CN110938710B - 一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用 - Google Patents

一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使轮状病毒和肠道腺病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

Description

一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测轮状病毒和肠道腺病毒核酸的试剂盒及其应用。
背景技术
轮状病毒(RV)是一种双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科。它是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪－口途径，临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻 5天，严重时出现脱水症状。
肠道腺病毒(EAD)具体是指腺病毒40、41型，它是一种DNA病毒。腺病毒胃肠炎广泛分布于世界各地，在小儿发病情况仅次于轮状病毒性肠炎，最早发病年龄为1月，绝大多数发生于3岁以下的婴幼儿。Ad-40主要感染1岁左右婴儿，Ad-41则感染稍大的幼儿，全年均可发病，但腺病毒性胃肠炎一般呈散发性。腺病毒胃肠炎的潜伏期约10天，主要表现为腹泻，量少或多，呈水样便或稀便，少数可排出粘液，病程4-8天，常伴呕吐。部分患者有呼吸道症状，少数患者发热，病程多自限，排毒时间约1周。某些患者失水较严重，个别重度失水者可死亡。
轮状病毒和肠道腺病毒感染的实验室诊断方法有很多，一般可以分为病毒分离培养，免疫学检测和分子生物学检测。病毒分离培养是最传统的检测，该方法虽然可靠，但病毒分离培养阳性率低，耗时也很长(1到2周)，因此使该方法无法在临床上得到有效应用。免疫学检测主要包括ELISA、胶体金免疫层析法。免疫学检测方法特异性和灵敏度适中，简便快捷，也是现在临床上常用的检测方法，但存在难以解决的假阴性假阳性问题。分子生物学检测的方法可直接检测轮状病毒和肠道腺病毒的核酸，灵敏度高、特异性强，检测速度也较快，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势，是轮状病毒和肠道腺病毒检测的主要方法之一。但是分子生物学检测的方法对硬件设施有一定的要求，要有专门的核酸检测实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。因此，人们仍然需要寻找一种操作简单、快速、价格低廉的轮状病毒和肠道腺病毒诊断方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测轮状病毒和肠道腺病毒核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，也不需要特殊的仪器，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使轮状病毒和肠道腺病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。
为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种轮状病毒和肠道腺病毒核酸联合检测胶体金层析试剂盒，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：
1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl2，70mM K Cl，15％DMSO，5mM DTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；其中扩增引物包括三对：轮状病毒、肠道腺病毒和人内参基因，具体的：
(1)轮状病毒(NSP5基因一段保守区序列)引物：
RVA-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATCATTCTC ATTCTCAGTGCG；
RVA-F引物(5’-3’)：5’-GTTGGGTGCGATCAAGTGGA-3’；
(2)肠道腺病毒(E3基因一段保守区序列)引物：
EAD-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGCCGA TGTAGATGTTGCA；
EAD-F引物(5’-3’)：TGGAACCCTCCAGTTTGTGG；
(3)内参(人18SrRNA一段保守区序列)核酸引物
内参-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTCTAGA ATTACCACAGT；
内参-F引物(5’-3’)：CTGGTTGATCCTGCCAGTA；
在设计引物时同时要保证各自单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰。各组引物的R引物5’端都引入了T7 RNA聚合酶启动子序列。
2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7 RNA聚合酶和RnaseH；
3)核酸提取试剂：细胞裂解液(购至美国Signosis公司，货号CL-0001)：可以裂解细胞，释放核酸；
4)检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针(金探针)、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：
(1)轮状病毒特异探针(5’-3’)
RVA-CES1：TAAAGGAATTAAAGTGAGTGttttTATCTATAGCTGGTGT；
RVA-CES2：CAAACTTAGATTCATCTGTAttttTATCTATAGCTGGTGT；
RVA-LES1：TCAATATCAACTAATGTAAAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTG AGC；
RVA-LES2：GAAGGAGAAATCCAAGAACGttttCGCAGTGCTCGAGCTCT GAGC；
RVA-LES3：ACCATAGAAGTAGGAAACACttttCGCAGTGCTCGAGCTCT GAGC；
(2)肠道腺病毒特异探针(5’-3’)
EAD-CES1：ACTTCAACCCATTCTCGGGCttttCTATGTATCTGTGAGT；
EAD-CES2：GCTCCTGGTCTTTACCCAGAttttCTATGTATCTGTGAGT；
EAD-LES1：CGACTTCATCCCAAACTACGttttCGCAGTGCTCGAGCTCTG AGC；
EAD-LES2：ACGCGGTGAGCGAATCTGTGttttCGCAGTGCTCGAGCTCTG AGC；
EAD-LES3：GACGGCTACGACTGAATCCCttttCGCAGTGCTCGAGCTCTG AGC；
(3)内参特异探针(5’-3’)
内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttATCTGTATAGTGTCTG；
内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttATCTGTATAGTGTCTG；
内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；
内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；
内参LES3：AATACAGGACTCTTTCttttCCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；
(4)C线显色探针
5’-TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC-3’；
(5)金探针
金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：
5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGC TCGAGCACTGCG-3’；
5)试纸条
所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸； NC膜上有T线(检测线)、C线(质控线)。试纸条上有三条检测线和一条质控线，从样品垫到吸水纸方向分别为EAD-T、RVA-T、内参-T和C线(如图1)。 EAD-T处包被EAD包被探针、RVA-T处包被RVA包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针。具体序列(5’-3’)为：
C线包被探针：GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA；
内参包被探针：CAGACACTATACAGATttttCAGACACTATACAGAT；
RVA包被探针：TATTCGGTGGCAAGTCGAGCttttTACACCAGCTATAGA TA；
EAD包被探针：ACATTCATTCCTACAGttttTACTCACAGATACATAG。
本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测轮状病毒和肠道腺病毒核酸的试剂盒检测轮状病毒和肠道腺毒核酸的方法，包括如下步骤：
(1)RNA恒温扩增
本发明检测指标有三个：轮状病毒、肠道腺病毒和人内参基因。针对每个指标设计一对(F/R引物)扩增引物，其中R引物5’端带有T7 RNA聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下，将待测RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RNaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；在F 引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有T7启动子的双链DNA；带有T7启动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成 RNA分子产物。转录的RNA分子产物可以进入循环扩增过程，首先F引物会结合转录的RNA分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的RNA转化为RNA:cDNA 杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；接着R引物会结合到单链cDNA上，在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有T7启动子的双链DNA分子，为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板，进而在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成大量的RNA 分子产物(如图2)。
本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。
(2)金探针层析
a，设计特异探针、金探针、C线显色探针和包被探针
特异探针：每个指标特异探针包括在两种：CES系列和LES系列，每种探针可以设计多条。其中CES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和包被在NC膜上的包被探针集合，起到固定扩增产物RNA的作用，这两个部分用4～5个T链接。每条LES探针也包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和金探针结合，起到链接金探针显色的作用，这两个部分用4～5个T链接。
金探针：金探针5’端被巯基化修饰，巯基基团可以和胶体金颗粒形成共价键，被标记到胶体金颗粒上。金探针可以和特异探针LES的一端结合。
包被探针：包被探针被固定在NC膜上，可以和特异探针CES的一端结合，起到固定的作用。每个包被探针包含两个拷贝，中间用4～5个T连接。
C线显色探针：包含两个部分，之间用4～5个T链接。该探针一端可以和金探针结合，另一端可以和包被在NC膜上的C线包被探针结合。在层析时，无论有无RNA扩增产物，C线显色探针都可以形成“C线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时可以被NC膜上的C线包被探针捕获拦截，形成肉眼可见的条带。该探针可以质控试纸条和检测液的质量，层析过程无误。
所述特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，CES系列同放大探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。
所述特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高固定的效率和结合更多的金探针，从而提高检测的灵敏度。
b，试纸条检测
所用试纸条有检测线和质控线，所述检测线包括在RVA-T、EAD-T、内参 -T，其中RVA-T处包被的RVA包被探针能够特异性结合轮状病毒CES系列探针的一端；EAD-T处包被的EAD包被探针能够特异性结合肠道腺病毒CES系列探针的一端；内参-T处包被的内参包被探针能够特异性结合内参CES系列探针的一端。所述质控线(C线)上包被C线包被探针能特异性结合C线显色探针。将特异探针CES、特异探针LES、金探针和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在试纸条上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效 (如图3)。
结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：
(1)核酸提取
采集疑似腹泻患者的粪便样本，使用核酸提取试剂提取样本病原体分子。
(2)RNA恒温扩增
向17μL的含有轮状病毒、肠道腺病毒和内参引物的扩增反应液中加入2μL 核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μL扩增酶，42℃恒温扩增1小时。待测样本中若有轮状病毒或肠道腺病毒核酸，扩增时会对指标核酸分子进行大量扩增富集。
(3)试纸条层析
a，预杂交
将RNA恒温扩增产物与检测液(包括特异探针、金探针以及C线显色探针) 混合，42℃预杂交10分钟。扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端同NC膜上的包被探针结合；LES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端可以与金探针互补配对结合，当有扩增产物时可以形成“CES 探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”。
b，层析检测
将预杂交产物滴在试纸条样品垫处，预杂交液会沿着NC膜向吸水纸方向层析，当有待测RNA扩增产物时，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就会形成，在层析时会被NC膜上包被的包被探针拦截，形成肉眼看见的条带，此为阳性(如图4阳性)。
若无待测RNA产物扩增，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就不会形成，胶体金颗粒就不能在T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性(如图4阴性)。
无论有无待测RNA产物扩增，C线显色探针都可以形成“C线显色探针--- 金探针”复合物，该复合物在层析时会沿着NC膜向前流动，当到达C线时，与 C线处包被的序列结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效(如图4)。
第二方面，提供上述基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测轮状病毒和肠道腺病毒核酸的试剂盒在制备轮状和/或肠道腺病毒检测试剂中的应用。
本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：
1、本发明通过RNA恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增轮状病毒、肠道腺病毒和内参基因三种指标，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。 RNA恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。
2、由于轮状病毒序列变异较大，本发明在设计引物时必须保证能够扩增出所有常见的亚型流行株核酸，所选基因区域较为保守。同时本发明在设计引物时同时经过多轮测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。
3、本发明在设计时引入的特异探针CES系列和特异探针LES系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将放大探针和RNA核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标RNA核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在NC膜上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表4 所列的10种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对RVA(ATCC VR-2018)的最低检测限为1.6TCID50/mL、ADV40(ATCC VR-931)的最低检测限为1.6TCID50/mL、ADV41 (ATCC VR-930)的最低检测限为2.8TCID50/mL。对于94份诊断结果均与感染性腹泻相关临床样本的轮状和/或肠道腺病毒检测灵敏度、特异性高于某商品化检测轮状和/或肠道腺病毒荧光定量PCR试剂盒。
4、本发明采用RNA恒温扩增技术和试纸条层析技术，即应用了RNA恒温扩增对仪器要求低的特点，又成功的融合了胶体金快速的特点。通过试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于流感病毒核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。
附图说明
图1试纸条示意图；
图2RNA恒温扩增原理图；
图3试纸条显色原理图；
图4检测阴阳性示意图；
a：RVA阳性、EAD阴性、内参阳性；
b：RVA阴性、EAD阳性、内参阳性；
c：RVA阳性、EAD阳性、内参阳性；
d：RVA阴性、EAD阴性、内参阳性；
e：RVA阴性、EAD阴性、内参阴性；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press,2005) 中所述的条件进行。
【实施例1】核酸检测试纸条的制备
在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：硝酸纤维素膜(NC膜)、样本垫、吸水纸、PVC底板等。
1、喷膜：
检测线EAD-T：能够捕获结合EAD特异探针CES序列，10μM EAD包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；
检测线RVA-T：能够捕获结合RVA特异探针CES序列，10μM RVA包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；
检测线内参-T：能够捕获结合内参特异探针CES序列，10μM内参包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；
质控线(C线)：能够捕获结合C线显色探针序列，10μM C线包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；
喷膜完毕后，在紫外交联仪中自动交联一次，放于37℃洁净恒温箱内干燥2 小时，存于干燥环境中备用。
2、试纸条组装
分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的NC膜、样品垫从上到下依次固定于 PVC底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图1。
【实施例2】灵敏度检测
将ATCC来源的RVA(ATCC编号VR-2018)、ADV40(ATCC编号VR-931)、ADV41(ATCC编号VR-930)的病毒原液进行梯度稀释液进行最低检测限确定，每个梯度的病毒稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～ 95％阳性检出率的病毒水平作为最低检测限，检出结果如下：
表1.1不同滴度RVA的检测实验数据
表1.2 RVA最低检测限实验数据
表2.1 不同滴度ADV40的检测实验数据
表2.2 ADV40最低检测限实验数据
表3.1 不同滴度ADV41的检测实验数据
表3.2 ADV41最低检测限实验数据
最终确定本发明试剂盒的检测灵敏度为：
【实施例3】特异性检测
将不同的病原体提取核酸后检测，验证试剂盒探针设计的特异性，验证结果如下：
表4 其他病原微生物的交叉反应验证结果
结论
从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他病原微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。
【实施例4】临床样本的验证
1，临床样本信息
在湖北省武汉市儿童医院共检测样本94份，其中男性标本和女性标本分别为50例和44例，分别占比为53.19％和46.81％。94例标本中，患者年龄最大为5岁，最小为3个月，平均年龄为3.53岁。入组患者的诊断结果均为感染性腹泻。
2，检测结果
(1)轮状病毒检测结果
检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测轮状病毒荧光PCR试剂盒对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：
对于不一致的10例样本采用“基因测序法”进行复测检测，结果有8例阳性，全部为本发明试剂盒检测阳性某商品化检测轮状病毒荧光PCR试剂盒检测阴性样本。通过结果比对，某商品化检测轮状病毒荧光PCR试剂盒检测轮状病毒存在漏检和假阳性的情况。显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本轮状病毒检测检测灵敏度更高，特异性更强。
(2)肠道腺病毒检测结果
检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测肠道腺病毒荧光PCR试剂盒对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：
对于不一致的5例样本采用“基因测序法”进行复测，结果有4例阳性，全部为本发明试剂盒检测阳性某商品化检测肠道腺病毒荧光PCR试剂盒检测阴性样本。通过结果比对，某商品化检测肠道腺病毒荧光PCR试剂盒检测肠道腺病毒存在漏检和假阳性的情况。显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本肠道腺病毒检测检测灵敏度更高，特异性更强。
序列表
<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司
<120> 一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactataggg agatcattct cattctcagt gcg 43
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgggtgcg atcaagtgga 20
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactataggg agagcgccga tgtagatgtt gca 43
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggaaccctc cagtttgtgg 20
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggg agagctctag aattaccaca gt 42
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggttgatc ctgccagta 19
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taaaggaatt aaagtgagtg tttttatcta tagctggtgt 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaacttaga ttcatctgta tttttatcta tagctggtgt 40
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcaatatcaa ctaatgtaaa ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggagaaa tccaagaacg ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
accatagaag taggaaacac ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acttcaaccc attctcgggc ttttctatgt atctgtgagt 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctcctggtc tttacccaga ttttctatgt atctgtgagt 40
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgacttcatc ccaaactacg ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgcggtgag cgaatctgtg ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gacggctacg actgaatccc ttttcgcagt gctcgagctc tgagc 45
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaggaaggca gcaggctttt atctgtatag tgtctg 36
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcgcaaatta cccacttttt atctgtatag tgtctg 36
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cccgacccgg ggaggttttt cgcagtgctc gagctctgag c 41
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agtgacgaaa aataactttt cgcagtgctc gagctctgag c 41
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatacaggac tctttctttt ccgcagtgct cgagctctga gc 42
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcagatcact atgtactttt cgcagtgctc gagctctgag c 41
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctactctgc agtgctccat cgtacgtctg tcatttttgc tcagagctcg agcactgcg 59
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtacatagtg atctgatttt gtacatagtg atctga 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagacactat acagattttt cagacactat acagat 36
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tattcggtgg caagtcgagc tttttacacc agctatagat a 41
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acattcattc ctacagtttt tactcacaga tacatag 37

Claims (3)

1.一种轮状病毒和肠道腺病毒核酸联合检测胶体金层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：
1)扩增反应液：含40mM pH 8.0的Tris-HCl，12mM MgCl2，70mM KCl，15％DMSO，5mM DTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；其中扩增引物包括三对：轮状病毒、肠道腺病毒和人内参基因，具体的：
(1)轮状病毒引物：
RVA-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATCATTCTC ATTCTCAGTGCG；
RVA-F引物(5’-3’)：5’-GTTGGGTGCGATCAAGTGGA-3’；
(2)肠道腺病毒引物：
EAD-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGCCGA TGTAGATGTTGCA；
EAD-F引物(5’-3’)：TGGAACCCTCCAGTTTGTGG；
(3)内参核酸引物：
内参-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTCTAGA ATTACCACAGT；
内参-F引物(5’-3’)：CTGGTTGATCCTGCCAGTA；
2)扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；
3)核酸提取试剂：细胞裂解液；
4)检测液：包含金探针，为胶体金颗粒标记的核酸探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：
(1)轮状病毒特异探针(5’-3’)
RVA-CES1：TAAAGGAATTAAAGTGAGTGttttTATCTATAGCTGGTGT；
RVA-CES2：CAAACTTAGATTCATCTGTAttttTATCTATAGCTGGTGT；
RVA-LES1：TCAATATCAACTAATGTAAAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTG AGC；
RVA-LES2：GAAGGAGAAATCCAAGAACGttttCGCAGTGCTCGAGCTCT GAGC；
RVA-LES3：ACCATAGAAGTAGGAAACACttttCGCAGTGCTCGAGCTCT GAGC；
(2)肠道腺病毒特异探针(5’-3’)
EAD-CES1：ACTTCAACCCATTCTCGGGCttttCTATGTATCTGTGAGT；
EAD-CES2：GCTCCTGGTCTTTACCCAGAttttCTATGTATCTGTGAGT；
EAD-LES1：CGACTTCATCCCAAACTACGttttCGCAGTGCTCGAGCTCTG AGC；
EAD-LES2：ACGCGGTGAGCGAATCTGTGttttCGCAGTGCTCGAGCTCTG AGC；
EAD-LES3：GACGGCTACGACTGAATCCCttttCGCAGTGCTCGAGCTCTG AGC；
(3)内参特异探针(5’-3’)
内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttATCTGTATAGTGTCTG；
内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttATCTGTATAGTGTCTG；
内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；
内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；
内参LES3：AATACAGGACTCTTTCttttCCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；(4)C线显色探针
5’-TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC-3’；
(5)金探针
金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：
5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGC TCGAGCACTGCG-3’；
5)试纸条
所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有检测线T线、质控线C线，试纸条上有三条检测线和一条质控线，从样品垫到吸水纸方向分别为EAD-T、RVA-T、内参-T和C线，EAD-T处包被EAD包被探针、RVA-T处包被RVA包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列(5’-3’)为：
C线包被探针：GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA；
内参包被探针：CAGACACTATACAGATttttCAGACACTATACAGAT；
RVA包被探针：TATTCGGTGGCAAGTCGAGCttttTACACCAGCTATAGA TA；
EAD包被探针：ACATTCATTCCTACAGttttTACTCACAGATACATAG。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为AMV或M-MLV。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒在制备轮状病毒和/或肠道腺病毒检测试剂中的应用。
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