CN112725336A - 一种磁珠法快速提取rna的裂解结合液、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁珠法快速提取RNA的裂解结合液、试剂盒及其应用，所述裂解结合液包含0.1‑1mmol/L多果定，5‑1000mol/L氯化钠，10‑50mmol/L柠檬酸钠，10‑60mmol/L二硫苏糖醇，1‑30mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，10％‑30％(v/v)的50％聚乙二醇8000，0.1％‑1％(v/v)的100％Proclin300。相对于现有技术，本发明所提供的裂解结合液或试剂盒，应用于磁珠法提取RNA时，可以短时间内有效的裂解细胞，释放出核酸。裂解液的性质稳定，配合磁珠使用进行核酸的吸附和回收。
Description
技术领域
本发明属于RNA提取技术领域，特别涉及一种磁珠法快速提取RNA的裂解结合液、试剂盒及其应用。
背景技术
核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的组成物质，是所有生物分子中最重要的物质，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。核酸由核苷酸组成，而核苷酸单体由五碳糖、磷酸基和含氮碱基组成。如果五碳糖是核糖，则形成的聚合物是RNA；如果五碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是DNA。
核酸提取是现代分子生物学研究的必要的基础技术，制备高质量核酸是后续研究成功与否的关键。例如，当下，全球针对新型冠状病毒的核酸检测，其前提条件就是对新型冠状病毒颗粒内的核酸进行释放或者提取，才能顺利进行核酸检测，进而达到疫情防控的要求。核酸提取的原则首先保证核酸一级结构的完整，其次要排除其它分子的污染。核酸的提取方法，有着悠久的历史，且形成多种提取方法。针对脱氧核糖核酸(DNA)提取的方法，就包括SDS法、CTAB法、酶裂解法等以先先裂解释放DNA后层析纯化的经典方法，以及基于这些基础的DNA提取方法延展优化而成的多种商业试剂盒，最主要的有柱提法、磁珠法等。针对核糖核酸(RNA)的提取，例如提取新型冠状病毒的RNA，经典方法有Trizol法，以及柱提法、磁珠法等商业试剂盒。
RNA是生物分子中最重要基本物质之一，也成为了该领域中研究对象之一，核酸(RNA)提取在实验过程中显得尤为重要。核酸提取也不断的从传统耗时的提取方法不断的发展进步转变为简便高效的提取方法，为了使提取到的核酸满足纯度和质量的要求，提取的技术也在不断的更新。
磁珠法提取已成为分子领域中常用的提取方式。磁珠法是运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用纳米磁性微球的超顺磁性，在一定缓冲条件和外加磁场的作用下，能从血液、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。目前我们各大公司医院核酸提取的需求量大大的增加，磁珠法提取操作简单，用时短，并且能够实现自动化大批量操作。
目前常用的的裂解液主要成分基本是胍盐，如盐酸胍，异硫氰酸胍。能够使蛋白变性，溶解蛋白质，使细胞破碎，让核酸从细胞内释放出来。但因胍盐容易受温度，湿度等条件的影响，从而影响裂解液的作用，这些缺点需要不断通过技术的改进，那么一种成分稳定，不容易受其他条件影响的裂解液十分重要。
发明内容
发明目的：针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种磁珠法快速提取RNA的裂解结合液、试剂盒及其应用，该裂解结合液和试剂盒成分稳定，适用于唾液、咽拭子样本提取病毒RNA，速度快，效率高。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种磁珠法快速提取RNA的裂解结合液，所述的裂解结合液所含组分有0.1-1mmol/L多果定(十二烷基胍醋酸盐)，5-1000mmol/L氯化钠(NaCl)，10-50mmol/L柠檬酸钠，10-60mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，1-30mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，10％-30％(v/v)的50％聚乙二醇(PEG8000)，0.1％-1％(v/v)的100％Proclin300。
所述裂解结合液中，使用多果定的成分稳定性较好，能够起到裂解细胞和一部分去污剂的作用。氯化钠在试剂中提供一定的盐离子，合适浓度的氯化钠起到促进磁珠与核酸结合的作用。柠檬酸钠可以控制反应体系内的离子强度，起到调节PH的作用，保持稳定的缓冲体系。EDTA-2Na能够起到保护核酸的作用。聚乙二醇8000作为结合液中主要成分，能够使磁珠和核酸进行有效的结合。
所述50％聚乙二醇(PEG8000)为聚乙二醇粉末与去离子水比例为1:2配制而成。
优选的，所述裂解结合液包含：
0.1-0.5mmol/L，进一步优选0.1-0.4mmol/L的选多果定；
5-500mmol/L，进一步优选50-200mmol/L的氯化钠；
10-50mmol/L，进一步优选10-30mmol/L的柠檬酸钠；
10-50mmol/L，进一步优选15-30mmol/L的二硫苏糖醇；
10-30mmol/L，进一步优选15-30mmol/L的乙二胺四乙酸二钠；
10％-25％(v/v)，进一步优选15％-25％(v/v)的50％聚乙二醇8000；
0.1％-0.6％(v/v)，进一步优选0.3％-0.6％(v/v)的100％Proclin300。
proclin300的加入时机是在上述试剂配制完之后，按照配制量加入，能够起到保护试剂稳定性。
一种磁珠法快速提取RNA的试剂盒，所述试剂盒包括所述的裂解结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠混合液。
作为优选：
所述的洗涤液的成分可以75％-80％的乙醇。
所述的洗脱液可以是无酶水或者low TE buffer。
所述的磁珠混合液中，磁珠粒径在300-500nm的范围内回收效果最好，所选磁珠修饰基团可以是羧基或硅羟基磁珠。
本发明最后提供了所述裂解结合液在磁珠法提取RNA中的应用。
以及所述的试剂盒在磁珠法提取RNA中的应用。
有益效果：相对于现有技术，本发明所提供的裂解结合液或试剂盒，应用于磁珠法提取RNA时，可以短时间内有效的裂解细胞，释放出核酸。裂解液的性质稳定，配合磁珠使用进行核酸的吸附和回收。
附图说明
图1为本发明配方1核酸提取试剂盒提取假病毒核酸后PCR扩增曲线图。
图2为本发明配方2核酸提取试剂盒提取假病毒核酸后PCR扩增曲线图。
图3为中科拜尔核酸提取试剂盒提取假病毒核酸后PCR扩增曲线图。
图4为本发明配方2核酸提取试剂盒与中科拜尔核酸提取试剂盒提取假病毒核酸后PCR扩增曲线图重叠分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下面描述的实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂、仪器等，若无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：两种不同水平的本发明所述试剂配制
1、准备多果定(sigma，货号45466，粉末状)，氯化钠(sigma，货号S3014，颗粒状)，柠檬酸钠(sigma，货号C8532，颗粒状)，DTT(Solarbia，货号578517，颗粒状)，EDTA-2Na(sigma，货号E7889，液体，0.5M)，聚乙二醇8000(PEG8000，sigma，货号：P5413，粉末状)，proclin300(Solarbio，液体，100％)，以及其他配置所需的H2O、器皿或者耗材等；
2、按照一定比例，将上述试剂配置成相应母液：
| 试剂 | 母液浓度 |
| 多果定 | 20mM |
| 氯化钠 | 5M |
| 柠檬酸钠 | 0.1M |
| DTT | 1M |
| EDTA-2Na | 0.5M(原浓度) |
| PEG8000 | 50％(w/v) |
3、配置裂解液：按以下配方表分别加入试剂
| 试剂名称(母液) | 裂解液配方1 | 裂解液配方2 |
| 多果定(20mM) | 5mL | 1mL |
| 氯化钠(5M) | 20mL | 2mL |
| 柠檬酸钠(0.1M) | 20mL | 20mL |
| DTT(1M) | 2mL | 4mL |
| EDTA-2Na(0.5M) | 0.4mL | 0.5mL |
| PEG8000(50％) | 20mL | 17mL |
| Proclin300(100％) | 0.5mL | 0.5mL |
| 水 | 定容至100ml | 定容至100ml |
4、配置洗涤剂：准备无水乙醇和去离子水，配制80％的洗涤试剂。
5、配置磁珠：准备磁固含量为10mg/ml的磁珠，粒径范围为300-500nm，可以使用水对磁珠稀释30-50倍。
6、配置洗脱液：去离子水或者0.1x TE buffer。
7、试剂分装：试剂分装在96孔深孔板内，分别裂解结合液分装在第一列，磁珠溶液分装在第二列，洗涤试剂分装在第三列至第五列，洗脱试剂分装在第六列。
8、使用裂解液配方1分装的试剂板标记为配方1反应板；使用裂解液配方2分装的试剂板标记为配方2反应板。
实施例2：本发明试剂性能验证
1、样本准备：准备假病毒进行提取，将假病毒进行灭活56℃，30min。灭活完成后将假病毒稀释至200copies/ul，准备进行RNA提取。
2、核酸提取：将灭活后的假病毒取200ul分别加入到分装好的配方1反应板和配方2反应板试剂板，按照下表所述“提取程序”，使用自动化提取仪进行提取，提取结束后，收集洗脱液，用于后续PCR反应。
提取程序为
| 名称 | 时间 | 模块温度 |
| 磁珠混合 | 20s | 室温 |
| 移磁珠 | 40s | 室温 |
| 裂解结合 | 360s | 90℃ |
| 洗涤 | 40s | 80℃ |
| 洗涤 | 40s | 80℃ |
| 洗涤 | 40s | 80℃ |
| 洗脱回收 | 300s | 85℃ |
| 弃磁珠 | 20s | 室温 |
3、由配方1反应板提取的核酸标记为样品1；由配方2反应板提取的核酸标记为样品2。
4、PCR反应：分别取样品1和样品2各5ul，加入15ul的扩增试剂进行PCR反应，每个反应重复3次，按照反应程序为55℃10min，95℃1min，(95℃10S，60℃1min45cycles)进行PCR扩增反应。
5、扩增结束后，由样品1所得扩增曲线为图1；由样品2所得扩增曲线为图2，具体见附图。
实施例3：竞品性能验证
1、样本准备：准备假病毒进行提取，将假病毒进行灭活56℃，30min。灭活完成后将假病毒稀释至200copies/ul，准备进行RNA提取。
2、核酸提取：将灭活后的假病毒取200ul分别加入到分装好的中科拜尔反应板中，按照下表所述“提取程序”，使用自动化提取仪进行提取，提取结束后，收集洗脱液，用于后续PCR反应。
提取程序为
| 名称 | 时间 | 模块温度 |
| 磁珠混合 | 20s | 室温 |
| 移磁珠 | 40s | 室温 |
| 裂解结合 | 360s | 90℃ |
| 洗涤 | 40s | 80℃ |
| 洗涤 | 40s | 80℃ |
| 洗涤 | 40s | 80℃ |
| 洗脱回收 | 300s | 85℃ |
| 弃磁珠 | 20s | 室温 |
3、所得提取的核酸标记为样品zk。
4、PCR反应：取样品zk5ul，加入15ul的扩增试剂进行PCR反应，每个反应重复3次，按照反应程序为55℃10min，95℃1min，(95℃10S，60℃1min 45cycles)进行PCR扩增反应。
5、扩增结束后，由样品zk所得扩增曲线为图3，具体见附图。
6、数据结果分析：本发明上述两个实施例中，实施例2中，样品2所得扩增曲线相较于样品1所得扩增曲线，样品2所得扩增曲线在平行性、稳定性、扩增效率方面表现较好。本发明的含裂解液配方2的试剂盒(实施例2)与中科拜尔提取试剂盒对比，本发明的含裂解液配方2的试剂盒稳定性较好，平行样本间数据差异小(图4)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种磁珠法快速提取RNA的裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液包含0.1-1mmol/L多果定，5-1000mmol/L氯化钠，10-50mmol/L柠檬酸钠，10-60mmol/L二硫苏糖醇，1-30mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，10％-30％(v/v)的50％聚乙二醇8000，0.1％-1％(v/v)的100％Proclin300。
2.根据权利要求1所述的磁珠法快速提取RNA的裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液包含0.1-0.5mmol/L多果定，5-500mmol/L氯化钠，10-50mmol/L柠檬酸钠，10-50mmol/L二硫苏糖醇，10-30mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，10％-25％(v/v)的50％聚乙二醇8000，0.1％-0.6％(v/v)的100％Proclin300。
3.一种磁珠法快速提取RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-2任一项所述的裂解结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠混合液。
4.根据权利要求3所述的磁珠法快速提取RNA的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液选自75％-80％的乙醇。
5.根据权利要求3所述的磁珠法快速提取RNA的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液选自无酶水或者low TE buffer。
6.根据权利要求3所述的磁珠法快速提取RNA的试剂盒，其特征在于，所述磁珠混合液中，磁珠粒径在300-500nm的范围内，磁珠选自羧基修饰或硅羟基修饰磁珠。
7.权利要求1-2任一项所述的裂解结合液在磁珠法提取RNA中的应用。
8.权利要求3-6任一项所述的试剂盒在磁珠法提取RNA中的应用。
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| CN102605102A (zh) * | 2012-03-07 | 2012-07-25 | 天根生化科技（北京）有限公司 | 用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法 |
| CN104450684A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-03-25 | 南京中科神光科技有限公司 | 一种磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒及提取方法 |
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| CN111593047A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-08-28 | 申翌生物科技(杭州)有限公司 | 适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒及提取方法 |
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2021
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