CN115011454A - 核酸检测装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸检测装置和方法。包括基板，在核酸检测时进行旋转，在基板内部包含有以下腔室，分别为：用于加入、容纳核酸样本溶液的样品腔，腔内放入核酸样本溶液，样品腔上端口和外界大气连通；用于核酸扩增反应的反应腔，位于样品腔下方，腔内预先放置用于核酸扩增反应的核酸扩增试剂，反应腔上端和样品腔底端之间通过纵向液体通道通道连通；用于层析试纸条检测的试纸条腔，腔内预先放置核酸试纸条，试纸条腔和反应腔之间通过弯折通道连通。本发明装置及方法可快速有效、低成本无污染地实现核酸扩增及其产物的侧向层析检测，避免了基层和家用检测下缺乏培训和经验的处理问题。
Description
技术领域
本发明属于生化分析领域的一种核酸检测方法和装置，尤其是涉及到一种能够利用侧向层析试纸条对核酸扩增产物进行检测的核酸检测方法和装置。
背景技术
关于侧向层析核酸检测测试条，已经有很多的报道，可参看相关的综述文献“Rapid developments in lateral flow immunoassay for nucleic acid detection”(Analyst,2021,146,1514–1528)等。
利用侧向层析核酸试纸条对目标核酸进行检测是一种简便的可视化检测方法，能够促进核酸检测向基层以及家庭推广，从而在疾病诊断、食品安全、环境检测等各个领域得到应用。侧向层析核酸检测试纸条可以和聚合酶链式扩增(PCR)以及各种等温扩增方法，如LAMP、RPA等结合使用。
但是，目前核酸扩增方法和侧向层析试纸条结合还是存在着一些不足，有待进一步改进。主要问题是在操作过程中需要将核酸扩增产物添加到试纸条的样品垫上。为完成这样的操作，如果扩增是在一个单独的反应管中进行的话，就需要在核酸扩增结束后将扩增管打开。这种开盖过程容易引起环境中扩增产物的气溶胶污染，有可能会导致后续检测的假阳性结果。同时，由于核酸扩增检测的灵敏度很高，为了减少试剂的消耗，一般核酸扩增的反应体系体积较小。而常见的侧向层析试纸条检测所需的溶液量要大于普通核酸扩增反应体系。这样在整个检测过程中，就牵涉到一个扩增产物的稀释步骤。这一稀释步骤也增大了整个操作的复杂性。
目前，有一些方法，会把扩增和试纸条集成在一个装置中，一方面防止气溶胶释放到周围环境中，同时另一方面也能实现核酸扩增，产物稀释以及试纸条中样品垫上溶液添加等整个过程，但是这些方法和装置都比较复杂，成本较高。针对这些问题，本发明提出了一种新的核酸检测方法和相应的装置，能够很好的实现核酸扩增和试纸条检测。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明提出了一种核酸检测方法和装置，可快速有效、低成本无污染地实现核酸扩增及其产物的侧向层析检测，避免了基层和家用检测下缺乏培训和经验的处理问题。
本发明的技术方案如下：
一、一种核酸检测装置：
包括基板，在核酸检测时进行旋转，是绕朝向弯折管道的时针方向旋转，具体是当连接样本腔和试纸条腔的通道在样本腔左边时逆时针旋转；而当连接样本腔和试纸条腔的通道在样本腔右边时顺时针旋转。同理，当连接反应腔和试纸条腔的通道在反应腔左边时逆时针旋转；而当连接反应腔和试纸条腔的通道在反应腔右边时顺时针旋转。在基板内部包含以下腔室，分别为：
包括用于加入、容纳核酸样本溶液和核酸扩增试剂的样品反应腔，腔内放入核酸样本溶液及核酸扩增试剂；
包括用于层析试纸条检测的试纸条腔，腔内预先放置核酸试纸条，试纸条腔和样品腔之间通过弯折通道连通，弯折通道中至少有一点高于样品反应腔/样品腔中可能添加溶液的最高液面，且所有通道位于样本腔左、或右的一侧。所述的核酸试纸条贴附在试纸条腔靠近弯折通道的角落或者内壁上。
所述的样品反应腔具体分为样品腔和反应腔：
包括用于加入、容纳核酸样本溶液的样品腔，腔内放入核酸样本溶液；
包括用于核酸扩增反应的反应腔，位于样品腔下方，腔内预先放置用于核酸扩增反应的核酸扩增试剂，试纸条腔经反应腔和样品腔连通，试纸条腔和样品腔之间不直接连通，反应腔上端和样品腔底端之间通过液体通道连通，试纸条腔和反应腔之间通过弯折通道连通。
反应腔的体积小于50微升。当扩增反应的液体体积大于50微升时，可以将用于核酸扩增反应的核酸扩增试剂放置于样品腔，直接采用样品腔进行扩增反应，而省略反应腔，这时也可称样本腔为样本反应腔。
所述的弯折通道为U形、Z形、S形、几字形、L形等通道。
所述的弯折通道为直线通道、曲线通道中的一种或者多种的组合。
在弯折通道中设置用于控制液体流动和停止位置的毛细管阀，毛细管阀位置的设置为：当装置处于水平状态时，弯折通道中的溶液静压力不能突破毛细管阀的阻力；而当装置处于非水平状态后，样品反应腔/样品腔、反应腔的位置变化引起弯折通道中的溶液静压力上升，从而弯折通道中的溶液静压力突破毛细管阀引起液体在弯折通道中的流动。
还设有气体连通通道，试纸条腔经气体连通通道后和样品反应腔/样品腔顶部连通。
还包括用于放置核酸检测试剂的试剂腔，和样品反应腔/样品腔处于同一高度，腔内添加检测试剂，检测试剂为带有标记的单链DNA序列溶液，试剂腔的下端经液体通道与试纸条腔和样品反应腔/反应腔之间的弯折通道连通，液体通道的特征为液体通道中有至少一点高于样品反应腔/样品腔可能添加溶液的最高液面和试剂腔中可能添加溶液的最高液面，以两者的高点为对比点。
还设有气体连通通道，试纸条腔经气体连通通道后和样品反应腔/样品腔、试剂腔的顶部连通。具体是设置一个竖直的气体连通通道和一个水平的气体连通通道，水平的气体连通通道将样品腔和试剂腔的顶部连通，竖直的气体连通通道将试剂腔的顶部和试纸条腔连通。
在样品反应腔/样品腔和试剂腔中分别设置有用于在腔转动时候阻止腔内的溶液进入腔顶部连通通道的隔板结构。
所述的第一纵向液体通道、第二纵向液体通道和第三纵向液体通道均位于反应腔的同一侧，通道的位置也均在试剂腔、样品腔和反应腔的同一侧，试剂腔和样品腔均位于反应腔的另一侧。
还包括用于防污染的气压缓冲腔，气压缓冲腔和气体连通通道相通，，使得气压缓冲腔分别和样品腔、试剂腔、试纸条腔直接连通。气压缓冲腔的一侧侧壁在基板处开设开口，在开口处密封设置柔性薄膜。
所述的反应腔处设置有用于加热反应腔的温控装置。当省略反应腔时，温控装置可位于样品腔的底部。
二、第一种上述核酸检测装置的核酸检测方法：
S1、在样品反应腔中预先添加核酸扩增试剂和核酸样本溶液，直接在样品反应腔内进行核酸扩增反应；
S3、在扩增反应结束后在核酸样本溶液内获得反应扩增液，将整体装置绕向设置弯折管道的时针方向旋转角度，在静压的作用下反应扩增液和试剂腔中的溶液通过弯折管道进入到试纸条腔内的底部发生混合，使得检测试剂中标记的单链DNA序列和反应扩增液中的目标核酸序列结合，在到达试纸条腔底部后，混合的溶液接触试纸条腔中的核酸试纸条进行层析反应进行检测。
三、第二种上述核酸检测装置的核酸检测方法：
S1、在反应腔中预先添加核酸扩增试剂，在样品腔中预先添加核酸样本溶液，在试剂腔中预先添加检测试剂；
S2、将核酸样本溶液添加到样本腔内，在静压作用下核酸样本溶液进入到反应腔，在反应腔内进行核酸扩增反应；通过毛细管道保证静压作用；
S3、在扩增反应结束后在反应腔内获得反应扩增液，将整体装置的基板绕向设置弯折管道的时针方向旋转角度，在静压的作用下反应腔、样本腔和试剂腔中的溶液通过弯折管道进入到试纸条腔内的底部发生混合，使得检测试剂中标记的单链DNA序列和反应扩增液中的目标核酸序列结合，在到达试纸条腔底部后，混合的溶液接触试纸条腔中的核酸试纸条进行层析反应进行检测。具体地，当连接反应腔和试纸条腔的通道在反应腔左边时，逆时针旋转；而当连接反应腔和试纸条腔的通道在反应腔右边时，顺时针旋转。
本发明的有益效果是：
本发明的装置及方法能够实现核酸扩增及其产物的侧向层析检测。为完成检测，使用者只有两步操作。第一是向样本腔10中滴加一定量的被测样本；第二是待核酸扩增结束后，旋转装置即可。这个旋转操作也可以利用配套的仪器来实现，可利用舵机等方便、低成本地实现转动。这些为核酸检测向基层及家庭使用推广奠定了基础。
同时，在本发明的装置中，当加入样本后，只要盖紧样本腔的管口，这个装置内部和外界完全隔绝，没有任何的气体、液体的连通口。同时，装置也设有气压缓冲腔，放置在加热条件下装置内部气压高于外部气压，具有很强的防污染能力。整个装置通过内部气路的设计，实现各个腔室气压的自动平衡，这样液体运动均可利用液体静压控制完成，无需任何外界的泵、阀，和外界也没有任何的连通。就核酸扩增而言，对于核酸扩增子的防污染设计是一个十分重要的内容。特别是对于基层和家用检测来说，操作者往往缺乏培训和经验，防污染设计更为重要。本发明的装置在此有明显优势。
和已有的方法相比，本发明的装置和方法具有结构简单、操作方便、结果稳定、和防止和核酸扩增产物污染等的优势。
附图说明
图1是本发明装置的结构示意图。1、基板，21、22、23、24、纵向液体通道，31、32、33、横向液体通道，4、反应腔，5、试纸条腔，61、62、气体连通通道，7、气压缓冲腔，8、试剂腔，91、92、腔内分割板，10、样品腔，11、毛细管道，121、122、毛细管阀。
图2本发明装置的示意图，可省略了反应腔及气压缓冲腔，10标记为样品反应腔，其余标记可参见图1。
图3是气压缓冲腔7的剖面示意图。13、柔性薄膜。
图4是核酸层析试纸条检测结果。a)阳性样本，b)阴性样本。
图5是本发明装置的一个实施例示意图。在该装置中未设置试剂腔。
图6是本发明装置的一个实施例示意图。14、舵机接口，15、温控装置。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施对本发明作进一步说明。
通过图1介绍本发明的方法和配套装置。请注意为了方便说明本发明的相关内容，突出结构细节，该图不是根据各个结构的实际尺寸大小按比例绘制。
在说明过程中，纸面的上下方向为纵向(亦即文中用上、下，或高、低描述相对位置)，纸面的水平方向为横向(亦即文中用左、右描述相对位置)，而垂直于纸面的方向为深度方向(亦即文中用凹、凸，或深、浅描述相对位置)。
在下面所描述的左、右位置，均是以装置在一定条件下会进行逆时针转动进行检测操作为例进行说明的。装置也可以进行顺时针的转动，在此情况下，所有描述的左、右位置均应该互换。
如图1所示，装置中包含设置在基板1内部的相互各自独立的五个腔室，分别为样品腔10、试剂腔8、反应腔4、试纸条腔5和气压缓冲腔7。样品腔10的体积一般大于50微升，反应腔4的体积小于50微升。在对较大样本体积量(大于50微升)进行扩增反应时，即当扩增反应的液体体积大于50微升时，可以将样品腔10和反应腔4合为一体，称为样品反应腔(如图2所示)。
基板1侧面和舵机的输出轴连接，具体实施在基板1侧面设置用于连接舵机的输出轴的舵机接口14，舵机的输出轴插入到舵机接口14带动基板1旋转。
反应腔4处于样品腔10的左下方，通过通道24相连。从反应腔4到试纸条腔5经弯折通道的液体通道相连。从竖直方向而言，在弯折通道中至少有一点高于样品腔10中可能添加溶液的最高液面。同时，从水平方向而言，弯折通道位于反应腔的一侧；且从水平方向而言，反应腔4位于样品腔10和弯折通道之间。当省略反应腔4时，样品腔10和反应腔4合为一体形成的样品反应腔以同样的方式和试纸条腔5经液体通道相连。
弯折通道为U形、Z形、S形、几字形、L形等通道。同时，弯折通道为直线通道、曲线通道中的一种或者多种的组合。
举例而言，反应腔4和试纸条腔5联通弯折通道的一个具体形式是由近U形的直线通道构成，从反应腔4到试纸条腔5依次经水平的第一横向液体通道31、竖直的第三纵向液体通道23、水平的第三横向液体通道33、竖直的第一纵向液体通道21形成的倒U形弯折通道连通，第三横向液体通道33高于反应腔4，其中的所述的第三纵向液体通道23顶端高于样品腔10中可能添加溶液的最高液面。
即如图1所示，反应腔4的左、下部通过通道31，并经过进一步通过通道23、通道33、通道21和试纸条腔5相通。其中通道23的设置，使得通道23纵向的最高端高于样品腔10中可能添加溶液的最高液面，也即是在当装置处于如图1所示的水平放置的位置时，加入到样品腔10中的溶液不会填充满通道23，从而避免在此位置条件下有溶液进入到试纸条腔5。当省略反应腔4时，样品腔10以同样的方式和试纸条腔5经液体通道相连，如图2所示。
在反应腔4中有预先固化的核酸扩增试剂，可以采用冻干、风干等方法。只需加入相应的样本溶液，在配以适当的温度控制就能够完成核酸扩增反应。当核酸扩增反应的体积大于50微升时，可省略反应腔4，这时可将核酸扩增试剂预先固化于样品反应腔底部。
试剂腔8处于样品腔10的左侧或右侧，和样品腔10基本处于同一高度。试剂腔8的下端经液体通道与试纸条腔5和反应腔4之间的弯折通道连通。其液体通道的特征为通道中有至少一点高于样品腔10可能添加溶液的最高液面以及试剂腔8中可能添加溶液的最高液面，以两者的高点为对比点。
举例而言，试剂腔8的下端依次经水平的第二横向液体通道32、竖直第二纵向液体通道22后和第三横向液体通道33的中间连通，第三横向液体通道33的两端分别和第一纵向液体通道21、第三纵向液体通道23连通，且第二纵向液体通道22的顶端高于试剂腔8中可能添加溶液的最高液面和样品腔10可能添加溶液的最高液面。
具体形式如图1所示，其左、下部通过通道32，并进一步通过通道22、通道33以及通道21和试纸条腔5相通。其中通道22的设置，使得通道22纵向的最高端高于试剂腔8中溶液液面，也即是在当装置处于如图1所示的水平放置的位置时，加入到试剂腔8中的溶液不会填充满通道22，从而避免在此位置条件下有溶液进入到试纸条腔5，同时这一设计也可保证当装置处于如图所示的水平放置的位置时，试剂腔5中的溶液不会和样品腔10以及反应腔4中的溶液混合。
反应腔4到样品腔10之间还可设置有毛细管道11，试纸条腔5顶部经毛细管道11和反应腔4连通，毛细管通道11的顶端高于样品腔10中可能添加溶液的最高液面，毛细管道11的作用是当液体在静压作用下从样品腔10进入到反应腔4时，可以避免气泡在反应腔4顶部形成。
在样品腔10和试剂腔8中设置有如图所示的隔板结构91和92，从而当装置转动时，可以阻止试剂腔8中的溶液进入通道62，阻止样品腔10中的溶液进入毛细管道11。隔板结构91设置在试剂腔8顶部远离通道62一侧的内壁上，且位于通道62下方；隔板结构92设置在样品腔10顶部远离毛细管道11一侧的内壁上，且位于毛细管道11下方。
通道21、22和23的位置均在试剂腔8、样品腔10和反应腔4的左侧，并且相对于通道22和23，通道21在最左侧。通道33连接的是通道21、通道22和通道23的纵向最高端(顶部)。
在连接反应腔4和试纸条腔5的液体通道中设置用于控制液体流动和停止位置的毛细管阀。毛细管阀位置的设置原则为：当装置处于水平状态时通道中溶液静压力不能突破毛细管阀的阻力；而当装置旋转后，由于样品腔10、反应腔4的位置变化引起通道中溶液静压上升，从而可以突破毛细管阀，引起液体在通道中的流动。
图1显示了在通道22和通道23的中设置毛细管阀的一个具体形式。毛细管阀121设置的位置高于样品腔10中可能添加的最高液面位置，而毛细管阀122设置的位置高于试剂腔8中可能添加的最高液面位置。当装置在如图所示的水平放置的位置时，反应腔4中液体在毛细管力的作用下到达毛细管阀所处位置。由于在毛细管阀的位置处表面张力的方向发生变化，液体流通到毛细管阀的位置就停止了。而当核酸扩增反应结束后，通过装置的旋转一定角度，这时通道中的液体除了受到表面张力的作用，也将受到管道中液体静压的作用，在液体静压的作用下，通道中的液体突破毛细管阀的阻力，向通道下游流动。这样就可以通过毛细管阀121和122控制液体在这些管道中的流动及停止位置。
举例而言，第三纵向液体通道23中设置用于控制液体流动和停止位置的毛细管阀121，毛细管阀121高于样品腔10中可能添加溶液的最高液面。
试纸条腔5的左侧和通道21相通，从而当整个装置转动一定角度后，样品腔10、反应腔4及试剂腔8中的溶液可以通过通道21进入到试纸条腔5中。试纸条腔的设计使得其体积较大，当整个装置逆时针转动一定角度后，所有进入的溶液只会填充试纸条腔5的底部，也即溶液和试纸条腔5内的层析试纸条的样品垫部位接触。
在装置中设有通道61和62。在添加样本、试剂以及后续操作时，需确保溶液不会进入到通道61和62中。样本和试剂添加完之后，可以利用盖子或胶带等将样品腔10、试剂腔8和周围环境隔离，从而装置内成为一个密闭系统。同时，通过通道61和62，将样品腔10、试剂腔8和试纸条腔5成为一个联通系统，从而确保各个腔室的气压不会干扰装置内液体的流动。
在装置中设有气压缓冲腔7，气压缓冲腔7和通道61、62相通，从而和装置内部的气体连通。气压缓冲腔7的一侧侧壁打通，然后用柔性薄膜13封闭(如图3所示)。柔性薄膜13的面积很大，从而在受到压力时可以自动张开，膨胀，而不会产生应力。
设置气压缓冲腔7能够进一步提高装置的防污染能力。在本装置的实际检测中，往往需要对反应腔4中的液体进行加热以促使核酸扩增反应进行，如PCR反应需要将溶液温度最高加热至95度左右。等温扩增，如LAMP反应，也需要控制反应液在65度左右。虽然可以控制加热的面积，但是，这样的加热操作不可避免地会同时加热反应装置中的气体，从而引起气体体积膨胀。本装置的设计是在检测过程中，整个装置的内部处于一个气密的条件下，从而避免核酸扩增产物的泄漏从而引起环境中扩增产物的污染。但是，如果装置内部的气压相对于环境处于一个正压的状态，则容易在一些条件下，如操作过程中样本腔添加样本后，操作者没有把盖子完全密闭盖紧的情况下引起装置内气体向周围环境的泄漏。为解决这些问题，本装置中设置了气压缓冲腔，当装置内部气体受热膨胀时，会对气压缓冲腔中的柔性薄膜13产生压力，扩张柔性薄膜13，从而仍旧维持装置内外的气压平衡，避免在一些极端条件下可能会出现的装置内气体向外界的泄漏，进一步增强整个装置的防污染能力。
同时，气压缓冲腔的设置也使得整个装置内部虽然和外界环境没有连通，但气压和外界气压是平衡的，这样就可以避免加热过程中装置内部气压过高从而在液体中形成气泡，从而影响扩增反应，以及避免气泡在通道中聚集影响气体流动。
下面介绍本发明的具体检测实施过程：
1、样本及检测试剂的添加。
反应腔4中预先放置的核酸扩增试剂。
根据反应腔4中预先放置的核酸扩增试剂的要求，样品腔10中添加经过标准核酸提取过程的核酸样本溶液，也可以是经过简单处理，如加热或稀释后的核酸样本溶液。核酸样本溶液添加的量可以约为50到1000微升。在能够满足后续层析测试要求的情况下，核酸样本溶液的添加量可以少些。
试剂腔8中添加检测试剂，检测试剂为带有标记的单链DNA序列。在通道33、21以及试纸条腔5中，检测试剂中带有标记的单链DNA序列可以和经过扩增的目标序列以碱基互补的形式结合，从而对目标核酸序列实现标记，以利于层析核酸检测试纸条的检测。检测试剂的添加量可以为10到1000微升。
2、核酸扩增反应
核酸样本溶液添加到样本腔10之后，由于反应腔4处于样本腔10的左下部且和样本腔10通过沟道连通，在静压的作用下，核酸样本溶液会进入到反应腔4，核酸扩增反应获得反应扩增液。
反应腔4本身通过左下部的通道和样本腔10中液面大气相同。同时，也可进一步在反应腔4的左上部设置毛细管道11，并且使得毛细管通道11的最高端高于样本腔10中的液面，这样毛细管通道11也能起到一个气压连通的作用，从而使得核酸样本溶液能够充满反应腔4。
虽然样本溶液也会进入毛细管通道11和通道23中，但是，在设计中使得这些通道的体积相比于反应腔4可以基本忽略。同时，虽然样本腔10和反应腔4通过通道24相连，但是，在这一通道24中，溶质成分只能通过扩散的方式实现运动。在核酸扩增反应的时间尺度内，扩散所带来的传质效应是很小的，从而使得整个核酸扩增反应只在反应腔4中进行。
设计中可以将反应腔4体积控制在3到50微升之间，这样，只要在样本腔10中加入适当的样本，就可以根据装置的设计，在反应腔4中得到相应体积的溶液并进行反应，这样可以大大减少核酸扩增生化试剂的消耗，降低成本。
反应腔4核酸扩增的温度控制可利用外置或附属的温控装置。根据需要，可以进行PCR反应，也可以实现等温扩增反应，常见的有LAMP以及RPA等。
当核酸扩增反应体积大于50微升时，可以省略反应腔4，直接在样品腔10中进行扩增反应。
3、扩增产物的核酸试纸条检测
在扩增反应结束后，将装置逆时针旋转一定角度，如90度。这时，在静压的作用下，反应腔4、样本腔10以及试剂腔8中的溶液会通过通道33、通道21最终进入到试纸条腔5的底部。在通道中以及在试纸条腔5的底部中，检测试剂、核酸样本溶液和反应扩增液的各种溶液会发生混合，混合后到达试纸条腔5底部后，接触试纸条腔5中的核酸试纸条的样品垫部分，从而通过层析反应，在核酸试纸条上实现检测。
其中一方面使得检测试剂中用于标记的单链DNA序列和反应扩增液中的目标核酸序列发生结合，另一方面，由于检测试剂、核酸样本溶液和反应扩增液的混合，也使得原本较小体积的反应扩增液得到稀释，体积变大，有利于层析检测。
本发明的实施实例：
1、沙门氏菌的等温扩增及层析试纸条检测
该实施例的结构如图1所示，所使用的材料为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板材，板材的厚度为5毫米，利用机械加工的方式在板材的一面加工出如图1所示的图形(请注意图1为了说明方便，并不是根据实际尺寸绘制。若有图形所示和文字描述不一致时，以下面文字说明为准)。
样本腔、反应腔、试剂腔和气压缓冲腔的深度均为2毫米；试纸条腔的深度为3毫米。样本腔的宽度为4毫米，高度为40毫米，其中腔内分割板距离腔顶部为30毫米，分隔板右端距离腔壁为1毫米。反应腔的宽度为4毫米，高度为3毫米。试剂腔的宽度为4毫米，高度为50毫米，其中腔内分割板距离腔顶部为30毫米，分隔板右端距离腔壁为1毫米。试纸条腔的高度为42毫米，宽度为62毫米。气压缓冲腔的宽度为15毫米，高度为10毫米。
纵向通道21、22、23、24的截面尺寸为0.5x0.5毫米，各通道长度及形状根据实际需要设置，但需确保通道23的顶部高于样本腔内所加样本液面的最高高度。根据需要，可在通道22和23中设置毛细管阀，以阻止通道中液体的流动。毛细管阀121设置的位置高于样品腔10中可能添加的最高液面位置，而毛细管阀122设置的位置高于试剂腔8中可能添加的最高液面位置。
横向通道31、32、和33的截面尺寸为0.5x0.5毫米，形状及通道的长度根据实际需要确定。
气体连通通道61和62的截面尺寸为0.2x0.2毫米，形状根据实际需要确定，以确保分别连接试纸条腔和试剂腔，以及试剂腔和样本腔。
毛细管通道11的截面尺寸为0.1x0.1毫米，形状根据实际需要确定，以实现连接样本腔上部和反应腔。
上述结构加工完毕后，可利用键合、粘结等技术和另一块PMMA板材粘结以构建完整腔室。其中，在这块一块板材的气压缓冲腔7相应的位置，需要打穿形成一个宽15毫米、高10毫米的矩形腔，然后，在表面用伸缩性好、面积大的柔性薄膜封闭，以形成气压缓冲腔。
在样本腔的顶部可设置管帽或黏胶带，从而可以在添加样本后封闭整个装置。
本实施例以沙门氏菌的检测为例，以沙门氏菌中的侵袭蛋白A(invA)基因为靶标，进行LAMP扩增反应及层析试纸条检测。
反应的体系如下：
这些反应组合可以通过冻干或风干的方法，预先放置于反应腔中。同时，在FIP的5’端标记有FAM。LB没有包括在反应体系中，在LB的5’端标记有生物素，同时用ThermoPol缓冲液溶解，LB的浓度为0.2μM，作为检测试剂，添加到试剂腔中，添加的量在20微升。
装置中所用的试纸条为常见的核酸检测层析试纸条，T线上固定有链霉亲和素，胶体金上连接有FAM抗体。
所添加的样本为经过培养的沙门氏菌样本，浓度为1000cfu每毫升，经过磁珠核酸提取。在在样本腔中添加的样本为100微升。
添加样本后，可用胶带封闭样本腔，也可以用管帽等，从而隔绝装置内外的气、液交换，防止可能发生的气溶胶污染。利用外加的温控装置或芯片所自带的温控装置15，对反应进行加热，温度控制在65度左右，反应30分钟。
之后，将装置逆时针旋转一定角度，如90度，以通过装置芯片中的额液体静压，实现反应腔、试剂腔以及样本腔中液体的流动、混合，最终进入到试纸条腔底部，接触试纸条的样品垫，开始层析。等待5到15分钟，观察是试纸条腔中的试纸条。阳性样本会出现两条条带，而阴性样本只有一条条带(分别如图4a和图4b所示)。
2、沙门氏菌的PCR扩增及层析试纸条检测
采用实施例1的装置，但是进行PCR扩增，因此所配置的温控装置能够在50度到95度间进行温度循环。
这里采用的扩增酶为TaKaRa TaqTM HS DNA聚合酶，购自宝生物工程(大连)有限公司，并采用配套的反应缓冲液，进行冻干。分别采用实施例1中的F3和B3作为PCR扩增的引物。在F3的5’端标记有FAM。PCR扩增时F3的浓度为0.4μM，而B3的浓度为0.4μM。这样进行的为不对称的PCR扩增，扩增产物自然生成单链，可以和检测探针结合，以实现后续的核酸层析试纸条检测。其他的PCR扩增条件如普通正常PCR要求。
在检测探针的5’端标记有生物素，将检测探针溶解，浓度为0.2μM，作为检测试剂，添加到试剂腔中，添加的量为20微升。
之后，将装置逆时针旋转90度，等待5到15分钟。观察是试纸条腔中的试纸条。阳性样本会出现两条条带，而阴性样本只有一条条带。
3、简化装置中的沙门氏菌的等温扩增及层析试纸条检测
本实施例采用简化的装置，如图5所示。在这一装置中，未设置试剂腔。LAMP扩增反应中，将生物素标记的LB3试剂也放置入反应腔的冻干材料中。然后，如实施例1进行LAMP扩增及试纸条检测。
该实施例的优点是省略了装置中的试剂腔，也简化了试剂添加步骤。但可能存在的缺点是若引物及反应体系设计不当，可能会发生FIB和LB之间引物二聚体以及其他的副反应，从而引起假阳性的结果。
4、利用自动转动仪器实现检测。
如图6所示，在装置芯片中预先切割出不对称的十字形结构。然后，在检测中，将装置芯片利用这结构放置在舵机的相应接口处。如实施例1进行LAMP扩增，扩增结束后利用舵机转动，实现装置的自动转动，完成装置内液体的流动以实现扩增结果的层析试纸条检测。舵机的转动角度及方向可以根据装置芯片内液体流动的需要精确控制。
Claims (11)
1.一种核酸检测装置，其特征在于：
包括基板(1)，在核酸检测时进行旋转，在基板(1)内部包含以下腔室，分别为：
包括用于加入、容纳核酸样本溶液和核酸扩增试剂的样品反应腔；
包括用于层析试纸条检测的试纸条腔(5)，腔内预先放置核酸试纸条，试纸条腔(5)和样品腔(10)之间通过弯折通道连通，弯折通道中至少有一点高于样品腔(10)中可能添加溶液的最高液面。
2.根据权利要求1所述的一种核酸检测装置，其特征在于：
所述的样品反应腔具体分为：
包括用于加入、容纳核酸样本溶液的样品腔(10)，腔内放入核酸样本溶液；
还包括用于核酸扩增反应的反应腔(4)，位于样品腔(10)下方，腔内预先放置用于核酸扩增反应的核酸扩增试剂，试纸条腔(5)经反应腔(4)和样品腔(10)连通，反应腔(4)上端和样品腔(10)底端之间通过液体通道(24)连通，试纸条腔(5)和反应腔(4)之间通过弯折通道连通。
3.根据权利要求2所述的一种核酸检测装置，其特征在于：
在弯折通道中设置用于控制液体流动和停止位置的毛细管阀(121)，毛细管阀(121)位置的设置为：当装置处于水平状态时，弯折通道中的溶液静压力不能突破毛细管阀(121)的阻力；而当装置处于非水平状态后，样品反应腔/样品腔(10)、反应腔(4)的位置变化引起弯折通道中的溶液静压力上升，从而弯折通道中的溶液静压力突破毛细管阀(121)引起液体在弯折通道中的流动。
4.根据权利要求1或2所述的一种核酸检测装置，其特征在于：
还设有气体连通通道(61、62)，试纸条腔(5)经气体连通通道(61、62)后和样品反应腔/样品腔(10)顶部连通。
5.根据权利要求1或2所述的一种核酸检测装置，其特征在于：
还包括用于放置核酸检测试剂的试剂腔(8)，和样品反应腔/样品腔(10)处于同一高度，腔内添加检测试剂，试剂腔(8)的下端经液体通道与试纸条腔(5)和样品反应腔/反应腔(4)之间的弯折通道连通，液体通道的特征为液体通道中有至少一点高于样品反应腔/样品腔(10)可能添加溶液的最高液面和试剂腔(8)中可能添加溶液的最高液面。
6.根据权利要求5所述的一种核酸检测装置，其特征在于：
还设有气体连通通道(61、62)，试纸条腔(5)经气体连通通道(61、62)后和样品反应腔/样品腔(10)、试剂腔(8)的顶部连通。
7.根据权利要求5所述的一种核酸检测装置，其特征在于：
在样品反应腔/样品腔(10)和试剂腔(8)中分别设置有用于在腔转动时候阻止腔内的溶液进入腔顶部连通通道的隔板结构(91、92)。
8.根据权利要求5所述的一种核酸检测装置，其特征在于：
还包括用于防污染的气压缓冲腔(7)，气压缓冲腔(7)和气体连通通道(61、62)相通，气压缓冲腔(7)的一侧侧壁开设开口，在开口处密封设置柔性薄膜(13)。
9.根据权利要求2所述的一种核酸检测装置，其特征在于：
所述的反应腔(4)处设置有用于加热反应腔(4)的温控装置(15)。
10.应用于权利要求1所述核酸检测装置的核酸检测方法，其特征在于：
S1、在样品反应腔中预先添加核酸扩增试剂和核酸样本溶液，直接在样品反应腔内进行核酸扩增反应；
S3、在扩增反应结束后在核酸样本溶液内获得反应扩增液，将整体装置绕向设置弯折管道的时针方向旋转角度，在静压的作用下样品反应腔和试剂腔(8)中的溶液通过弯折管道进入到试纸条腔(5)内的底部发生混合，使得检测试剂中标记的单链DNA序列和反应扩增液中的目标核酸序列结合，在到达试纸条腔(5)底部后，混合的溶液接触试纸条腔(5)中的核酸试纸条进行层析反应进行检测。
11.应用于权利要求2所述核酸检测装置的核酸检测方法，其特征在于：
S1、在反应腔(4)中预先添加核酸扩增试剂，在样品腔(10)中预先添加核酸样本溶液，在试剂腔(8)中预先添加检测试剂；
S2、将核酸样本溶液添加到样本腔(10)内，在静压作用下核酸样本溶液从进入到反应腔(4)，在反应腔(4)内进行核酸扩增反应；
S3、在扩增反应结束后在反应腔(4)内获得反应扩增液，将整体装置绕向设置弯折管道的时针方向旋转角度，在静压的作用下反应腔(4)、样本腔(10)和试剂腔(8)中的溶液通过弯折管道进入到试纸条腔(5)内的底部发生混合，使得检测试剂中标记的单链DNA序列和反应扩增液中的目标核酸序列结合，在到达试纸条腔(5)底部后，混合的溶液接触试纸条腔(5)中的核酸试纸条进行层析反应进行检测。
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