CN102321764A - 一种用于定量分析生物样品中反义寡核苷酸的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物样品中反义寡核苷酸的定量分析,包括各种修饰的DNA寡核苷酸在血浆、心、肝、脾、肺、肾、尿、粪、胆汁生物样品中的定量分析。本发明涉及将修饰的寡核苷酸与探针杂交,通过T4DNA连接酶和S1单链特异核酸内切酶的酶学行为,利用酶联桥接分析法(Enzyme-linked bridging assay,ELBA)对待测寡核苷酸的原形与代谢物区分定量,提高生物样品中寡核苷酸定量分析的灵敏度、适用性、准确性和特异性。
Description
技术领域:
本发明属于生物检测领域。具体而言,本发明涉及基因药物及其代谢物的定量分析,更具体说,本发明涉及用于定量分析生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的新方法。
发明背景:
以反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)和核酸刺激基序(CpG)为代表的小分子核酸药物在基因治疗中占据着越来越重要的地位,该类药物在极低剂量下给药即能发挥药效。迄今,已有ASODN和CpG药物通过美国FDA批准上市,更有多种该类药物处于临床前和临床试验。因此,建立生物基质中高灵敏度和样品前处理简单的高通量定量分析方法对于评价临床前及临床研究阶段生物样品中小分子核酸药物的药代动力学行为至关重要。
目前生物样品中ASODN定量分析的非放射性同位素标记手段中,毛细管凝胶电泳(Capillary gel electrophoresis,CGE)和高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography,HPLC)是应用最为成熟和广泛的方法。目前的报道研究中,CGE方法检测对于血浆中ASODN的最低定量限(Lower limit of quantification,LLOQ)可达到70μg·L-1(约12nmol·L-1),在组织中的LLOQ为6μg/g(分子量为6500,100nmol·L-1)。HPLC方法的分辨率和灵敏度均略低于CGE。两种方法的共同缺点是样品处理过程复杂,绝对回收率较低,分析成本较高,应用有所限制。重要的是,方法灵敏度无法满足小剂量(≤mg·Kg-1)给药情况下对血浆和组织分布中末端消除相ODN的定量要求。因此,迫切需要与之适应的高灵敏度和高通量定量分析方法进行药代动力学评估。
近年来,基于定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术的发展,出现了系列高灵敏度的核酸检测方法,但这些方法多是针对微小RNA和短干扰RNA类核酸或基于klenow酶的PCR技术对DNA寡核苷酸的定量分析(CN 101611153A,CN 101835903A),虽然可满足生物基质中检测灵敏度要求,但该方法不能对反义寡核苷酸与其代谢物分别定量,无法精确评价寡核苷酸类药物在生物体内的代谢与动力学情况,限制了该方法在临床或临床前药代动力学研究中的应用。
Wei等人(pharm Res,2006.23(6),p.1251-1264)报道的研究中,描述了对血浆和细胞裂解物基质中硫代磷酸寡核苷酸原形的定量分析方法,然而寡核苷酸类药物临床前药代动力学行为的评价需要更适用于各种生物组织和体液中的定量方法;此外,寡核苷酸类药物的结构特点要求一种能在生物基质中区分代谢物的定量方法。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种能够定量分析生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的新方法。
本发明为核酸分子杂交的酶联桥接法(Enzyme-linked bridging assay,ELBA),主要基于核酸杂交原理,利用一个锚定的、3’端与待测ODN序列互补的捕获探针俘获生物基质中的ODN,再通过T4DNA连接酶将检测探针(序列与捕获探针5’端互补,3’端偶联酶标发光检测系统)与上述核酸杂交复合物相连,建立桥接体系。S1核酸内切酶是单链特异性的核酸内切酶,可以降解双链核酸中的单链或缺口处切割双链DNA,在上述桥接体系中,可以通过酶切将不能与检测探针连接从而构成完整双链的差减ODN序列(即ODN的5’或3’降解产物,其3’端与检测探针5’端之间有1个以上的碱基缺口)去除,以保证桥接系统的序列长度特异性,做到对ODN原形或者降解产物的分别定量。本发明对复杂生物基质(各种组织和体液)的样品前处理简单,可以满足生物样品中各种组织和体液来源的寡核苷酸类药物定量要求,并具有对寡核苷酸类药物与其代谢物具有分别定量能力,因此本发明在适用性、特异性上更具优势。
本发明首先人工合成3’端有生物素标记并与待测反义寡核苷酸序列互补的特异捕获探针;3’端有地高辛标记、与捕获探针5’末端完全互补的9个碱基的检测探针,捕获探针与特异目的序列杂交,杂交复合物以生物素-亲和素特异亲和力结合于包被有亲和素的固相96孔板;加入检测探针杂交结合于捕获探针5’末端并通过T4DNA连接酶作用连接形成完整的杂交双链,S1单链核酸酶去除未杂交形成完整双链结构的单链分子;以微板读数仪(SynergyTM,Bio-tek,U.S.A)检测完整杂交双链的检测探针3’端地高辛特异酶联免疫反应信号,对待测寡核苷酸原形进行定量,见图1。
本发明提供了用于用于定量检测生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的捕获探针,其长度为27-32个核苷酸,其由两部分组成,3’端的18个核苷酸与待测序列完全互补,5’端部分为与检测探针完全互补。
在具体实施方案中,所述捕获探针核苷酸序列为其核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:9所示,3’端用生物素标记。
一种用于定量检测生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的试剂,其中包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:9所示的一种或多种捕获探针和通用检测探针,所述通用检测探针结构为5’-磷酸化-GAATAGCGA-地高辛-3’。
一个具体实施方案中,所述试剂含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的捕获探针。
一个具体实施方案中,所述试剂含有核苷酸序列如SEQ ID NO:2至6所示的捕获探针。
实验证明,所述试剂对不同序列结构、不同类别的寡核酸序列均能实现定量检测。
一个具体实施方案中,所述试剂含有核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQID NO:9所示的捕获探针。
实验证明,所述试剂能够同时实现对生物样品中的反义寡核酸及其代谢物的特异性定量。
另一方面,本发明提供了一种定量检测生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的方法,该方法包括:
a)捕获待测物将所述样品与捕获探针进行杂交反应,样品中的反义寡核苷酸或其代谢物与捕获探针3’端的部分形成杂交链;
b)固定杂交链将步骤a)中形成的杂交链结合与固相支持物结合;
c)连接通用检测探针将通用检测探针与所述杂交链中的单链部分进行互补、连接,
d)酶切去除未形成完整杂交双链的单链;
e)加入检测探针特异性酶标抗体;
f)加入酶标抗体特异荧光底物系统,检测完整双链结构的信号。
本发明方法中,通过设计不同的捕获探针实现原形和代谢物的分别定量。反义寡核苷酸的3’N-1/3’N-2代谢物与针对原形设计的捕获探针及检测探针杂交形成的是有缺口的杂交分子因而可被S1单链特异核酸酶所识别并降解;而代谢物可与针对各自序列设计的捕获探针及检测探针杂交形成完整双链结构进行分别定量。
本发明所述的生物样品可以是动物组织和体液,所述动物可以是猕猴和大鼠等,所述组织包括心,肝,脾,肺,肾,体液包括全血浆,血浆,胆汁,尿液。生物体液和血浆样品不需做预处理,可直接做检测样品。组织样品的处理方法为将其用等体积的缓冲液GA和4U蛋白酶K在55℃条件下温育30min后上样检测。
在本发明的一个实施方案中,其中所述酶标抗体为碱性磷酸酶标地高辛抗体,底物选择Attophos底物系统。
在本发明的一个实施方案中,其中所述酶切为S1核酸酶酶切,S1核酸酶可特异性降解单链核酸,以及含有缺口的不完整双链核酸。。
在本发明的一个实施方案中,其中所述连接为T4DNA连接酶连接。
本发明中,所述的待测反义寡核苷酸为18~25个碱基的寡核苷酸序列;优选为为18~21个碱基,包括富含GC的B型、C型CpG。也可以是硫代磷酸寡核苷酸(PTO)、2’-甲氧乙基(2-’MOE)、锁核酸(LNA)等修饰形式。
本发明中,所述的反义寡核苷酸的代谢物包括同一序列的3’N-1和3’N-2序列。
在本发明的一个实施方案中,所述固定杂交链是通过生物素和亲和素之间特异性结合实现,即捕获探针3’端标记物是生物素时,固相支持物表面用亲和素包被,例如可以是中性亲和素包被的96微孔板。
在本发明的一个实施方案中,所述信号检测通过微板读数仪。检测信号所用激发波长为430nm,发射波长为560nm。
本发明相对于其他寡核苷酸定量方法的主要优势如下:
1.高灵敏度,本发明方法涉及到两个增强灵敏度系统,即高灵敏度的亲和素-生物素结合系统和高灵敏度的荧光发光信号检测系统,可以实现低剂量下(≤1mg·Kg-1)的血药浓度监测,完全能够满足寡核苷酸类药物的定量分析与药代动力学研究。
2.高通量,基于ELISA技术的固相96孔板原理,可以一次针对多个生物样品同时间,同条件检测。
3.普适性,方法可以通过设计不同的捕获探针,对具有不同序列结构、不同类别、以及多种修饰方式的寡核苷酸进行定量检测。
4.高特异性,方法采用S1核酸酶(可特异识别单链核酸以及核酸杂交双链中的缺口部分并进行酶切)可确保酶连桥接体系中终点检测信号特异性地来源于待测寡核苷酸原形,去除未形成完整双链结构的单链探针、待测核酸的代谢产物(3’N-X)等形成的信号干扰;基于此原理,本发明可针对同一序列的原形和代谢物分别设计特异性探针以完成反义寡核苷酸的原形和代谢物的分别定量能力。
5.简便快速,针对不同生物样品的定量分析前处理方法简便,易操作。血浆、尿液和胆汁等体液样品中测定不需要任何样品前处理,组织等复杂样品处理过程简便、快捷。
附图说明:
图1:ELBA定量方法测定寡核苷酸的原理图
图2:ELBA对猕猴血浆中IGF定量分析的标准曲线
图3:ELBA对猕猴1mg·Kg-1静脉滴注IGF药时曲线的测定
图4:ELBA对不同类型、不同序列结构的ASODN、CpG的定量标准曲线
图5:ELBA对PTO、MOE和LNA修饰形式的ASODN的定量标准曲线
图6:ELBA对ASODN的原形及3’N-1、3’N-2代谢物定量的特异性
图7:ELBA对ASODN的原形及3’N-1、3’N-2代谢物定量的标准曲线
图8:ELBA对猕猴体内ASODN原形及3’N-1、3’N-2代谢物的血浆药时曲线测定
图9:ELBA在组织和尿液、胆汁等生物基质中对ASODN定量的标准曲线
图10:ELBA用于测定ASODN在大鼠体内生物分布和胆汁、粪尿排泄情况
除另有说明外,本申请中的所有科技术语的都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本申请中描述类似或等同的方法及材料都可用于实施或检验本发明,但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。本申请中引用的全部出版物、专利申请、专利及其他参考文献其全部内容在此引入作为参考。如有抵触,包括定义,以本申请为准。
下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式,而决不构成对本发明的限制。本领域技术人员应该理解的是,在不违背本发明的精神和原则的前提下,对本发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例
在本申请中,如无特别说明,本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术,这些技术都是本领域技术人员所掌握的。这些技术在本领域技术人员常用文献中有详细地描述,例如Sambrook等人编著的Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第三版等。
实施例1
ELBA对血浆中IGF反义寡核苷酸定量分析标准曲线的建立
探针合成:合成针对胰岛素生长因子(IGF)的硫代反义寡核苷酸序列的捕获探针以及通用型检测探针,捕获探针3’端18个碱基与待测序列完全互补,且有生物素标记,5’端9个碱基与检测探针完全互补;检测探针的3’端带有地高辛标记
IGF ODN 5’-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA-3’
捕获探针5’-TCGCTATTCTGAAGTCTGGCTCCGGAGGA-Biotin-3’
检测探针5’-Phosphorylated-GAATAGCGA-Digoxigenin-3’
标准品配制:猕猴空白抗凝血浆四倍倍比稀释50nM硫代反义寡核苷酸IGF ODN至0.012nM,空白血浆为对照。
捕获待测物:利用杂交液(60mM Na2HPO4,1M NaCl,5mM EDTA,0.2%Tween 20,pH 7.4)将捕获探针稀释至100nM,沸水浴中变性10min后冰上放置,与配制的不同浓度的标准品等体积混匀,在42℃水浴条件下孵育杂交2.5h。
杂交链的固定:上述杂交产物加入96孔板中(中性亲和素包被,Pierce公司),37℃通过亲和素-生物素结合反应1.5h,将杂交双链固定于微孔板中。
连接检测探针:弃去微孔板中液体,洗板液(25mM This-HCl,0.15M NaCl,0.2%Tween20,pH 7.2)洗板3次以去除多余未结合的探针。将T4DNA连接酶、10×T4DNA连接缓冲液和检测探针(终浓度为50nM)配成混合液加入微孔板中,每孔150μL,18℃条件下连接3h,使检测探针与捕获探针和待测物的杂交链之间形成完整的双链结构并固定于96孔板固相。
未完全杂交单链的去除:通过单链特异性的S1核酸酶(按照说明书将S1核酸酶和10×缓冲液配制成混合液,每孔150μL,45U/孔),37℃条件下进行酶切反应1.5h。
连接酶标抗体:弃去微孔板中液体,洗板液洗板3次,加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(按说明书配制,反应浓度1∶1500),37℃条件下反应0.5h。
信号检测:加入Attophos碱性磷酸酶标荧光系统作用底物(Promega公司),避光反应20min后用Biotek微板读数仪激发波长430nm/发射波长560nm条件下进行信号收集。
数据分析:每个样品均做平行三孔检测,取荧光信号平均值以及标准差,与对应浓度应用Origin 5.0软件分析,取双对数曲线,建立浓度——信号线性方程,本发明检测方法针对IGF寡核苷酸序列在猕猴全血浆中的准确定量范围为0.012~12.5nM,见图2。
实施例2
ELBA对猕猴1mg·Kg-1静脉滴注后IGF药时曲线的测定
四只成年猕猴分别单次静脉滴注(v.d.)1mg·Kg-1IGF,30min内恒速滴注完毕,分别于给药前(0min)以及滴注开始后10min,20min,30min,35min,45min,1h,1.25h,1.5h,2h,2.5h,3h,4h,6h,和8h,在给药部位对侧后肢静脉取血,血样均用EDTA-K2抗凝管采集,离心获得血浆样品后保存于-80℃待测。
本发明所述方法不需要对血浆样品进行任何前处理,可以用血浆样品直接检测(具体实施例1),同板随行空白猕猴血浆基质的标准曲线,根据标准曲线对猕猴体内IGF的药物浓度进行回算,结果表明本发明可有效检测到反义寡核苷酸IGF低剂量给药后8小时血浆中药物含量(图3)。
实施例3
ELBA对不同类型、不同序列结构的ASODN和CpG定量的适用性
人工合成不同序列结构的反义寡核苷酸(672、KS0604、GTI-2040、IGF),以及富含GC含量的B、C型CpG序列,针对不同结构设计合成不同捕获探针,通用型检测探针同上。
672ODN:5’-GCTCAGTTTACTAGTGCCATT-3’
672捕获探针:5’-TCGCTATTC-AATGGCACTAGTAAACTGAGC-Biotin-3’
KS604ODN:5’-CTCCCAGCGTGCGCCATC-3’
KS0604捕获探针:5’-TCGCTATTC-GATGGCGCACGCTGGGAG-Biotin-3’
GTI-2040ODN:5’-GGCTAAATCGCTCCACCAAG-3’
GTI-2040捕获探针:5’-TCGCTATTC-CTTGGTGGAGCGATTTAGCC-Biotin-3’
B-型CpG ODN:5’-CGTCGTTTTCTCGTTTTGTCGTT-3’
B-型CpG捕获探针:5′-TCGCTATTC-AACGACAAAACGAGAAAACGACG-Biotin-3’
C-型CpG ODN:5’-TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3’
C-型CpG捕获探针:5’-TCGCTATTC-CGGCGCGCGCCGAAAACGACGA-Biotin-3’
通用检测探针:5’-Phosphorylated-GAATAGCGA-Digoxigenin-3’
同一实验条件下利用ELBA方法对不同序列结构和不同类别的寡核苷酸药物进行定量分析(实施例1),结果表明本发明对不同序列结构、不同类别的寡核苷酸序列的定量检测均适用(图4)。
实施例4
ELBA对不同化学结构修饰的ASODN定量的适用性
针对同一反义寡核苷酸序列IGF合成不同化学结构修饰的ASODN,考察ELBA定量方法对不同化学结构修饰的ASODN的适用性。修饰形式包括常见的硫代磷酸寡核苷酸(PTO)、2’甲氧基修饰(2’-O-Me)和锁核酸(LNA)修饰,序列中斜体为修饰位点。捕获探针和通用检测探针同实施例1。
硫代磷酸修饰(PTO)IGF:TCCTCCGGA GCCA GA CTTCA
2’-O甲氧乙基修饰(MOE)IGF:TCCTCCGGAGCCAGACTTCA
锁核酸(LNA)修饰IGF:TCCTCCGGAGCCAGACTT CA
同一实验条件下(实施例1)对上述不同化学结构修饰的ASODN进行定量分析,结果表明本发明适用于生物基质(猕猴血浆)中上述化学修饰的寡核苷酸药物的定量分析,标准曲线定量范围为0.012~12.5nM(图5)。
实施例5
ELBA对ASODN原形和3’代谢物的定量分析
合成针对IGF序列的3’N-1,3’N-2序列模拟其体内代谢物,利用不同的捕获探针,实现对ASODN 3’代谢物的同时定量,并将此方法应用于猕猴(1mg·Kg-1静脉滴注)体内药代动力学实验。
IGF原形捕获探针5’-TCGCTATTCtgAAGTCTGGCTCCGGAGGA-3’-Biotin
IGF 3’N-1捕获探针5’-TCG CTATTCgAAGT CTG GCT CCG GAG GA-3’-Biotin
IGF 3’N-2捕获探针5’-TCG CTATTCAAGT CTG GCT CCG GAG GA-3’-Biotin
以空白猕猴血浆为基质,配制如下样品,并选用不同的捕获探针与实施例1中所述检测探针进行检测:
样品A:12.5nM原形+12.5nM 3’N-1+12.5nM 3’N-2,分别以IGF原形、IGF 3’N-1、IGF3’N-2三种捕获探针对样品A进行定量检测;
样品B1:12.5nM原形+12.5nM 3’N-1,以IGF原形捕获探针对样品B1进行定量检测;
样品B2:12.5nM原形+12.5nM 3’N-2,以IGF3’N-1捕获探针对样品B2进行定量检测;
样品B3:12.5nM 3’N-1+12.5nM 3’N-2,以IGF3’N-2捕获探针对样品B3进行定量检测。
同一实验条件下(同实施例1)的定量结果表明,本发明不仅可以实现针对IGF原形、IGF 3’N-1、IGF 3’N-2的特异性定量,交叉反应小(图6),也可以在同板中实现对原形和多个代谢物的同时定量(图7),该发明成功地用于评价IGF猕猴体内给药后原形和代谢物的定量情况,提示血浆样品中反义寡核苷酸IGF的主要代谢物形式为3’N-1形式(图8)。
实施例6
ELBA在复杂生物基质(组织和体液)中对ODN定量的适用性
取空白Wistar大鼠心、肝、脾、肺、肾组织及粪便,称重,于适量生理盐水中,利用手持式匀浆器匀浆制备成组织匀浆液(200mg/mL),以其为基质将标准品(IGF)4倍梯度进行稀释制备标准曲线。将各浓度点标准品后加入等体积GA缓冲液(天根生化,北京)和4U/mL蛋白酶K,56℃孵育消化30min后将组织裂解液直接用于测定;体液胆汁、尿液不做预处理直接4倍梯度稀释标准品制备标准曲线。
取12只Wistar大鼠,雌雄各半,尾静脉注射22mg·Kg-1IGF分别于给药前(0min)以及给药即时开始20min,1h,2h,4h,7h时间点取2只大鼠心、肝、脾、肺、肾、组织匀浆(200mg/mL),冻存于-80℃待测,另取2只Wistar大鼠尾静脉注射22mg·Kg-1KS0604分别于给药前(0min)以及给药即时开始10min,30min,45min,1h,1.25h,1.5h,2h,2.25h,2.5h,3.25h,4.6h,5.3h,6.7h,8h取胆汁冻存于-80℃待测。
给药后各组织样品经过消化处理后(同上),与胆汁,尿液样品共同检测(同具体实施例1),同板做随行标准曲线测定,根据标准曲线做各时间点生物样品中待测物浓度的线性回归计算,结果表明,本发明方法针对组织中IGF的定量范围可达0.097~100nM(6ng~6μgODN/g组织),对胆汁和尿液中IGF的定量范围可达0.097~100nM,各基质中定量标准曲线见图9,IGF在生物组织分布情况见图10。由此可见,本发明所述检测方法具有很高灵敏度。
Claims (10)
1.用于定量检测生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的捕获探针,其长度为27-32个核苷酸,其由两部分组成,3’端的18个核苷酸与待测序列完全互补,5’端部分为与检测探针完全互补。
2.权利要求1所述的捕获探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:9所示。
3.权利要求1或2所述的捕获探针,其3’端标记有生物素。
4.一种用于定量检测生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的试剂,其中包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:9所示的一种或多种捕获探针和通用检测探针,所述通用检测探针结构为5’-磷酸化-GAATAGCGA-地高辛-3’。
5.权利要求4所述的试剂,其中所述捕获探针为核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的捕获探针。
6.一种定量检测生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的方法,该方法包括:
a)捕获待测物将所述样品与捕获探针进行杂交反应,样品中的反义寡核苷酸或其代谢物与捕获探针3’端的部分形成杂交链;
b)固定杂交链将步骤a)中形成的杂交链结合与固相支持物结合;
c)连接通用检测探针将通用检测探针与所述杂交链中的单链部分进行互补、连接,
d)酶切去除未形成完整杂交双链的单链;
e)加入检测探针特异性酶标抗体;
f)加入酶标抗体特异荧光底物系统,检测完整双链结构的信号。
7.权利要求6所述的方法,其中所述生物样品包括动物心、肝、脾、肺、肾和体液,其中体液包括血浆、胆汁、尿液。
8.权利要求6所述的方法,其中所述酶标抗体为碱性磷酸酶标地高辛抗体,其中所述酶切为S1核酸酶酶切,所述连接为T4DNA连接酶连接。
9.权利要求6所述的方法,所述反义寡核苷酸为18~25个碱基的寡核苷酸序列,优选为18~21个碱基的寡核酸序列,包括富含GC的B型、C型CpG。
10.权利要求6所述的方法,所述反义寡核苷酸可以是硫代磷酸寡核苷酸(PTO)、2’-甲氧乙基(2-’MOE)、锁核酸(LNA)等修饰形式。
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