5' ACTTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3' (SEQ IDN°13)
- 5' ACTGGTGGTGGTTGGAGCAG 3' (SEQ IDN°14) Exemple 6 :
1) Objectif
Ce travail a pour objectif la détermination du polymorphisme génétique d'un ADN grâce à l'utilisation d'une nouvelle technique de biopuce.
Cette technique consiste en l'amplification génique d'intérêt, l'hybridation des produits d'amplification obtenus sur un support solide (substrat) préalablement préparé par fixation d'une sonde de façon covalente, extension de la sonde avec un nucléotide modifié, révélation de la dégradation ou de la protection de la sonde.
Ce protocole ci-dessous décrit est appliqué à la détermination du génotype C282Y et H63D du gène de l'hémochromatose.
2) Protocole
a) Préparation de l'ADN
PCR avec amorces pour amplifier région génomique d'intérêt correspondant au génotype C282Y et H63D.
Séquence des amorces utilisées :
C282Y For : gggCTggATAACCTTggCT (SEQ ID N°l 5)
C282Y Rev : gTCACATACCCCAgATCACA (SEQ ID N°16) H63D For : CCTTggTCTTTCCTTgTTTgA (SEQ ID N°17) H63D Rev : TCTggCTTgAAATTCTACTgg (SEQ ID N°18) Ces amorces sont modifiées à leur extrémité 5' avec l'ajout d'un marqueur fluorescent Cy3 (Amersham)
La taille des fragments d'amplification attendue dans chaque cas est d'environ 100 pb Les amplifications obtenues sont vérifiées sur gel d'agarose 1,5%
Les sondes utilisées pour C282Y et H63D sont celles décrites dans l'exemple 4: deux sondes pour chaque génotype à déterminer.
b) Préparation des supports solides
Les sondes sont fixées suite à une modification chimique de la surface permettant la réactivité de l' extrémités 5' des ohgonucléotides sondes.
Pour chaque génotype à déterminer, 2 sondes sont dessinées permettant l'hybridation des brins sens et anti-sens de l'amplification, et positionnées juste en amont de la base à révéler, voir description Exemple 4.
c) Hybridation sur les puces
1 Dilution des amplifications volume:volume avec du TE IX
2 Dénaturation des PCR 100°c pendant 5 min puis déposés dans la glace 1 min
3 Hybridation des PCR:
Produits d'amplification dilués dans un tampon d'hybridation (SSC 5X, Denhardt IX)
Dépôt sur le substrat de silicium de la PCR
Les substrats sont placés en chambre humide dans une boîte de Pétri à 37°c pendant 45 min sous 300 rpm
Lavages avec SSC 5X . 4 Détection du polymorphisme: a)- Elongation avec le dGTP uniquement Mix réalisé pour chaque puce :
Bst pol 8U/μl (Biolabs): 0,8 μl (soit 0,016 U/μl) Tampon Bst pol 10 X (Biolabs): 40 μl alphaThiodGTP (Amersham) 1 mM : 4 μl Eau stérile: 355, 2 μl
- Dépôt des 400 μl de Mix sur chaque puce - Incubation à 50°C 20 min sous 300 rpm
- Lavages avec SSC 5X
b)- Digestion
Mix réalisé pour les 3 puces Eau stérile : 1350 μl
Tampon Exo III 10 X (Biolabs): 150 μl Exo III lOOU/μl (Biolabs): 0,3 μl
- Dépôt des 400 μl de Mix sur chaque puce - Incubation à 37°c 10 min sous 300 rpm
- Lavages dans du PB S 0,1% Tween 20
d)- Révélation
La mesure de l'émission de fluorescence due à Cy3 est effectuée (lecture sur un scanner par exemple) sur chaque plot/puce.
3) Résultats
Un signal positif a été obtenu pour C282Y et H63D (résultats non présentés). Pour les différents ADN testés, on observe une disparition de la fluorescence due à Cy3 dans 1 plots sur 2 pour les différents génotypes.
En conclusion, une dégradation de certaines sondes par l'Exo III est observée et cette dégradation n'est observée que pour les brins n'ayant pas incorporé le thiodGTP.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection d'une mutation en position n dans un acide nucléique cible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) hybridation d'une sonde liée en 5' à un support solide du type puce à ADN avec un acide nucléique cible, l'extrémité 3' de ladite sonde s'hybridant au maximum jusqu'au nucléotide n-1 de l'acide nucléique cible , b) elongation de la sonde hybridée à l'étape a) par incorporation dans la direction 5'-3' de nucléotides complémentaires dudit acide nucléique cible au moyen d'un mélange réactionnel comprenant au moins un dérivé de nucléotide résistant à la dégradation par une exonuclease et une ADN polymérase, c) digestion par ladite exonuclease de sorte que seules les sondes élongées à l'étape b) ne sont pas dégradées, lavage, d) détection de la présence ou de l'absence de la mutation par mesure directe ou indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape d) la présence ou l'absence de la mutation par mesure de la modification d'une propriété du support solide liée à la présence ou à l'absence d'ADN.
3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape d) la présence ou l'absence de la mutation par lecture optique de la présence ou à l'absence d'ADN.
4. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'on mesure à l'étape d) une variation d'une caractéristique physico-chimique, électrique, optique ou mécanique du support solide notamment choisit parmi la charge, le dopage, la conductivité, la résistance, l'impédance ou tout autre effet de variation électrique, de l'effet de champ ou encore toute variation de masse entraînant une variation de champ, de la fréquence de résonance, de l'admittance électroacoustique, de l'indice de réfraction du support notamment de l'ellipsométrie, des ondes évanescentes comprenant la mesure de la SPR (surface plasmon résonance), de l'angle de réfraction de Brewster, de l'angle critique de reflection, de la FTR (frustrated total reflection), ou la STIR (scattered total internai reflection).
5. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le support solide consiste en une puce à ADN comprenant un matériau sélectionné parmi les semiconducteurs, les diélectriques et les transducteurs piézo-électrique ou une structure or-prisme.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le support solide comprend des structures du type Métal-Oxyde-Semiconducteur (MOS), de préférence Electrolyte-Oxyde-Semiconducteur (EOS).
7. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le support solide comprend des transistors à effet de champ (FET), notamment des transistors du type ISFET ou ENFET.
8. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'un groupe contenant un atome métallique est greffé sur les sondes, notamment un groupe ferrocène.
9. Procédé selon la revendication 3 caractérisé que ce que l'étape d) consiste à mesurer la quantité de lumière transmise à travers le support solide, ledit support étant fait d'un matériau transparent, notamment du verre.
10. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'étape d) consiste à mesurer la fluorescence des sondes préalablement marquées.
1 1. Procédé selon l'une des revendications 9 et 10 caractérisé en ce que la lecture optique est effectuée par une caméra CCD.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'on utilise à l'étape b) un αS-phosphothioatedésoxynucléotide, de préférence αS-dATP, αS-dTTP, αS-dCTP, αS-dGTP, αS-dUTP ou αS-dITP.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'on utilise à l'étape c) l'exonucléase III.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée parallèlement sur 4 sites pour chaque sonde, avec addition d'un mélange réactionnel comprenant un αS-phosphothioatedésoxynucléotide différent par site.
15. Procédé selon l'une des revendications précédentes destiné à la détection de mutations de gènes impliquées dans des maladies, notamment dans des maladies génétiques héréditaires, en particulier l'hémochromatose, l'anémie à hématies falciformes, les β et α thalassemies, la fibrose kystique, l'hémophilie, et des mutations dans les gènes impliqués dans le cancer.
16. Procédé selon l'une des revendications précédentes destiné à l'étude du polymorphisme des gènes ou de toute région génétique.
17. Procédé selon l'une des revendications précédentes destiné à la détection et/ou à l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
18. Dispositif permettant de mettre en œuvre le procédé selon l'une des revendications précédentes.
19. Dispositif selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il comprend un système de détection de la présence ou de l'absence d'ADN en un site donné d'une puce, notamment un transducteur piezo-électrique, un transducteur à effet de champ, un lecteur de densité optique ou de fluorescence.
20. Kit comprenant une puce à ADN sur laquelle sont fixées des sondes et au moins un des éléments choisis parmi : un lot de 4 mélanges réactionnels comportant chacun un αS- phosphothioatedésoxynucléotide différent sélectionné parmi αS-dATP, αS-dTTP, αS-dCTP, αS-dGTP, αS-dUTP et αS-dITP, une ADN polymérase, - une exonuclease, en particulier l'exonucléase III, un lot de solutions pour solubiliser l'ADN polymérase et/ou l'exonucléase dans le cas où ces enzymes se présentent sous la forme de poudre.
21. Kit selon la revendication 20 caractérisé en ce que les puces comportent un support solide du type ISFET, ENFET.
22. Kit selon l'une des revendications 20 et 21 caractérisé en ce qu'il est destiné à la détection de mutations de gènes impliquées dans des maladies, notamment dans des maladies génétiques héréditaires et dans le cancer.
23. Kit selon l'une des revendications 20 et 21 caractérisé en ce qu'il est destiné à la détection de SNPs (Single Nucletide Polymorphisme).
24. Kit selon l'une des revendications 20 et 21 caractérisé en ce qu'il est destiné à la détection et/ou l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
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