发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供盆底补片复合生物材料的制备方法,其制备方法简单,不使用化学交联剂。
为实现上述发明目的,技术方案为:
盆底补片复合生物材料的制备方法,将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料在压强至少为100MPa条件下处理至少5分钟,得盆底补片复合生物材料;
所述脱细胞基质凝胶是将脱细胞基质溶于醋酸溶液中,经灭酶、离心、超滤、透析所得。
本发明中的脱细胞基质是指异体组织经细胞灭活处理后,制备成无活体细胞存在的细胞外基质成分和结构,主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡糖糖、结构蛋白等。因其无抗原性,以及良好的生物相容性,成为组织工程支架材料的选择之一。本发明中使用的脱细胞基质凝胶是将脱细胞基质溶于醋酸溶液中制得,醋酸溶液可以为任意浓度,为了便于下一步操作,最优为溶解在质量分数为0.5%的醋酸溶液中。
本发明中脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料可以按任意比例混合,以脱细胞基质凝胶浸没聚丙烯材料为宜,优选为将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料按质量比为1-10:1混合,在压强至少为100-200MPa条件下处理5-15分钟。
优选的,所述脱细胞基质的制备方法具体为,将脱细胞基质按1g脱细胞基质加100mL质量分数为0.5%醋酸溶液;在温度为4℃条件下用NaOH将pH调至7-7.4灭活酶,然后在温度为4℃、转速为8000rpm条件下,离心15分钟,收集沉淀;再将收集的沉淀以10~12 mg/ mL溶解在质量分数为0.5%的醋酸中,用孔径为0 .45 μm 的滤膜过滤,然后在4℃条件下用浓度为0 .001 mol/ L 醋酸溶液透析2次,每次24小时,得脱细胞基质凝胶。
本发明中脱细胞基质可以按照现有技术中公开的制备方法制备,也可以按照本发明公开的方法制备,优选为,所述脱细胞基质的制备方法,具体步骤如下:取动物组织,清洗干净;剪成块,用水冲洗后进行消毒,然后进行脱脂,再浸入醋酸溶液中溶胀,最后进行匀浆,得匀浆液;将所得匀浆液用胃蛋白酶酶解;然后用氯化钠盐析,经离心后收集沉淀,得脱细胞基质。
更优选的,所述消毒是用质量分数为0.1%的新洁尔灭,消毒至少15分钟;
所述脱脂为将动物组织浸入脱脂液中,在温度为4℃,搅拌至少16小时;所述脱脂液是乙醇:异丙醇:水体积比为7:4:89的混合物;
所述溶胀是加入相当于动物组织1-10倍的醋酸溶液,在温度为4℃条件下,浸泡24小时;
所述酶解是加入相当于匀浆液体积10倍的醋酸溶液和相当于匀浆液重量1%的胃蛋白酶,在温度为4℃条件下,处理48小时;
所述盐析中氯化钠的终浓度为2mol/L,盐析时间为2小时。
更优选的,所述醋酸溶液是质量分数为0.5%的醋酸水溶液。
优选的,所述动物组织为猪去粘膜层膀胱或猪去皮下组织皮肤。
本发明目的之二在于提供由上述制备方法制得的盆底补片复合生物材料,其炎症反应小,组织相容性好。
为实现上述技术目的,技术方案为:
所述方法制备的盆底补片复合生物材料。
本发明有益效果在于:本发明公开了盆底补片复合生物材料的制备方法,其制备方法简单,采用物理方法,利用高压使脱细胞基质凝胶和聚丙烯材料牢固的交联在一起,不需要使用化学交联剂,因此无化学试剂残留,同时交联后能够结合脱细胞基质凝胶和聚丙烯的性质,使制得的盆底补片复合生物材即具有聚丙烯材料的力学性质,又与组织的相容性好,使用后无炎症反应;可以用于治疗盆腔脏器脱垂,治疗效果好,无副作用。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。
实施例1
盆底补片复合生物材料的制备方法,具体包括以下步骤:
A.制备脱细胞基质凝胶
取猪的新鲜膀胱,用自来水清洗干净,然后去表面粘膜层,得猪去粘膜层膀胱;
将所得猪去粘膜层膀胱用剪刀剪成小块,用纯水冲洗3遍,然后用消毒液浸泡15分钟进行消毒,其中消毒液为质量分数为0.1%新洁尔灭;
将消毒的膀胱组织浸入脱脂液中,置于温度为4℃条件下,磁力搅拌16小时进行脱脂,得脱脂膀胱组织;其中脱脂液为乙醇:异丙醇:水按7:4:89混合(体积比);
将所得脱脂膀胱组织用超纯水反复清洗5次,用相当于猪去粘膜层膀胱重量1倍的质量分数为0.5%醋酸溶液溶胀脱脂膀胱组织,在温度为4℃条件下,浸泡24小时,得溶胀膀胱组织;
将所得溶胀膀胱组织用匀浆机匀浆,得匀浆液;
将所得匀浆液加入相当于猪去粘膜层膀胱重量10倍的质量分数为0.5%的醋酸溶液和相当于猪去粘膜层膀胱重量1%的胃蛋白酶,在温度为4℃条件下,酶解48小时,得酶解液;
将所得酶解液过滤,收集滤液,向滤液中加入氯化钠至氯化钠终浓度为2mol/L,盐析2小时;将盐析液,在温度为4℃、转速为8000rpm条件下,离心15分钟,收集沉淀,得脱细胞基质;
最后将所得脱细胞基质按1g脱细胞基质加100mL质量分数为0.5%醋酸溶液;在温度为4℃条件下用NaOH将pH调至7.4灭活酶,然后在温度为4℃、转速为8000rpm条件下,离心15分钟,收集沉淀;再将收集的沉淀以10 mg/ mL 再溶解在0.5%的醋酸中,用孔径为0 .45 μm 的滤膜过滤,然后在4℃条件下用浓度为0 .001 mol/ L 醋酸溶液透析2次,每次24小时,最后得脱细胞基质凝胶。
B.制备复合生物材料
取聚丙烯材料和步骤A所得脱细胞基质凝胶按重量比为1:1加入铝箔袋内,排除空气进行密封;在压强为100 MPa条件下处理15分钟;处理的铝膜袋在超净台内,用无菌生理盐水洗脱3次,去除未交联的材料,干燥,得盆底补片复合生物材料;其中100 MPa 压强由HPP.L3-600/0.6 超高压设备提供(天津市华泰森淼生物工程技术有限公司)。
盆底补片复合生物材料体内植入评价
选取雌性大鼠20只,平均分成两组,分别将聚丙烯材料和制得的盆底补片复合生物材料分别植入大鼠阴道粘膜下层。植入后1、2、3、4周,观察小鼠阴道局部反应,并分别取材料和周围组织进行免疫组化染色,染色指标分别为,染色指标分别为免疫因子CD4、免疫因子CD8、趋化因子受体CCR4和CXC趋化因子受体3CXCR3,结果如表1所示。
表1. 免疫组化染色结果
结果表明,植入2周后,聚丙烯材料组未与植入周围组织融合,界限分明,有轻微炎症反应;植入4周后,聚丙烯材料组表现为局部有结痂出现;而盆底补片复合生物材料在植入4周后,表现为表面轻微淡黄,组织相容性好,与周围组织镶嵌长在一起。并且能够有效降低CD4,CD8等阳性率,并抑制Th1细胞的分化,从而降低CXCR3的阳性率;同时诱导Th2细胞分化,增加CCR4受体数量,促进植入后的复合材料走向移植接受或适应。
实施例2
盆底补片复合生物材料的制备方法,具体包括以下步骤:
A.制备脱细胞基质凝胶
取猪的新鲜皮肤,用自来水清洗干净,然后用剖层机去除皮下组织,得猪去皮下组织皮肤;
将所得猪去皮下组织皮肤用剪刀剪成小块,用纯水冲洗5遍,然后用消毒液浸泡20分钟进行消毒,其中消毒液为质量分数为0.1%新洁尔灭;
将所得消毒的猪皮肤组织浸入脱脂液中,置于温度为4℃条件下,磁力搅拌18小时进行脱脂,得脱脂猪皮肤组织;其中脱脂液为乙醇:异丙醇:水按为7:4:89(体积比)混合;
将所得脱脂猪皮肤组织用超纯水反复清洗3次,用相当于猪去皮下组织重量10倍的质量分数为0.5%醋酸溶液浸没脱脂猪皮肤组织,在温度为4℃条件下,浸泡30小时进行溶胀,得溶胀猪皮肤组织;将所得溶胀猪皮肤组织用匀浆机匀浆,得匀浆液;
将所得匀浆液加入相当于猪去皮下组织皮肤重量10倍的质量分数为0.5%的醋酸溶液和相当于猪去皮下组织皮肤重量1%的胃蛋白酶,在温度为4℃条件下,酶解48小时,得酶解液;
将所得酶解液过滤,收集滤液,向滤液中加入氯化钠至氯化钠终浓度为2mol/L,盐析2小时;然后在温度为4℃、转速为8000rpm条件下,离心15分钟,收集沉淀,得脱细胞基质;
最后将所得脱细胞基质按1g脱细胞基质加100mL质量分数为0.5%醋酸溶液;在4℃条件下用NaOH将pH调至7,然后在温度为4℃、转速为8000rpm条件下,离心15分钟,收集沉淀;再将收集的沉淀以12 mg/ mL 再溶解在0.5%的醋酸中,用孔径为0 .45 μm 的滤膜过滤,然后在4℃条件下用0 .001 mol/ L 醋酸溶液透析2次,每次24小时,最后得脱细胞基质凝胶。
B.制备复合生物材料
取聚丙烯材料和步骤A所得脱细胞基质凝胶按重量比为1:10加入铝箔袋内,排除空气进行密封;在压强为200 MPa条件下处理5分钟;将处理后的铝膜袋在超净台内,用无菌生理盐水洗脱3次,去除未交联的材料,干燥,得盆底补片复合生物材料;其中200 MPa 压强由HPP.L3-600/0.6 超高压设备提供(天津市华泰森淼生物工程技术有限公司)。
盆底补片复合生物材料体内植入评价
选取雌性大鼠20只,平均分成两组,分别将聚丙烯材料和制得的盆底补片复合生物材料分别植入大鼠阴道粘膜下层。植入后1、2、3、4周,观察小鼠阴道局部反应,并分别取材料和周围组织进行免疫组化染色,染色指标分别为免疫因子CD4、免疫因子CD8、趋化因子受体4 CCR4和CXC趋化因子受体3 CXCR3,结果如表2所示。
表2. 免疫组化染色结果
结果表明,植入2周后,使用聚丙烯材料的大鼠聚丙烯材料未与植入周围组织融合,植入4周后,使用聚丙烯材料的大鼠局部有结痂出现;而植入盆底补片复合生物材料在植入4周后,表面呈轻微淡黄,组织相容性好,与周围组织镶嵌长在一起。免疫染色结果表明,猪皮胶原与聚丙烯复合材料可有效降低CD4和CD8的阳性率,并抑制Th1细胞(CXCR3阳性)的分化,同时诱导Th2细胞(CCR4)分化,促进植入后的复合材料走向移植接受或适应。
本发明中除了可以用猪膀胱和猪的新鲜皮肤制备细胞外基质溶液,还可以用心包膜、小肠粘膜、胆囊等组织按照同样的方法制备。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。