CN104789554B

CN104789554B - 从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法

Info

Publication number: CN104789554B
Application number: CN201510166618.XA
Authority: CN
Inventors: 于广利; 孙学超; 陈璇; 刘亚男; 许春龙
Original assignee: NANTONG TIANLONG ANIMAL BY-PRODUCTS Co Ltd; Ocean University of China
Current assignee: Nantong Guang Heng Biotechnology Co., Ltd.; Ocean University of China
Priority date: 2015-04-10
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2017-11-28
Anticipated expiration: 2035-04-10
Also published as: CN104789554A

Abstract

本发明涉及从动物组织制备脱氧核糖核酸领域，尤其是一种利用猪小肠黏膜肝素提取后的废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法。将猪小肠黏膜肝素提取后废弃液进行柱吸附、脱附、酸沉、复溶、醇沉、透析，获得高纯度的脱氧核糖核酸，其分子量在3～70kDa之间。本发明选用猪小肠黏膜肝素提取废弃液作为脱氧核糖核酸的提取原料，不仅能提高猪小肠粘膜的综合利用率，降低废液排放，实现猪小肠黏膜中肝素与核酸产品的联产，提高原料附加值，而且能为脱氧核糖核酸提供稳定的工业化原料，利用本发明技术获得的产品在提高免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗心脑血管疾病等中具有广阔的市场应用价值。

Description

从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法

技术领域

本发明涉及从动物组织制备脱氧核糖核酸领域，尤其是一种利用猪小肠黏膜肝素提取后的废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法。

背景技术

核酸是生命的最基本物质之一，它广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内，生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。

DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质，在生物体的个体生长、发育、繁殖、遗传等各个环节起着重要作用，有促进细胞生长、增强细胞活力及改善机体代谢等作用。随着人类对DNA研究的不断深入，发现其对众多重大疾病的治疗、治疗后恢复、营养保健等方面有积极的作用，不同生物组织中提取的DNA可用于：(1)增强免疫功能；(2)治疗急、慢性肝炎及治疗后恢复；(3)治疗白细胞减少症，包括肿瘤患者放疗、化疗后的白细胞减少；(4)治疗血小板减少症、贫血及再生障碍性贫血等疾病；(5)治疗冠心病、心肌梗塞、心肌炎；(6)促进大面积创伤的修复；(7)抗衰老；(8)各种慢性消耗性疾病营养补充等。因此，近年来核酸物质需求量很大，如：欧洲对核酸的需求额从2005年6.7亿美元增加到2012年的14.9亿美元，从事核酸类相关技术研究意义重大，产品的市场需求很大。在核酸制备技术方面，八十年代前后主要从小牛胸腺和鱼类精囊中提取，九十年代后，由于该类货源紧缺，限制了DNA的生产；由于生物发酵法生产DNA技术难度大、成本很高，近年来从动物废弃物中提取DNA成为研究的热点。如：中国专利(申请号：200410016960.3)披露了一种从猪、羊、鸡和鸭的胸腺中提取脱氧核苷酸方法，惠长野等开展了从猪小肠黏膜中提取脱氧核糖核酸的研究(沈阳药科大学学报,2013,30(1):63-67)。

我国是全球肝素粗品和肝素原料药的生产大国和出口国，而制取肝素的原料主要以猪小肠黏膜为主。肠粘膜提取肝素后有大量废弃物产生，废弃物的排放不仅造成环境污染，同时废弃物中具有医疗保健作用的活性物质也被浪费。因此，对废弃物进行利用，从中提取高附加值的脱氧核糖核酸，不仅能减轻环境污染，而且可以实现废弃物的综合利用，提高经济效益，也是本发明的意义所在。

发明内容

针对脱氧核苷酸提取原料紧缺的现状，以及猪小肠黏膜肝素提取过程中废弃物随意排放、造成资源浪费的现象，本发明的目的在于提供一种从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，该方法可实现猪小肠粘膜综合利用，提高产品附加值，为脱氧核糖核酸的制备提供新来源，缓解原料短缺的现状。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：

一种从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，该方法包括以下步骤：

(1)柱吸附：将离子交换树脂装入吸附柱中，用泵将猪小肠黏膜肝素提取后废弃液通过含有树脂的吸附柱进行吸附；

(2)脱附：用浓度为0.05～0.2mol/L的氯化钠洗脱吸附柱，用温度为60～70℃浓度为2.0～4.0mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集脱附液；

(3)酸沉：将收集的脱附液调节pH至1～3，静置；

(4)复溶：将(3)中混合液进行离心，收集沉淀，用蒸馏水清洗沉淀2～4次，加入蒸馏水，搅拌下加入碱溶液，使沉淀溶解；

(5)醇沉：加入体积分数为90％～95％的乙醇进行沉淀，静置12～24h，去掉上清液，收集下层沉淀；

(6)透析：将(5)中沉淀溶于37～55℃蒸馏水中，转入透析袋中，透析，去除小分子物质，透析结束后，将透析内液进行旋蒸浓缩，冻干，获得脱氧核糖核酸。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，该方法所获得的脱氧核糖核酸的分子量分布范围为3～70kDa之间。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，步骤(1)中，吸附所用的树脂为罗门哈斯AMBERLITE FPA 98 CL树脂，猪小肠黏膜肝素提取后废弃液与树脂的重量比为700～1200:1。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，步骤(2)中，清洗吸附柱所用0.05～0.2mol/L的氯化钠溶液体积为吸附柱体积的2～3倍，脱附所用的2.0～4.0mol/L氯化钠溶液体积为吸附柱体积的1.5～3倍。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，步骤(3)中，调节脱附液pH值时采用的酸为1～3mol/L的盐酸，边搅拌边加酸，静置温度为4～8℃，时间为4～12h。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，步骤(4)中，复溶所采用的碱为1～4mol/L的氢氧化钠，边搅拌边滴加，直至沉淀全部复溶，溶液pH为6～8。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，步骤(5)中，醇沉所用乙醇的体积为复溶后溶液体积的3～4倍。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，步骤(6)中，透析脱盐所用透析袋或超滤浓缩膜截留分子量为1000Da，透析时间为12～24h，每隔2～4h换一次水。

本发明的优点和有益效果为：

(1)本发明在离子树脂脱附工艺中先用2～3倍柱体积的0.05～0.2moL/L的氯化钠清洗。因为脱氧核糖核酸在该盐浓度范围内溶解度较低，而低浓度的氯化钠溶液可以去除部分树脂中的杂质。用温度为60～70℃浓度为2.0～4.0mol/L的氯化钠溶液进行脱附，是因为在该高盐浓度下脱氧核糖核酸的溶解度达到最大，且在该温度下，大多数杂蛋白质会发生变性，该条件能将脱氧核糖核酸与树脂中的杂质及样品中的蛋白质进行有效分离，获得较高纯度的脱氧核糖核酸。

(2)本发明将酸沉复溶所获得脱氧核糖核酸产品进行醇沉，是根据脱氧核糖核酸不溶于乙醇溶液，而某些小肽和色素等杂质能够溶于乙醇溶液的特点，利用这一原理，可以将所需脱氧核糖核酸产品进一步纯化。

(3)本发明猪小肠原料丰富、采用的制备和工艺简单，适合于工业生产，可弥补市场中脱氧核糖核酸资源不足的缺陷。

(4)本发明选用猪小肠黏膜肝素提取后的工业生产后的废弃液，来源充足，成本低廉，适合规模化生产，所得产品具有重要的市场应用前景。

总之，与现有采用的原料和技术不同，本发明所使用的原材料既不是胸腺，也不是猪小肠的黏膜，而是工业化生产肝素后的废液；所用的提取技术既不是表面活性剂和盐析也不是酶解与钙离子沉淀，而是离子交换树脂吸附分离和醇沉技术，且得到的产品质量标准也与其不同；本发明产品DNA纯度高，其磷含量为9.1％～9.3％，接近于理论值9.2wt％，尤其本发明技术路线简单，成本低廉，无毒无污染，选用原料为肝素提取后的废弃液，不仅不影响肝素的提取和肝素的质量，而且降低环境污染，并回收高附加值的DNA产品。

附图说明

图1为本发明脱氧核糖核酸的紫外吸收图。

图2为本发明脱氧核糖核酸的十八角度激光散射仪分析图。其中，横坐标时间单位是分钟，纵坐标相对标尺的单位是相对空白溶液的折光指数(ΔRI)。

图3为本发明脱氧核糖核酸的红外光谱图。

具体实施方式

在具体实施方式中，本发明所提供脱氧核糖核酸的制备方法，将猪小肠黏膜肝素提取后废弃液进行柱吸附，然后进行脱附，收集脱附液调pH，醇沉、脱水、干燥，具体工艺步骤如下：

(1)柱吸附：将离子交换树脂装入吸附柱中，用泵将猪小肠黏膜肝素提取后废弃液通过吸附柱进行吸附；

(2)脱附：用浓度为0.05～0.2mol/L的氯化钠清洗吸附柱，排净后，用温度为60～70℃浓度为2.0～4.0mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集脱附液；

(3)酸沉：将收集起的脱附液调节pH至1～3，静置，沉淀；

(4)复溶：离心，去除上清，沉淀用蒸馏水清洗三遍，去除沉淀表面残留的上清液，加入蒸馏水，缓慢滴加碱溶液使沉淀复溶。

(6)透析：将醇沉所得沉淀溶于37～55℃蒸馏水中，转入透析袋中，透析，去除盐等小分子物质，透析结束后，将透析内液旋蒸浓缩，冻干，获得寡聚脱氧核糖核酸。所述脱氧核糖核酸的分子量分布范围为3～70kDa之间，凝胶渗透色谱检测洗脱峰单一对称，含有少量核糖核酸，其重量百分含量为1％～3％。

步骤(1)中，二次吸附所用的树脂为罗门哈斯AMBERLITE FPA 98 CL树脂，猪小肠黏膜肝素提取后废弃液与树脂的重量比为700～1200:1。步骤(2)中，清洗吸附柱所用0.05～0.2mol/L的氯化钠溶液体积为吸附柱体积的2～3倍，脱附所用的2.0～4.0mol/L的氯化钠溶液体积为吸附柱体积的1.5～3倍。步骤(3)中，调节脱附液pH值时采用的酸为3mol/L的盐酸，边搅拌边加酸，静置温度为4～8℃，时间为4～12h。步骤(4)中，复溶所采用的碱为2mol/L的氢氧化钠，边搅拌边滴加，直至沉淀全部复溶，此时，溶液pH约为6～8。步骤(5)中，醇沉所用的体积为复溶后溶液体积的3～4倍。步骤(6)中，透析所用的透析袋截留分子量为1000Da，透析时间为24h，每隔4h换一次水。

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进一步的详细说明，结合附图阅读本发明的具体实施例后，本发明的其他优点将变得更加清晰，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

将200g罗门哈斯AMBERLITE FPA 98 CL树脂装入吸附柱中，用泵将猪小肠黏膜肝素提取后的170kg废弃液通过含有吸附柱进行吸附，先采用浓度为0.1moL/L的氯化钠水溶液清洗2倍柱体积，再用温度为60℃浓度为4.0mol/L的氯化钠水溶液洗脱2倍柱体积，收集脱附液。将收集起的脱附液边搅拌边用3mol/L盐酸调节pH至2，于4℃静置4h。离心，去除上清，沉淀用蒸馏水清洗三遍，去除上清残留物，缓慢向沉淀中滴加2mo/L氢氧化钠水溶液，直至沉淀完全溶解，加入3倍体积分数为90％的乙醇进行沉淀，4℃条件下静置12h，离心去除上清液，收集下层沉淀。将沉淀溶于37℃蒸馏水中，搅拌复溶，转至截留量为1000Da透析袋中，透析脱盐12h，浓缩，冻干。也可以采用1000～2000Da超滤膜设备进行浓缩脱盐后，冻干。本实施例中，获得脱氧核糖核酸PM-1(12.6g)。

实施例2

将500g罗门哈斯AMBERLITE FPA 98 CL树脂装入吸附柱中，用泵将猪小肠黏膜肝素提取后570kg废弃液通过树脂进行吸附，先采用浓度为0.2moL/L的氯化钠水溶液清洗树脂2.5倍柱体积，树脂洗净后，用温度为60℃浓度为2.0mol/L的氯化钠水溶液洗脱2倍柱体积，收集脱附液。将收集起的脱附液边搅拌边用2mol/L盐酸调节pH至3，于4℃静置6h。离心，去除上清，沉淀用蒸馏水反复清洗三遍，去除上清残留物，缓慢向沉淀中滴加2mo/L氢氧化钠水溶液，直至沉淀完全复溶，加入4倍体积分数为95％的乙醇进行沉淀，4℃条件下静置24h，离心去除上清液，收集下层沉淀。将沉淀溶于50℃蒸馏水中，搅拌，使其复溶，转至截留量为2000Da透析袋中，透析脱盐24h，浓缩，冻干。也可以采用1000～2000Da超滤膜设备进行浓缩脱盐后，冻干。本实施例中，获得脱氧核糖核酸PM-2(41.3g)。

上述脱氧核糖核酸的鉴定及分析：

1、脱氧核糖核酸的紫外全波长吸收

采用双蒸水做溶剂，分别配制0.05mg/mL的PM-1、PM-2水溶液，采用紫外全波长扫描(190～400nm)检测其最大吸收波长，扫描结果如图1。从图1中可知，PM-1和PM-2均在260nm处有最大吸收，且其260nm/280nm比值分别为1.76和1.87且不超过1.9，说明所得产品主要为DNA。

2、脱氧核糖核酸的鉴别

脱氧核糖在酸性溶液中与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物。利用该特点，将本发明制备的寡聚脱氧核糖核酸PM-1和PM-2配制成200ug/mL水溶液于试管中，加入苯胺二苯胺试剂，60℃保温30min，结果表明PM-1和PM-2溶液变成为蓝色，证明所制备样品为脱氧核糖核酸。

3、脱氧核糖核酸中蛋白含量及磷酸根含量测定

采用Folin-酚和定磷法测定所得产品PM-1与PM-2中蛋白质含量及磷酸根含量。结果表明，产品中蛋白含量极低，磷酸根含量在9.0wt％～9.3wt％左右。

4、脱氧核糖核酸分子量分布范围分析

采用琼脂糖凝胶电泳及十八角激光散射仪进行分析。采用琼脂糖凝胶电泳对所得产品PM-1和PM-2中核酸进行分析，经与DNA标准品对比，PM-1与PM-2呈分散状，说明所得产品为寡聚脱氧核糖核酸，而且其条带主要在100bp以下，表明所得产品为寡聚脱氧核糖核酸。为了精确测定其分子量分布范围，采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)及十八角激光散射仪和示差检测器联用在线检测方法分析PM-1和PM-2分子量(图2)。从图中可知，PM-1和PM-2的色谱峰对称，说明产品纯度较高，分子量分布宽度分别为1.27和1.12；分子量分别在4.1～67.3kDa和3.7～63.8kDa之间。

5、脱氧核糖核酸的红外光谱分析

本发明所制备的寡聚脱氧核糖核酸的红外光谱如图3所示。以PM-2为例，1662.69cm^-1处为碱基上C＝O伸缩振动，1489.55cm^-1处为碱基上N-C伸缩振动，1232.84cm^-1处为核酸中磷酸二酯基团中P＝O反对称伸缩振动，1068.66cm^-1处为核酸中磷酸二酯基团O＝P对称伸缩振动，970.15cm^-1处为核酸的磷酸单酯二价阴离子(PO₃ ^2-)对称伸缩振动引起。PM-1的红外光谱特征与PM-2相似。

6、脱氧核糖核酸中的核糖核酸含量测定

采用酸降-PMP衍生测定单糖组成的方法测定本发明所制备的脱氧核糖核酸中核糖核酸的含量。采用高效液相色谱法(HPLC)检测PM-1和PM-2的单糖组成，通过换算得知，PM-1和PM-2中核糖核酸重量含量分别为占2.12％和2.95％，进一步表明本发明产品脱氧核糖核酸的纯度较高，达到97％以上。以目前市场高纯度(95％)DNA最低价格40元/克计算，采用本发明工艺每天可从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中回收17公斤以上高质量猪内肠DNA，可以产生68万元经济效益。

综上所述，本发明以猪小肠黏膜肝素提取废弃液为原材料制备脱氧核糖核酸，纯度较高，可进一步用作制备脱氧核糖核酸注射液原料。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）柱吸附：将离子交换树脂装入吸附柱中，用泵将猪小肠黏膜肝素提取后废弃液通过含有树脂的吸附柱内进行吸附；吸附所用的树脂为罗门哈斯AMBERLITE FPA 98 CL树脂，猪小肠黏膜肝素提取后废弃液与树脂的重量比为700～1200:1；

（2）脱附：用浓度为0.05～0.2 mol/L的氯化钠洗脱吸附柱，用温度为60～70 ℃浓度为2.0～4.0mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集脱附液；

步骤（2）中，清洗吸附柱所用0.05～0.2 mol/L的氯化钠溶液体积为吸附柱体积的2～3倍，脱附所用的2.0～4.0 mol/L氯化钠溶液体积为吸附柱体积的1.5～3倍；

（3）酸沉：将收集的脱附液调节pH至1～3，静置；

（4）复溶：将（3）中混合液进行离心，收集沉淀，用蒸馏水清洗沉淀2～4次，加入蒸馏水，搅拌下加入碱溶液，使沉淀溶解；

（5）醇沉：加入体积分数为90%～95%的乙醇进行沉淀，静置12～24 h，去掉上清液，收集下层沉淀；

步骤（5）中，醇沉所用乙醇的体积为复溶后溶液体积的3～4倍；

（6）透析：将（5）中沉淀溶于37～55℃蒸馏水中，转入透析袋中，透析，去除小分子物质，透析结束后，将透析内液旋转蒸发浓缩，冻干，获得寡聚脱氧核糖核酸；

该方法所获得的脱氧核糖核酸的分子量分布范围为3～70KDa之间，脱氧核糖核酸的纯度达到97%以上，磷酸根含量在9.0 wt%～9.3wt%。

2.根据权利要求1所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，其特征在于，步骤（3）中，调节脱附液pH值时采用的酸为1～3 mol/L的盐酸，边搅拌边加酸，静置温度为4～8 ℃，时间为4～12 h。

3.根据权利要求1所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，其特征在于，步骤（4）中，复溶所采用的碱为1～4 mol/L的氢氧化钠，边搅拌边滴加，直至沉淀全部复溶，溶液pH为6～8。

4.根据权利要求1所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，其特征在于，步骤（6）中，透析脱盐所用透析袋或超滤浓缩膜截留分子量为1000 Da，透析时间为12～24 h，每隔2～4 h换一次水。