CN110295235A - 一种双标记探针及其在snp分型及肿瘤突变的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双标记探针，包括：对探针5’端尾巴序列上做荧光标记，对靶特异结合序列的次位碱基进行淬灭基团标记；5’端尾巴序列的长度为2‑8个碱基，是人为添加的碱基序列，与靶序列不互补配对；靶特异结合序列的长度为16‑28nt，与靶序列有0‑1个碱基不匹配；本发明保证了荧光基团和淬灭基团具有最近的空间距离，使得淬灭效果最佳，大大提高了检测特异性，将非特异的背景降到最低；改善了分子信标与模板匹配不稳定的问题，提高了探针与模板之间的结合效力，增强了荧光信号强度，提高了检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及体外分子诊断领域，特别是一种双标记探针及其在SNP分型及肿瘤突变的应用。
背景技术
近年来，探针的非放射性标记受到很大重视，并取得了迅速发展，广泛应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断等。常用的荧光探针法是ARMS技术和分子信标技术。ARMS技术的基本原理是，如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其中，两条上游引物的3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，共用一条下游引物，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来，但是通常不能做到灵敏度、特异性兼顾，很难同时达到高特异和高灵敏。另外，TaqMan水解探针要求一定的长度以保证探针的特异性和结合模板的能力，但是长度会导致两末端的荧光基团距离远而使得荧光共振能量传递的效率降低，淬灭不彻底。
典型的分子信标探针呈发卡结构，包括环区域和茎区域。环区域有18-30个碱基可与靶序列互补，通过两端5至7个互补碱基的茎形成发卡结构，其5’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团。当信标处于闭环形状时，淬灭基团位于荧光基团附近，这导致后者的荧光发射淬灭。如果待检测的核酸与环中的链互补，则在核酸和环之间形成的双链比茎结构更稳定，导致茎结构打开，因此荧光基团和淬灭基团分离，在激发光照射下就会发出荧光，因此指示靶核酸序列是否存在于测试样品中。分子信标具有较低的荧光本底，特异性强，但是杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较差；有时因分子信标的茎太强，在低温下它可能在探针与目标结合时保持闭合；本发明的双标记探针，能够改善分子信标与模板匹配不稳定的问题，提高探针与模板之间的结合效力，增强荧光信号强度，提高检测灵敏度，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种双标记探针及其在SNP分型及肿瘤突变检测中的应用，通过对探针5’端尾巴序列上做荧光标记，对靶特异结合序列的次位碱基进行淬灭基团标记，保证了荧光基团和淬灭基团具有最近的空间距离，使得淬灭效果最佳，大大提高了检测特异性，将非特异的背景降到最低；改善了分子信标与模板匹配不稳定的问题，提高了探针与模板之间的结合效力，增强了荧光信号强度，提高了检测灵敏度。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种双标记探针，包括：对探针5’端尾巴序列上做荧光标记，对靶特异结合序列的次位碱基进行淬灭基团标记；5’端尾巴序列的长度为2-8个碱基，是人为添加的碱基序列，与靶序列不互补配对；靶特异结合序列的长度为16-28nt，与靶序列有0-1个碱基不匹配。
前述的一种双标记探针，探针的修饰方式为：若靶特异结合序列的次位碱基非T，即在5’端尾巴中的T碱基上修饰荧光基团，在次位碱基引入T碱基，并在T碱基上修饰淬灭基团。
前述的一种双标记探针，探针的修饰方式为：若靶特异结合序列的次位碱基为T，即在5’端尾巴中引入的T碱基上修饰荧光基团，在次位T碱基上修饰淬灭基团。
一种双标记探针在SNP分型的应用，检测SNP分型的过程为：
步骤一，根据SNP各个等位基因型分别设计野生型检测探针和突变型检测探针，分别标记各个荧光基团，野生型探针的靶特异结合序列与野生型模板有0-1个碱基不匹配，与突变型模板存在1-2个碱基不匹配；突变型检测探针与突变型模板有0-1个碱基不匹配，与野生型模板有1-2个不匹配；设计上下游引物，可同时扩增野生型和突变型模板；
步骤二，配制PCR反应体系，设置反应程序，加模板，上机PCR；
步骤三，根据荧光PCR仪给出的CT值和各个通道荧光采集结果，对SNP等位基因型进行判读。
一种双标记探针在肿瘤突变的应用，检测体细胞突变的过程为：
步骤一，根据突变位点设计突变型探针，在探针的5’端尾巴序列上修饰荧光基团，在靶特异性结合序列的第二个碱基上修饰淬灭基团，该探针与突变型模板有0-1个碱基不匹配，与野生型模板有1-2个碱基不匹配；
步骤二，设计特异性上游引物和下游引物；
步骤三，配置PCR反应体系；
步骤四，加样，上机，检测靶序列。
前述的一种双标记探针在肿瘤突变的应用，检测p.E545K位点体细胞突变的过程为：
步骤一，设计突变型探针E545K-MT-P，序列如SEQ NO.01，其中，在探针的5’端尾巴的T碱基上修饰荧光基团，在靶特异结合序列的次位碱基位置引入碱基T，并在其上修饰淬灭基团；探针与突变型模板有1个碱基不匹配，与野生型模板有2个碱基不匹配；
步骤二，设计上游引物E545K-F，序列为SEQ NO.03，下游引物E545K-R，序列为SEQNO.04；
步骤三，配置PCR反应体系；
步骤四，加入p.E545K突变型质粒，上机，检测靶序列。
前述的一种双标记探针在肿瘤突变的应用，在探针的5’端尾巴序列上修饰的荧光基团为FAM。
前述的一种双标记探针在肿瘤突变的应用，在靶特异性结合序列的碱基上修饰的淬灭基团为BHQ1。
本发明的有益之处在于：
本发明通过对探针5’端尾巴序列上做荧光标记，对靶特异结合序列的次位碱基进行淬灭基团标记，保证了荧光基团和淬灭基团具有最近的空间距离，使得淬灭效果最佳，大大提高了检测特异性，将非特异的背景降到最低；
本发明的双标记探针与模板匹配能力强，与模板结合的稳定性高，明显增强了探针的敏感性，提高了低丰度突变的检测灵敏度；
本发明的双标记探针采用邻近位的修饰方式，探针完整时荧光基团发出的光始终被淬灭基团所淬灭，打破了普通荧光探针受长度限制的问题，探针长度选择更自由，不会对淬灭效果产生影响，具有极低的荧光本底。
附图说明
图1是本发明双标记探针的检测原理图；
图2是本发明双标记探针与分子信标的实验结果比较图(三角号曲线表示的是双标记探针的检测结果，黑色方块曲线表示的是分子信标探针的检测结果)；
图3是本发明双标记探针的实验结果图；
图4是本发明ARMS-TaqMan的实验结果图；
图5是本发明双标记探针的检测灵敏度实验结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种双标记探针，包括：对探针5’端尾巴序列上做荧光标记，对靶特异结合序列的次位碱基进行淬灭基团标记；5’端尾巴序列的长度为2-8个碱基，是人为添加的碱基序列，与靶序列不互补配对；靶特异结合序列的长度为16-28nt，与靶序列有0-1个碱基不匹配；双标记探针的检测原理如图1所示。
探针的修饰方式有两种，一种探针的修饰方式为：若靶特异结合序列的次位碱基非T，即在5’端尾巴中的T碱基上修饰荧光基团，在次位碱基引入T碱基，并在T碱基上修饰淬灭基团。第二种探针的修饰方式为：若靶特异结合序列的次位碱基为T，即在5’端尾巴中引入的T碱基上修饰荧光基团，在次位T碱基上修饰淬灭基团。
一种双标记探针在SNP分型的应用，检测SNP分型的过程为：
步骤一，根据SNP不同等位基因型分别设计野生型检测探针和突变型检测探针，分别标记不同的荧光基团，野生型探针的靶特异结合序列与野生型模板有0-1个碱基不匹配，与突变型模板存在1-2个碱基不匹配；突变型检测探针与突变型模板有0-1个碱基不匹配，与野生型模板有1-2个碱基不匹配；设计上下游引物，可同时扩增野生型和突变型模板。
步骤二，配制PCR反应体系，设置反应程序，加模板，上机PCR；
步骤三，根据荧光PCR仪给出的CT值和不同的通道荧光采集结果，对SNP等位基因型进行判读。
一种双标记探针在肿瘤突变的应用，检测体细胞突变的过程为：
步骤一，根据位点设计突变型探针，在探针的5’端尾巴序列上修饰荧光基团，在靶特异性结合序列的第二个碱基上修饰淬灭基团，该探针与突变型模板有0-1个碱基不匹配，与野生型模板有1-2个碱基不匹配；
步骤二，设计特异性上游引物和下游引物；
步骤三，配置PCR反应体系；
步骤四，加样，上机，检测靶序列。
以下通过具体实施例进行实验验证；
将双标记探针应用在肿瘤突变的检测；
实验一，新型双标记探针与分子信标检测性能比较；
实施例：以p.E545K位点为例，设计突变型探针E545K-MT-P，序列如SEQ NO.01，其中，在探针的5’端尾巴的T碱基上修饰荧光基团FAM，在靶特异结合序列的次位碱基位置引入碱基T，并在其上修饰淬灭基团BHQ1；探针与突变型模板有1个碱基不匹配，与野生型模板有2个碱基不匹配。设计上游引物E545K-F，序列为SEQ NO.03，下游引物E545K-R，序列为SEQNO.04，HBB内参基因引物探针，序列如SEQ NO.07、SEQ NO.08、SEQ NO.09，标记HEX。
对比实施例：设计分子信标E545K-MG，序列如SEQ NO.02，与突变型模板完全匹配。
表1本发明使用的引物探针
注：E545K-MT-P的尾巴序列为“-”之前的4个碱基，斜体碱基表示突变位点。E545K-MT-P上的下划线碱基表示荧光和淬灭修饰的碱基；E545K-MG上的下划线表示信标探针的茎区域；ARMS-F的下划线表示突变位点。
2.PCR反应体系配制
新型双标记探针体系如下，
补充去离子水至25μl。
分子信标探针体系如下，
补充去离子水至25μl。
3.加样，上机
分别加入5μl的p.E545K突变型质粒，浓度为10^4copies/μl，做2个平行管并设置无模板对照。上机程序为：93-95℃5～10min，一个循环；93-95℃5～15s，58-62℃20～40s(在此阶段采光)，40～50个循环；优选上机程序为：95℃5min，一个循环；95℃10s，60℃30s(采集荧光)，45个循环。仪器使用AB7500、SLAN96S/P等荧光PCR仪，优选SLAN96P荧光PCR仪。
4.实验结果分析：
如图2所示，三角号曲线表示的是本发明的新型双标记探针的检测结果，黑色方块曲线表示的是分子信标探针的检测结果。新型双标记探针与分子信标探针相比，其对荧光信号具有更快的响应能力和更高的荧光强度，说明新型双标记探针的杂交效率比分子信标更高。
实验二，新型双标记探针与ARMS-TaqMan技术特异性以及灵敏度对比；
1.新型双标记探针的引物探针使用实验一中设计的，根据p.E545K位点设计上游ARMS引物ARMS-F，突变位点位于3’末端，用下划线表示，序列如SEQ NO.05；下游引物E545K-R，序列如SEQ NO.04；TaqMan探针E545K-P，序列如SEQ NO.06，HBB内参基因引物探针，序列如SEQ NO.07、SEQ NO.08、SEQ NO.09，标记HEX。
2.PCR反应体系配制
双标记探针体系与实验一一致。ARMS-TaqMan探针体系如下：
补充去离子水至25μl。
3.加样，上机
a)特异性实验：取5-20μl的p.E545K突变型和野生型质粒作为模板，优选5μl的p.E545K突变型质粒和野生型质粒；浓度均为10^4copies/μl，每种模板做2个重复，同时设置无模板对照。上机程序为：93-95℃5～10min，一个循环；93-95℃5～15s，55-57℃20～40s(在此阶段采光)，72℃15-40s，40～50个循环。仪器使用AB7500、SLAN96S/P等荧光PCR仪。
b)灵敏度实验：取5-20μl的p.E545K突变型和野生型混合质粒作为模板，突变率为1％和0.1％，突变模板浓度分别为500copies/反应、50copies/反应、5copies/反应，每个浓度做4个重复。上机程序为：93-95℃5～10min，一个循环；93-95℃5～15s，55-57℃20～40s(在此阶段采光)，72℃15-40s，40～50个循环。仪器使用AB7500、SLAN96S/P等荧光PCR仪。作为一种优选，上机程序为：95℃5min，一个循环；95℃10s，60℃30s(在此阶段采光)，45个循环。ARMS-TaqMan体系的上机程序为：95℃5min，一个循环；95℃10s，56℃30s(在此阶段采光)，72℃20s，45个循环。仪器优选使用SLAN96P荧光PCR仪。
4.实验结果分析
a)特异性实验结果分析：如图3、4所示，图3是本发明双标记探针的实验结果图，图4是本发明ARMS-TaqMan的实验结果图，图3和图4中的黑色实线表示突变型模板的扩增曲线，虚线表示野生型模板的扩增曲线，表明新型双标记探针的特异性明显高于ARMS-TaqMan技术，因此新型双标记探针对控制野生型模板具有非常显著的优势，大大降低了假阳性率，提高了检测结果的准确性。
b)灵敏度实验结果分析：如图5所示，新型双标记探针的灵敏度高达0.1％，可以检出低至5个拷贝每反应的突变。
本发明通过对探针5’端尾巴序列上做荧光标记，对靶特异结合序列的次位碱基进行淬灭基团标记，保证了荧光基团和淬灭基团具有最近的空间距离，使得淬灭效果最佳，大大提高了检测特异性，将非特异的背景降到最低；双标记探针与模板匹配能力强，与模板结合的稳定性高，明显增强了探针的敏感性，提高了低丰度突变的检测灵敏度；本发明的双标记探针采用邻近位的修饰方式，探针完整时荧光基团发出的光始终被淬灭基团所淬灭，打破了普通荧光探针受长度限制的问题，探针长度选择更自由，不会对淬灭效果产生影响，具有极低的荧光本底。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 合肥欧创基因生物科技有限公司
<120> 一种双标记探针及其在SNP分型及肿瘤突变的应用
<141> 2019-07-26
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> artical sequence
<400> 1
atacatgcag gagaaagatt ttctatggag tc 32
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<212> DNA
<213> artical sequence
<400> 2
cgcaccgaaa tcactgagca ggagaaaggg tgcg 34
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agggaaaatg acaaagaaca g 21
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 4
ctgagatcag ccaaattcag t 21
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<400> 5
gagatcctct ctctgaaatc acta 24
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<400> 6
tctatggagt cacaggtaag tg 22
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gtggatgaag ttggtggtg 19
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<212> DNA
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<400> 8
aaaggactca aagaacctct g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> artical sequence
<400> 9
aggctgctgg tggtctaccc t 21
Claims (8)
1.一种双标记探针，其特征在于，包括：对探针5’端尾巴序列上做荧光标记，对靶特异结合序列的次位碱基进行淬灭基团标记；所述5’端尾巴序列的长度为2-8个碱基，是人为添加的碱基序列，与靶序列不互补配对；所述靶特异结合序列的长度为16-28nt，与靶序列有0-1个碱基不匹配。
2.根据权利要求1所述的一种双标记探针，其特征在于，探针的修饰方式为：若靶特异结合序列的次位碱基非T，即在5’端尾巴中的T碱基上修饰荧光基团，在次位碱基引入T碱基，并在T碱基上修饰淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的一种双标记探针，其特征在于，探针的修饰方式为：若靶特异结合序列的次位碱基为T，即在5’端尾巴中引入的T碱基上修饰荧光基团，在次位T碱基上修饰淬灭基团。
4.一种双标记探针在SNP分型的应用，其特征在于，检测SNP分型的过程为：
步骤一，根据SNP各个等位基因型分别设计野生型检测探针和突变型检测探针，分别标记各个荧光基团，野生型探针的靶特异结合序列与野生型模板有0-1个碱基不匹配，与突变型模板存在1-2个碱基不匹配；突变型检测探针与突变型模板有0-1个碱基不匹配，与野生型模板存在1-2个碱基不匹配；设计上下游引物，可同时扩增野生型和突变型模板；
步骤二，配制PCR反应体系，设置反应程序，加模板，上机PCR；
步骤三，根据荧光PCR仪给出的CT值和各个通道荧光采集结果，对SNP等位基因型进行判读。
5.一种双标记探针在肿瘤突变的应用，其特征在于，检测体细胞突变的过程为：
步骤一，根据突变位点设计突变型探针，在探针的5’端尾巴序列上修饰荧光基团，在靶特异性结合序列的第二个碱基上修饰淬灭基团，该探针与突变型模板有0-1个碱基不匹配，与野生型模板有1-2个碱基不匹配；
步骤二，设计特异性上游引物和下游引物；
步骤三，配置PCR反应体系；
步骤四，加样，上机，检测靶序列。
6.根据权利要求5所述的一种双标记探针在肿瘤突变的应用，其特征在于，检测p.E545K位点体细胞突变的过程为：
步骤一，设计突变型探针E545K-MT-P，序列如SEQ NO.01，其中，在探针的5’端尾巴的T碱基上修饰荧光基团，在靶特异结合序列的次位碱基位置引入碱基T，并在其上修饰淬灭基团；探针与突变型模板有1个碱基不匹配，与野生型模板有2个碱基不匹配；
步骤二，设计上游引物E545K-F，序列为SEQ NO.03，下游引物E545K-R，序列为SEQNO.04；
步骤三，配置PCR反应体系；
步骤四，加入p.E545K突变型质粒，上机，检测靶序列。
7.根据权利要求6所述的一种双标记探针在肿瘤突变的应用，其特征在于，在探针的5’端尾巴序列上修饰的荧光基团为FAM。
8.根据权利要求6所述的一种双标记探针在肿瘤突变的应用，其特征在于，在靶特异性结合序列的碱基上修饰的淬灭基团为BHQ1。
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