CN113025585A

CN113025585A - 一种假病毒的纯化试剂及纯化方法

Info

Publication number: CN113025585A
Application number: CN202110265212.2A
Authority: CN
Inventors: 张瑜; 蔡亦梅; 李亚楠; 张泽云; 高静; 金鑫浩; 贾欣月; 任鲁风
Original assignee: Beijing Integrated Biosystems Co ltd
Current assignee: Beijing Integrated Biosystems Co ltd
Priority date: 2021-03-11
Filing date: 2021-03-11
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2041-03-11
Also published as: CN113025585B

Abstract

本发明属于假病毒纯化技术领域，具体涉及一种假病毒的纯化试剂及纯化方法。所述假病毒的纯化试剂，包括以下组分：裂解液、醇洗液、脱盐液、洗脱液；其中，所述醇洗液的组分为：乙醇、醋酸钠、枸橼酸三钠、柠檬酸二钠、三羟戊二酸钠；所述脱盐液的组分为：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)、2‑环己胺基乙磺酸、盐酸赖氨酸。本发明提供的一种假病毒的纯化试剂及纯化方法，能够快速完成假病毒的纯化，纯化方法操作简单、成本低、纯化效率高，扩增的荧光曲线良好。

Description

一种假病毒的纯化试剂及纯化方法

技术领域

本发明属于假病毒纯化技术领域，具体涉及一种假病毒的纯化试剂及纯化方法。

背景技术

假病毒是指一种反转录病毒能够整合另外一种不同种类病毒的囊膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒的囊膜，而基因组保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒假病毒科(Pseudoviridae)，又译作伪病毒科，是一种逆转录病毒，形态为单链RNA，该类病毒主要感染真菌和无脊椎动物。

假病毒(pseudovirus)又称“伪病毒”，是一类嵌合型病毒颗粒，是在一种复制缺陷型病毒(病毒载体)的表面上表达另一种病毒的重组糖蛋白的嵌合病毒颗粒。

因为真病毒对实验室环境要求高且获取难度高，对实验操作人员也有着极高要求，因此在病毒研究过程，假病毒就十分重要，因安全性、易检测性、靶标明确性、易引入突变等特点，假病毒作为基础研究样本，能够极大地缩短实验周期，并降低实验难度。

在假病毒颗粒制备技术中，目前存在的最大问题是纯化问题以及含有假病毒颗粒溶液的纯度问题。在假病毒的使用过程，假病毒作为模拟样本，同样需要经过纯化验证，但是常规的病毒提取试剂盒实验周期较长且需要高速离心，难以满足实验的快速简便。

传统方法一般是将含有外源基因的重组体成功构建后进行诱导表达，然后破碎细胞，双酶(DNaseI和RNase A)消化，再按照噬菌体纯化方法进行纯化，盐沉淀，梯度离心回收假病毒颗粒。这种方法操作繁琐，对设备要求高，多数需要高速离心，更关键的是梯度离心回收的含有假病毒颗粒的溶液中仍然存在一定量的核酸，并且残余核酸在PCR鉴定含有假病毒颗粒溶液的纯度过程中很容易使PCR产生假阳性，更进一步影响到假病毒颗粒定量的研究。虽然有些研究人员在纯化的含有假病毒颗粒溶液提取RNA后，再进行DNase I酶消化，以去除残存核酸干扰，但这样会造成制备的RNA损失很大，同样造成下一步定量不精确。

因此，有必要研究一种假病毒的纯化方法，以满足假病毒的快速纯化的要求。

发明内容

为克服以上技术问题，本发明提供了一种假病毒的纯化试剂及纯化方法，能够快速完成假病毒的纯化，纯化方法操作简单、成本低、纯化效率高，扩增的荧光曲线良好。

为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：

一种假病毒的纯化试剂，包括以下组分：裂解液、醇洗液、脱盐液、洗脱液；

其中，所述醇洗液的组分为：乙醇、醋酸钠、枸橼酸三钠、柠檬酸二钠、三羟戊二酸钠；

所述脱盐液的组分为：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、2-环己胺基乙磺酸、盐酸赖氨酸。

优选地，所述裂解液的组分为：盐酸胍(GuHCl)、醋酸钠(NaAc)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。

优选地，所述洗脱液的组分为：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、EDTA·2Na。

优选地，所述裂解液中各组分浓度为：3-6M GuHCl、0.1-0.5M NaAc、1-2％(质量浓度)Triton X-100。

优选地，所述醇洗液中，乙醇的体积分数为50-70％；醋酸钠的浓度为0.1-0.2M；枸橼酸三钠的浓度为5-15mM、柠檬酸二钠的浓度为5-10mM、三羟戊二酸钠的浓度为1-5mM；

优选地，所述枸橼酸、柠檬酸二钠和羟戊二酸钠的浓度比为1-3:1-2:1；优选为3:2:1。

优选地，所述枸橼酸、柠檬酸二钠和羟戊二酸钠的总浓度为15-26mM。

优选地，所述脱盐液中各组分的浓度为：5-10mM Tris-HCl、5-10mM 2-环己胺基乙磺酸、1-5mM盐酸赖氨酸。

优选地，所述洗脱液中各组分的浓度为：5-10mM Tris-HCl、1-3mM EDTA·2Na。

优选地，所述裂解液、醇洗液、脱盐液和洗脱液的溶剂均为去离子水。

本发明的另一目的在于提供一种使用所述假病毒纯化试剂对假病毒进行纯化的方法，包括以下步骤：

(1)取磁珠振荡混匀后，放入EP管中；

(2)加入裂解液和假病毒，涡旋震荡混匀，静置；

(3)使用磁力架吸附溶液澄清，吸出废液弃掉；

(4)向EP管中加入醇洗液，震荡混匀，使用磁铁吸附磁珠，弃掉上清液；

(5)保持磁铁吸附，沿管内侧壁转圈加入脱盐液，静置，弃掉上清液；

(6)加入洗脱液，水浴，再次震荡混匀；

(7)用磁铁吸附住磁珠，将产物冰浴或4℃保存或进行后续PCR验证。

优选地，步骤(2)中，所述静置的时间为30-60s；

优选地，步骤(5)中，所述静置的时间为2-10s；

优选地，步骤(6)中，所述水浴的温度为50-70℃；

优选地，步骤(6)中，所述水浴的时间为1-5min。

本发明的另一目的在于提供所述假病毒的纯化试剂在制备微流控芯片中的应用。

以上技术方案中各试剂和磁珠可以根据需要和产品性能选用进口或国产的各种型号。

与现有技术比，本发明的技术优势在于：

(1)本发明提供的假病毒的纯化方法具有较好的纯化效果，能够快速完成纯化，操作方法简单易行。

(2)本发明提供的假病毒的纯化方法整个过程不需要高速离心，降低了纯化设备要求。

(3)本发明提供的假病毒纯化方法成本低，纯化得率高，扩增的荧光曲线良好。

附图说明

图1：实施例1中假病毒纯化产物的荧光曲线；

图2：实施例2中假病毒纯化产物的荧光曲线；

图3：实施例3中假病毒纯化产物的荧光曲线；

图4：实施例1与对比例1的纯化产物荧光曲线对比图；

图5：实施例1与对比例2的纯化产物荧光曲线对比图；

图6：实施例1与对比例3的纯化产物荧光曲线对比图；

图7：实施例1与对比例4的纯化产物荧光曲线对比图；

图8：实施例1与对比例5的纯化产物荧光曲线对比图；

图9：实施例1与对比例6的纯化产物荧光曲线对比图；

附图中标记的具体含义如下：A：5×10²拷贝数时的荧光曲线；B：5×10³拷贝数时的荧光曲线；C：5×10⁴拷贝数时的荧光曲线；D：5×10⁵拷贝数时的荧光曲线；

现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明具体实施方式中的硅羟基磁珠来源为上海阿拉丁生化科技股份有限公司(型号：S8036-300nm-1-EA)。

实施例1

所述裂解液组成及各组分浓度为：4M GuHCl、0.3M NaAc、1.5％(质量浓度)TritonX-100；溶剂为去离子水。

所述醇洗液组成及各组分浓度为：乙醇的体积分数为70％；醋酸钠的浓度为0.15M；枸橼酸三钠的浓度为9mM、柠檬酸二钠的浓度为6mM、三羟戊二酸钠的浓度为3mM；溶剂为去离子水。

所述脱盐液中组成及各组分浓度为：6mM Tris-HCl、7mM 2-环己胺基乙磺酸、2mM盐酸赖氨酸；溶剂为去离子水。

所述洗脱液组成及各组分浓度为：6mM Tris-HCl、2mM EDTA·2Na；溶剂为去离子水。

使用该纯化试剂对假病毒进行纯化，所述假病毒纯化的方法，包括以下步骤：

(1)硅羟基磁珠振荡混匀后，取10μL放入EP管中；

(2)加入80μL裂解液和20μL假病毒，涡旋震荡混匀，静置40s；

(3)使用磁力架吸附溶液澄清，吸出废液弃掉；

(4)向EP管中加入100μL醇洗液，震荡混匀，使用磁铁吸附磁珠，弃掉上清液；

(5)保持磁铁吸附，沿管内侧壁转圈加入100μL脱盐液，静置8s，弃掉上清液(注意不要冲散磁珠)；

(6)加入100μL洗脱液，60℃水浴3min，再次震荡混匀；

实施例2

所述裂解液组成及各组分浓度为：3M GuHCl、0.5M NaAc、1％Triton X-100；溶剂为去离子水。

所述醇洗液组成及各组分浓度为：乙醇的体积分数为70％；醋酸钠的浓度为0.1M；枸橼酸三钠的浓度为5mM、柠檬酸二钠的浓度为5mM、三羟戊二酸钠的浓度为5mM；溶剂为去离子水。

所述脱盐液组成及各组分浓度为：5mM Tris-HCl、10mM 2-环己胺基乙磺酸、1mM盐酸赖氨酸；溶剂为去离子水。

所述洗脱液组成及各组分浓度为：5mM Tris-HCl、3mM EDTA·2Na；溶剂为去离子水。

(1)硅羟基磁珠振荡混匀后，取10μL放入EP管中；

(2)加入80μL裂解液和20μL假病毒，涡旋震荡混匀，静置30s；

(3)使用磁力架吸附溶液澄清，吸出废液弃掉；

(5)保持磁铁吸附，沿管内侧壁转圈加入100μL脱盐液，静置10s，弃掉上清液(注意不要冲散磁珠)；

(6)加入100μL洗脱液，50℃水浴5min，再次震荡混匀；

实施例3

所述裂解液组成及各组分浓度为：6M GuHCl、0.1M NaAc、2％Triton X-100；溶剂为去离子水。

所述醇洗液组成及各组分浓度为：乙醇的体积分数为50％；醋酸钠的浓度为0.2M；枸橼酸三钠的浓度为15mM、柠檬酸二钠的浓度为10mM、三羟戊二酸钠的浓度为1mM；溶剂为去离子水。

所述脱盐液组成及各组分浓度为：10mM Tris-HCl、5mM 2-环己胺基乙磺酸、5mM盐酸赖氨酸；溶剂为去离子水。

所述洗脱液组成及各组分浓度为：10mM Tris-HCl、1mM EDTA·2Na；溶剂为去离子水。

(1)硅羟基磁珠振荡3-5混匀后，取10μL放入EP管中；

(2)加入80μL裂解液和20μL假病毒，涡旋震荡混匀，静置60s；

(3)使用磁力架吸附溶液澄清，吸出废液弃掉；

(5)保持磁铁吸附，沿管内侧壁转圈加入100μL脱盐液，静置2s，弃掉上清液(注意不要冲散磁珠)；

(6)加入100μL洗脱液，70℃水浴1min，再次震荡混匀；

对比例1

与实施例1相比，醇洗液的组成不同。

所述醇洗液组成及各组分浓度为：乙醇的体积分数为70％；醋酸钠的浓度为0.15M；枸橼酸三钠的浓度为9mM、柠檬酸二钠的浓度为9mM；溶剂为去离子水。

其余组成同实施例1。

使用该纯化试剂对假病毒进行纯化，所述假病毒纯化的方法，步骤同实施例1。

对比例2

与实施例1相比，醇洗液的组成不同。

所述醇洗液组成及各组分浓度为：乙醇的体积分数为70％；醋酸钠的浓度为0.15M；枸橼酸三钠的浓度为3mM、柠檬酸二钠的浓度为6mM、三羟戊二酸钠的浓度为9mM；溶剂为去离子水。

其余组成同实施例1。

对比例3

与实施例1相比，醇洗液的组成不同。

所述醇洗液组成及各组分浓度为：乙醇的体积分数为70％；醋酸钠的浓度为0.1M；柠檬酸二钠的浓度为6mM、三羟戊二酸钠的浓度为12mM；溶剂为去离子水。

其余组成同实施例1。

对比例4

与实施例1相比，脱盐液的组成不同。

所述脱盐液组成及各组分浓度为：6mM Tris-HCl、9mM盐酸赖氨酸；溶剂为去离子水。

其余组成同实施例1。

对比例5

与实施例1相比，脱盐液的组成不同。

所述脱盐液组成及各组分浓度为：6mM Tris-HCl、9mM 2-环己胺基乙磺酸；溶剂为去离子水。

其余组成同实施例1。

对比例6

与实施例1相比，纯化方法不同。

一种假病毒的纯化试剂，组成同实施例1。

(1)硅羟基磁珠振荡混匀后，取10μL放入EP管中；

(2)加入80μL裂解液和20μL假病毒，涡旋震荡混匀，静置40s；

(3)使用磁力架吸附溶液澄清，吸出废液弃掉；

(6)加入100μL洗脱液，80℃水浴15min，再次震荡混匀；

效果例

1.纯化得率

使用applied biosystems 7500荧光定量PCR仪进行绝对定量。方法：建立5×10⁵-5×10¹的RNA标准曲线，对假病毒纯化后产物进行定量，通过定量拷贝数换算得率。结果参照表1。

表1假病毒纯化得率

试验组	纯化得率％
		实施例1	96.4
实施例2	95.7
		实施例3	96.2
对比例1	82.9
		对比例2	85.6
对比例3	78.5
		对比例4	64.3
对比例5	81.5
		对比例6	86.7

由此可知，本发明提供的假病毒纯化方法具有较高的纯化得率。

2.RT-qPCR三重荧光扩增验证

试验方法：按照表2要求配制PCR实验用试剂(所用引物及探针的序列表详情见表3)，混匀后，以25μL为一份，分装到八连排管中；随后加入25μL模板或样品；随后将八连排管放入实时荧光定量PCR仪ABI 7500中，设置程序如下表4所示：

表2 PCR试剂配制明细表

表3所用引物及探针的序列表

E-上游引物	ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
		E-下游引物	ATATTGCAGCAGTACGCACACA
E-FAM探针	FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1
		nsp14-上游引物	TGGGGYTTTACRGGTAACCT
nsp14-下游引物	AACRCGCTTAACAAAGCACTC
		nsp14-CY5探针	CY5-TAGTTGTGATGCWATCATGACTAGGTGT-BHQ3
N1-上游引物	GACCCCAAAATCAGCGAAAT
		N1-下游引物	TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
N1-HEX探针	HEX-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1

表4实时荧光定量PCR仪参数

过程	参数
		反转录	55℃，5min
热启动	95℃，30s
		循环	45cycles 95℃5s，60℃35s

(1)设置浓度梯度(5×10²、5×10³、5×10⁴、5×10⁵拷贝数)进行纯化，验证实施例1-3中假病毒纯化产物的荧光曲线(每个浓度下重复4次试验)，结果见图1-3。

(2)浓度为4×10³拷贝数时，分别对比实施例1与对比例1-6的纯化产物荧光曲线(重复3次试验)，结果见图4-9。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种假病毒的纯化试剂，包括以下组分：裂解液、醇洗液、脱盐液、洗脱液；

所述脱盐液的组分为：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2-环己胺基乙磺酸、盐酸赖氨酸。

2.如权利要求1所述的假病毒的纯化试剂，其特征在于，所述裂解液的组分为：盐酸胍、醋酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚。

3.如权利要求1所述的假病毒的纯化试剂，其特征在于，所述洗脱液的组分为：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、EDTA·2Na。

4.如权利要求1所述的假病毒的纯化试剂，其特征在于，所述裂解液中各组分浓度为：3-6M盐酸胍、0.1-0.5M醋酸钠、1-2％聚乙二醇辛基苯基醚。

5.如权利要求1所述的假病毒的纯化试剂，其特征在于，所述醇洗液中，乙醇的体积分数为50-70％；醋酸钠的浓度为0.1-0.2M；枸橼酸三钠的浓度为5-15mM、柠檬酸二钠的浓度为5-10mM、三羟戊二酸钠的浓度为1-5mM。

6.如权利要求5所述的假病毒的纯化试剂，其特征在于，所述枸橼酸、柠檬酸二钠和羟戊二酸钠的浓度比为1-3:1-2:1；所述枸橼酸、柠檬酸二钠和羟戊二酸钠的总浓度为15-26mM。

7.如权利要求1所述的假病毒的纯化试剂，其特征在于，所述脱盐液中各组分的浓度为：5-10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5-10mM 2-环己胺基乙磺酸、1-5mM盐酸赖氨酸；

所述洗脱液中各组分的浓度为：5-10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1-3mM EDTA·2Na。

8.一种假病毒的纯化方法，其特征在于，使用权利要求1-7任一所述的假病毒纯化试剂对假病毒进行纯化，包括以下步骤：

(1)取磁珠振荡混匀后，放入EP管中；

(2)加入裂解液和假病毒，涡旋震荡混匀，静置；

(3)使用磁力架吸附溶液澄清，吸出废液弃掉；

(6)加入洗脱液，水浴，再次震荡混匀；

9.如权利要求8所述的假病毒的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述静置的时间为30-60s；步骤(5)中，所述静置的时间为2-10s；步骤(6)中，所述水浴的温度为50-70℃；所述水浴的时间为1-5min。

10.如权利要求1-7任一所述的假病毒的纯化试剂在制备微流控芯片中的应用。