CN103961797A - 促进蜗牛黏液分泌的方法及其萃取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种促进蜗牛黏液分泌的方法及其黏液的萃取方法，包含提供活体蜗牛，并在一预设时间内以具有预设电压的金属装置接触该活体蜗牛的腹足。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进腹足纲的陆生生物体黏液分泌的方法及其萃取方法，且特别涉及一种促进蜗牛黏液分泌的方法及其萃取方法。
背景技术
皮肤老化的过程是自然生物的演化。然而，环境的影响及基因的改变可能加速此过程。举例来说，暴露于UV光增加氧化伤害被称为光老化。经由临床证明，暴露在阳光下，光老化影响皱纹，干燥，毛细孔扩张，粗糙，并且失去皮肤的延展性及皮肤的色素改变。不仅如此，还会影响生成皮肤的良性或是恶性的肿瘤。皮肤老化也会伴随一些病理的机制，如ROS的促进生成，皮肤再生的能力，细胞迁移的减少，贴附及存活率。
最近几年有关天然物质的研究增加可改进及刺激皮肤的再生。在这方面，有些蜗牛的分泌物对于烫伤皮肤及开放性的伤口具有再生的能力，特别是软件动物被证明具有抗氧化活性并使急性放射性皮炎引起的损伤修复。
然而，天然的蜗牛黏液分泌量非常稀少，造成市场上添加蜗牛黏液相关的产品价格居高不下。因此，如何增加蜗牛黏液的分泌量长久以来是亟需解决的一重要课题。蜗牛天生较为脆弱，无法以较为剧烈的方式促进其黏液的分泌，因而增加蜗牛黏液萃取的难度。US Pat.No.5538740揭露了以离心的方式针对活体蜗牛进行离心条件为2×g相对离心场（relative centrifugal field；RCF），10分钟的离心步骤，以增加其黏液的分泌量。虽然2×g的RCF对于蜗牛而言是相对轻微的物理性刺激，然而由于萃取时间需达10分钟，难以排除此条件对于蜗牛是否会有副作用，更甚致死亡。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种轻微物理性刺激，且刺激时间短的促进蜗牛黏液分泌的方法；其以预设电压刺激、促进活体蜗牛黏液的分泌，且电刺激后的蜗牛仍为活体蜗牛。换句话说，利用本发明所提供的方法萃取蜗牛黏液不会造成蜗牛死亡。
本发明方法的一方面提供一种促进蜗牛黏液分泌的方法，包含提供活体蜗牛，并在一预设时间内以具有预设电压的金属装置接触该蜗牛的腹足。
根据本发明方法的一实施方式，所述促进蜗牛黏液分泌的方法，其中预设时间可为5秒至150秒。
根据本发明方法的另一实施方式，所述促进蜗牛黏液分泌的方法，其中预设电压可为0.5伏特至50伏特。
本发明方法的另一方面提供一种蜗牛黏液萃取方法，包含提供活体蜗牛，且蜗牛具有黏液。在一预设时间内以具有预设电压的金属装置接触该蜗牛的腹足以增加该黏液的分泌量。随后，提取蜗牛的黏液。
根据本发明方法的一实施方式，所述蜗牛黏液萃取方法，其中预设时间可为30秒至120秒。
根据本发明方法的另一实施方式，所述蜗牛黏液萃取方法，其中预设电压可为2伏特至30伏特。
根据本发明方法的再一实施方式，所述蜗牛黏液萃取方法还可包含均质所述黏液，以平均黏液的黏度，并离心黏液，以沉降黏液中的杂质，以及过滤黏液，以滤除黏液的杂质。
由此，本发明以不致造成蜗牛死亡，且不伤害蜗牛的方式促进其黏液的分泌，并通过萃取蜗牛的黏液，并可将其广泛应用于促进伤口的愈合以及皮肤的改质。
附图说明
为了使本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，提供附图，在附图中：
图1是蜗牛黏液对于人类纤维母细胞的迁移（创伤修复）分析实验照片。
具体实施方式
本发明提供一种促进蜗牛黏液分泌的方法，包含提供活体蜗牛，并在一预设时间内以具有预设电压的金属装置接触活体蜗牛的腹足。所述促进蜗牛黏液分泌的方法，其中预设时间可为5秒至150秒，而预设电压可为0.5伏特至50伏特。
此外，本发明还提供一种蜗牛黏液萃取方法，包含提供具有黏液的活体蜗牛。在一预设时间内以具有预设电压的金属装置接触该活体蜗牛的腹足以增加该黏液的分泌量。随后，提取活体蜗牛的黏液。再者，更可以均质所述黏液，以平均黏液的黏度，并离心黏液，以沉降黏液中的杂质，以及过滤黏液，以滤除黏液的杂质。所述蜗牛黏液萃取方法，其中预设时间可为30秒至120秒，而预设电压可为2伏特至30伏特。
现以下述试验例详细说明本发明，然而本发明不局限于下列试验例所揭示的内容。
试验例I
1.电压萃取黏液流程
将蜗牛从培养箱取出后，初步喷湿以排除不健康的蜗牛，并将筛选出的健康蜗牛以水淋洗，将其置入适当的容器去除多余的水分，等待水分蒸散（约3个小时），再依需求的黏液量秤取适量的蜗牛；蜗牛与其所分泌的黏液比例约10%。开始萃取时需注意对器材及手部进行消毒，并确认所欲施以电刺激的电压值，并需留意碰触到电极（金属装置）的危险。利用具有电极的金属装置接触蜗牛腹足，使蜗牛接受电压的刺激使其分泌蜗牛黏液，平均一只蜗牛萃取的时间约6min，另外所有盛装黏液的容器外围也必须放置冰块，以维持低温环境，并于黏液收集完毕之后迅速将其放入-20℃冰箱保存。
2.萃取的黏液处理流程
处理蜗牛液的步骤分别为：初步处理：均质、离心(两阶段)、过滤、纯化，冰冻保存；其中纯化步骤主要是利用胶体过滤法。
均质步骤
此步骤的目的是将较黏稠的黏液搅拌均匀，使其浓度达到一个平均值。首先将欲处理的黏液自保存的-20℃冰箱取出并退冰，并放置冰浴。由于实验过程中都处于室温的环境中，因此必须随时留意温度的变化与冰块的融化速率。此步骤所花费的较佳时间约为每500mL的黏液均质约20min，而使用更多的黏液去均质的处理时间不一定等比例放大，可能要更长的时间才会有效果。
离心步骤
此步骤的目的是去除蜗牛黏液中的杂质，将蜗牛黏液中不溶物质及微小的颗粒沉降，另外有沉降系数极低的悬浮于液体表面物质也有分离的效果。于离心前设定离心的条件，本试验例的条件为：离心时间35min及离心转速约9000rpm。此外，由于离心时可能会产生离心热，使得离心机内的环境温度上升，造成黏液的破坏，因此离心温度预设为-4～5℃。
离心管的处理是先清洗后，用反渗透过滤（RO）水润洗，再使用灭菌釜高温高压灭菌。离心管的材质为聚丙烯（Polypropylene；PP），其可于121℃、20min的条件下以灭菌釜高温高压灭菌。离心管容量的限制为盛装的液体约20mL，并针对其盛装液体的总重量进行对称平衡，使得离心管于离心时不因重量不一导致旋转时倾斜于一方，而损坏离心机的轴心。
胶体层析过滤步骤
此步骤是使用抽气过滤与胶体过滤法，在真空系统中辅助滤液通过滤纸过滤，其用以滤除在离心过程中无法排除的肉眼无法辨识的颗粒或悬浮系数中等的不溶物质与粘稠的液体等。先用孔径较大的棉纤维滤纸（滤纸规格为：直径90mm，孔径理论大小7μm）将较粗的颗粒过滤掉，再以孔径较小的聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride；PVDF）滤膜（滤膜规格为:直径47mm，孔径大小0.45μm与0.22μm）进行更进一步的过滤。由此，避免在孔径更细微的胶体过滤中造成管柱的堵塞。进行胶体过滤环境为4℃的冷房；其中，分离蛋白质所使用的胶球，以多糖类为主体；例如:本实验采用的葡聚醣凝胶为Sephadex G-200（SephadexTM），其使用洋菜糖为主要的高级材料。离子交换层析管柱使用DEAE-Sepharose6B（SephadexTM），是一种聚苯乙烯-苯二乙烯复合材质，以及亲合性层析(CNBr-activated Sepharose4B；SephadexTM)。在此不选择使用一般常见的树脂类是因为树脂类胶球对蛋白质的吸附力很大，经常会使得蛋白质变性失活，而只能用在小分子样本。缓冲溶液是使用酸碱值为pH7的磷酸缓冲溶液。配置完成的缓冲溶液亦需以滤膜过滤，并利用超音波震荡去气（degas）。胶体过滤层析、离子交换树脂层析及亲合性吸附层析管柱装填方式为先预估胶体体积之后，清洗胶体，并于清洗结束后使胶体静置达到温度平衡，再进入填充管柱的步骤。注意胶体装填时，应一次不中断地倒完胶体。其次，装填后步骤分为静平衡与动平衡。静平衡：待胶体自然沉淀约30min；动平衡：胶柱装填完成后要充分流洗，并以流速30mL/h加压流洗让胶体更加紧密。此步骤中需留意勿使胶体干掉，并留意馏分收集器（fraction collector）是否正常运作。此外，整个管柱系统的温度不可骤变，尤其不可升温，否则会产生气泡。于进行分离（fractionation）时，磷酸缓冲液的流速为1mL/min。经由这些步骤可使胶体具有使不同分子量大小的微粒达到分离效果，最后收集干净的黏液即可放置冷冻保存。
试验例II
1.不同电压与时间的影响（黏液萃取率）
设定不同电压以及不同持续时间刺激下，观察蜗牛分泌黏液的情形。蜗牛在黏液萃取过程中，不会因为蜗牛受到刺激而造成其生理剧变而死亡。为排除个体差异的疑虑，本试验经交叉重复批次实验。
蜗牛接受刺激的电压及反应时间的试验条件如下：电压10、20、30、40、50（V），且时间分别为30、60、90、120、150秒。由下表1得知，仅仅增加萃取时间，对于黏液的萃取率增加的帮助相当有限。而另一方面，电刺激的电压大小不会影响萃取时间。此外，当萃取时间高达90秒以上时，只能够萃取到微量的黏液，且无法计算其分泌量。
参照表1，其是蜗牛萃取时间和电压大小对黏液萃取率（%）的影响。蜗牛于不同持续刺激时间的条件下施予五种不同大小的电刺激，其中电刺激的方式是以带有电极的金属探针直接接触蜗牛的腹足，而电刺激的电压分别为10、20、30、40、50伏特（V）。
以所述各种电压电刺激蜗牛30秒后，其萃取率由电压小至大依序分别为0.07、0.09、0.12、0.11、0.06mL/g。其中，以电压30伏特（V）的条件电刺激蜗牛有稍微较高的黏液产值。
以所述各种电压电刺激蜗牛60秒后，蜗牛仍有分泌黏液的能力，其黏液的萃取率由电压小至大依序分别为0.13、0.11、0.17、0.13、0.10mL/g，因此可得知蜗牛在此条件下仍能够继续维持黏液的分泌。
以所述各种电压电刺激蜗牛90秒后，其黏液萃取率较电刺激时间30秒及60秒还来得高，其黏液的萃取率由电压小至大依序分别为0.21、0.13、0.21、0.17、0.15mL/g，且在实验结束后，观察数天，蜗牛皆具有良好的爬行情形和回复饮食能力。
表1、蜗牛萃取时间和电压大小对黏液萃取率(%)的影响
经实验结果得到持续刺激90秒的萃取条件为最佳，最后完成萃取时纪录观察各蜗牛的情形，隔一天也观察蜗牛的状况是否有异常，发现在10伏特（V）持续刺激90秒的条件下有快速回复行动的能力，经过一个晚上就能达到正常爬行及饮食的状态；而20伏特（V）和30伏特（V）持续刺激90秒的情形则在饲养时发现大部分蜗牛也有正常的饮食，但剩余蜗牛需花至少两天才得以恢复情形，之后观察数日所有蜗牛皆无死亡的现象；而40伏特（V）与50伏特（V）且持续刺激90秒的条件就有明显缓于10～30伏特（V）持续刺激90秒恢复正常情况。40伏特（V）与50伏特（V）情况相似，几乎全数受刺激的蜗牛于4天至一个星期内恢复正常，只有少数蜗牛会有休眠情形，因此不采纳20伏特（V）至50伏特（V）的萃取条件。本试验例的蜗牛在10伏特（V）且持续90秒的萃取条件下能不受刺激影响而增加蜗牛黏液分泌效率。
2.蜗牛黏液对人类纤维母细胞（CCD-966SK）迁移（创伤修复）的分析
蜗牛黏液中含有尿囊素，胶原蛋白，弹力蛋白，乙醇酸及维生素A，D，E。尿囊素为一种高价值的药剂，并且可用于角质细胞及纤维母细胞的增殖。而乙醇酸为天然的去角质剂，去除皮肤角质。
将纤维母细胞以每一孔1×104的细胞密度接种于24孔盘，接着将细胞培养成单层细胞，以微量吸管的吸管头轻刮24孔盘表面刮伤单层细胞，接着以培养基清洗以去除细胞碎片，再将蜗牛黏液添加入24孔盘中。刮伤后培养12及24小时后以倒立式显微镜拍照并记录。
单层细胞刮伤区域的生成不仅依赖细胞的迁移，还包括细胞增生以填补组织缺损的部位，此过程对于受损细胞相当重要。参照图1，其是蜗牛黏液对于人类纤维母细胞的迁移（创伤修复）分析实验照片。与对照组相比，蜗牛黏液快速修复划伤区域，培养12小时后可明显看出添加蜗牛黏液相较于对照组，细胞明显迁移至刮伤表面。在24小时后，对照组受刮伤的区域尚未填平，而添加蜗牛黏液以有填平趋势，亦即证明利用本发明的方法所萃取的蜗牛黏液具有帮助细胞创伤后修复的能力。
由上述本发明实施方式可知，应用本发明具有下列优点：
经本发明萃取后的黏液，其中含有尿囊素，乙醇酸，多糖类及蛋白质。先前已有诸多研究指出尿囊素是一种强力抗氧化剂和活性氧(Reactive Oxygen Species；ROS)的清道夫，并且具有细胞增生的效果。而在乙醇酸方面(glycolic acid,GA)，可广泛地应用于化妆品及去除皮肤表层的试剂中。
虽然本发明已以实施方式揭露如上，然而其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修改与改变，因此本发明的保护范围以所附权利要求书所界定为准。
Claims (13)
1.一种促进蜗牛黏液分泌的方法，包括：
提供活体蜗牛；
在一预设时间内以具有预设电压的金属装置接触该活体蜗牛的腹足。
2.根据权利要求1的促进蜗牛黏液分泌的方法，其中该预设时间为5秒至150秒。
3.根据权利要求1的促进蜗牛黏液分泌的方法，其中该预设时间为30秒至120秒。
4.根据权利要求1的促进蜗牛黏液分泌的方法，其中该预设时间为90秒。
5.根据权利要求1的促进蜗牛黏液分泌的方法，其中该预设电压为0.5伏特至50伏特。
6.根据权利要求1的促进蜗牛黏液分泌的方法，其中该预设电压为2伏特至30伏特。
7.根据权利要求1的促进蜗牛黏液分泌的方法，其中该预设电压为10伏特。
8.一种蜗牛黏液萃取方法，包括：
提供活体蜗牛，该蜗牛具有黏液；
在一预设时间内以具有预设电压的金属装置接触该活体蜗牛的腹足以增加该黏液的分泌量；以及
提取该活体蜗牛的该黏液。
9.根据权利要求8的蜗牛黏液萃取方法，其中该预设时间为30秒至120秒。
10.根据权利要求8的蜗牛黏液萃取方法，其中该预设时间为90秒。
11.根据权利要求8的蜗牛黏液萃取方法，其中该预设电压为2伏特至30伏特。
12.根据权利要求8的蜗牛黏液萃取方法，其中该预设电压为10伏特。
13.根据权利要求8的蜗牛黏液萃取方法，更包括：
均质该黏液，以平均该黏液的黏度；
离心该黏液，以沉降该黏液的杂质；以及
过滤该黏液，以滤除该黏液中的该杂质。
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