TW201431566A - 促進蝸牛黏液分泌之方法及其萃取方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種促進蝸牛黏液分泌之方法及其黏液的萃取方法，包含提供一活體蝸牛，並在一預設時間內以具有一預設電壓之金屬探棒接觸該活體蝸牛之腹足。

Description

促進蝸牛黏液分泌之方法及其萃取方法

本發明是有關於一種促進腹足綱的陸生生物體黏液分泌之方法及其萃取方法，且特別是有關於一種促進蝸牛黏液分泌之方法及其萃取方法。

皮膚老化的過程是自然生物的演化。然而，環境的影響及基因的改變可能加速此過程。舉例來說，暴露UV光增加氧化傷害稱為光老化。經由臨床證明，暴露在陽光下，光老化影響皺紋，乾燥，毛細孔擴張，粗糙，並且失去皮膚的延展性及皮膚的色素改變。不只如此，還會影響生成皮膚的良性或是惡性的腫瘤。皮膚老化也會伴隨一些病理的機制，像是ROS的促進生成，皮膚再生的能力，細胞遷移的減少，貼附及存活率。

最近幾年有關天然物質的研究增加可改進及刺激皮膚的再生。在這方面，有些蝸牛的分泌物對於燙傷皮膚及開放性的傷口具有再生的能力，特別是軟體動物被證明具有抗氧化活性並使急性放射性皮炎引起的損傷修復。

然而，天然之蝸牛黏液分泌量非常稀少，造成市場上添加蝸牛黏液相關的產品價格居高不下。因此，如何增加蝸牛黏液之分泌量長久以來一直是亟需解決之一重要課題。蝸牛天生較為脆弱，無法以較為劇烈的方式促進其黏液之分泌，因而增加蝸牛黏液萃取之困難度。US Pat.No.5538740揭露以離心之方式針對活體蝸牛進行離心條件為 2×g相對離心場(relative centrifugal field；RCF)，10分鐘之離心步驟，以增加其黏液之分泌量。雖然2×g的RCF對於蝸牛而言是相對輕微的物理性刺激，然其萃取時間需達10分鐘，而難以排除此條件對於蝸牛是否會有副作用，更甚致死亡。

有鑑於此，本發明提供輕微物理性刺激，且刺激時間短的一種促進蝸牛黏液分泌之方法；其係以預設電壓刺激、促進活體蝸牛黏液之分泌，且電刺激後之蝸牛仍為活體蝸牛。換句話說，利用本發明所提供之方法萃取蝸牛黏液不會造成蝸牛死亡。

本發明方法之一態樣提供一種促進蝸牛黏液分泌之方法，包含提供一活體蝸牛，並在一預設時間內以具有一預設電壓之金屬探棒接觸該蝸牛之腹足。

根據本發明方法態樣之一實施方式，前述促進蝸牛黏液分泌之方法，其中預設時間可為5秒至150秒。

根據本發明方法態樣之一實施方式，前述促進蝸牛黏液分泌之方法，其中預設電壓可為0.5伏特至50伏特。

本發明方法之另一態樣提供一種蝸牛黏液萃取方法，包含提供一活體蝸牛，且蝸牛具有一黏液。在一預設時間內以具有一預設電壓之金屬探棒接觸該蝸牛之腹足以增加該黏液之分泌量。接者，提取蝸牛之黏液。

根據本發明方法態樣之一實施方式，前述蝸牛黏液萃取方法，其中預設時間可為30秒至120秒。

根據本發明方法態樣之另一實施方式，前述蝸牛黏液萃取方法，其中預設電壓可為2伏特至30伏特。

根據本發明方法態樣之另一實施方式，前述蝸牛黏液萃取方法更可包含均質前述之黏液，以平均黏液之黏度，並離心黏液，以沉降黏液當中之雜質，以及過濾黏液，以濾除黏液之雜質。

藉此，本發明以不致造成蝸牛死亡，且不傷害蝸牛之方式促進其黏液之分泌，並藉以萃取蝸牛之黏液，並可將其廣泛應用於促進傷口之癒合以及皮膚之改質。

本發明提供一種促進蝸牛黏液分泌之方法，包含提供一活體蝸牛，並在一預設時間內以具有一預設電壓之金屬探棒接觸活體蝸牛之腹足。前述促進蝸牛黏液分泌之方法，其中預設時間可為5秒至150秒，而預設電壓可為0.5伏特至50伏特。

此外，本發明另提供一種蝸牛黏液萃取方法，包含提供一具有一黏液之活體蝸牛。在一預設時間內以具有一預設電壓之金屬探棒接觸該活體蝸牛之腹足以增加該黏液之分泌量。接著，提取活體蝸牛之黏液。再者，更可以均質前述之黏液，以平均黏液之黏度，並離心黏液，以沉降黏液當中之雜質，以及過濾黏液，以濾除黏液之雜質。前述蝸牛黏液萃取方法，其中預設時間可為30秒至120秒，而預設電壓可為2伏特至30伏特。

茲以下列試驗例詳細說明本發明，然本發明不侷限於下列試驗例揭示之內容。

試驗例I

1.電壓萃取黏液流程

將蝸牛從培養箱取出後，初步噴濕以排除不健康的蝸牛，並將篩選出的健康蝸牛以水淋洗，並將其置入適當的容器去除多餘的水分，等待水分蒸散(約3個小時)，再依需求之黏液量秤取適量的蝸牛；蝸牛與其所分泌之黏液比例約10%。開始萃取時注意器材及手部須進行消毒，並確認所欲施以電刺激的電壓值，並須留意碰觸到電極(金屬探棒)的危險。利用具有電極的金屬探棒接觸蝸牛腹足，讓蝸牛接受電壓的刺激使其分泌蝸牛黏液，平均一隻萃取的時間約6 min，另外所有盛裝黏液之容器外圍也必須放置冰塊，以維持低溫環境，並於黏液收集完畢之後迅速將其放入-20℃冰箱保存。

2.萃取之黏液處理流程

處理蝸牛液的步驟分別為：初步處理：均質、離心(兩階段)、過濾、純化，冰凍保存；其中純化步驟主要係利用膠體過濾法。

均質步驟

此步驟之目的是在將較黏稠的黏液攪拌均勻，使其濃度達到一個平均值。首先將欲處理之黏液自保存之-20℃冰箱取出並退冰，並放置冰浴。由於實驗過程中都處於室溫的環境中，因此必須隨時留意溫度的變化與冰塊的融化速率。此步驟所花費的較佳時間約為每500 mL之黏液均質約20 min，而使用更多的黏液去均質的處理時間不一定等比例放大，可能要更長的時間才會有效果。

離心步驟

此步驟之目的是在於去除蝸牛黏液中的雜質，將蝸牛黏液中不溶物質及微小的顆粒沉降，另外有沉降係數極低的懸浮於液體表面物質也有分離的效果。於離心前設定離心之條件，本試驗例之條件為：離心時間35 min及離心轉速約9000 rpm。此外，由於離心時可能會產生離心熱，使得離心機內之環境溫度上升，造成黏液之破壞，因此離心溫度預設為-4~5℃。

離心管的處理係先清洗過後，用逆滲透過濾(RO)水潤洗，再使用滅菌釜高溫高壓滅菌。離心管的材質為聚丙烯(Polypropylene；PP)，其可於121℃、20 min之條件下以滅菌釜高溫高壓滅菌。離心管容量的限制為盛裝之液體約20mL，並針對其盛裝液體之總重量進行對稱平衡，使得離心管於離心時不因重量不一導致旋轉時傾斜於一方，而損壞離心機之軸心。

過濾步驟

此步驟係使用抽氣過濾與膠體過濾法，在真空系統中輔助濾液通過濾紙過濾，其係用以濾除在離心過程中無法排除之肉眼無法辨識的顆粒或懸浮係數中等的不溶物質與粘稠的液體等。先用孔徑較大的棉纖維濾紙(濾紙規格為：直徑90mm，孔徑理論大小7 μm)將較粗的顆粒過濾掉，再以孔徑較小的聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride；PVDF)濾膜(濾膜規格為：直徑47mm，孔徑大小0.45 μm與0.22 μm)進行更進一步的過濾。藉此，避免在孔徑更細微的膠體過濾中造成管柱之堵塞。進行膠體過濾環境為4℃的冷房；其中，分離蛋白質所使用的膠球，係以多醣類為主體；例如：本實驗採用的葡聚醣凝膠(Sephadex^TM)，而其使用洋菜糖為主要的高級材料。在此不選擇使用一般常見的樹脂類(resin)，係因為樹脂類膠球對蛋白質的吸附力很大，經常會使得蛋白質變性失活，而只能用在小分子樣本。緩衝溶液係使用酸鹼值為pH 7的磷酸緩衝溶液。配置完成的緩衝溶液亦需以濾膜過濾，並利用超音波震盪去氣(degas)。管柱裝填方式為先預估膠體體積之後，清洗膠體，並於清洗結束後使膠體靜置達到溫度平衡，再進入填充管柱的步驟。注意膠體裝填時，要一次不中斷地倒完膠體。其次，裝填後步驟分為靜平衡與動平衡。靜平衡：待膠體自然沉澱約30 min；動平衡：膠柱裝填完成後要充分流洗，並以流速30 mL/h加壓流洗讓膠體更加緊密。此步驟中須留意勿使膠體乾掉，並留意分劃收集器(fraction collector)是否正常運作。此外，整個管柱系統的溫度不可驟變，尤其不可升溫，否則會產生氣泡。於進行分離(fractionation)時，磷酸緩衝液的流速為1 mL/min。經由這些步驟可使膠體具有使不同分子量大小的微粒達到分離效果，最後收集乾淨的黏液即可放置冷凍保存。

試驗例II

1.不同電壓與時間之影響(黏液萃取率)

設定不同電壓以及不同持續時間刺激下，觀察蝸牛分泌黏液之情形。蝸牛在黏液萃取過程中，不會因為蝸牛受到刺激而造成其生理劇變而死亡。為排除個體差異之疑慮，本試驗經交叉重複批次實驗。

蝸牛接受刺激之電壓及反應時間的試驗條件如下：電壓10、20、30、40、50(V)，且時間分別為30、60、90、120、150秒。由下列表1得知，僅僅增加萃取之時間，對於黏液的萃取率之增加，幫助相當有限。而另一方面，電刺激的電壓大小不會影響萃取時間。此外，當萃取時間高達90秒以上時，只能夠萃取到微量的黏液，且無法計算其分泌量。

請參照表1，其係蝸牛萃取時間和電壓大小對黏液萃取率(%)的影響。蝸牛於不同持續刺激時間的條件下施予五種不同大小之電刺激，其中電刺激之方式係以帶有電極的金屬探針直接接觸蝸牛的腹足，而電刺激之電壓分別為10、20、30、40、50伏特(V)。

以前述各種電壓電刺激蝸牛30秒後，其萃取率由電壓 小至大依序分別為0.07、0.09、0.12、0.11、0.06 mL/g。其中，以電壓30伏特(V)之條件電刺激蝸牛有稍微較高的黏液產值。

以前述各種電壓電刺激蝸牛60秒後，蝸牛仍有分泌黏液之能力，其黏液的萃取率由電壓小至大依序分別為0.13、0.11、0.17、0.13、0.10 mL/g，因此可得知蝸牛在此條件下仍能夠繼續維持黏液之分泌。

以前述各種電壓電刺激蝸牛90秒後，其黏液萃取率較電刺激時間30秒及60秒還來得高，其黏液的萃取率由電壓小至大依序分別為0.21、0.13、0.21、0.17、0.15 mL/g，且在實驗結束後，觀察數天，蝸牛皆具有良好的爬行情形和回復飲食能力。

經實驗結果得到持續刺激90秒的萃取條件為最佳，最後完成萃取時紀錄觀察各蝸牛的情形，隔一天也觀察蝸牛的狀況是否有異常，發現在10伏特(V)持續刺激90秒的條件下有快速回復行動的能力，經過一個晚上就能達到正常爬行及飲食的狀態；而20伏特(V)和30伏特(V) 持續刺激90秒的情形則在飼養時發現大部分蝸牛也有正常的飲食，但剩餘蝸牛需花至少兩天才得以恢復情形，之後觀察數日所有蝸牛皆無死亡的現象；而40伏特(V)與50伏特(V)且持續刺激90秒的條件就有明顯緩於10~30伏特(V)持續刺激90秒恢復正常情況。40伏特(V)與50伏特(V)情況相似，幾乎全數受刺激之蝸牛於4天至一個星期內恢復正常，只有少數蝸牛會有休眠情形，因此不採納20伏特(V)至50伏特(V)的萃取條件。本試驗例之蝸牛在10伏特(V)且持續90秒的萃取條件下能不受刺激影響而增加蝸牛黏液分泌效率。

2.蝸牛黏液對人類纖維母細胞(CCD-966SK)遷移(創傷修復)之分析

蝸牛黏液中含有尿囊素，膠原蛋白，彈力蛋白，乙醇酸及維他命A，D，E。尿囊素為一種高價值的藥劑，並且可用於角質細胞及纖維母細胞的增殖。而乙醇酸為天然的去角質劑，去除皮膚角質。

將纖維母細胞以每一孔洞1×10⁴的細胞密度接種於24孔盤，接著將細胞培養成單層細胞，以微量吸管(pipette)之吸管頭(tip)輕刮24孔盤表面刮傷單層細胞，接著以培養基清洗以去除細胞碎片，再將蝸牛黏液添加入24孔盤中。刮傷後培養12及24小時之後以倒立式顯微鏡拍照並記錄。

單層細胞刮傷區域的生成不僅依賴細胞的遷移，還包括細胞增生以填補組織缺損的部位，此過程對於受損細胞相當重要。請參照第1圖，其係蝸牛黏液對於人類纖維母 細胞的遷移(創傷修復)分析實驗照片。與對照組相比，蝸牛黏液快速修復劃傷區域，培養第12小時之後可明顯看出添加蝸牛黏液相較於對照組，細胞明顯遷移至刮傷表面。在第24小時之後，對照組受刮傷之區域尚未填平，而添加蝸牛黏液以有填平趨勢，亦即證明利用本發明之方法所萃取之蝸牛黏液具有幫助細胞創傷後修復之能力。

由上述本發明實施方式可知，應用本發明具有下列優點：

經本發明萃取後之黏液，其中含有尿囊素，乙醇酸，多醣類及蛋白質。先前已有諸多研究指出尿囊素是一種強力抗氧化劑和活性氧(Reactive Oxygen Species；ROS)的清道夫，並且具有細胞增生的效果。而在乙醇酸方面(glycolic acid,GA)，可廣泛地應用於化妝品及去除皮膚表層的試劑中。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖係蝸牛黏液對於人類纖維母細胞的遷移(創傷修復)分析實驗照片。

Claims (13)

1. 一種促進蝸牛黏液分泌之方法，包含：提供一活體蝸牛；在一預設時間內以具有一預設電壓之金屬探棒接觸該活體蝸牛之腹足。
2. 如請求項1之促進蝸牛黏液分泌之方法，其中該預設時間為5秒至150秒。
3. 如請求項1之促進蝸牛黏液分泌之方法，其中該預設時間為30秒至120秒。
4. 如請求項1之促進蝸牛黏液分泌之方法，其中該預設時間為90秒。
5. 如請求項1之促進蝸牛黏液分泌之方法，其中該預設電壓為0.5伏特至50伏特。
6. 如請求項1之促進蝸牛黏液分泌之方法，其中該預設電壓為2伏特至30伏特。
7. 如請求項1之促進蝸牛黏液分泌之方法，其中該預設電壓為10伏特。
8. 一種蝸牛黏液萃取方法，包含：提供一活體蝸牛，該蝸牛具有一黏液；在一預設時間內以具有一預設電壓之金屬探棒接觸該活體蝸牛之腹足以增加該黏液之分泌量；以及提取該活體蝸牛之該黏液。
9. 如請求項8之蝸牛黏液萃取方法，其中該預設時間為30秒至120秒。
10. 如請求項8之蝸牛黏液萃取方法，其中該預設時間為90秒。
11. 如請求項8之蝸牛黏液萃取方法，其中該預設電壓為2伏特至30伏特。
12. 如請求項8之蝸牛黏液萃取方法，其中該預設電壓為10伏特。
13. 如請求項8之蝸牛黏液萃取方法，更包含：均質該黏液，以平均該黏液之黏度；離心該黏液，以沉降該黏液之雜質；以及過濾該黏液，以濾除該黏液中之該雜質。