KR102395365B1 - 소수성 플레이트 상에 배열된 복수의 하이드로젤 미세입자를 포함하는 pcr용 반응 칩 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소수성 플레이트(plate); 및 상기 소수성 플레이트 상에 배열된 균일한 크기의 복수의 다공성 하이드로젤(hydrogel) 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩에 관한 것이다. 상기 반응 칩은 제조방법이 보다 간단하고, 상기 복수의 하이드로젤 미세입자 각각은 소수성 플레이트(plate) 상에 서로 분리되어 배열되어 하이드로젤 미세입자가 PCR 반응물을 PCR 과정이 진행되는 동안 보유할 수 있으므로 보관 및 사용이 용이하다. 또한, 각각의 하이드로젤 미세입자는 반응 챔버에서 각각 독립적으로 분리되어 반응이 일어날 수 있어 PCR 반응물 및 반응 생성물이 오염될 가능성이 매우 낮아 정확도가 우수하다.

Description

소수성 플레이트 상에 배열된 복수의 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩 {Reaction chip for PCR comprising multiple hydrogel microparticles arranged on a hydrophobic plate}
본 명세서에는 디지털 PCR용 반응 칩, 이의 제조방법, 이를 이용한 PCR 방법이 개시된다.
중합효소 연쇄 반응, 즉 PCR(Polymerase Chain Reaction)은 핵산을 포함하는 샘플 용액을 반복적으로 가열 및 냉각하고 핵산의 특정 염기 서열을 갖는 부위를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 기술로써, 구체적으로 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing), 및 신장(Extension) 등의 일련의 온도 효소 반응 단계로 진행될 수 있다. PCR은 생명과학, 유전공학 및 의료 분야 등에서 분석 및 진단 목적으로 널리 사용되고 있다.
PCR은 최근 디지털 PCR이 도입되면서 3세대로 구분할 수 있다. 앞선 1세대 일반 PCR은 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동을 통해 유전자의 정성분석이 가능한 시스템으로, 정량적인 분석은 힘들었다. 이러한 정량적인 부분을 보완하기 위해 개발된 2세대 PCR인 리얼타임(Real-time) PCR은 상대정량분석을 기반으로 Ct value를 통해 유전자 발현의 정량 및 정성분석이 가능한 시스템이다. 하지만 리얼타임 PCR의 경우, 절대정량 분석을 위해서는 표준곡선이 필수이며 PCR의 효율에 따라 결과 값에 편차가 생길 수 있는 단점을 가지고 있다. 이러한 정량분석의 한계를 극복하기 위한 방법으로 디지털 PCR의 개념이 적용되기 시작하였다.
디지털　PCR은 샘플을 다수의 구획에 나누어　포획한 후 각 구획에서 개별적으로 반응을 수행하는 방식으로, 표준물질 없이도 검출목표 유전자의 실시간 절대정량이 가능하며, 극소량의 시료만으로도 분석이 가능하며, 리얼타임 PCR에 비하여 많은 양의 시료를 동시에 처리할 수 있다는 장점이 있다.
디지털 PCR에서는 형광 신호가 나타나는 웰(well)당 유전자 카피수가 1개인 경우에만 데이터의 신뢰성이 보장된다. 즉, 디지털 PCR에서의 정량은 프아송 분포(poisson distribution)를 통해 웰당 신호가 있거나 없는 경우 이를 디지털 값 1 또는 0으로 보고 포지티브(1의 값)와 네가티브(0의 값)의 비율을 계산하는데, 전체 포지티브와 네가티브 합에 대한 포지티브의 비율이 프아송 분포의 유전자 카피수 1개를 크게 벗어나는 경우에는 확률적으로 웰 당 유전자 카피수가 1개를 초과하는 것을 의미하는 것이므로 데이터의 신뢰성을 담보할 수 없게 된다. 이러한 이유로 디지털 PCR에서는 증폭 후 정량한 값이 프아송 분포를 만족시키지 않아 웰 당 유전자 카피수가 1개를 크게 초과하는 경우에는 유전자 시료를 희석하여 프아송 분포를 만족시키도록 하는 것이 중요하고 웰 당 유전자 카피수 1개에 근접한 경우에는 보정된 값으로 정량하는 것이 중요하다. 예를 들어, Poisson 9 프로그램을 이용하여 보정가능하다.
디지털 PCR은 정량 분석의 용이성, 대용량 분석, 다량의 시료 처리 능력 등에도 불구하고 현재까지는 디지털 PCR의 데이터 신뢰성 확보를 위한 정량 분석의 보정 기술이 요구되고 있고, 웰당 유전자 카피수를 1개로 맞추는데 기술적인 어려움이 존재하고 있다. 특히, 기존 디지털 PCR은 표적 핵산 주형(template), 프라이머 및 형광 프로브를 포함하는 액상(liquid)의 액적(droplet)을 디지털 PCR 수행 시마다 고가의 복잡한 장비를 이용하여 제조하여 각각을 하나의 웰에 분배하고, 이를 증폭 후 형광 프로브를 검출하는 3단계(액적 제조, 증폭 및 검출)를 각기 다른 장비를 이용하여 수행해야한다. 이러한 과정은 매우 복잡하고 오랜 시간이 걸리며 한 번에 많은 수의 안정적인 액적을 제조할 수 있는 장비일수록 고가여서 시간 및 비용적으로 효율성이 떨어진다. 나아가, 기존 디지털 PCR에서 제조된 액적은 액체 형태여서 보관, 운반 및 재사용이 어렵다는 한계가 있다.
Shen. F., Du. W. et al., Digital PCR on a SlipChip, Lab on a Chip, Issue 20, 2010 DOI:10.1039/c004521g Gudrun Pohl and le-Ming Shih, Principle and applications of digital PCR, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1), 41-47 (2004)
일 측면에서, 본 발명의 목적은 시간 및 비용 효율적으로 PCR, 구체적으로 디지털 PCR을 수행하기 위한 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩, PCR용 반응 칩 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 PCR용 반응 칩을 이용한 PCR 방법 및 상기 PCR용 반응 칩을 포함하는 PCR 장치를 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 소수성 플레이트(plate); 및 복수의 다공성 하이드로젤(hydrogel) 미세입자를 포함하고, 상기 복수의 하이드로젤 미세입자는 상기 소수성 플레이트에 서로 분리되어 배열되며, 상기 하이드로젤 미세입자는 친수성 폴리머인, PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄 반응)용 반응 칩을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (1) 소수성 플레이트(plate)를 준비하는 단계; (2) 친수성 프레폴리머(pre-polymer)를 포함하는 미세입자 형성 용액을 제조하는 단계; (3) 상기 소수성 플레이트 위에 상기 미세입자 형성 용액을 3차원 형태로 사출(jetting)하여 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자를 상기 소수성 플레이트 상에 배열하는 단계; (4) 상기 소수성 플레이트 상에 배열된 하이드로젤 미세입자를 경화시키는 단계; 및 (5) 상기 소수성 플레이트에 배열된 하이드로젤 미세입자 표면에 수불용성 용액을 흘려주어 입자들을 분리(isolation)시키는 단계를 포함하는 PCR용 반응 칩 제조방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 표적(target) 핵산이 포함된 검출 시료를 상기 PCR용 반응 칩에 주입하는 단계; 및 상기 표적 핵산을 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는 PCR 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 PCR용 반응 칩; 및 반응 챔버(chamber)를 포함하는 PCR 장치를 제공한다.
본 발명은, 소수성 플레이트 및 상기 소수성 플레이트 상에 배열된 복수의 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩을 제공한다. 상기 본 발명에 따른 PCR용 반응 칩은 제조방법이 보다 간단하고, 하이드로젤 미세입자가 PCR 반응물을 PCR 과정이 진행되는 동안 보유할 수 있어 보관 및 사용이 용이하다. 또한, 각각의 하이드로젤 미세입자는 반응 챔버에서 각각 분리된 채로 반응이 일어날 수 있어 PCR 반응물 및 반응 생성물이 오염될 가능성이 매우 낮아 정확도가 우수하다. 종래의 디지털 PCR에서 사용되는 드롭렛(droplet)보다 본 발명에 따른 하이드로젤 미세입자가 더 안정하기 때문에, 30 분 동안 40 사이클이 수행되는 PCR 프로토콜을 보다 빠르게 진행할 수 있어 효율적이다. 또한 본 발명에 따른 PCR용 반응 칩은 형광 염료 또는 형광 프로브에 의해 검출되는 미세입자의 수를 계수함으로써 표적 핵산을 정량적으로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 디지털 PCR을 수행하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩 제조 과정 중 소수성 플레이트 위에 하이드로젤 미세입자 형성 용액을 사출하여 하이드로젤 미세입자를 소수성 플레이트 상에 배열시킨 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 나타낸 사진이다.
도 3b는 디지털 PCR용 반응 칩의 소수성 플레이트 상에 배열된 복수의 하이드로젤 미세입자들을 여러 크기로 확대하여 촬영한 사진이다.
도 3c는 상기 도 3b의 하이드로젤 미세입자를 확대한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예인 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩의 제조단계 및 이를 이용한 디지털 PCR 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예인 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩의 제조 및 이를 이용한 디지털 PCR 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 나타낸 도이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩에 검출 시료 및 디지털 PCR 반응 용액을 주입하였을 때의 모습을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩에서 PCR 증폭을 수행한 후의 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 초기 PCR 반응물(1차 PCR 반응물)의 디지털 PCR을 수행한 결과(Taqman 프로브를 이용하여 검출)를 나타내는 도이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 2차 PCR 반응물(1차 PCR 반응물을 1/10로 희석)의 디지털 PCR을 수행한 결과(Taqman 프로브를 이용하여 검출)를 나타내는 도이다.
도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 3차 PCR 반응물(2차 PCR 반응물을 1/10로 희석)의 디지털 PCR을 수행한 결과(Taqman 프로브를 이용하여 검출)를 나타내는 도이다.
도 7d는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 4차 PCR 반응물(3차 PCR 반응물을 1/10로 희석)의 디지털 PCR을 수행한 결과(Taqman 프로브를 이용하여 검출)를 나타내는 도이다.
도 7e는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 5차 PCR 반응물(4차 PCR 반응물을 1/10로 희석)의 디지털 PCR을 수행한 결과(Taqman 프로브를 이용하여 검출)를 나타내는 도이다.
도 7f는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 6차 PCR 반응물(5차 PCR 반응물을 1/10로 희석)의 디지털 PCR을 수행한 결과(Taqman 프로브를 이용하여 검출)를 나타내는 도이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 초기 PCR 반응물(1차 PCR 반응물)의 디지털 PCR을 수행한 결과(SYBR 그린을 이용하여 검출)를 나타내는 도이다. (E.coli_10^5)
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 2차 PCR 반응물(1차 PCR 반응물을 1/10로 희석)의 디지털 PCR을 수행한 결과(SYBR 그린을 이용하여 검출)를 나타내는 도이다.(E.coli_10^4)
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 3차 PCR 반응물(2차 PCR 반응물을 1/10로 희석)의 디지털 PCR을 수행한 결과(SYBR 그린을 이용하여 검출)를 나타내는 도이다.(E.coli_10^3)
도 8d는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 4차 PCR 반응물(3차 PCR 반응물을 1/10로 희석)의 디지털 PCR을 수행한 결과(SYBR 그린을 이용하여 검출)를 나타내는 도이다.(E.coli_10^2)
도 8e는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 5차 PCR 반응물(4차 PCR 반응물을 1/10로 희석)의 디지털 PCR을 수행한 결과(SYBR 그린을 이용하여 검출)를 나타내는 도이다. (E.coli_10^1)
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 NTC 테스트를 수행한 결과(Taqman 프로브를 이용하여 검출) 중 1번째 사이클의 결과를 나타낸 도이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 NTC 테스트를 수행한 결과(Taqman 프로브를 이용하여 검출) 중 40번째 사이클의 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩으로서, 프라이머가 고정되어 있지 않은 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 NTC 테스트를 수행한 결과(SYBR 그린을 이용하여 검출)를 나타낸 도이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 표적 핵산인 BCR-ABL을 포함하는 K562 토탈 RNA를 증폭한 결과로, K562 one-step RT-qPCR 1번째 사이클의 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 표적 핵산인 BCR-ABL을 포함하는 K562 토탈 RNA를 증폭한 결과로, K562 one-step RT-qPCR 40번째 사이클의 결과를 나타낸 도이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 표적 RNA인 BCR-ABL를 증폭한 결과를 나타내는 도로, 음성 대조군(negative control)인 HeLa 토탈 RNA(total RNA)와 실험군(positive control)인 K562 total RNA를 함께 섞어 증폭하기 전 1번째 사이클의 결과를 나타낸 도이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 표적 RNA인 BCR-ABL를 증폭한 결과를 나타내는 도로, 음성 대조군(negative control)인 HeLa 토탈 RNA(total RNA)와 실험군(positive control)인 K562 토탈 RNA를 함께 섞어 증폭한 40번째 사이클의 결과를 나타낸 도이다.
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 50 kbp 길이의 gDNA를 표적 핵산으로 하여 디지털 PCR를 수행한 결과로, 1번째 사이클의 결과를 나타낸 도이다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 50 kbp 길이의 gDNA를 표적 핵산으로 하여 디지털 PCR를 수행한 결과로, 40번째 사이클의 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 소수성 플레이트(plate); 및 복수의 다공성 하이드로젤(hydrogel) 미세입자를 포함하고, 상기 복수의 하이드로젤 미세입자는 상기 소수성 플레이트에 서로 분리되어 배열되며, 상기 하이드로젤 미세입자는 친수성 폴리머인, PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄 반응)용 반응 칩을 제공한다.
상기 반응 칩은 PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄 반응)을 위한 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄 반응)을 위한 반응 칩일 수 있다. 상기 디지털 PCR은 샘플을 다수의 구획에 나누어　포획한 후 각 구획에서 개별적으로 반응을 수행하는 방식으로, 표준물질 없이도 검출목표 유전자의 실시간 절대정량이 가능하며, 극소량의 시료만으로도 분석이 가능하며, 실시간 PCR(real-time PCR)에 비하여 많은 양의 시료를 동시에 처리할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 기존의 qPCR의 결과 분석 방식이 아날로그 방식인 점에 반해, 상기 디지털 PCR은 결과 신호가 "0" 또는 "1"의 값을 가져 분석 방식이 디지털 방식인 디지털 PCR은 한번에 다양한 시료의 검사 그리고 다양한 검사 항목을 한번에 수행할 수 있는 장점이 있다. 디지털 PCR은 DNA 시료를 표준 곡선이 필요 없는 단일 분자 계수법을 적용하여 절대정량이 가능한 기술로서, 하나의 웰 당 하나의 액적(droplet)에 대한 PCR 반응으로 보다 정확한 절대 정량을 수행할 수 있는 장점이 있다(Gudrun Pohl and le-Ming Shih, Principle and applications of digital PCR, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1), 41-47 (2004) 참조).
본 발명의 일 실시예에 따른 PCR용 반응 칩은 소수성 플레이트(hydrophobic plate)를 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 소수성 플레이트는 소수성 재료로 제조된 플레이트이거나 플레이트상에 소수성 코팅층이 적층된 것일 수 있으나, 소수성을 갖는 플레이트라면 제한되지 않는다. 일 실시예로서 상기 소수성 플레이트는 유리 플레이트일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PCR용 반응 칩은 상기 플레이트 상에 배열된 균일한 크기의 복수의 다공성 하이드로젤(hydrogel) 미세입자를 포함할 수 있다. 상기 다공성 하이드로젤 미세입자는 표적 핵산, PCR, 디지털 PCR을 수행할 수 있는 3차원의 구조체라면 제한되지 않으며, 예를 들면 디스크와 같은 판상형(Plate type), 기둥형(post type), 구형(spherical type), 반구형(hemisphericaltype) 등의 형태일 수 있다. 일 실시예로서 상기 다공성 하이드로젤 미세입자는 구체적으로 평균 1 ㎛ 내지 5000 ㎛, 보다 구체적으로 평균 10 내지 500 μm의 입경크기를 가질 수 있다. 본 명세서에서 평균 입경 크기는 한 입자의 중심을 지나는 현의 길이의 평균 값을 의미한다. 예를 들어 다공성 하이드로젤 미세입자가 구형인 경우, 평균 입경 크기는 입자의 중심을 지나는 지름의 평균 값이다. 보다 더 구체적으로 상기 다공성 하이드로젤 미세입자의 평균 입경크기는 1㎛ 이상, 2㎛ 이상, 3㎛ 이상, 4㎛ 이상, 5㎛ 이상, 6㎛ 이상, 7㎛ 이상, 8㎛ 이상, 9㎛ 이상, 10 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상, 30 ㎛ 이상, 40 ㎛ 이상, 50 ㎛ 이상, 60 ㎛ 이상, 70 ㎛ 이상, 80 ㎛ 이상, 90 ㎛ 이상, 100 ㎛ 이상, 110 ㎛ 이상, 120 ㎛ 이상, 130 ㎛ 이상, 140 ㎛ 이상, 150 ㎛ 이상, 160 ㎛ 이상, 170 ㎛ 이상, 180 ㎛ 이상, 190 ㎛ 이상, 200 ㎛ 이상, 210 ㎛ 이상, 220 ㎛ 이상, 230 ㎛ 이상, 240 ㎛ 이상, 250 ㎛ 이상, 260 ㎛ 이상, 270 ㎛ 이상, 280 ㎛ 이상, 290 ㎛ 이상, 300 ㎛ 이상, 310 ㎛ 이상, 320 ㎛ 이상, 330 ㎛ 이상, 340 ㎛ 이상, 350 ㎛ 이상, 360 ㎛ 이상, 370 ㎛ 이상, 380 ㎛ 이상, 390 ㎛ 이상, 400 ㎛ 이상, 410 ㎛ 이상, 420 ㎛ 이상, 430 ㎛ 이상, 440 ㎛ 이상, 450 ㎛ 이상, 460 ㎛ 이상, 470 ㎛ 이상, 480 ㎛ 이상, 490 ㎛ 이상, 500 ㎛ 이상, 600 ㎛ 이상, 700 ㎛ 이상, 800 ㎛ 이상, 900 ㎛ 이상, 1000 ㎛ 이상, 1500 ㎛ 이상, 2000 ㎛ 이상, 2500 ㎛ 이상, 3000 ㎛ 이상, 3500 ㎛ 이상, 4000 ㎛ 이상 또는 4500 ㎛ 이상일 수 있고, 5000 ㎛ 이하, 4500 ㎛ 이하, 4000 ㎛ 이하, 3500 ㎛ 이하, 3000 ㎛ 이하, 2500 ㎛ 이하, 2000 ㎛ 이하, 1500 ㎛ 이하, 1000 ㎛ 이하, 900 ㎛ 이하, 800 ㎛ 이하, 700 ㎛ 이하, 600 ㎛ 이하, 500 ㎛ 이하, 490 ㎛ 이하, 480 ㎛ 이하, 470 ㎛ 이하, 460 ㎛ 이하, 450 ㎛ 이하, 440 ㎛ 이하, 430 ㎛ 이하, 420 ㎛ 이하, 410 ㎛ 이하, 400 ㎛ 이하, 390 ㎛ 이하, 380 ㎛ 이하, 370 ㎛ 이하, 360 ㎛ 이하, 350 ㎛ 이하, 340 ㎛ 이하, 330 ㎛ 이하, 320 ㎛ 이하, 310 ㎛ 이하, 300 ㎛ 이하, 290 ㎛ 이하, 280 ㎛ 이하, 270 ㎛ 이하, 260 ㎛ 이하, 250 ㎛ 이하, 240 ㎛ 이하, 230 ㎛ 이하, 220 ㎛ 이하, 210 ㎛ 이하, 200 ㎛ 이하, 190 ㎛ 이하, 180 ㎛ 이하, 170 ㎛ 이하, 160 ㎛ 이하, 150 ㎛ 이하, 140 ㎛ 이하, 130 ㎛ 이하, 120 ㎛ 이하, 110 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이하, 90 ㎛ 이하, 80 ㎛ 이하, 70 ㎛ 이하, 60 ㎛ 이하, 50 ㎛ 이하, 40 ㎛ 이하, 30 ㎛ 이하, 20 ㎛ 이하, 10㎛ 이하, 5㎛ 이하 또는 2㎛ 이하일 수 있으나, 상기 소수성 플레이트 상에서 배열되어 디지털 PCR을 수행하기 위한 입경 크기라면 제한되지 않는다. 일 실시예로서, 상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자들의 각 입자 평균 직경은 10 내지 500 μm로 균일한 것일 수 있고, 구체적으로 상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자의 각 평균 직경은 10 내지 500 μm, 10 내지 400 μm, 10 내지 300 μm, 10 내지 200 μm, 20 내지 500 μm, 20 내지 400 μm, 20 내지 300 μm, 20 내지 200 μm, 30 내지 500 μm, 30 내지 400 μm, 30 내지 300 μm, 30 내지 200 μm, 30 내지 100 μm, 100 내지 500 μm, 100 내지 400 μm, 100 내지 300 μm, 200 내지 500 μm, 200 내지 400 μm, 200 내지 300 μm, 220 내지 500 μm, 220 내지 450 μm, 220 내지 400 μm, 220 내지 380 μm, 220 내지 360 μm, 220 내지 340 μm, 220 내지 320 μm, 220 내지 300 μm, 240 내지 500 μm, 240 내지 450 μm, 240 내지 400 μm, 240 내지 380 μm, 240 내지 360 μm, 240 내지 340 μm, 240 내지 320 μm, 240 내지 300 μm, 260 내지 500 μm, 260 내지 450 μm, 260 내지 400 μm, 260 내지 380 μm, 260 내지 360 μm, 260 내지 340 μm, 260 내지 320 μm, 260 내지 300 μm, 280 내지 500 μm, 280 내지 450 μm, 280 내지 400 μm, 280 내지 380 μm, 280 내지 360 μm, 280 내지 340 μm, 280 내지 320 μm 또는 280 내지 300 μm로 균일한 것일 수 있다. 상기 다공성 하이드로젤 미세입자는 공극을 포함하는 다공성(porous) 미세입자일 수 있고, 상기 미세입자의 공극율은 미세입자의 총 부피에 대하여 10 내지 95 부피%, 구체적으로, 10 부피% 이상, 15 부피% 이상, 20 부피% 이상, 25 부피% 이상, 30 부피% 이상, 35 부피% 이상, 40 부피% 이상, 45 부피% 이상, 50 부피% 이상, 55 부피% 이상, 60 부피% 이상, 65 부피% 이상, 70 부피% 이상, 75 부피% 이상, 80 부피% 이상, 85 부피% 이상 또는 90 부피% 이상일 수 있고, 95 부피% 이하, 90 부피% 이하, 85 부피% 이하, 80 부피% 이하, 75 부피% 이하, 70 부피% 이하, 65 부피% 이하, 60 부피% 이하, 55 부피% 이하, 50 부피% 이하, 45 부피% 이하, 40 부피% 이하, 35 부피% 이하, 30 부피% 이하, 25 부피% 이하, 20 부피% 이하 또는 15 부피% 이하일 수 있다. 공극율이 상기 범위를 벗어날 경우 다공성이 떨어지거나 구조체의 안정도가 불안정해질 수 있다.
일 실시예로서 상기 다공성 하이드로젤 미세입자는 친수성 폴리머이며, 보다구체적으로는 프레폴리머(pre-polymer)의 고형물일 수 있다. 즉, 상기 다공성 하이드로젤 미세입자의 재료는 고형화가 가능한 프레폴리머(pre-polymer)라면 제한없이 사용할 수 있으며, 구체적으로 폴리에틸렌 글리콜-디아크릴레이트(Polyethylene Glycol-Diacrylate, PEG-DA) 또는 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide, PAAM)와 같은 친수성 폴리머를 사용할 수 있다.
일 실시예로서 상기 다공성 하이드로젤 미세입자는 상기 프레폴리머(pre-polymer), 공극유도중합체(porogen), 광개시제 및 증류수를 혼합하여 미세입자 형성 용액을 제조하는 단계; 상기 미세입자 형성 용액, 또는 상기 미세입자 형성 용액과 표적 핵산의 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 하나 이상이 혼합된 용액을 상기 PCR용 반응 칩의 소수성 플레이트 상에 사출하는 단계; 및 상기 미세입자 형성 용액 또는 혼합 용액을 목적하는 형상으로 성형하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에서 상기 "프레폴리머(pre-polymer)"란 폴리머의 성형가공을 용이하게 하기 위해 중합 또는 중축합 반응을 적당한 단계에서 정지한 예비 중합물을 의미하는 것으로, 본 발명의 경우 고형화되기 이전의 성형가공이 용이한 상태의 폴리머를 의미한다. 또한, 일 실시예에서 상기 표적 핵산의 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 하나 이상이 혼합된 용액은 상기 프라이머를 미세입자에 고정화하기 위한 작용기를 더 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 미세입자 형성 용액의 제조단계는 용액에 포함된 공극유도중합체의 분자량을 변형시킴으로써 미세입자 내에 형성되는 공극의 크기를 조절하는 것을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 공극유도중합체는 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG)을 사용할 수 있으며, 구체적으로 PEG200, PEG300, PEG400, PEG600, PEG1000, PEG1500, PEG2000, PEG3000, PEG3350, PEG4000, PEG6000, PEG8000, PEG10000, PEG12000, PEG20000, PEG35000, PEG40000 등(제조사: Sigma Aldrich)을 사용할 수 있다. 상기 공극유도중합체의 분자량에 따라 표적 핵산 증폭 또는 검출 효율이 변할 수 있다. 상기 다공성 하이드로젤 미세입자 제조방법은 상기 성형된 다공성 하이드로젤 미세입자를 세정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세정 단계는 세정을 통하여 상기 다공성 구조의 공극 내부에 고정되지 않은 프로브를 제거하는 것을 포함할 수 있으며, 공극유도중합체를 제거하는 것을 더 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 혼합된 용액을 목적하는 형상으로 성형하는 단계는 일 실시예로서 마스크 또는 형틀(mold)을 통해 목적하는 형상으로 성형하거나, 액적(droplet) 형태로 성형하여 광가교시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이를 통해 다양한 형태 및 크기의 입자로 제조할 수 있다.
기존 디지털 PCR은 표적 핵산 주형(template), 프라이머 및 형광 프로브를 포함하는 액상(liquid)의 액적(droplet)을 디지털 PCR 수행 시마다 고가의 복잡한 장비를 이용하여 제조해야 한다는 단점이 있었다. 즉, 액적 각각을 하나의 웰에 분배하여, 이를 증폭 후 형광 프로브를 검출하는 3단계(액적 제조, 증폭 및 검출)를 각기 다른 장비를 이용하여 수행해야 하므로, 과정이 매우 복잡하고 오랜 시간이 걸리며 한 번에 많은 수의, 그리고 안정적인 액적을 제조할 수 있는 장비일수록 고가여서 시간 및 비용적으로 효율성이 떨어진다. 이에 반해, 본 발명에 따른 PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩은 기존 디지털 PCR의 액적에 대응되는 하이드로젤 미세입자를 포함하고 있어, 기존 액적 제조과정에 비해 하이드로젤 미세입자 제조과정이 매우 단순하고 적은 시간이 걸리며, 디지털 PCR용 반응 칩내에서 하이드로젤 미세입자의 배열, 증폭 및 검출을 모두 진행할 수 있어 디지털 PCR 수행 및 검출까지의 과정이 매우 단순하여 시간 및 비용 효율적이다. 또한, 기존 디지털 PCR에서 제조된 액적은 액체 형태여서 보관, 운반 및 재사용이 어려우나, 본 발명에 따른 PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩의 소수성 플레이트 상에 배열된 하이드로젤 미세입자는 고체(solid) 형태이므로 보관 및 운반이 용이하고 이미 사용된 미세입자를 디지털 PCR용 반응 칩에서 꺼내어 후공정할 수 있어 재사용이 가능하다는 장점이 있다.
일 실시예로서 상기 다공성 하이드로젤 미세입자는 공극 내부에 PCR 프라이머가 고정되지 않은 것일 수 있다.
일 실시예로서 상기 다공성 하이드로젤 미세입자는 공극 내부에 PCR 프라이머로서 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 하나 이상이 고정된 것일 수 있다.
일 실시예로서 상기 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 하나 이상은 화학적 반응기 및 이중결합(double bond) 중 하나 이상을 포함함으로써 하이드로젤 미세입자의 공극 내부에 화학적으로 고정된 것일 수 있다. 상기 화학적 반응기는 작용기로 불릴 수 있고, 아크릴기(acryl group), 아민기(amine group) 및 카복실기(carboxyl group)로 이루어진 화학적 반응기 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 하이드로젤 미세입자는 공극 내부에 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 모두가 고정된 것일 수 있고, 또는 상기 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 한 방향의 프라이머만이 고정된 것일 수 있고, 또는 상기 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두가 고정되지 않은 것일 수 있다. 상기 하이드로젤 미세입자에 고정되거나 고정되지 않은 프라이머는 PCR 수행 시에 상기 PCR용 반응 칩에 주입되는 용액에 포함될 수 있다.
일 실시예로서 상기 하이드로젤 미세입자의 공극 내부에 고정된 PCR 프라이머는 하이드로젤 미세입자와 링커(linker)로 연결된 것일 수 있으며, 이 경우 링커에 의해 프라이머가 공극 내에 움직일 수 있는 자유도가 높아지므로 반응성이 향상된다. 상기 링커의 길이는 5 내지 100 nm일 수 있고, 구체적으로 20 내지 50 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 링커는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리머나 알킬사슬(alkyl chain)과 같은 폴리머 사슬일 수 있으나, PCR 프라이머 및 다공성 하이드로젤 미세입자와 결합할 수 있는 것이면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자가 소수성 플레이트 상에 배열된 PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 RNA 증폭 시 표적 RNA 특이적으로 형광이 검출되어 높은 민감도 및 정확도로 디지털 PCR을 수행할 수 있고 노이즈가 감소하는 것을 확인하였으며, 고정된 프라이머에 의해 만들어진 표적 핵산의 증폭물(amplicon)을 주형으로 하여 PCR 증폭이 계속적으로 일어나면 표적 핵산의 증폭이 반복적으로 일어나 선택성이 매우 증가하게 된다. 또한, 간단한 과정을 통해, 즉 한 단계만으로도 RNA 증폭이 가능하고(실시예 2), 상기 고정된 프라이머에 특이적인 표적에 대해서는 재사용될 수 있으며, 선택적인 타겟 포획(capturing)과 오염원(contamination)들을 세척(washing)할 수 있는 세척 단계(washing step)과 같은 전공정(pre-processing)이 가능하고, 나아가, 디지털 PCR 이후 RNA 증폭 결과 생성된 앰플리콘(amplicon)이 상기 고정된 프라이머에 결합되어 있기 때문에 앰플리콘 수집(collection)이 용이하여 시료 농축(sample enrichment)과 녹는점 분석(melting temperature analaysis)과 같은 후공정(post-processing)이 가능하다.
일 실시예로서 상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자는 상기 PCR용 반응 칩의 소수성 플레이트 상에 다각형 형태로 배열된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자는 상기 소수성 플레이트 상에 삼각형, 사각형, 오각형, 육각형, 칠각형, 팔각형, 구각형 등의 형태로 배열된 것일 수 있고, 시간 및 비용 효율적으로 PCR을 수행하기에 적절한 형태라면 그 형태는 제한되지 않는다. 일 실시예로서 상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자는 상기 소수성 플레이트 상에 10 개/cm2 내지 1000 개/cm2의 밀도로 배열된 것일 수 있고, 구체적으로, 10 개/cm2 이상, 50 개/cm2 이상, 100 개/cm2 이상, 110 개/cm2 이상, 120 개/cm2 이상, 130 개/cm2 이상, 140 개/cm2 이상, 150 개/cm2 이상, 160 개/cm2 이상, 170 개/cm2 이상, 180 개/cm2 이상, 190 개/cm2 이상, 200 개/cm2 이상, 210 개/cm2 이상, 220 개/cm2 이상, 230 개/cm2 이상, 240 개/cm2 이상, 250 개/cm2 이상, 260 개/cm2 이상, 270 개/cm2 이상, 280 개/cm2 이상, 290 개/cm2 이상, 300 개/cm2 이상, 310 개/cm2 이상, 320 개/cm2 이상, 330 개/cm2 이상, 340 개/cm2 이상, 350 개/cm2 이상, 360 개/cm2 이상, 370 개/cm2 이상, 380 개/cm2 이상, 390 개/cm2 이상, 400 개/cm2 이상, 410 개/cm2 이상, 420 개/cm2 이상, 430 개/cm2 이상, 440 개/cm2 이상, 450 개/cm2 이상, 460 개/cm2 이상, 470 개/cm2 이상, 480 개/cm2 이상, 490 개/cm2 이상, 500 개/cm2 이상, 600 개/cm2 이상, 700 개/cm2 이상, 800 개/cm2 이상 또는 900 개/cm2 이상의 밀도로 배열된 것일 수 있고, 1000 개/cm2 이하, 900 개/cm2 이하, 800 개/cm2 이하, 700 개/cm2 이하, 600 개/cm2 이하, 500 개/cm2 이하, 490 개/cm2 이하, 480 개/cm2 이하, 470 개/cm2 이하, 460 개/cm2 이하, 450 개/cm2 이하, 440 개/cm2 이하, 430 개/cm2 이하, 420 개/cm2 이하, 410 개/cm2 이하, 400 개/cm2 이하, 390 개/cm2 이하, 380 개/cm2 이하, 370 개/cm2 이하, 360 개/cm2 이하, 350 개/cm2 이하, 340 개/cm2 이하, 330 개/cm2 이하, 320 개/cm2 이하, 310 개/cm2 이하, 300 개/cm2 이하, 290 개/cm2 이하, 280 개/cm2 이하, 270 개/cm2 이하, 260 개/cm2 이하, 250 개/cm2 이하, 240 개/cm2 이하, 230 개/cm2 이하, 220 개/cm2 이하, 210 개/cm2 이하, 200 개/cm2 이하, 190 개/cm2 이하, 180 개/cm2 이하, 170 개/cm2 이하, 160 개/cm2 이하, 150 개/cm2 이하, 140 개/cm2 이하, 130 개/cm2 이하, 120 개/cm2 이하, 110 개/cm2 이하, 100 개/cm2 이하 또는 50 개/cm2 이하의 밀도로 배열된 것일 수 있다. 일 실시예로서 상기 소수성 플레이트 상에 상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자는 각 하이드로젤 미세입자 직경의 1 내지 10 배의 간격으로 배열된 것일 수 있고, 구체적으로 1 배 이상, 1.1 배 이상, 1.2 배 이상, 1.3 배 이상, 1.4 배 이상, 1.5 배 이상, 1.6 배 이상, 1.7 배 이상, 1.8 배 이상, 1.9 배 이상, 2 배 이상, 2.1 배 이상, 2.2 배 이상, 2.3 배 이상, 2.4 배 이상, 2.5 배 이상, 2.6 배 이상, 2.7 배 이상, 2.8 배 이상, 2.9 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상 또는 9 배 이상의 간격으로 배열된 것일 수 있고, 10 배 이하, 9 배 이하, 8 배 이하, 7 배 이하, 6 배 이하, 5 배 이하, 4 배 이하, 3 배 이하, 2.9 배 이하, 2.8 배 이하, 2.7 배 이하, 2.6 배 이하, 2.5 배 이하, 2.4 배 이하, 2.3 배 이하, 2.2 배 이하, 2.1 배 이하, 2 배 이하, 1.9 배 이하, 1.8 배 이하, 1.7 배 이하, 1.6 배 이하, 1.5 배 이하, 1.4 배 이하, 1.3 배 이하, 1.2 배 이하 또는 1.1 배 이하의 간격으로 배열된 것일 수 있다. 또한, 상기 소수성 플레이트 상에 상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자의 간격이 10 내지 50000 ㎛일 수 있고, 구체적으로, 10 ㎛ 이상, 100 ㎛ 이상, 200 ㎛ 이상, 300 ㎛ 이상, 400 ㎛ 이상, 500 ㎛ 이상, 600 ㎛ 이상, 700 ㎛ 이상, 800 ㎛ 이상, 900 ㎛ 이상, 1000 ㎛ 이상, 2000 ㎛ 이상, 3000 ㎛ 이상, 4000 ㎛ 이상, 5000 ㎛ 이상, 6000 ㎛ 이상, 7000 ㎛ 이상, 8000 ㎛ 이상, 9000 ㎛ 이상, 10000 ㎛ 이상, 20000 ㎛ 이상, 30000 ㎛ 이상 또는 40000 ㎛ 이상일 수 있고, 50000 ㎛ 이하, 40000 ㎛ 이하, 30000 ㎛ 이하, 20000 ㎛ 이하, 10000 ㎛ 이하, 9000 ㎛ 이하, 8000 ㎛ 이하, 7000 ㎛ 이하, 6000 ㎛ 이하, 5000 ㎛ 이하, 4000 ㎛ 이하, 3000 ㎛ 이하, 2000 ㎛ 이하, 1000 ㎛ 이하, 900 ㎛ 이하, 800 ㎛ 이하, 700 ㎛ 이하, 600 ㎛ 이하, 500 ㎛ 이하, 400 ㎛ 이하, 300 ㎛ 이하, 200 ㎛ 이하 또는 100 ㎛ 이하일 수 있다. 상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자의 밀도 및 간격은 시간 및 비용 효율적으로 PCR을 수행할 수 있는 것이라면 제한되지 않는다.
일 실시예로서 상기 하이드로젤 미세입자를 구성하는 매트릭스(matrix)에 디아릴디메틸염화암모늄(Diallyl dimethyl ammonium chloride, DADMAC)과 같은 양전하를 띠는 물질, 혹은 폴리아크릴산(poly acrylic acid, PAA)과 같은 음전하를 띠는 물질을 첨가하여 전하(charge)를 띄게 할 수 있다. 상기 전하에 의해 핵산의 전하가 음전하를 띄고 있기 때문에 DADMAC으로 구성된 입자는 특정 표적 핵산을 더 많이 끌어 모아 소량의 표적 핵산을 보다 많이 증폭할 수 있다. 또한 음전하를 띄는 PAA의 경우는 특정 표적 핵산들을 선택적으로 증폭시킬 수 있어 비특이적 핵산들의 증폭을 막아 선택성을 높일 수 잇다. 상기 전하에 의해 증폭되는 표적 핵산은 하이드로젤 미세입자에 고정된 프라이머에 특이적인 것일 수 있고, 또는 PCR용 반응 칩에 주입하는 PCR 반응 용액에 포함된 프라이머에 특이적인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예로서 상기 하이드로젤 미세입자는 표적(target) 핵산이 포함된 검출 시료를 포함할 수 있다. 상기 표적 핵산은 DNA, RNA, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적 핵산은 구체적으로, 이중가닥 핵산일 수 있으며, 보다 구체적으로 이중가닥 DNA일 수 있다. 상기 표적 핵산이 이중가닥 핵산인 경우, 상기 표적 핵산 검출 구조체에 주입되는 표적 핵산은 단일가닥으로 변성된 것일 수 있다. 또는 상기 표적 핵산은 구체적으로, 단일가닥 핵산일 수 있으며, 보다 구체적으로 단일가닥 DNA 또는 RNA일 수 있고, 상기 RNA는 보다 더 구체적으로 miRNA(마이크로 RNA)일 수 있다.
일 실시예로서 상기 하이드로젤 미세입자는 PCR 프라이머로서 전방향 프라이머(forward primer), 역방향 프라이머(reverse primer), 표적(target) 핵산이 포함된 검출 시료, 및 dNTP 및 DNA 중합효소가 포함된 PCR 반응 용액을 포함할 수 있고, 상기 PCR 반응 용액은 역전사 효소를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 복수의 하이드로젤 미세입자 각각은 입자 표면에 수불용성 물질을 포함하여 각각의 미세입자가 서로 분리되어 배열되는 것일 수 있다. 상기 수불용성 물질은 오일을 포함하는 수불용성인 용액일 수 있고, 구체적으로 미네랄 오일, 실리콘 오일 및 미네랄 오일 및 계면활성화제의 혼합물, 또는 실리콘 오일 및 계면활성제의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 입자 표면에 수불용성 물질을 포함함으로써 상기 PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩의 소수성 플레이트 상에 배열된 복수의 하이드로젤 미세입자 각각은 쉽게 분리(isolation)되어 액적(droplet)이 배열된 것과 같은 형태를 용이하게 구현할 수 있다. 따라서 PCR 반응이 복수의 하이드로젤 미세입자 별로 독립적으로 일어나서, 각 미세입자 별로 표적 핵산이 증폭되는바, PCR, 구체적으로 디지털 PCR 수행 시 각 미세입자가 보유하고 있는 PCR 반응물 및 반응 생성물이 섞이지 않게 되므로 오염될 가능성이 매우 낮아 정확도가 우수하다. 또한, 캡슐화제에 의한 캡슐화 및 분리에 의해 상기 복수의 하이드로젤 미세입자 각각이 PCR 반응물을 과정이 진행되는 동안 보유할 수 있어 보관 및 사용이 용이하다. 상기 PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 PCR, 구체적으로 디지털 PCR 수행 시, 표적 핵산 또는 표적 핵산의 증폭물(amplicon)과 프로브 또는 형광염료(dye)의 반응에 의해 검출하는 것일 수 있다. 일 실시예로서, 상기 프로브는 택맨 프로브(Taqman probe)일 수 있고, 형광염료는 사이버 그린(SYBR green), 피코그린(Picogreen), 에바그린(Evagreen), 훼히스트 33258(Hoechst 33258), 훼히스트 33342(Hoechst 33342), 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 아크리딘 오렌지(acridine orange), 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide), 미트람이신(mithramycin), TO-PRO-3, TOTO, YOYO 및 YOPRO-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 표적 핵산 또는 표적 핵산의 증폭물과 프로브 또는 형광염료의 반응에 의해 표적 핵산의 존재 여부를 검출할 수 있는 것이라면 그 종류는 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 PCR용 반응 칩의 제조방법은 (1) 소수성 플레이트(plate)를 준비하는 단계; (2) 프레폴리머(pre-polymer)를 포함하는 미세입자 형성 용액을 제조하는 단계; (3) 상기 소수성 플레이트 위에 상기 미세입자 형성 용액을 3차원 형태로 사출(jetting)하여 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자를 상기 소수성 플레이트 상에 배열하는 단계; (4) 상기 소수성 플레이트 상에 배열된 하이드로젤 미세입자를 경화시키는 단계; 및 (5) 상기 소수성 플레이트에 수불용성 용액을 흘려주어 입자들을 분리(isolation)시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 소수성 플레이트, 프레폴리머, 하이드로젤 미세입자, 캡슐화제, PCR용 반응 칩에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
일 실시예로서 상기 (3) 단계는 상기 배열된 하이드로젤 미세입자의 표면상에 오일을 흘려주는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 단계는 상기 배열된 하이드로젤 미세입자 위에 오일을 흘려주고 배양하여 상기 하이드로젤 미세입자의 표면을 보다 고르고 편평하게 할 수 있다. 예를 들어 구형의 하이드로젤 미세입자를 만들고자 한 경우 오일을 상기 미세입자의 표면상에 흘려줌으로써 오일이 표면 상에 존재하는 틈이나 오목한 부분 등을 매꾸어 표면을 고르게 하므로, 보다 완벽한 구형의 형태로 만들 수 있다.
일 실시예로서 상기 PCR용 반응 칩 제조방법은 상기 (4) 단계 및 상기 (5) 단계 사이에 상기 소수성 플레이트를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척은 상기 (4) 단계의 소수성 플레이트를 증류수에 넣어 두는 것을 의미하며, 이는 상기 (4) 단계의 경화 이후 미세입자에 묻어있는 오일을 제거하기 위해 알코올, 구체적으로 에탄올로 세척할 수 있는데, 이 때 첨가한 에탄올, 또는 아직 미세입자에 묻어있는 오일을 공기 중에서 건조시키지 않고 증류수에 넣어두어 확산(diffusion)을 이용하여 제거하기 위함이다. 만일, 상기 소수성 플레이트를 공기 중에서 건조시킨다면 소수성 플레이트에 배열된 하이드로젤 미세입자가 함유하고 있는 수분이 제거되어 미세입자의 모양이 바뀌거나 미세입자의 매트릭스의 변형(defection)이 생길 수 있기 때문이다.
일 실시예로서 상기 PCR용 반응 칩 제조방법은 상기 (4) 단계 및 상기 (5) 단계 사이에, 경화된 미세입자가 배열된 소수성 플레이트를 건조시키는 단계; 및 상기 건조된 소수성 플레이트 위에 폴리머 몰드(mold)를 올려놓고 상기 소수성 플레이트의 표면에 상기 몰드를 접착시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 폴리머 몰드와 소수성 플레이트를 접착하기 위해서 플라즈마 결합(plasma bonding)을 수행할 수 있다. 만일 플라즈마 결합을 수행하지 않으면 상기 폴리머 몰드와 소수성 플레이트가 제대로 부착되지 않아 PCR 수행 과정 중 변성(denaturation) 과정의 고온에서 상기 폴리머 몰드와 소수성 플레이트가 분리되어 이에 포함된 수불용성 용액이 흘러나올 수 있으며, 이에 따라 형광 신호를 관찰할 수 없는 문제가 발생할 수 있다. 일 실시예로서 상기 PCR용 반응 칩은 상기 반응 칩의 소수성 플레이트 상에 배열된 하이드로젤 미세입자의 공극 내부에 PCR 프라이머로서 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 하나 이상이 고정된 것이거나, 또는 상기 PCR 프라이머인 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두가 고정되지 않은 것일 수 있으며, 또한 상기 하이드로젤 미세입자는 표적(target) 핵산이 포함된 검출 시료; 및 dNTP, DNA 중합효소 및 역전사 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 포함된 PCR 반응 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표적(target) 핵산이 포함된 검출 시료를 상기 PCR용 반응 칩에 주입하는 단계; 및 상기 표적 핵산을 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는 PCR 방법을 제공한다. 상기 표적 핵산, PCR용 반응 칩, PCR, 디지털 PCR에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
일 실시예로서 상기 PCR용 반응 칩은 상기 반응 칩의 소수성 플레이트 상에 배열된 하이드로젤 미세입자의 공극 내부에 PCR 프라이머로서 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 하나 이상이 고정된 것이거나, 또는 상기 PCR 프라이머인 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두가 고정되지 않은 것일 수 있다.
일 실시예로서 상기 PCR 방법은 상기 검출 시료를 디지털 PCR용 반응 칩에 주입하는 단계는 추가로 PCR 프라이머로서 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer), 역방향 프라이머(reverse primer), dNTP 및 DNA 중합효소가 포함된 PCR 반응 용액을 PCR용 반응 칩에 주입하는 것을 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 PCR 반응 용액은 역전사 효소를 더 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 PCR 방법은 상기 주입 단계 이후 상기 PCR용 반응 칩의 하이드로젤 미세입자 표면에 수불용성 용액을 흘려주는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 수불용성 용액은 오일을 포함할 수 있고, 구체적으로 미네랄 오일, 실리콘 오일 및 미네랄 오일 중 하나 이상의 오일, 및 계면활성화제의 혼합물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 실리콘 오일 및 계면활성제의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같이 수불용성 용액을 하이드로젤 미세입자 표면에 흘려줌으로써 복수의 하이드로젤 미세입자 각각은 소수성 플레이트 상에서 서로 쉽게 분리(isolation)되어 액적(droplet) 배열된 것과 같은 형태를 용이하게 구현할 수 있다. 따라서 PCR 반응이 복수의 하이드로젤 미세입자 별로 독립적으로 일어나서, 각 미세입자 별로 표적 핵산이 증폭되는바, PCR, 구체적으로 디지털 PCR 수행 시 각 미세입자가 보유하고 있는 PCR 반응물 및 반응 생성물이 섞이지 않게 되므로 오염될 가능성이 매우 낮아 정확도가 우수하다. 또한, 상기 복수의 하이드로젤 미세입자 각각이 PCR 반응물을 과정이 진행되는 동안 보유할 수 있어 보관 및 사용이 용이하다.
일 실시예로서 상기 PCR 방법은 상기 증폭 단계 이후에 상기 증폭된 핵산을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 핵산 검출 단계는 상기 증폭된 핵산으로부터 형광(Fluorescence) 신호를 측정하는 것일 수 있다. 상기 형광 신호 측정은 표적 핵산 또는 표적 핵산의 증폭물(amplicon)과 프로브 또는 형광염료(dye)의 반응에 의해 검출된 형광 신호를 측정하는 것일 수 있다. 일 실시예로서 상기 프로브는 택맨 프로브(Taqman probe)일 수 있고, 형광염료는 사이버 그린(SYBR green), 피코그린(Picogreen), 에바그린(Evagreen), 훼히스트 33258(Hoechst 33258), 훼히스트 33342(Hoechst 33342), 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 아크리딘 오렌지(acridine orange), 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide), 미트람이신(mithramycin), TO-PRO-3, TOTO, YOYO 및 YOPRO-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 표적 핵산 또는 표적 핵산의 증폭물과 프로브 또는 형광염료의 반응에 의해 표적 핵산의 존재 여부를 검출할 수 있는 것이라면 그 종류는 제한되지 않는다.
일 실시예로서 상기 PCR 방법은 상기 핵산 검출 단계 이후에 표적 핵산의 정량 분석 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 정량 분석은 상기 PCR용 반응 칩의 소수성 플레이트 상에 배열된 하이드로젤 미세입자 내부에 포함된 평균 0.5개 내지 1개의 카피수(copy number)로 존재하는 표적 핵산 또는 이의 증폭물(amplicon)에 의해 검출된 형광 신호에 의해 분석되는 것일 수 있다. 구체적으로, 형광 신호가 나타나는 하이드로젤 미세입자는 1개의 유전자 카피수의 시료가 분배되어 증폭 후 신호를 나타내는 것이므로 "1"의 값으로 카운트하고 형광 신호가 없는 하이드로젤 미세입자는 0개의 카피수의 시료가 분배되어 증폭이 일어나지 않아 신호가 없는 것이므로 "0"으로 카운트함으로써 절대 정량을 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 PCR용 반응 칩; 및 반응 챔버(chamber)를 포함하는 PCR 장치를 제공한다. 상기 PCR용 반응 칩에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩의 제조 및 이를 이용한 PCR 수행
[실시예 1-1] 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩 제조
본 발명의 일 실시예로서 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 하기의 과정을 통해 제조하였다.
(1) 소수성 플레이트 준비
하이드로젤 미세입자들이 배열되는 소수성 플레이트를 제조하기 위해, 먼저 0.55T 글래스(glass)(코닝글라스, 알루미노실리케이트 0.55T)를 준비하고, 상기 0.55T 글래스를 아세톤(acetone)으로 5분, 이소프로필안티피린(isopropylantipyrine, IPA)으로 5분, 3차 증류수(deionized water, DI)로 5분 순으로 워싱한 후 에어(air)로 건조시켰다. 그런 다음, 3-(트리메톡시실릴)프로필 메틸아크릴레이트 (3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylate, TMS-PMA) 용액이 들어있는 페트리 디쉬에 상기 0.55T 글래스를 넣고 70℃에서 2시간 동안 코팅시킨 후, 99% 에탄올로 세척하고 에어(air)로 건조시켜 소수성 플레이트를 만들었다.
(2) 소수성 플레이트에 하이드로젤 미세입자 배열
하이드로젤 미세입자를 제조하기 위해, 먼저, PEG700DA (sigma Aldrich, PEG(Poly ethylene)glycol 700 diacrylate) 20% v/v, PEG600 (sigma-aldrich, PEG(Poly ethylene)glycol 600) 40% v/v, 광개시제 (Darocur1173) (sigma-aldrich, Darocur®) 5% v/v 및 PBS 버퍼(phosphate buffer saline) (Lonza, Phosphate Buffered Saline (1X)) 35% v/v 를 혼합하여 프레폴리머 용액(pre-polymer solution)인 미세입자 형성 용액 200 μl를 제조하였다.
그 후, 상기 (1) 과정에서 만든 소수성 플레이트 위에 도 2와 같이 육각형 모양으로 상기 프레폴리머 용액을 사출(jetting)하여 하이드로젤 미세입자를 소수성 플레이트 상에 배열시켰다(hexagonal array). 상기 배열된 하이드로젤 미세입자 위에 미네랄 오일(Sigma-aldrich, mineral oil)을 흘려주고 10 분 동안 그래도 두어 입자의 모양을 구형으로 만들었다. 그런 다음, 상기 소수성 플레이트를 UV 챔버(Arrayer 2000, Advanced Technology Inc.Korea Fushion cure system, minuta technology)에 넣고 2 분간 UV(4.5mJ/cm2)를 조사하여 경화(curing) 시켰다. 그리고, 상기 오일 제거 후 99% 에탄올로 세척하여(washing) 고정되지 않은 PEGDA 및 PEG를 미세입자 내에서 제거하고, 증류수(DI)가 채워져 있는 페트리 디쉬에 상기 미세입자가 배열된 소수성 플레이트를 1시간 동안 넣어 두어 상기 과정에서 제거된 미네랄 오일, 고정되지 않은 프라이머, PEGDA 및 PEG(progen)를 제거하였다. 이를 통해 복수의 하이드로젤 미세입자가 배열된 소수성 플레이트를 포함하는 PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩을 제조하였다. 배열된 모습은 도 3a 내지 도 3c와 같다. 도 3b에 나타난 바와 같이 하이드로젤 미세입자가 소수성 플레이트 상에 육각형 모양으로 높은 밀도로 배열되어 있고 정사각형 패킹에서 브릿지(bridge)가 쉽게 형성되어 있으며, 미세입자와 각진 배열(angled array) 간의 거리가 멀다. 또한, 미세입자의 평균 밀도는 350 개/cm2이고(50 kPa/ 100 us), 미세입자간 평균 거리는 580 μm, 미세입자의 평균 직경은 290 μm으로 균일한 크기를 가짐을 확인하였다.
[실시예 1-2] 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩을 이용한 PCR
본 발명의 일 실시예로서 상기 실시예 1-1의 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 하기와 같이 과정을 통해 PCR을 수행하였다.
상기 실시예 1-1에서 제조된 디지털 PCR용 반응 칩을 건조시킨 후 PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드(mold)를 이용하여 상기 몰드와 상기 디지털 PCR용 반응 칩의 플라즈마 결합(plasma bonding)을 수행하였다. 그 후 30 분 동안 진공 상태에서 상기 몰드와 상기 디지털 PCR용 반응 칩이 붙을 수 있도록 둔 다음, 표적(target) 핵산인 E.coli 합성 DNA가 포함된 검출 시료 (synthetic DNA(IDT, Korea)), 및 표적 핵산의 PCR용 전방향 프라이머 (E.coli forward primer(IDT, KOREA), PCR용 역방향 프라이머 (E.coli reverse primer(IDT, KOREA)), Taqman probe(IDT, KOREA), PCR mastermix(Nanobiosys, Korea, Nanobiosys Taqman matsermix)를 포함하는 디지털 PCR 반응 용액을 상기 몰드가 붙은 디지털 PCR용 반응 칩에 주입한 후 10분 간 배양하였다. 상기 디지털 PCR 반응 용액 주입 시, 형광염료로 SYBR 그린 (NBS SYBR green mastermix(Nanobiosys, Korea), 또는 프로브로 Taqman probe (NBS Taqman mastermix(Nanobiosys, Korea) 를 함께 주입하였다. 또한, 상기 표적 핵산, PCR용 전방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브의 염기서열은 하기 표 1과 같다.
구분 염기서열 서열번호
표적(target) 핵산 5'-GCA TCG TGA CCA CCT TGA TTG CAT TAT- 3' 서열번호 1
PCR 전방향 프라이머(PCR forward primer) 5'-GCA TCG TGA CCA CCT TGA- 3' 서열번호 2
PCR 역방향 프라이머(PCR reverse primer) 5'-CAG CGT GGT GGC AAA A- 3' 서열번호 3
프로브(Taqman probe) 5-TGC ATT ATG TTT GCC GGT ATC CG-3' 서열번호 4
상기 배양된 디지털 PCR용 반응 칩에 미네랄 오일 (Mineral oil, sigma aldrich) 및 0.3%의 계면활성제 (Triton-X, sigma aldrich)를 포함하는 수불용성 용액을 흘려주어 상기 디지털 PCR용 반응 칩의 소수성 플레이트 상에 배열된 복수의 하이드로젤 미세입자 각각을 분리(isolation)하였으며, 이로써 복수의 하이드로젤 미세입자가 서로 접착되지 않고 입자별로 독립적으로 PCR을 수행할 수 있게 하였다. 또한, 상기 PDMS 몰드의 유입구(inlet), 유출구(outlet)에 NOA(Norland Optical Adhesive 83)를 덮어 2 분 동안 UV(4.5mJ/cm2)를 조사한 후 경화(curing)시켜 상기 PDMS 몰드의 유입구 및 유출구를 막아 캡슐화 이후 PCR 과정에서 캡슐화제, 예를 들어 미네랄 오일이 밖으로 새는 것을 방지하였다.
그 다음, 하기와 같은 조건에서 40 사이클로 PCR을 수행하였다.
- 전변성(pre-denature): 95℃에서 15초,
- 변성(denature): 95℃에서 5초,
- 어닐링(annealing) 및 신장(elongation): 60℃에서 30초
도 6a는 상기 실시예 1-1에서 제조된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 나타내고, 도 6b는 상기 실시예 1-2에서 상기 디지털 PCR용 반응 칩에 검출 시료 및 디지털 PCR 반응 용액을 주입하였을 때의 모습을 도식화하여 나타낸 것이며, 도 6c는 상기 실시예 1-2에서 PCR 증폭을 수행한 후의 결과를 나타낸 도이다. 도 6c에 나타난 바와 같이, 표적 핵산을 포함하고 있는 하이드로젤 미세입자에서는 형광이 검출되어 정량적 검출이 가능함을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩의 제조방법은 1) 표적 핵산 및 PCR용 프라이머 등을 포함하는 PCR 반응물을 사전 제작된 PCR용 반응 칩에 도입하고, 2) 수불용성 용액을 사용하여 각각의 미세입자를 분리(isolation)할 수 있어, 제조방법이 보다 간단하다. 또한, PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩은 하이드로젤 미세입자가 PCR 반응물을 과정이 진행되는 동안 보유할 수 있고, 각각의 하이드로젤 미세입자는 캡슐화제로 분리된 후에 반응 챔버에서 분리된 채로 반응이 일어난다. 종래의 디지털 PCR에서 사용되는 드롯렛(droplet)보다 본 발명에 따른 하이드로젤 미세입자가 보다 더 안정하기 때문에, 30 분 동안 40 사이클이 수행되는 PCR 프로토콜을 보다 빠르게 진행할 수 있다. 디지털 PCR 수행 후에는 형광 염료 또는 형광 프로브에 의해 검출되는 미세입자의 수를 계수함으로써 표적 핵산을 정량적으로 검출할 수 있다.
[실시예 2] 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩의 제조 및 이를 이용한 PCR 수행
[실시예 2-1] 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩 제조
본 발명의 일 실시예로서 프라이머가 공극 내부에 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 하기의 과정을 통해 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 디지털 PCR용 반응 칩을 제조하였으며, 다만 상기 실시예 1-1의 (2) 소수성 플레이트에 하이드로젤 미세입자 배열 과정에서, 프레폴리머 용액 제조 후, 미세입자 내에 고정하고자 하는 상기 표 1의 서열번호 3의 PCR 역방향 프라이머로서 5' 말단에 아크리다이트 작용기(acrydite, Acryd)가 포함된 프라이머 1 mM를 5% v/v로 상기 프레폴리머 용액에 혼합하고, 상기 실시예 1의 (1) 과정에서 만든 소수성 플레이트 위에 도 2b와 같이 육각형 모양으로 상기 프라이머가 혼합된 프레폴리머 용액을 사출(jetting)하였다.
[실시예 2-2] 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩을 이용한 PCR
본 발명의 일 실시예로서 상기 실시예 2-1의 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 상기 실시예 1-2와 동일한 과정을 통해 디지털 PCR을 수행하였다. 다만, 실시예 1-2의 검출 시료 및 디지털 PCR 반응 용액 주입 과정에서 디지털 PCR용 반응 칩에 주입되는 디지털 PCR 반응 용액이 표적 핵산의 PCR용 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 모두 포함하는 것과는 달리, 상기 실시예 2-1에서 제조된 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 디지털 PCR을 수행할 때는 상기 디지털 PCR 반응 용액에 이미 고정된 프라이머를 제외한 표적 핵산의 PCR용 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 어느 하나만을 포함시켰다. 이 때, 상기 실시예 2-1에서 제조된 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩을 이용하여 PCR을 수행할 때, 상기 PCR 반응 용액에 이미 고정된 프라이머를 포함한 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두를 포함시킬 수 있다.
[실험예 1] 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩을 이용한 PCR 효율 측정
[실험예 1-1] PCR 반응물 농도에 따른 PCR 결과 확인
상기 실시예 1-1에서 제조한 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 상기 실시예 1-2의 방법으로 디지털 PCR을 수행하였다. 이 때, 초기 PCR 반응물을 1/10배씩 희석하여 디지털 PCR을 각각 수행하였으며, 각 농도별로 Taqman 프로브와 SYBR 그린을 각각 이용하여 표적 핵산을 포함하는 하이드로젤 미세입자의 수를 계수함으로써 정량적으로 검출 반응을 수행하였다.
구체적으로, Taqman 프로브를 이용한 경우, 초기 PCR 반응물(1차 PCR 반응물이라 함)에서 예상되는 copy 수가 106 copies/μl일 때, 실제 copy 수는 1.67 X 105 copies/μl 이며, 이 때 PCR용 반응 칩 내의 350 개의 하이드로젤 미세입자 중 350 개 모두가 Taqman 프로브에 의해 형광 검출되었다(도 7a 참조). 상기 초기 PCR 반응물을 1/10씩 희석하였을 때(차례로 2차 PCR 반응물, 3차 PCR 반응물 등이라 함) 각각의 예상되는 copy 수, 실제 copy 수, PCR용 반응 칩 내의 하이드로젤 미세입자 중 형광이 검출된 미세입자 수는 하기 표 2와 같다(도 7b 내지 도 7f 참조).
PCR 반응물 예상 copy 수
(copies/μl)		 실제 copy 수
(copies/μl)		 형광이 검출된
미세입자 수
1차 106 1.67 X 105 350/350
2차 105 1.67 X 104 350/350
3차 104 1.67 X 103 264/350
4차 103 167 131/350
5차 102 16 26/350
6차 101 1.67 5/350
표 2에 나타난 바와 같이, PCR 반응물을 10배씩 희석할 때마다 실제 copy 수가 1/10씩 감소함을 확인하였으며, 형광이 검출된 미세입자 수도 함께 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 매우 적은 수의 DNA의 copy 수, 예를 들어 10 미만의 copy 수 또는 100 미만의 copy 수에서도 정확한 정량 분석이 가능함을 알 수 있었다.
또한, SYBR 그린을 이용한 경우의 결과는 도 8a 내지 도 8e와 같으며, SYBR 그린이 Taqman 프로브에 비해 표적에 대한 특이도(specific)이 낮다는 것을 고려할 때, 이 역시 PCR 반응물을 10배씩 희석할 때마다 형광이 검출된 미세입자 수도 점점 감소하였는바, 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 매우 적은 수의 DNA의 copy 수에서도 정확한 정량 분석이 가능함을 알 수 있었다.
[실험예 1-2] 음성 주형 대조군(NTC, negative template control)의 PCR 결과 확인
디지털 PCR에서 위-양성 신호(false-positive signal)는 핵산 주형(template)의 절대적 정량을 왜곡하지 않기 위해 매우 중요한 것이므로, 표적 핵산을 포함하지 않는 음성 주형 대조군(negative template control, NTC)에 의한 디지털 PCR 반응 여부를 확인(NTC(negative template control) 테스트라고 함)하였다. 이를 위해 상기 실시예 1-1에서 제조한 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 상기 실시예 1-2의 방법으로 디지털 PCR을 수행하였다. 이 때, 표적 핵산 1μl 대신 3차 증류수(DW) 1 μl이 포함된 검출 시료를 포함하는 PCR 반응 용액을 이용하여 디지털 PCR을 수행하였으며, 그 결과는 도 9a 및 도 9b(Taqman 프로브를 이용한 경우), 도 10(SYBR 그린을 이용한 경우)에 나타내었다.
도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, 1번째 사이클에서부터 40번째 사이클에 이르기까지 형광이 검출된 미세입자는 전혀 없는 것으로 확인되었으며, SYBR 그린을 이용하였을 때도(도 10) 형광이 검출된 미세입자는 없었다. 디지털 PCR은 표적 핵산이 없는 경우에 음성(negative) 신호, 즉, 형광 신호가 검출되지 않아야 보다 정확한 표적 핵산 검출이 가능하다. NTC 테스트는 이러한 위-양성 신호 발생 여부를 확인하기 위한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하는 경우, 표적 핵산이 없을 때는 형광 신호를 방출하는 미세입자가 없어야 PCR 후 형광 신호를 띄는 미세입자가 모두 양성 신호(positive signal)로 보고 그러한 미세입자의 수를 세어 정확한 핵산의 copy 수를 계산할 수 있으므로 높은 정확도를 가진 디지털 PCR용 반응 칩임을 확인할 수 있다. 결국, 본 발명에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩은 핵산을 포함하지 않는 미세입자는 형광이 검출되지 않았다. 또한, SYBR 그린은 Taqman 프로브에 비하여 표적 핵산에 대한 특이도(specific)가 낮아 종래 디지털 PCR은 Taqman 프로브가 있어야만 신호를 확인할 수 있었으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩은 Taqman 프로브 외에도 SYBR 그린을 이용하여서도 신호를 확인할 수 있으므로, 정확도가 매우 높음을 알 수 있다.
상술한 바와 같이 종래 PCR, 디지털 PCR 시에는 SYBR 그린을 이용하여 표적 핵산을 검출하기 어려웠으나, 상기 실시예 2의 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR, 디지털 PCR용 반응 칩을 이용한다면 프라이머 고정에 의해 프라이머의 반응할 수 있는 친화도(affinity)가 감소되어 비특이적(non-specific) 반응에 대한 음성(negative) 신호를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩, 특히 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용한다면 SYBR 그린과 같은 표적 핵산에 대한 특이도가 낮은 염료를 포함하는 프로브로도 디지털 PCR을 통해 표적 핵산을 보다 높은 정확도로 검출할 수 있다.
[실험예 2] 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩을 이용한 RNA 증폭
[실험예 2-1] PCR용 반응 칩을 이용한 RNA 증폭 결과 확인
상기 실시예 2-1에서 제조한 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 RNA 증폭을 수행하였다. 이 때 사용된 표적 RNA (BCR-ABL), 역전사 프라이머, PCR용 전방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브의 염기서열은 하기 표 3과 같으며, 모두 IDT 사(대한민국)의 것을 사용하였다.
구분 염기서열 서열번호
표적 RNA
(BCR-ABL)		 5'-TCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGG GGCTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACT TTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGRRGG-3' 서열번호 5
역전사 프라이머(RT primer) 5'-CCAACGAGCGGCTTCACT-3' 서열번호 6
PCR 전방향 프라이머(PCR forward primer) 5'- TCCGCTGACCATCAAYAAGGA- 3' 서열번호 7
PCR 역방향 프라이머(PCR reverse primer) 5'- CACTCAGACCCTGAGGCTCAA- 3' 서열번호 8
프로브(Taqman probe) 5'-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA-3' 서열번호 9
이 때, 65℃에서 10분 간 전배양(Pre-incubation) 후, 42℃에서 60분 간 역전사(Reverse Transcription, RT) 반응을 수행하여 cDNA를 합성였으며, 이후 PCR을 총 40 사이클로 수행하였는데 PCR 증폭 과정 및 조건은 하기와 같다.
- 전변성(pre-denature): 95℃에서 8초, 1 사이클
- 변성(denature): 95℃에서 4초,
- 어닐링(annealing) 및 신장(enlongation): 60℃에서 60초
RNA 증폭 결과, 도 11a 및 도 11b에 나타난 바와 같이, 1번째 사이클(도 11a)에 비하여 40 사이클을 수행한 후(도 11b)에 형광이 검출된 미세입자의 수가 보다 증가하였다. 이를 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR용 반응 칩, 구체적으로 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하면 디지털 PCR로 원-스텝(one-step)으로 RNA의 역전사 및 실시간 정량 PCR (RT-qPCR)을 수행하여 형광 신호를 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
[실험예 2-2] 음성 대조군 및 표적 핵산이 모두 존재할 때의 RNA 증폭 결과 확인
상기 실시예 2-1에서 제조한 프라이머가 고정된 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 음성 대조군(negative control)인 HeLa 토탈 RNA(total RNA)(한국세포주은행, 서울대학교)과, 실험군(Positive control)인 상기 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 표적 핵산인 BCR-ABL을 포함하는 K562 토탈 RNA(한국세포주은행, 서울대학교)가 모두 존재할 때 RNA 증폭을 수행하였으며, 그 결과를 도 12a 및 도 12b에 나타내었다.
도 12a 및 도 12b에 나타난 바와 같이, 1번째 사이클(도 12a)에 비하여 40 사이클을 수행한 후(도 12b)에 형광이 검출된 미세입자의 수가 보다 증가하였다. 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하면 디지털 PCR로 원-스텝(one-step)으로 RNA의 역전사 및 실시간 정량 PCR (RT-qPCR)을 수행하여 형광 신호를 확인할 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 3] 하이드로젤 미세입자를 포함하는 PCR용 반응 칩을 이용한 길이가 긴 DNA의 PCR
본 발명에 따른 디지털 PCR용 반응 칩의 실용성을 확인하기 위해, 상기 실시예 1-1에서 제조한 하이드로젤 미세입자를 포함하는 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하여 길이가 긴 DNA의 디지털 PCR을 수행하였으며, 이 때 표적 DNA는 바이러스에서 추출된 E.coli의 genomic DNA (Escherichia coli K-12 chromosome, complete gene, 4582kbp)는 XL1-blue(전기천공법용 수용성 세포(competent cells), 제조사 Agilent Technologies, california, USA) E.coli에서 추출한 것이다. 상기 표 1의 서열번호 2 내지 4의 PCR 전방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브를 이용하였고, 상기 실시예 1-2의 (2)에서와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 그런 다음 그 결과를 도 13a 및 도 13b에 나타내었다.
도 13a 및 도 13b에 나타난 바와 같이, 1번째 사이클(도 13a)에 비하여 40 사이클을 수행한 후(도 13b)에 형광이 검출된 미세입자의 수가 보다 증가하였는바, 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하면 약 50 kbp 초과의 길이가 긴 gDNA로도 디지털 PCR이 가능하다. 이는 시료로부터 분리된, 또는 합성된 짧은 길이의 핵산(DNA, RNA)이 아닌 시료 자체로 디지털 PCR에서 신호를 확인할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 PCR용 반응 칩을 이용하면 시료 자체를 이용하여 높은 정확도로 표적 검출이 가능함을 알 수 있다.
<110> Korea Institute of Science of Technology <120> Reaction chip for PCR comprising multiple hydrogel microparticles arranged on a hydrophobic plate <130> 18p615/ind <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target DNA <400> 1 gcatcgtgac caccttgatt gcattat 27 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer <400> 2 gcatcgtgac caccttga 18 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer <400> 3 cagcgtggtg gcaaaa 16 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe <400> 4 tgcattatgt ttgccggtat ccg 23 <210> 5 <211> 163 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target RNA <400> 5 tccgctgacc atcaataagg aagatgatga gtctccgggg ctctatgggt ttctgaatgt 60 catcgtccac tcagccactg gatttaagca gagttcagaa gcccttcagc ggccagtagc 120 atctgacttt gagcctcagg gtctgagtga agccgctcgr rgg 163 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer <400> 6 ccaacgagcg gcttcact 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer <400> 7 tccgctgacc atcaayaagg a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer <400> 8 cactcagacc ctgaggctca a 21 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe <400> 9 cccttcagcg gccagtagca tctga 25

Claims (22)

  1. 소수성 플레이트(plate); 및
    복수의 다공성 하이드로젤(hydrogel) 미세입자를 포함하고,
    상기 복수의 하이드로젤 미세입자는 입자 표면에 도포된 수불용성 물질에 의해 상기 소수성 플레이트에 서로 분리되어 배열된 것이며,
    상기 하이드로젤 미세입자는 친수성 폴리머인, PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄 반응)용 반응 칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로젤 미세입자는 공극 내부에 PCR 프라이머로서 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 하나 이상이 고정된 것인, PCR용 반응 칩.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 하이드로젤 미세입자의 공극 내부에 고정된 프라이머는,
    아크릴기(acryl group), 아민기(amine group) 및 카복실기(carboxyl group) 이루어진 화학적 반응기; 및
    이중결합(double bond) 중 하나 이상을 포함하고,
    상기 화학적 반응기를 포함하는 프라이머는 화학적 반응기가 하이드로젤 미세입자에 화학적으로 고정된 것인, PCR용 반응 칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로젤 미세입자는 공극 내부에 PCR 프라이머가 고정되지 않은 것인, PCR용 반응 칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자는 상기 소수성 플레이트 상에 다각형 형태로 배열된 것인, PCR용 반응 칩.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자들의 각 입자 평균 직경은 10 내지 500 μm인, PCR용 반응 칩.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 수불용성 물질은 오일을 포함하는, PCR용 반응 칩.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 PCR용 반응 칩은 디지털 PCR용 반응 칩인, PCR용 반응 칩.
  10. 제1항 내지 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 PCR용 반응 칩 제조방법으로,
    (1) 소수성 플레이트(plate)를 준비하는 단계;
    (2) 친수성 프레폴리머(pre-polymer)를 포함하는 미세입자 형성 용액을 제조하는 단계;
    (3) 상기 소수성 플레이트 위에 상기 미세입자 형성 용액을 3차원 형태로 사출(jetting)하여 복수의 다공성 하이드로젤 미세입자를 상기 소수성 플레이트 상에 배열하는 단계;
    (4) 상기 소수성 플레이트 상에 배열된 하이드로젤 미세입자를 경화시키는 단계; 및
    (5) 상기 소수성 플레이트에 배열된 하이드로젤 미세입자 표면에 수불용성 용액을 도포하여 입자들을 분리(isolation)시키는 단계;
    를 포함하며,
    상기 (5) 단계는 중합효소 연쇄반응(PCR)시 상기 하이드로젤 미세입자에 검출시료 및 PCR 반응용액 주입 후에 이루어지는 것인, PCR용 반응 칩 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (3) 단계는 상기 배열된 하이드로젤 미세입자 표면상에 오일을 흘려주는 단계를 더 포함하는, PCR용 반응 칩 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 (4) 단계 및 상기 (5) 단계 사이에,
    상기 경화된 미세입자가 배열된 소수성 플레이트를 건조시키는 단계; 및
    상기 건조된 소수성 플레이트 위에 폴리머 몰드(mold)를 올려놓고 상기 소수성 플레이트의 표면에 상기 몰드를 접착시키는 단계;
    를 추가로 포함하는, PCR용 반응 칩 제조방법.
  13. 표적(target) 핵산이 포함된 검출 시료를 제1항 내지 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 PCR용 반응 칩에 주입하는 단계; 및
    상기 표적 핵산을 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계;
    를 포함하는 PCR 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 검출 시료를 PCR용 반응 칩에 주입하는 단계는 상기 검출 시료와 함께 PCR 프라이머로서 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer), 역방향 프라이머(reverse primer), dNTP 및 DNA 중합효소가 포함된 PCR 반응 용액을 PCR용 반응 칩에 주입하는 것인, PCR 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 PCR 반응 용액은 역전사 효소를 추가로 포함하는, PCR 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 PCR은 상기 PCR용 반응 칩에 배열된 복수의 하이드로젤 미세입자별로 독립적으로 표적 핵산이 증폭되는 것인, PCR 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 PCR 방법은 상기 증폭 단계 이후에 상기 증폭된 핵산을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인, PCR 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 증폭 핵산 검출 단계는 상기 증폭된 핵산으로부터 형광(Fluorescence) 신호를 측정하는 것인, PCR 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 형광 신호는 표적 핵산 또는 표적 핵산의 증폭물(amplicon)과, 프로브 또는 형광염료(dye)의 반응에 의한 형광 신호이고,
    상기 프로브는 택맨 프로브(Taqman probe)를 포함하고,
    상기 형광염료는 사이버 그린(SYBR green), 피코그린(Picogreen), 에바그린(Evagreen), 훼히스트 33258(Hoechst 33258), 훼히스트 33342(Hoechst 33342), 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 아크리딘 오렌지(acridine orange), 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide), 미트람이신(mithramycin), TO-PRO-3, TOTO, YOYO 및 YOPRO-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, PCR 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 PCR 방법은 상기 핵산 검출 단계 이후에 표적 핵산의 정량 분석 단계를 추가로 포함하는 것인, PCR 방법.
  21. 제13항에 있어서,
    상기 PCR은 디지털 PCR인, PCR 방법.
  22. 제1항 내지 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 PCR용 반응 칩; 및
    반응 챔버(chamber);
    를 포함하는 PCR 장치.
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