CN112342315A - 一种新冠病毒、甲乙流感及呼吸道合胞病毒检测试剂盒 - Google Patents

一种新冠病毒、甲乙流感及呼吸道合胞病毒检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新冠病毒、甲乙流感及呼吸道合胞病毒检测试剂盒。本发明结合引物探针设计以及相适应检测体系的优化探究，开发了一组新型冠状病毒(2019‑nCoV/SARS‑CoV‑2)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)及呼吸道合胞病毒(RSV)核酸联合检测引物与探针组合及联合核酸检测试剂盒，引物与探针序列如SEQ ID NO：1‑18所示。该试剂盒具有检测灵敏度高、重复性好、假阴性及假阳性低的优势，能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒与呼吸道合胞病毒引起的呼吸道感染，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗。

Description

一种新冠病毒、甲乙流感及呼吸道合胞病毒检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学及临床诊断技术领域。更具体地，涉及一种新型冠状病毒(2019-nCoV/SARS-CoV-2)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)及呼吸道合胞病毒(RSV)核酸联合检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒2019-nCoV/SARS-CoV-2正处于在世界蔓延的势头，人类却缺乏有效的抗病毒疫苗和特效药物，当前对感染者或携带者准确检测诊断对于疫情控制具有至关重要的作用及意义。另外，当下正是各种甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒等相关病毒感染致病高发期，其临床表现与新型冠状病毒肺炎相似，难以通过临床表现、胸部影像学鉴别。而且日前研究显示，新冠病毒感染者和非感染者，均有合并感染的现象。如果发热病例不能得到及时的快速精准诊断，流感病例很有可能被视同新型冠状病毒感染对待、患者合并感染多、交叉感染隐患大、给新型冠状病毒的防控带来极为不利影响。
因此，临床诊断手段需要改进，应高度重视除新冠病毒外的其他呼吸道常见病原体筛查。在收诊新冠肺炎患者或疑似患者过程中，需要评估其他感染的可能性，以便及时进行临床分类、隔离和治疗。
目前临床一线急需快速鉴别新冠病毒和流感病毒等其他呼吸道病毒的相关产品，为临床提供精准检测，利于选择合理的治疗方案，也大大减轻医院负担，使宝贵的救治资源集中用于新型冠状病毒患者的救治中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有关于新冠病毒和流感病毒等其他呼吸道病毒区别检测诊断技术的不足，提供一种新型冠状病毒(2019-nCoV)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)及呼吸道合胞病毒(RSV)核酸联合检测试剂盒。该试剂盒检测灵敏度高、重复性好、假阴性及假阳性低，能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒与呼吸道合胞病毒引起的呼吸道感染，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗。
本发明的目的是提供一组新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测引物与探针组合。
本发明另一目的是提供一种新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一组新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测引物与探针组合，包括如下组分：
(1)用于检测2019-nCoV ORF1ab(open reading frame,ORF1ab)靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-3所示；
(2)用于检测2019-nCoV核壳蛋白N(nucleoprotein，N)靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：4-6所示；
(3)用于检测甲型流感病毒靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如 SEQ IDNO：7-9所示；
(4)用于检测乙型流感病毒靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如 SEQ IDNO：10～11的引物和SEQ ID NO：12所示；
(5)用于检测呼吸道合胞病毒靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQID NO：13-15所示；
(6)用于检测内标B2M的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO： 16-18所示。
具体地，引物与探针序列如表1所示。
优选地，所述探针的两端均分别标记最大发射波长518nm、538nm～553nm、 574nm～575nm、607nm～615nm、640nm、666nm～667nm、690nm染料的其中一种并且不同。
更优选地，所述探针的5’端标记ROX、FAM、HEX或CY5荧光发生基团， 3’端标记MGB。
最优选地，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示探针的5’端标记ROX荧光发生基团，3’端标记MGB；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所示探针的5’端标记FAM荧光发生基团， 3’端标记MGB
SEQ ID NO：15所示探针的5’端标记HEX荧光发生基团，3’端标记MGB；
SEQ ID NO：18所示探针的5’端标记CY5荧光发生基团，3’端标记MGB。
本发明开发的上述引物及探针组合，能够在同一管反应中有效鉴别新冠病毒、普通甲型流感及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，检测灵敏度高、重复性好、假阴性低、假阳性低。
本发明基于此构建了一种新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，含有上述引物与探针组合。
优选地，用于检测靶基因的探针使用浓度为180-220nM，用于检测内标的探针使用浓度为80-120nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为180-220nM，用于检测内标的引物使用浓度为80-120nM。
更优选地，用于检测靶基因的探针使用浓度为200nM，用于检测内标的探针使用浓度为100nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为200nM，用于检测内标的引物使用浓度为100nM。
作为一种可选择的优选方案，所述联合检测试剂盒还包括PCR缓冲液、酶混合液、空白对照和阳性对照。
优选地，所述PCR缓冲液的组成为：26-30mol/L pH8-8.5Tris-HCl， 15-25mmol/L(NH4)2SO4，28-32mmol/L KC1，3.5-4.5mmol/L MgCl2，0.15-0.25mol/ L dNTPs。
更优选地，所述PCR缓冲液组成为：28mol/L pH8.0 Tris-HCl，20mmol/L (NH4)2SO4，30mmol/L KC1，4.0mmol/L MgCl2,0.2mol/L dNTPs。
优选地，所述酶混合液包括热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶 (UNG)；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，逆转录酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份。
优选地，所述空白对照为无RNA酶的水；
优选地，所述阳性对照：2019-nCoV ORF1ab基因质粒，浓度为1.0×105 copies/ml；2019-nCoV N基因质粒，浓度为1.0×105copies/ml；甲型流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；乙型流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；呼吸道合胞病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；内标质粒，浓度为1.0×104copies/ml。
本发明开发的试剂盒，内标选用的是人B2M蛋白基因作为内源性内标，监控样本采集、提取及检测整个实验流程，避免假阴性出现。同时设置UNG酶 +dUTP防污染措施，避免PCR产物污染带来的假阳性结果。
本发明是基于多重荧光PCR技术，通过实时荧光PCR仪，进行同步核酸扩增与检测，而提供一种可以在同一反应管中检测第一组甲型流感(FluA)病毒、第二组乙型流感(FluB)病毒、第三组新冠病毒2019-nCoV ORF 1ab基因及N 基因、第四组呼吸道合胞病毒、第五组细胞内标的B2M基因的试剂盒。第五组同步检测细胞内保守基因B2M，用于评估采集样本质量及PCR抑制因素，对检测过程进行质量控制。本发明所有的探针Tm接近相同且高于引物的Tm大约 8-10℃，所有引物的Tm接近相同58～60℃，确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。
本发明的试剂盒既可以将新冠病毒2019-nCoV、甲型流感(FluA)、乙型流感(FluB)病毒、呼吸道合胞病毒四种类型的病毒进行分类，同时还可通过内标对检测过程进行质量控制，并设置UNG酶+dUTP防污染措施，避免PCR产物污染带来的假阳性结果。
本发明具有以下有益效果：
本发明开发了一组新型冠状病毒(2019-nCoV)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)及呼吸道合胞病毒(RSV)核酸联合检测引物及探针组合，能够在同一管反应中有效鉴别新冠病毒、普通甲型流感及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，检测灵敏度高、重复性好、假阴性低、假阳性低。
同时还构建了新型冠状病毒(2019-nCoV)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)及呼吸道合胞病毒(RSV)核酸联合检测试剂盒，引物探针组合以及相适应检测体系经过优化探究得到，试剂盒检测包括新型冠状病毒2019-nCoV(ROX 通道)、甲型流感/乙型流感(FAM通道)、呼吸道合胞病毒(HEX通道)、内源性内标(CY5通道)，以人RNA内参B2M作为内参，用于监控样本采集、提取、扩增即整个检测流程，避免假阴性结果；设置UNG酶+dUTP防污染措施，避免PCR产物污染带来的假阳性结果；并搭配全自动核酸提取平台，整个检测过程可在2小时内完成。
试剂盒检测灵敏度高、重复性好、假阴性及假阳性低，能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒与呼吸道合胞病毒引起的呼吸道感染，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗，为临床一线快速鉴别新冠病毒和流感病毒等其他呼吸道病毒提供精准检测，利于选择合理的治疗方案，可大大减轻医院负担，使宝贵的救治资源集中用于新型冠状病毒患者的救治中，对于疫情的控制具有很重要的应用价值。
附图说明
图1是本发明检测甲流质控品不同浓度(1×101copies/ml、1×102copies/ml、 1×103copies/ml、1×104copies/ml、1×105copies/ml、1×106copies/ml)的扩增曲线图。
图2是本发明检测乙流质控品不同浓度(1×101copies/ml、1×102copies/ml、 1×103copies/ml、1×104copies/ml、1×105copies/ml、1×106copies/ml)的扩增曲线图。
图3是本发明检测呼吸道合胞病毒质控品不同浓度(1×101copies/ml、 1×102copies/ml、1×103copies/ml、1×104copies/ml、1×105copies/ml、1×106copies/ml)的扩增曲线图。
图4是本发明检测新冠质控品不同浓度(1×101copies/ml、1×102copies/ml、 1×103copies/ml、1×104copies/ml、1×105copies/ml、1×106copies/ml)的扩增曲线图。
图5是本发明检测内标质控品不同浓度(1×101copies/ml、1×102copies/ml、 1×103copies/ml、1×104copies/ml、1×105copies/ml、1×106copies/ml)的扩增曲线图。
图6是本发明检测广东CDC新冠室间质评质控品5330不同浓度稀释 (1×101copies/ml、1×103copies/ml、1×104copies/ml、1×105copies/ml)的扩增曲线图。
图7-24是本发明检测第三方邦德胜公司18例质控品的扩增曲线图。
图25是本发明检测试剂盒中阳性对照及空白对照的扩增结果。
图26是本发明检测上海临床检测中心室间质控品的扩增曲线图。
图27是阳性样本30例RNA内参(ABI 7500PCR仪)。
图28是阳性样本30例2019-nCoV通道图(ABI 7500PCR仪)。
图29是阴性样本20例RNA内参图，有3个样本RNA内参Ct无起跳，可提示为采样无效样本(ABI 7500PCR仪)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1引物与探针设计及筛选
1、本发明对几种病毒序列进行分析并经大量研究探索，设计了表1-4所示引物与探针组：
表1 本发明引物与探针组合
Figure RE-GDA0002881640700000061
表2 对照组1
Figure RE-GDA0002881640700000062
Figure RE-GDA0002881640700000071
Figure RE-GDA0002881640700000081
表3 对照组2
Figure RE-GDA0002881640700000082
Figure RE-GDA0002881640700000091
表4 对照组3
Figure RE-GDA0002881640700000092
Figure RE-GDA0002881640700000101
Figure RE-GDA0002881640700000111
2、同时，经过相适应的检测体系优化探索，建立了如下检测体系：每管PCR 加入23.5μl RT-PCR扩增液及1.5μl的酶混合液。并加入5μl模板RNA量。
即RT-PCR检测体系(总体积30μl)包括：
(1)23.5μl RT-PCR扩增液，扩增液包括引物、探针和PCR缓冲液；
用于检测靶基因的探针使用浓度为200nM，用于检测内标的探针使用浓度为100nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为200nM，用于检测内标的引物使用浓度为100nM；
PCR缓冲液的组成为：28mol/L pH8.0 Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2SO4， 30mmol/LKC1，4.0mmol/L MgCl2,0.2mol/L dNTPs；
(2)1.5μl的酶混合液(包括热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶 (UNG))；
(3)5μl模板核酸。
3、利用上述表1-4所示各组引物与探针进行检测，使用新冠2019-nCoV质控品、甲型流感(Flu A)质控品、乙型流感(Flu A)质控品、呼吸道合胞病毒A 及内标质控品进行4组引物探针组合进行测试。
荧光检测通道的设定如表5所示
表5
Detector Name Target Reporter Dye Quencher
FAM 甲型流感病毒/乙型流感病毒 FAM none
HEX 呼吸道合胞病毒 HEX/JOE none
ROX 2019-nCoV ROX none
CY5 内参B2M CY5 none
RT-PCR扩增程序的设定如表6所示：
表6
Figure RE-GDA0002881640700000112
Figure RE-GDA0002881640700000121
4、结果见下表7所示。
表7 各组MIX检测结果Ct值
Figure RE-GDA0002881640700000122
结果显示，相比对照组1-3，本发明的引物探针组合，针对每个病原体的检出敏感性及特异性最优。本发明的引物探针组合最大优势之一是针对在同一管 PCR反应体系中共有6对引物和6条探针，即实现多对引物及探针针对不同病原体进行同步检测，并保证针对每种病原体检测的敏感性及特异性均能满足临床检测要求，引物探针设计是至关重要的。
实施例2试剂盒
1、新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，包括如下组分：
(1)引物与探针组合
本发明人通过分析临床样本的DNA，经过大量的探索优化，得到了如表1 所示具有仅与新冠病毒2019-nCoV ORF1ab的互补的核甘酸序列的SEQ ID NO： 1～2的引物和SEQ IDNO：3的探针；仅与2019-nCoV N靶基因的互补的核苷酸序列的SEQ ID NO：4～5的引物和SEQID NO：6的探针；仅与甲型流感病毒的互补的核苷酸序列的SEQ ID NO：7～8的引物和SEQID NO：9的探针；仅与乙型流感病毒的互补的核苷酸序列的SEQ ID NO：10～11的引物和SEQID NO：12 的探针；仅与呼吸道合胞病毒的互补的核苷酸序列的SEQ ID NO：13～14的引物和SEQ ID NO：15的探针；内标的核苷酸序列的SEQ ID NO：16～17的引物和 SEQ ID NO：18的探针。第一组探针标记最大发射波长518nm染料、第二组探针标记最大发射波长553nm染料、第三组探针标记最大发射波长607nm染料、第四组探针标记最大发射波长667nm染料。以此来检测新冠病毒2019-nCoV、甲型流感(FluA)、乙型流感(FluB)及呼吸道合胞病毒并且同时检测细胞内B2M 基因用于评估样本质量及PCR抑制因素。
优选地，用于检测靶基因的探针使用浓度为180-220nM，用于检测内标的探针使用浓度为80-120nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为180-220nM，用于检测内标的引物使用浓度为80-120nM。
更优选地，用于检测靶基因的探针使用浓度为200nM，用于检测内标的探针使用浓度为100nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为200nM，用于检测内标的引物使用浓度为100nM。
(2)PCR缓冲液：
所述PCR缓冲液的组成为：26-30mol/L pH8-8.5Tris-HCl，15-25mmol/L (NH4)2SO4，28-32mmol/L KC1，3.5-4.5mmol/L MgCl2，0.15-0.25mol/L dNTPs。
优选地，所述PCR缓冲液的组成为：28mol/L pH8.0 Tris-HCl，20mmol/L (NH4)2SO4，30mmol/L KC1，4.0mmol/L MgCl2,0.2mol/L dNTPs。
(3)酶混合液：
所述酶混合液包括热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，逆转录酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份。
(4)空白对照
所述空白对照为无RNA酶的水；
(5)阳性对照：
所述阳性对照：2019-nCoV ORF1ab基因质粒，浓度为1.0×105copies/ml； 2019-nCoV N基因质粒，浓度为1.0×105copies/ml；甲型流感病毒质粒，浓度为 1.0×105copies/ml；乙型流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；呼吸道合胞病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；内标质粒，浓度为1.0×104copies/ml。
2、上述试剂盒的使用方法：
(1)样本采集及处理：
1)鼻咽拭子：用无菌拭子拭取鼻腔、咽部分泌物，将其置于无菌试管 (400-500μL生理盐水或PBS)，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。
2)痰液：留取前清水漱口3次，用力咳出呼吸道深部的痰液吐至无菌痰液收集器中。患者痰液较深不易咳出时，可在咳痰前捶背、协助排痰。采集痰量不能少于1mL。液化方法：痰液样本中加入等体积的乙酰半胱氨酸(10g/L)，室温振荡30分钟，待充分液化后才可进行后续核酸提取。
3)肺泡灌洗液：收集支气管肺泡灌洗液密闭送检。
样本采用MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒II，配套博日的自动提取仪。
(2)样本检测：
将样品提取的DNA 5μl加入PCR反应液并混匀后，再放置于荧光定量PCR 仪中反应，扩增程序：55℃15分钟，热启动95℃30秒，热循环95℃10秒， 60℃35秒，共45循环。
(3)扩增后曲线分析：
1)样本在FAM、HEX/JOE和ROX荧光检测通道Ct值显示为Undet，其 RNA内参B2M在CY5荧光检测通道Ct值≤40，判断为阴性。
2)样本在FAM荧光检测通道Ct值≤40，HEX/JOE和ROX荧光检测通道 Ct值显示为Undet，其RNA内参B2M在CY5荧光检测通道Ct值≤40或Undet，判断为甲型流感病毒/乙型流感病毒阳性。
3)样本在HEX/JOE荧光检测通道Ct值≤40，FAM和ROX荧光检测通道 Ct值显示为Undet，其RNA内参B2M在CY5荧光检测通道Ct值≤40或Undet，判断为呼吸道合胞病毒阳性。
4)样本在ROX荧光检测通道Ct值≤40，FAM和HEX/JOE荧光检测通道 Ct值显示为Undet，其RNA内参B2M在CY5荧光检测通道Ct值≤40或Undet，判断为2019-nCoV阳性。
5)样本在各荧光通道Ct值显示为Undet，判断为无效，需重新采样。
实施例3检测实例
1、实验
为检测本发明试剂盒针对新冠病毒2019-nCoV、甲型流感、乙型流感及呼吸合胞病毒的检测的准确性和有效性，我们对甲流质粒质控品、乙流质粒质控品、呼吸道合胞病毒质粒质控品、新冠质粒质控品、内标质粒质控品(不同浓度： 1×106copies/ml、1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml、 1×101copies/ml)进行测试，以及广东CDC新冠室间质评质控品5330(稀释不同浓度：1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×101copies/ml)、邦德胜公司18例质控品的进行检测。
2、结果
结果如图1-6分别是不同浓度的甲流质控品、乙流质控品、呼吸道合胞病毒质控品、新冠质控品、内标质控品、新冠室间质评质控品5330的扩增结果曲线图，扩增结果CT值结果如表8所示。结果显示本发明试剂盒针对新冠病毒 2019-nCoV、甲型流感、乙型流感及呼吸合胞病毒最低检出限为1×103copies/ml。
表8
Figure RE-GDA0002881640700000151
Figure RE-GDA0002881640700000161
同时，对邦德胜公司18例质控品的检测结果，包括人冠状病毒(HCoV-OC43、 HCoV-229E、HCoV--HKU1、HCoV--NL63)、甲型流感(H1N1、H5N1、H7N9、 H9N2、INFA、)、呼吸道合胞病毒A型、乙型流感病毒、登革热病毒I型、人副流感2型(PIV2 RNA)、人副流感3型(PIV3 RNA)、肺炎支原体、腺病毒、乙型肝炎，扩增曲线分别见图7-24，结果显示病毒检测无交叉，新冠病毒、甲型流感、乙型流感、呼吸道合胞病毒检测结果符合预期。
另外，本试剂盒阳性对照及空白对照的扩增结果如图25。
实施例4检测实例
为检测本发明试剂盒针对新冠病毒2019-nCoV、甲型流感、乙型流感及呼吸合胞病毒的检测的准确性和有效性，我们对上海临床检测中心发放的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测能力验证室间质控品进行验证，结果100％符合，扩增曲线图见图26，具体见下表9：
表9：上海临床检测中心新冠2019-nCoV核酸室间质评检测结果
Figure RE-GDA0002881640700000171
实施例5检测实例
广东省疾病预防控制中心的检测验证结果
样本类型：核酸提取物
样本数量：50例，30例阳性，20例阴性。阳性样本采用英潍捷基公司purelinkViral RNA/DNA Mini试剂盒提取。阴性样本采用Thermoscientific公司自动提取仪，Prefilled Viral Total NA试剂盒提取。
荧光PCR仪：ABI7500荧光PCR仪。
临床样本检测结果如表10和表11所示。荧光PCR扩增曲线如图27-29所示。
30例阳性样本经测序确认后，检测结果与测序一致。
结论：30例阳性样本符合率为100％，20例阴性样本中有3例样本原实验室检测结果为阴性，本发明试剂盒检测结果监控内参无起跳，判断为无效样本，其余样本检测结果相符合。
经试验证明本发明检测试剂盒的针对新冠检测与广东省CDC提供的结果具有较高的一致性。
表10 30例临床阳性样本的检测结果
Figure RE-GDA0002881640700000181
表11 20例阴性样本及对照品的检测结果
Figure RE-GDA0002881640700000191
结合上述实验结果，本发明试剂盒与实际临床检测结果具有很高的一致性，对疾病的诊断起到了快速、准确的效果，完全满足临床应用的要求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州凯普医药科技有限公司、广东凯普生物科技股份有限公司、广州凯普医学检验所有限公司
<120> 一种新冠病毒、甲乙流感及呼吸道合胞病毒检测试剂盒
<150> 202010202863.2
<151> 2020-03-20
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgttcatcaa acgttcggat 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agttctgcta ccagctcaa 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgaactgc acctcatggt c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcagcgttct tcggaatgtc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaatttgat ggcacctgtg tag 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catggaagtc acaccttcgg gaa 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggctatatg aagcaattga gg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggaaggagt tgaaccaaga 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctgattaay gatccctgg 19
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttccagacta caataataca aaagg 25
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctggttgta attcaggatc ttcacta 27
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccaaaaacac aatggcagaa 20
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cattgctgga cattaacttt ttctga 26
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagagaattt agtgttaatg caggtgta 28
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caatgatatg cctataacaa atga 24
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccactgaaaa agatgagtat gcc 23
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccacttaact atcttgggct gt 22
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgtgtgaacc atgtgactt 19
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cggtatgtgg aaaggttatg g 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttygatctyg grgggytata 20
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aggaaggagt tgaaccaaga hgc 23
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctgattaayg atccctgg 18
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttattacaar raayttccag actacaa 27
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctggytgyaa ttcaggrtct tcactaa 27
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caaaaacaca atggcag 17
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctaactgata gttatttaaa aggtgt 26
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gactgtgtta tatttagttt ctttagat 28
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgattatacc aacttaatta gtagac 26
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tgccgtgtga accatgtgac ttt 23
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cctccatgat gctgcttaca tg 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cacagcccaa gatagttaag tg 22
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tttggtggtg catcgtgttg tctgta 26
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
agtcacaaaa tcctttagga ttt 23
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gccgttgcca catagatc 18
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggtactggtc aggcaataac agttac 26
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cagacaacac gatgcaccac caaagg 26
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggaagccaat atggatcaag 20
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttgctgggaa aaacacagat cttga 25
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tccccttagt cagaggtgac aggattgg 28
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tcatggaatg gctaaagaca ag 22
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ctttgttaat gaaatcaact actgt 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cattcaacaa tgaagtgtga aaaag 25
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cctctacagt tatgatgaag tat 23
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
taaatcttaa atctatagca caaa 24
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tgaatatgat ggctgcaatt ataag 25
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tggcaatgat aatctcaacc t 21
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttactcacgt catccagcag ag 22
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tgtcggatgg atgaaaccca gaca 24
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tggaaagtca aatttcctga att 23
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gcggtgtaag tgcagcccgt ctta 24
<210> 56
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cgtgcggcac aggcact 17
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
aaagccctgt atacgacatc 20
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gacatctaca atgataaagt agctgg 26
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
catcttcgtc cttttcttgg aagc 24
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gctaaattcc taaaaactaa ttg 23
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gggtttgtgt tcacgctcac cgtg 24
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ggcattttgg acaaagcgtc tacg 24
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cagtgagcga ggactgcagc g 21
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
caatagggcc tcacatttac aacc 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tggccagccc cagttcatca gacat 25
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gagctaccag aagttccata t 21
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gttggtttaa gagaagaaat gatag 25
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ttcttcattc ctgagtcttg ccatag 26
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gaagcattaa tgaccaatg 19
<210> 70
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ctgctgaaag ttgtgtatga gtagtc 26
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
attcagggta gtatggccat agacc 25
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tcataaagct gctttgatat 20

Claims (10)

1.一组新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测引物与探针组合，其特征在于，包括如下组分：
(1)用于检测2019-nCoV ORF1ab靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：1-3所示；
(2)用于检测2019-nCoV核壳蛋白N靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQID NO：4-6所示；
(3)用于检测甲型流感病毒靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：7-9所示；
(4)用于检测乙型流感病毒靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：10～11的引物和SEQ ID NO：12所示；
(5)用于检测呼吸道合胞病毒靶基因的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：13-15所示；
(6)用于检测内标B2M的引物对和探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：16-18所示。
2.根据权利要求1所述引物与探针组合，其特征在于，所述探针的两端均分别标记最大发射波长518nm、538nm～553nm、574nm～575nm、607nm～615nm、640nm、666nm～667nm、690nm染料的其中一种并且不同。
3.根据权利要求1所述引物与探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记ROX、FAM、HEX或CY5荧光发生基团，3’端标记MGB。
4.根据权利要求1所述引物与探针组合，其特征在于，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示探针的5’端标记ROX荧光发生基团，3’端标记MGB；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所示探针的5’端标记FAM荧光发生基团，3’端标记MGB
SEQ ID NO：15所示探针的5’端标记HEX荧光发生基团，3’端标记MGB；
SEQ ID NO：18所示探针的5’端标记CY5荧光发生基团，3’端标记MGB。
5.权利要求1-4任一项所述引物与探针组合在制备新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒中的应用。
6.一种新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述引物与探针组合。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，用于检测靶基因的探针使用浓度为180-220nM，用于检测内标的探针使用浓度为80-120nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为180-220nM，用于检测内标的引物使用浓度为80-120nM。
8.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液，其组成为：26-30mol/LpH8-8.5Tris-HCl，15-25mmol/L(NH4)2SO4，28-32mmol/L KC1，3.5-4.5mmol/L MgCl2，0.15-0.25mol/L dNTPs。
9.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括酶混合液，包括热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，逆转录酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份。
10.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括空白对照和阳性对照；
所述空白对照为无RNA酶的水；
所述阳性对照：2019-nCoV ORF1ab基因质粒，浓度为1.0×105copies/ml；2019-nCoV N基因质粒，浓度为1.0×105copies/ml；甲型流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；乙型流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；呼吸道合胞病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；内标质粒，浓度为1.0×104copies/ml。
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