CN104560931B - 一种蜗牛酶的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于蜗牛酶的提取领域，具体涉及一种蜗牛酶的提取方法，包括选取健康蜗牛、用提取装置对上述蜗牛进行具有活性酶的蜗牛粘液收集、对提取过蜗牛粘液的蜗牛进行蜗牛壳与蜗牛肉分开等，本发明的优点是提取活体蜗牛粘液含有高有效成分。为蜗牛粘液提取物奠定质量的基础。是蜗牛粘液提取物质量的保证，所以蜗牛粘液的提取至关重要。

Description

一种蜗牛酶的提取方法

技术领域

本发明是一种生物的提取技术，尤其涉及一种蜗牛酶的提取方法：它是一种从蜗牛嗦囊及消化道中提取的蜗牛酶的生物提取过程。

背景技术

在现有技术中，蜗牛酶的提取主要活体蜗牛在刺激下自身分泌出来的蜗牛粘液和蜗牛的内脏为原料，蜗牛粘液成分包括蛋白质，蜗牛酶，黏液素，硫酸软骨素蛋白多糖，羟基乙酸等；蜗牛的嗦囊及消化道中含有20多种酶，蜗牛酶是多种混合酶；其中有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等；价值高，广泛应用在细胞学，基因工程学领域，在医学上，饲料的添加剂，保健品都有应用。

目前国内并有没有完成有效的提取蜗牛酶的提取技术，一方面蜗牛粘液的提取非常困难，不能对蜗牛内脏进行有效的分离，在提取的过程中，蜗牛酶损害严重，而且蜗牛酶的保存困难，影响保管运输。

发明内容

本发明提供了一种蜗牛酶的提取方法，提取过程中充分提取蜗牛粘液，有效对蜗牛内脏进行有效的分离，降低减少蜗牛酶的活性。本发明的目的在于提供一种操作性强，提取度高并且能够保证蜗牛酶的成分提取方法。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案是：

一种蜗牛酶的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选取体重30-40克，月龄3个半月及4个月的健康蜗牛；

2)利用提取装置对上述蜗牛进行具有活性酶的蜗牛粘液收集；

3)对2)中提取过蜗牛粘液的蜗牛进行蜗牛壳与蜗牛肉分开，在蜗牛肉中提取内脏，在内脏中提取含有蜗牛酶的棕色液体；

4)对上述2)与3)收集的含有活性酶的蜗牛粘液与棕色液体进行细胞的破碎水解；

5)对上述4)中水解过的含有蜗牛酶的水解物进行蜗牛酶提取，并经脱色，静置，分层后，取出上清液；

6)对上述5)提取的上清液进行三次过滤，过滤液为蜗牛酶提取液；

7)对上述过滤后的提取液进行结晶，获得蜗牛酶制剂；

8)对上述蜗牛酶制剂进行包装、入库。

优先地,用于所述步骤2)所述设备包括旋转振动桶2、喷水器1和集液桶3；所述旋转桶上设置有喷水器1，所述旋转振动桶2外设置所述集液桶3，所述旋转桶内可以放置蜗牛；所述旋转振动桶2上均有分布有液体导出孔6，原液和水的混合液通过所述液体导出孔6流入所述集液桶3；所述集液桶3上设置有液体收集孔5；所述旋转振动桶2下端设置有旋转振动轴，所述旋转振动轴通过转动带7连接第一电机88，并由所述转动带7带动而转动；所述旋转振动轴还连接第二电机999，所述第二电机999使所述旋转振动轴产生振动；第一电机88与第二电机999分别为横向电机与纵向电机；所述电机的功率为1.5KW。

优先地，所述2)收集的蜗牛粘液在4℃恒温下保存待用。

优先地，所述步骤3)提取内脏中的棕红色液体，采用下列两种方法之一：

第一种方法将蜗牛壳打破，将蜗牛肉和内脏分开，从蜗牛内脏里抽出嗦囊及消化道中的棕红色液体；

第二种方法将水煮沸腾把蜗牛迅速放入，在沸水中放入3-5分钟将蜗牛捞出放入冷水中，将蜗牛壳去掉，同时将蜗牛肉与内脏分开，内脏中找到棕红色液体。

优先地，所述步骤4)中进行水解采用的方法为高速离心泵，所述高速离心泵转数在8000rpm-12000rpm；水解工作环境为-4℃；水解时间为10分钟。

优先地，所述步骤5)中进行利用有机溶液正丁醇提取蜗牛酶，所述正丁醇的量为水解溶液的3-5倍，加入苯甲基磺酰氟与基乙醇用于提高酶的稳定性与防止氧化。

优先地，所述步骤5)脱色是利用活性炭脱色，活性炭的用量在0.1％。

优先地，所述的三次过滤分别为第一次粗滤截留大于直径2um颗粒，第二次微滤直径为0.2-2um的颗粒，第三次超滤截留直接20A-0.2um的颗粒。

优先地，所述的结晶方法获取蜗牛酶制剂采用下述两种方法之一，第一种采用中性盐硫酸铵，慢慢增加盐浓度至浑浊为止，然后静置进行结晶；第二种方法是对含酶溶液杀菌后直接采用冷冻干燥或喷雾干燥的方式结晶。

优先地，所述步骤7)的结晶条件为酶的纯度为50％以上，酶蛋白的溶度3-50mg/ml，温度在0-4℃，PH值在4.5-6.5之间。

说明书附图

图1为发明涉及一种蜗牛酶提取方法的流程图；

图2为发明的蜗牛粘液收集器,包括1-喷水器、2-旋转振动桶、3-集液桶、4-转动轴、5-液体收集孔、6-液体导出孔、7-转动带、8-第一电机与9-第二电机。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

本发明涉及一种蜗牛酶的提取方法，蜗牛酶的原料是以蜗牛，首先对蜗牛进行挑选，选择活体健康生长的白玉蜗牛所述白玉蜗牛为30-50克的重量，所述蜗牛生长周期在3个半月到4个月龄。

对选取的蜗牛净养，将选好的蜗牛放在净养池中净养3天，每天两次用清水冲洗净养池，使其排除体内的粪便，清除体外的泥土。

对上述净养处理过的蜗牛进行含有蜗牛酶及有效成分的粘液的收集，采用蜗牛粘液收集器，如图2所示，为本发明的蜗牛粘液收集器，是一种具有旋转滚动装置的容器，包括喷水器1、旋转振动桶2、集液桶3、转动轴4、液体收集孔5、液体导出孔6、转动带7、第一电机8与第二电机9，所述第一电机8是横向电机，所述第二电机9是竖向电机。所述旋转振动桶2上设置有喷水器1，所述旋转振动桶2外设置所述集液桶3，所述旋转振动桶2内可以放置蜗牛，所述旋转振动桶2上均有分布有液体导出孔6，原液和水的混合液通过所述液体导出孔6流入所述集液桶3，所述集液桶3上设置有液体收集孔5，所述旋转振动桶2下端设置有旋转转动轴4，所述旋转振动轴通过转动带7连接第一电机8，并由所述转动带7带动而转动，所述旋转振动轴还连接第二电机9，所述第二电机9使所述旋转振动轴产生振动，第一电机8与第二电机9分别为横向电机与纵向电机，第一电机8与第二电机9(功率为1.5KW)带动旋转振动桶2在旋转的同时还使旋转振动桶2产生振动，所述旋转振动桶2上均匀分布有液体导出孔6，上面还设置有喷水器1，用于加水稀释原液；所述旋转振动桶2外还设置有集液桶3，集液桶3底部设置有液体收集孔5，可排出粘液和水。蜗牛在刺激情况下分泌出含有蜗牛酶以及蛋白质，蛋白含量在80％以上，其余是微量元素。蜗牛在刺激情况下分泌出含有蜗牛酶以及蛋白质。

所述收集器的旋转振动桶2在通电后产生振动和滚动使蜗牛受到刺激，蜗牛受到刺激会分泌出粘液，粘液在少量水的的稀释下，通过液体导出孔6排出流入收集器。将收集到蜗牛分泌粘液暂存在4℃恒温环境，因蜗牛粘液的主要成份是蛋白质、凝胶等，在常温下4小时内会腐败，因此必须低温保存。

上述刺激后的蜗牛取出，将其蜗牛壳除掉取出内脏在嗦囊及消化道中收集含有蜗牛酶的的棕色液体，有两种方法：

(1)一种是将蜗牛壳打破。将蜗牛肉与内脏分开，从蜗牛内脏里抽出嗦囊及消化道中的棕色液体。

(2)第二种方法：将水煮沸腾把蜗牛迅速放入，在沸水中3-5分钟将蜗牛捞出放入冷水中；然后将蜗牛壳去掉，去壳的同时可把蜗牛肉，内脏分离并可保留完整的蜗牛壳；然后从蜗牛的内脏中找到消化道，从嗉囊和胃里抽取棕红色液体，一只生长蜗牛可抽取1.0-2.0毫升棕色液体，棕色液体是蜗牛体内含酶量最多的成分。

将上述提取含有蜗牛酶的棕色粘液与上述收集并低温保存的蜗牛分泌粘液进行细胞的破碎水解，工作环境在-4℃(采用低温是为了防止在工作中产生热量破坏蛋白质)，用高速冷冻泵离心水解10分钟，根据量的大小确定离心泵的转速，一般控制在8000rpm-12000rpm。

对上述水解的粘液进行蜗牛酶的提取，蜗牛酶是复合酶，多种不同的酶。我们用有机溶液正丁醇来提取，温度控制在10℃以下，提取液的体积是上述水解粘液的3-5倍，在提取操作时加入PMSF(苯甲基磺酰氟)改变提高酶的稳定性，防止蛋白酶的降解作用，加入基乙醇防止氧化。然后进行脱色，用活性炭吸附色素来脱色。一般活性炭的用量在0.1％。

脱色过含有蜗牛酶的粘液进行分离纯化，首先对上述粘液进行静止放置使得完全分层，取出上清液，所需的蜗牛酶分布在上清液中，将上清液提取出来，然后利用细菌漏斗粗滤截留大于直径2um颗粒，然后微滤直径为0.2-2um的颗粒，第三次超滤截留直接20A-0.2um的颗粒。

对上述三次过滤的含有蜗牛酶的上清液进行结晶，溶质以结晶体从溶液中析出的过程。是酶纯净的标志，只有同类分子才能形成晶体。也是酶与杂蛋白分离的方法，结晶的条件：

1)酶的纯度50％以上。

2)酶蛋白的浓度3-50mg/ml。

3)温度在0-4℃。

4)PH值在酶的稳定范围内(4.5-6.5)。

在结晶过程，有两种方法，第一种采用中性盐硫酸铵，慢慢增加盐浓度至浑浊为止，然后静置进行结晶。此结晶为纯蜗牛酶制剂。

第二种方法是对含酶溶液杀菌后直接采用冷冻干燥或喷雾干燥的方式结晶而成的蜗牛酶为蜗牛固体酶制剂。

对上述结晶获得蜗牛酶制剂分装，真空密封，在4℃下保存，然后用于生化试剂与医疗药物。白玉蜗牛1毫克的消化液可提取120-150毫克的蜗牛酶。

本发明的优点效果在于通过上述工艺技术方案：能够有效提取蜗牛酶，减少降低蜗牛酶的活性，有效的保存结晶蜗牛酶试剂，便于运输。

Claims (6)

1.一种蜗牛酶的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）选取体重30-40克，月龄3个半月及4个月的健康蜗牛；

2）利用提取装置对上述蜗牛进行具有活性酶的蜗牛粘液收集；

3）对2）中提取过蜗牛粘液的蜗牛进行蜗牛壳与蜗牛肉分开，在蜗牛肉中提取内脏，在内脏中提取含有蜗牛酶的棕色液体；

4）对上述2）与3）收集的含有活性酶的蜗牛粘液与棕色液体进行细胞的破碎水解；

5）对上述4）中水解过的含有蜗牛酶的水解物进行蜗牛酶提取，并经脱色，静置，分层后，取出上清液；

6）对上述5）提取的上清液进行三次过滤，过滤液为蜗牛酶提取液；

7）对上述过滤后的提取液进行结晶，获得蜗牛酶制剂；

8）对上述蜗牛酶制剂进行包装、入库；

用于所述步骤2）所述提取装置包括旋转振动桶、喷水器和集液桶；所述旋转振动桶上设置有喷水器，所述旋转振动桶外设置所述集液桶，所述旋转振动桶内可以放置蜗牛;所述旋转振动桶上均有分布有液体导出孔，原液和水的混合液通过所述液体导出孔流入所述集液桶;所述集液桶上设置有液体收集孔;所述旋转振动桶下端设置有旋转振动轴，所述旋转振动轴通过转动带连接第一电机，并由所述转动带带动而转动;所述旋转振动轴还连接第二电机，所述第二电机使所述旋转振动轴产生振动;第一电机与第二电机分别为横向电机与纵向电机;所述电机的功率为1.5KW；

所述步骤3）提取内脏中的棕色液体，采用下列两种方法之一：

第一种方法将蜗牛壳打破，将蜗牛肉和内脏分开，从蜗牛内脏里抽出嗦囊及消化道中的棕色液体；

第二种方法将水煮沸腾把蜗牛迅速放入，在沸水中放入3-5分钟将蜗牛捞出放入冷水中，将蜗牛壳去掉，同时将蜗牛肉与内脏分开，内脏中找到棕色液体；

所述步骤4）中进行水解采用的方法为高速离心泵，所述高速离心泵转数在8000rpm-12000rpm；水解工作环境为-4℃；水解时间为10分钟；

所述步骤5）中进行利用有机溶液正丁醇提取蜗牛酶，所述正丁醇的量为水解溶液的3-5倍，加入苯甲基磺酰氟与基乙醇用于提高酶的稳定性与防止氧化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2）收集的蜗牛粘液在4℃恒温下保存待用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）脱色是利用活性炭脱色，活性炭的用量在0.1％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的三次过滤分别为第一次粗滤截留大于直径2 μ m 颗粒，第二次微滤直径为0.2-2μ m 的颗粒，第三次超滤截留直接20A-0.2μ m的颗粒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的结晶方法获取蜗牛酶制剂采用下述两种方法之一，第一种采用中性盐硫酸铵，慢慢增加盐浓度至浑浊为止，然后静置进行结晶；第二种方法是对含酶溶液杀菌后直接采用冷冻干燥或喷雾干燥的方式结晶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤7）的结晶条件为酶的纯度为50％以上，酶蛋白的溶度3-50mg/ml，温度在0-4℃，PH值在4.5-6.5之间。