CN101148677A - 一种快速提取植物根际土中am真菌环境dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速扩提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法，属于分子生物学和应用微生物学领域。本发明设计一种用于快速从大量有代表性的根际土提取AM真菌基因组DNA方法。首先通过湿筛法去除根际土大量的PCR扩增制约因子，收集根际土中AM真菌相关结构用于DNA的提取，经机械破壁后加入CTAB促进DNA释放，经Chelex－100树脂的进一步纯化。本提取方法具有方便、简单、快速的特点，并且DNA提取量多、具可浓缩纯化等优点，提高了PCR扩增成功率。通过本发明成功地从100g根际土中提取到AM真菌的环境DNA，以此为模板通过nested－PCR克隆到根际土中AM真菌目的基因片段。本发明能够快速提取植物根际土中丛枝菌根真菌环境DNA，具有良好的应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法，属于分子生物学和应用微生物学领域。
背景技术：
丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungus，AMF)是自然界中一类分布广泛的土壤微生物，它可以与约90％以上的陆生维管束植物的根系形成一种互惠共生体——丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza，AM)。越来越多的研究表明根际土中大量的AMF根外菌丝在土壤生态系统中发挥着重要的生态学功能，发现土壤中AMF的种类和组成已成为影响植物群落定居、演替、植物区系组成的一个重要因素，进而也是影响生态系统中资源配置、生态系统的稳定性、物种多样性和生产力的重要因素。丛枝菌根表现出可以在不同组织水平上(Hierarchical Organizational Levels)影响生命系统的过程和功能。因此，AM已成为生态系统中一个重要的功能类群。基于菌根的古老起源及其分布的普遍性、生态功能的多样性和重要性，球囊霉门真菌国际菌种库(The International Bank for the Glomeromycota，BEG)管理委员会提出“严格地讲，自然界中的多数植物没有传统意义上的根系，只有菌根。因此，有关植物的研究如果不考虑菌根或者菌根的影响就不能全面反映植物生长的真实情况”。
因此，开展AMF群落结构特征及其生态分布调查研究一直是AM研究领域的一个热点。然而，由于AM真菌绝对活体营养这一生物学特性使得目前还无法对其进行传统意义上的纯培养，AM真菌这一特性极大地阻碍了AM真菌群落生态学的调查研究。自Simon等1992年首次报道了用特定的PCR引物对AMF的18S核糖体基因进行扩增得到AM真菌的第一条DNA序列以来，分子生物学这一有力工具在菌根研究领域初步显现出独特的魅力。因此，如何有效、快捷地从根际土或少量的新鲜根样中获得一定量的AM真菌目的DNA是开展AM真菌分子生态学及其应用研究的核心问题。
目前，从根际土(或植物根样)中获得AM真菌目的DNA的方法主要包括CTAB法、Chelex-100树脂法以及DNA提取试剂盒等。然而，以上三种方法都不能完全有效地解决从混有大量杂质的根际土中获得一定纯度的、有代表性的DNA。因此，从适量的根际土中获得AMF环境DNA对开展AMF分子生态分布特点研究显得尤为重要。
经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术之不足，通过发明一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA方法，迅速扩增根际土中AM真菌目的DNA片段，从分子生态学层面上更准确、全面地了解AM真菌在根际土中的生态学地位和功能。
本发明利用根际土中AMF相关结构可以悬浮在水面的特点，结合CTAB法和Chelex-100树脂(Chelex-100resin，以亚氨二乙酸为吸附的苯乙烯与二乙基苯的共聚物)方法并加以改进，解决了从大量的(100g或更多)根际土样品中获得AM真菌环境DNA的问题。
土壤中存在许多影响PCR效率的制约因子，如何有效去除这些制约因子是开展土壤生物分子生物学研究的首要问题。本发明根据根际土中AM真菌通常可以形成较大的厚垣孢子且能悬浮在水表面的特性，采用湿筛沉淀法初步去除土壤中大部分PCR制约因子，收集根际土壤中AM真菌相关结构(如AMF厚垣孢子、AMF根外菌丝等)作为提取AM真菌环境DNA的样品，从而有效解决市售试剂盒只能从痕量样品提取DNA而缺乏代表性的不足(如美国EPICENTRE SoilMaster提取试剂盒，只能提取0.10g土壤)。通过湿筛倾析法收集到AMF孢子等结构经过CTAB试剂提取后，一方面，CTAB促进DNA的释放并减少机械破壁过程中如内源核酸酶对目的DNA的降解作用；另一方面，利用首轮有机溶剂(如等体积苯酚和氯仿混合液)初步去除大部分有机杂质，然后用Chelex-100树脂代替CTAB法中后续的多次有机溶剂的纯化过程。联合应用Chelex-100法及CTAB法可以有效地减少CTAB法在多轮有机试剂纯化过程中造成目的DNA片段损失。同时，由于CTAB法的引入可以促进目的DNA分子从大量样品中释放，并经过首轮有机试剂纯化后去除溶液中大量的蛋白质、脂肪等杂质。然后利用Chelex-100树脂对多价金属离子的整合作用，可防止DNA在煮沸加热时被降解，同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用，这样既可以减少DNA的损失，又可以消除扩增中的一些抑制因子。
联合应用Chelex-100法及CTAB法，综合了二种DNA提取方法方便、简单、快速及DNA提取量多、可浓缩纯化等优点，提高了PCR扩增成功率。采用本发明可以快速从大量的根际土中获得AM真菌目的DNA，利用AM真菌特异性引物结合巢式PCR(nested-PCR)技术可以对根际土中定殖AMF相关分子标记片段进行快速扩增。本发明同时还适用研究大量根系内AM真菌DNA的提取。
本发明是这样实现的：
从适量根际土(100g)中提取AM真菌DNA，利用AMF特异性引物通过巢式PCR扩增AM真菌目的片段，通过转化、克隆以及扩增片段测序，测序结果在NCBI中利用Blastn工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行检索，根据检索结果判断扩增序列的性质。
1.根际土中AM真菌相关结构的收集：
称取根际土壤样品100g，放入250ml烧杯中，加水至120～150ml浸泡，以便土壤颗粒充分溶解，然后在磁力搅拌器上慢速搅拌10～20分钟，使土壤颗粒进一步分散；让土壤溶液通过一组20目和200目的分样筛(筛孔直径分别为900μm和70μm)，用自来水反复冲洗，滤去土壤颗粒；洗净后用洗瓶将200目筛面上的筛出物冲洗到200ml小烧杯中，静置5min后将上清液倒入100ml量筒中，保留烧瓶底部的筛出物与水约25ml；量筒静置约5min后，上清液分别转入500ml梨形分液漏斗中，全部过程重复三次；分液漏斗静置15min后，打开漏斗底部活塞，使水成滴滴下，待漏斗中剩下约40ml时，关闭活塞；收集漏斗内AMF土壤相关结构(主要是AM真菌厚垣孢子、根外菌丝等)和部分杂质。经真空抽滤去除多余水分用于提取根际土AM真菌环境DNA。
2.AM真菌环境DNA提取：
1).将收集到AM真菌相关结构移到无菌的研钵中，用液氮冷却材料，待水份蒸发后，加入少量石英砂，充分研磨材料使之呈粉末状，然后迅速将粉末状的材料转入2ml的离心管中；
2).在装有材料的离心管中加入65℃水浴预热的2×CTAB提取液1ml，使材料完全分散在提取液中，在65℃水浴锅中温浴1小时，期间每20分钟摇匀1次；
3).将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入300μl等体积的苯酚-氯仿颠倒混匀，然后6500转/分钟离心20min；
4).取上清液10μl转移到另一0.5ml的离心管中，再加入300μl 20％Chelex-100树脂(Sigma，USA)混匀，置于99.9℃的PCR仪上煮沸15min；
5).待样品冷却至室温，瞬时离心30s，取上清液稀释20-100倍后置于-20℃冰箱中保存备用或直接作为DNA模板进行PCR扩增。
3.nested-PCR扩增：
把提取的环境DNA稀释20-100倍(视提取质量而定)，根据下表配制PCR反应体系进行PCR扩增。首先使用外侧引物对--引物LR1(5’-GCA TAT CAA TAA GCGGAG GA-3’)和FLR2(5’-GTC GTT TAA AGC CAT TAC GTA-3’)进行第一次PCR扩增。对First PCR反应所得产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测若无条带出现则以FirstPCR产物直接作为Second PCR反应的模板(若有条带出现将其稀释50-100倍后作为Second PCR反应的模板)。以AM真菌专一性相对较强的寡核苷酸FLR3(5’-TTGAAA GGG AAA CGA TTG AAG T-3’)和FLR4(5’-TAC GTC AAC ATC CTT AACGAA-3’)为内侧引物进行Second(nested)PCR，获得长300至380bp的LSU基因片段。
10×PCR buffer 5μl
25mM MgCl2 3μl
10mM dNTP mix 1μl
Taq Polymerase 0.5μl
Primer1(10pmol/μl) 1μl
Primer2(10pmol/μl) 1μl
DNA(20ng) 1μl
ddH2O 37.5μl
Total 50μl
4.PCR扩增片段测序：
对PCR扩增所得片段进行电泳纯化回收并进行连接产物的转化和重组实验，挑选阳性克隆提取质粒直接进行测序。
5.测序结果分析：
运用NCBI上的核苷酸序列同源性分析工具Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对测序所得的DNA序列进行分析，根据检索结果判断扩增序列是否是AM真菌目的片段。
本发明与现有技术相比，具有准确、快捷、简便、经济等优点。
具体实施方式：
利用以上方法，结合nested-PCR技术，对扩增片段测序，测序结果在NCBI中利用Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行检索，根据检索结果判断扩增序列的性质。以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此，同样适用于根样内定殖AM真菌DNA提取、土壤内其他丝状真菌DNA的提取等。
实施例1：
坡柳(Dodonaea viscose)根际土中AMF基因组DNA提取：
称取坡柳植物根际土100g，通过湿筛倾析法收集AM真菌相关结构(AMF孢子、根外菌丝等)，经液氮冷却研磨成粉状，依据本发明方法加1000μl CTAB液和20％Chelex-100树脂进行DNA提取，并进行nested-PCR，经克隆、测序获得AMF目的基因。并将获得的基因递交到GenBank，序列登录号为EU118739。
实施例2：
扭黄茅(Heteropogon contortus)根际土中AM真菌基因组DNA提取；
基本同实施例一，并将获得的基因递交到GenBank，序列登录号为EU118750。
实施例3：
坡柳(D.viscose)根内AM真菌基因组DNA提取：
称取新鲜坡柳根系2g，用75％乙醇进行表面消毒后，经液氮冷却研磨成粉状，依据本发明方法加1000μl CTAB液和20％Chelex-100树脂进行DNA提取，并进行nested-PCR，经克隆、测序获得AM真菌目的基因。并将获得的基因递交到GenBank，序列登录号为EU118692。
实施例4：
扭黄茅(H.contortus)植物根内AM真菌基因组DNA提取：
基本同实施例三，并将获得的基因递交到GenBank，序列登录号为EU118712。
附图基因序列.txt
SEQUENCE LISTING
<110>云南大学
<120>一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法
<130>1
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>373
<212>DNA
<213>Uncultured Glomeromycota
<220>
<221>gene
<222>(1)..(373)
<223>
<400>1
ttgaaaggga aacgattgaa gtcagtcgta ctggcgaaaa atcaactact cgagtgagta 60
cttgtgggcg tacgtgagct tcacggccgc gttgtttgca atgttcgtgc tcttgtggtg 120
tactttttcg tgtggtaggt caatgtcggt tttgaacgcc ataaaatgat cggaggaatg 180
tagcttcgac ctcgttgaag tgttatagcc tttggtagat atggtgtttg ggatcgagga 240
ttgcaacgaa taccttttgg gctatccgtc tgacctctga tggttagctg ggtgccgaaa 300
gcatgcttac ggttatccaa gttgactgtc aatagattag aacgtgatta cattcgttaa 360
ggatgttgac gta 373
SEQUENCE LISTING
<110>云南大学
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Claims (1)
1.一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法，包括根际土中AM真菌相关结构的收集、真菌基因组DNA的提取、用AM真菌特异性引物进行nestedPCR扩增、及扩增片段测序及测序结果分析步骤，其特征在于本方法中所用根际土AM真菌DNA由下列方法得到：
a.称取100g根际土壤样品，经湿筛倾析法收集AMF厚垣孢子及根外菌丝结构，并将其置于无菌的研钵中，用液氮冷却材料，待水份蒸发后，加入少量石英砂，充分研磨材料使之呈粉末状，然后迅速将粉末状的材料转入2ml的离心管中；
b.在装有材料的离心管中加入65℃水浴预热的2×CTAB提取液1ml，使材料完全分散在提取液中，在65℃水浴锅中温浴1小时，期间每20分钟摇匀1次；
c.将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入300μl等体积的苯酚-氯仿颠倒混匀，然后6500转/分钟离心20min；
d.取上清液10μl转移到另一0.5ml的离心管中，再加入300μl 20％Chelex-100树脂混匀，置于99.9℃的PCR仪上煮沸15min；
e.待样品冷却至室温，瞬时离心30s，取上清液稀释20-100倍置于-20℃冰箱中保存备用或直接作为DNA模板进行PCR扩增。
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