CN114699565A - 生物补片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物补片及其制备方法，制备方法包括以下步骤：通过生物组织脱细胞处理获得生物组织的支架层；将水凝胶填充支架层的空隙；填充后的支架层使用交联剂进行交联抗钙化处理；本发明提供的生物补片，采用上述方法制得。本发明经脱细胞处理去除生物组织中含有的各种细胞和抗原成分，在降低免疫原性的同时保留细胞外基质成分和纤维框架，促进生物补片内源性组织再生；再经水凝胶填充压模处理，增强生物组织力学强度和弹性的同时也保证了生物组织厚度的均匀及表面的平整性；将填充水凝胶的生物组织采用新型交联剂进行交联抗钙化处理，得到无排异反应、力学性能优良，生物相容性好，并可诱导自身组织生长的生物补片。

Description

生物补片及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种生物补片及其制备方法。
背景技术
随着医疗技术的发展，越来越多的补片作为组织器官的修补材料被应用于各种外科手术中，使用补片的目的是为了对破损或薄弱的软组织进行加固和桥连。补片主要分为合成聚合物补片和生物材料补片两大类。其中，合成聚合物补片分为不吸收材料、可吸收材料和复合材料。不吸收材料如最常用的聚丙烯PP、膨化聚四氟乙烯ePTFE等，由于不可被组织降解，无法与机体组织有机结合，术后很容易引起炎症及感染，在体内长期留存后，材料结构的完整性遭到破坏，并可迁移到邻近的其他组织，引起慢性炎症和异物反应，需要进行翻修手术；其次由于不吸收材料在体内与周围组织力学顺应性的差别，会逐渐引起周围组织的纤维化反应并逐渐形成纤维包膜。若长时间的使用，材料对于相邻组织器官的侵蚀风险较大。可吸收材料一般采用聚乳酸等合成，如聚乙醇酸PGA、三亚甲基碳酸脂TMC等，具有无毒、良好生物相容性以及生物可降解性。同时，在体温下具有一定弹性和良好的机械加工性能，已被广泛用于体内植入材料等领域。虽然具有足够的力学性能，但植入体内后会引起急性炎症反应，其次是慢性炎症，最终形成肉芽组织，纤维包裹。并且聚乳酸等材料在降解过程中局部形成的高浓度乳酸、羟基乙酸造成细胞毒性。复合材料是将不吸收材料与可吸收材料进行涂层、分层、交联、载药等不同处理，减少不吸收成分，兼顾两者的优点，如聚乙醇酸(PGA)连接亲水可吸收防粘连层与聚丙烯层(PP)的复合补片，该补片可吸收防粘连层由羧甲基纤维素改性的透明质酸钠、聚乙二醇基共聚物等材料经化学交联而成。合成聚合物材料力学强度较好，但生物性能差，且不能诱导组织再生和愈合。
而生物补片是用各种技术从自然生物中提取，如同种或异种皮肤、小肠粘膜下组织，心包等胶原基质为材料，经过各种方法加工和保存，去除组织中含有的各种细胞、抗原成分，保留富含胶原的三维立体纤维框架。生物组织富含胶原的三维立体纤维框架可供宿主细胞增殖、组织重塑以及血管再生。生物补片与人工合成材料补片的组织修复机制完全不同，其植入机体后会引导组织进行内源性组织再生，主要过程是补片材料快速再血管化，循环中的干细胞进入并分化、填充、产生新的细胞外基质，从而修复组织缺损。而在实际应用中，生物组织补片因其自身力学强度不足，在加工过程中需引入戊二醛等化学交联剂，若处理方法不当，会造成潜在的细胞毒性，长期植入还存在有钙化的问题。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的在于提供一种生物补片及其制备方法，解决了生物组织制成的生物补片自身力学强度不足的问题，使得生物补片力学性能优良、生物相容性好，并可诱导自身组织生长。
本发明实施例提供一种生物补片的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
通过生物组织脱细胞处理获得生物组织的支架层；
将水凝胶填充所述支架层的空隙；
填充后的所述支架层使用交联剂进行交联抗钙化处理。
进一步地，所述脱细胞处理之前还需对生物组织进行预处理，所述预处理步骤包括：对裁剪好的生物组织使用生理盐水清洗和/或浸泡。
进一步地，所述脱细胞处理包括一种或多种方法：物理方法、化学方法和生物试剂，其中，所述物理方法包括使用超声、超高压力、反复冻融和/或机械搅拌破坏生物组织的细胞膜，将细胞内容物释放后通过洗涤剂来清除细胞碎片；所述化学方法包括利用一种或多种试剂改变细胞膜的通透性，使细胞溶胀破裂从而达到脱细胞；所述生物试剂为酶类。
进一步地，所述脱细胞处理步骤包括多次对生物组织进行冷冻、融化并震荡清洗后，放入生物试剂来溶解DNA和RNA，震荡溶解以后获得所述支架层。
进一步地，所述将生物组织平铺放置于超低温冷冻冰箱内超低温冷冻4.5～6.5h，以对生物组织进行冷冻；取出冷冻后的生物组织融化，并放置于生理盐水内震荡清洗；其中，所述超低温冷冻冰箱内的温度为-80℃～-40℃；
将经过多次冷冻、融化并震荡清洗步骤的生物组织浸入生理盐水中；第一摇床震荡清洗18～24h，间隔一段时间更换一次生理盐水；经过第一摇床清洗完成后，浸入用于的溶解DNA和RNA的Dnase和Rnase混合液中，放入第二摇床振荡18～24h；第二摇床振荡震荡完毕后，浸入生理盐水中，并经过第三摇床震荡清洗48h，其中每间隔一段时间更换一次生理盐水；所述第一摇床震荡的温度为0℃～8℃，所述第二摇床震荡的温度为35℃～37℃，所述第三摇床震荡的温度为0℃～8℃。
进一步地，将水凝胶填充所述支架层的空隙时包括多次将所述支架层浸泡在水凝胶单体溶液中，进行第四摇床震荡处理并放入压膜机中进行压膜处理。
进一步地，在所述水凝胶填充所述支架层的空隙之前还包括将脱细胞处理后形成的所述支架层放入注射水中，加入与所述支架层重量比为2：1的丙烯酸，并且将溶液的PH调节为9，震荡处理18～24h。
进一步地，所述水凝胶的材料选用天然亲水性高分子和/或合成的亲水高分子；所述天然亲水性高分子包括透明质酸和胶原，所述合成的亲水高分子聚丙烯酸、聚丙烯酰胺；所述交联剂包括以下一种或多种：α-氨基油酸AOA、环氧化合物、甲苯胺蓝、叠氮化合物以及原花青素溶液。
本发明实施例还提供一种生物补片，所述生物补片是采用上述的生物补片的制备方法制得。
进一步地，所述生物补片可以是单层，或者是多层叠加。
本实施例提供的生物补片及其制备方法，其有益效果在于：
(1)经脱细胞处理去除生物组织中含有的各种细胞和抗原成分，在降低免疫原性的同时保留细胞外基质成分和纤维框架，促进生物补片内源性组织再生；
(2)脱细胞处理后的生物组织再经水凝胶填充压模处理，增强生物组织力学强度和弹性的同时也保证了生物组织厚度的均匀及表面的平整性；
(3)将填充水凝胶的生物组织采用新型交联剂进行交联抗钙化处理，进一步增强生物补片的力学强度和抗钙化性能，得到无排异反应、力学性能优良，生物相容性好，并可诱导自身组织生长的生物补片。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中方法流程图。
图2为本发明实施例中生物补片的结构示意图。
图3为本发明实施例中生物补片的横切界面示意图。
图中，10-支架层，11-纤维框架，12-空隙。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
请参阅图1至图3，本发明提供一种生物补片的制备方法，制备方法包括以下步骤：
S10：通过生物组织脱细胞处理获得生物补片的支架层10。
首先，经过脱细胞处理去除生物组织(如牛心包)中含有的各种细胞和抗原成分，在降低免疫原性的同时保留细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和纤维框架11，即通过生物组织脱细胞处理获得生物补片的支架层10。细胞外基质是由大分子构成的错综复杂的网络，能为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。细胞外基质中富含多种生长因子，具有良好的生物活性，能够有效募集接触部位的细胞并为之提供合适的生长结构，诱导细胞定向分化，从而有利于组织的愈合。纤维框架可供宿主细胞增殖、组织重塑和血管再生。
具体地，脱细胞处理包括一种或多种方法：物理方法、化学方法和生物试剂，其中，物理方法包括使用超声、超高压力、反复冻融和/或机械搅拌破坏生物组织的细胞膜，将细胞内容物释放后通过洗涤剂来清除细胞碎片。化学方法包括利用一种或多种试剂改变细胞膜的通透性，使细胞溶胀破裂从而达到脱细胞，其中，试剂包括脱氧胆酸钠(SD)、聚乙二醇辛基苯基醚(别名：TritonX-100)和SDS。生物方法可选常用的酶类，比如胰蛋白酶、Dispase、核酸酶等。
步骤S10生物组织脱细胞处理，分为以下两个子步骤S11和S12。
S11：在脱细胞处理之前还需对生物组织进行预处理，预处理步骤包括对裁剪好的生物组织使用生理盐水清洗和/或浸泡。优选地，生理盐水采用无菌的生理盐水。
值得一提的是，生物组织可以选用以下一种或者多种：动物的真皮、小肠以及心包膜。动物可以是猪、牛、羊等，本申请对此不作限定。
S12：脱细胞处理步骤包括多次对生物组织进行冷冻、融化并震荡清洗后，放入生物试剂来溶解DNA和RNA，震荡溶解以后获得支架层10。
具体地，将预处理后的生物组织平铺放置于-80℃～-40℃的超低温冷冻冰箱内超低温冷冻4.5～6.5h，以对生物组织进行冷冻。冷冻完成后，取出冷冻后的生物组织融化后置于生理盐水内震荡清洗。优选地，将冷冻后的生物组织置于37℃条件下融化0.5～1h后放置于生理盐水内对融化后的生物组织进行震荡清洗5～10min。重复冷冻、融化并震荡清洗步骤多次，再继续下一步骤。
将经过多次冷冻、融化并震荡清洗步骤的生物组织浸入无菌的生理盐水中，恒温第一次摇床震荡清洗18～24h，间隔一段时间更换一次生理盐水。经过第一次摇床清洗完成后，浸入用于的溶解DNA和RNA的Dnase和Rnase混合液中，提高处理温度使得Dnase和Rnase混合液达到酶溶解的最佳处理温度，放入第二次摇床振荡18～24h。经过第二次摇床振荡震荡完毕后，取出并浸入无菌生理盐水中，降低至第一次震荡清洗温度并经过第三次摇床震荡清洗48h，其中每间隔一段时间更换一次生理盐水。完成脱细胞处理。
第一摇床震荡清洗和第三摇床震荡清洗时，更换无菌生理盐水的时间根据实际处理的情况而定，优选地，每6h更换一次。第一摇床震荡的温度为0℃～8℃，第二摇床震荡的温度为35℃～37℃，第三摇床震荡的温度为0℃～8℃，Dnase和Rnase混合液中包含80～160U/mL Dnase+50～120μg/mL Rnase混合液。
采用该种方法脱细胞程度较高，所得产品除去了主要免疫原性成分，生物相容性好，免疫原性低，能较好的调控细胞的粘粘附、迁移、增殖和分化。
S20：将水凝胶填充支架层10的空隙12，以增强支架层10的组织力学强度和弹性，压模处理同时也保证了心包厚度的均匀及表面的平整性。
具体地，步骤S20分为S21和S22两个子步骤。
S21：在水凝胶填充支架层10的空隙12之前还包括将脱细胞处理后形成的支架层10放入注射水中，使得注射水没过支架层10即可，加入与支架层10重量比为2：1的丙烯酸，并且将溶液的PH调节为9，震荡处理18～24h。
S22：将水凝胶填充支架层10的空隙12时包括将支架层10浸泡在水凝胶单体溶液中，多次进行第四次摇床震荡处理1h并放入压膜机中进行压膜处理。第四摇床震荡的温度为35℃～37℃。一般来说，进行3～4次浸泡于水凝胶单体溶液中第四次摇床震荡处理并放入压膜机中进行压膜。
水凝胶的材料选用天然亲水性高分子和/或合成的亲水高分子，天然亲水性高分子包括透明质酸和胶原，合成的亲水高分子聚丙烯酸、聚丙烯酰胺。在本实施例中，水凝胶单体溶液为30％的聚丙烯酰胺。使用丙烯酰胺水凝胶填充组织空隙12，并用压膜机进行压模处理，增强组织力学强度和弹性的同时也保证了生物组织厚度的均匀及表面的平整性
S30：填充后的所述支架层(10)使用交联剂进行交联抗钙化处理。
交联剂包括以下一种或多种：α-氨基油酸(AOA)、环氧化合物、甲苯胺蓝、叠氮化合物以及原花青素溶液。使用上述一种或者多种交联剂可以避免使用戊二醛处理造成的潜在细胞毒性和钙化问题。
请参阅图2和图3，本发明实施例还提供一种生物补片，该生物补片是采用上述的生物补片的制备方法制得。在实际使用的过程中，在本实施例中，生物补片是单层的，还可以多层生物补片叠加。
具体地，生物补片包括支架层10，支架层10包括细胞外基质和纤维框架11，纤维框架11之间形成内部空隙12，且水凝胶填充于空隙12内。水凝胶填充在空隙12时，由于水凝胶具有三维结构网络，使得生物补片复水之后，可以使水分子分散并保留在水凝胶中，以支撑纤维框架11，进一步增加生物补片的力学强度。
纤维框架11可以为生物补片提供力学强度，使得制成的生物补片能够承受外界载荷和防止变形。弹性纤维能够使生物补片富含弹性。为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种生物补片及其制备方法进行详细描述。
[实施例一]
预处理：取成年经检疫确认健康的生物组织(本实施例采用牛心包)，去除表面的脂肪和多余粘连组织后，放入无菌生理盐水中清洗5次后，选取外观无明显缺陷且厚度均匀的部位，裁切成所需要的的大小，并将其浸泡在无菌生理盐水内，待进行下步处理。
S10：脱细胞处理以获得生物补片的支架层10。
采用反复冻融和酶消化的脱细胞处理方法，将预处理后的生物组织平铺放置于超低温冷冻冰箱内，-80℃～-40℃下超低温冷冻4.5～6.5h，取出后于37℃条件下融化0.5～1h，并放置于无菌生理盐水内震荡清洗5～10min。重复上述操作3～4次。
然后取出生物组织，浸入无菌生理盐水中并将摇床温度调节至4℃，第一摇床震荡清洗18～24h，每6h换一次无菌生理盐水。再将生物组织取出，浸入80～160U/mL Dnase+50～120μg/mL Rnase混合液中，将摇床温度道调节至37℃，进行第二摇床振荡18～24h。取出生物组织后，浸入无菌生理盐水中，并将摇床温度调节至4℃，进行第三摇床震荡清洗48h，其中每6h换一次无菌生理盐水。
S20：将水凝胶填充支架层10的空隙12。
将经脱细胞处理后的生物组织平整放置于注射水中，注射水浸没生物组织即可。并加入与组织重量比为2：1的丙烯酸，调节溶液的PH值为9，室温下震荡处理18～24h。
处理完毕后，浸泡在30％丙烯酰胺水凝胶单体溶液中，于37℃第四摇床震荡处理1h后，取出放入压膜机中进行压膜处理。随后，再次将生物组织浸没在30％丙烯酰胺水凝胶单体溶液中，于37℃第四摇床震荡处理1h后，取出放入压膜机中进行压膜处理。重复以上操作3～4次。
S30：填充后的支架层10使用交联剂进行交联抗钙化处理。
将经填充后的支架层10置于0.2％～0.65％的戊二醛溶液里室温浸泡0.5-1h后取出，重新放入新的浓度0.2％～0.65％戊二醛溶液中，于37℃摇床浸泡7～14天，其中每7天更换一次戊二醛溶液，以便组织交联完全。使用70％～80％乙醇和0.5％～1.5％TritonX-100配制成含磷酸盐缓冲液，含磷酸盐缓冲液与0.05％～0.2％镁离子配置成抗钙化溶液，并将生物组织置于抗钙化溶液中，于37℃摇床震荡处理18～24h，每6h更换一次抗钙化溶液。
[实施例二]
预处理：取成年经检疫确认健康的生物组织(本实施例采用牛心包)，去除表面的脂肪和多余粘连组织后，放入无菌生理盐水中清洗5次后，选取外观无明显缺陷且厚度均匀的部位，裁切成所需要的的大小，并将其浸泡在无菌生理盐水内，待进行下步处理。
S10：脱细胞处理以获得生物补片的支架层10。
采用反复冻融和酶消化的脱细胞处理方法，将预处理后的生物组织平铺放置于超低温冷冻冰箱内，-80℃～-40℃下超低温冷冻4.5～6.5h，取出后于37℃条件下融化0.5～1h，并放置于无菌生理盐水内震荡清洗5～10min。重复上述操作3～4次。
然后取出生物组织，浸入无菌生理盐水中并将摇床温度调节至4℃，第一摇床震荡清洗18～24h，每6h换一次无菌生理盐水。再将生物组织取出，浸入80～160U/mL Dnase+50～120μg/mL Rnase混合液中，将摇床温度道调节至37℃，进行第二摇床振荡18～24h。取出生物组织后，浸入无菌生理盐水中，并将摇床温度调节至4℃，进行第三摇床震荡清洗48h，其中每6h换一次无菌生理盐水。
S20：将水凝胶填充支架层10的空隙12。
将经脱细胞处理后的生物组织平整放置于注射水中，注射水浸没生物组织即可。并加入与组织重量比为2：1的丙烯酸，调节溶液的PH值为9，室温下震荡处理18～24h。
处理完毕后，浸泡在30％丙烯酰胺水凝胶单体溶液中，于37℃第四摇床震荡处理1h后，取出放入压膜机中进行压膜处理。随后，再次将生物组织浸没在30％丙烯酰胺水凝胶单体溶液中，于37℃第四摇床震荡处理1h后，取出放入压膜机中进行压膜处理。重复以上操作3～4次。
S30：填充后的支架层10使用交联剂进行交联抗钙化处理。
将经填充后的支架层10置于0.5％的原花青素溶液中，37℃的摇床交联48～72h，每24h更换一次原花青素溶液。相比传统的戊二醛，原花青素溶液无毒。
[实施例三]
预处理：取成年经检疫确认健康的生物组织(本实施例采用牛心包)，去除表面的脂肪和多余粘连组织后，放入无菌生理盐水中清洗5次后，选取外观无明显缺陷且厚度均匀的部位，裁切成所需要的的大小，并将其浸泡在无菌生理盐水内，待进行下步处理。
S10：脱细胞处理以获得生物补片的支架层10。
采用反复冻融和酶消化的脱细胞处理方法，将预处理后的生物组织平铺放置于超低温冷冻冰箱内，-80℃～-40℃下超低温冷冻4.5～6.5h，取出后于37℃条件下融化0.5～1h，并放置于无菌生理盐水内震荡清洗5～10min。重复上述操作3～4次。
然后取出生物组织，浸入无菌生理盐水中并将摇床温度调节至4℃，第一摇床震荡清洗18～24h，每6h换一次无菌生理盐水。再将生物组织取出，浸入80～160U/mL Dnase+50～120μg/mL Rnase混合液中，将摇床温度道调节至37℃，进行第二摇床振荡18～24h。取出生物组织后，浸入无菌生理盐水中，并将摇床温度调节至4℃，进行第三摇床震荡清洗48h，其中每6h换一次无菌生理盐水。
S20：将水凝胶填充支架层10的空隙12。
将经脱细胞处理后的生物组织平整放置于注射水中，注射水浸没生物组织即可。并加入与组织重量比为2：1的丙烯酸，调节溶液的PH值为9，室温下震荡处理18～24h。
处理完毕后，浸泡在30％丙烯酰胺水凝胶单体溶液中，于37℃第四摇床震荡处理1h后，取出放入压膜机中进行压膜处理，随后，再次将生物组织浸没在30％丙烯酰胺水凝胶单体溶液中，于37℃第四摇床震荡处理1h后，取出放入压膜机中进行压膜处理。重复以上操作3～4次。
S30：填充后的支架层10使用交联剂进行交联抗钙化处理。
将经填充后的支架层10置于0.2％～0.65％的戊二醛溶液里室温浸泡0.5～1h后取出，重新放入新的浓度0.2％～0.65％戊二醛溶液中，于37℃摇床浸泡7～14天，其中每7天更换一次戊二醛溶液，以便组织交联完全。之后将交联完全的生物组织放入1％～5％的环氧氯丙烷室温处理48h，再放入0.5％～1.5％TritonX-100磷酸缓冲溶液中，于37℃摇床震荡处理6～8天，其中每3～4天更换一次溶液。
根据医药行业标准YY 0500-2004心血管植入物人工血管中8.8部分，测试实施例1-3的牛心包生物补片缝合强度；依据GB/T 528-2009硫化橡胶或热塑性橡胶拉伸应力应变性能的测定，测试实施例1-3的拉伸强度；根据GB/T529-2008硫化橡胶或热塑性橡胶撕裂强度的测定，测试实施例1-3的撕裂强度，具体结果参见下表(表中的数值为10个平行试样的平均值)。
实施例编号 缝合强度(N) 拉伸强度(Mpa) 撕裂强度(N)
1 58.54 21.77 67.61
2 53.66 23.87 56.67
3 55.40 24.80 60.63
本实施例提供的生物补片及其制备方法，其有益效果在于：
(1)经脱细胞处理去除生物组织中含有的各种细胞和抗原成分，在降低免疫原性的同时保留细胞外基质成分和纤维框架11，促进生物补片内源性组织再生。
(2)脱细胞处理后的生物组织再经水凝胶填充压模处理，增强生物组织力学强度和弹性的同时也保证了生物组织厚度的均匀及表面的平整性。
(3)将填充水凝胶的生物组织采用新型的交联剂进行交联抗钙化处理，进一步增强生物补片的力学强度和抗钙化性能，得到无排异反应、力学性能优良，生物相容性好，并可诱导自身组织生长的生物补片。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物补片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
通过生物组织脱细胞处理获得生物组织的支架层(10)；
将水凝胶填充所述支架层(10)的空隙(12)；
填充后的所述支架层(10)使用交联剂进行交联抗钙化处理。
2.根据权利要求1中所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理之前还需对生物组织进行预处理，所述预处理步骤包括：对裁剪好的生物组织使用生理盐水清洗和/或浸泡。
3.根据权利要求1中所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理包括一种或多种方法：物理方法、化学方法和生物试剂，其中，所述物理方法包括使用超声、超高压力、反复冻融和/或机械搅拌破坏生物组织的细胞膜，将细胞内容物释放后通过洗涤剂来清除细胞碎片；所述化学方法包括利用一种或多种试剂改变细胞膜的通透性，使细胞溶胀破裂从而达到脱细胞；所述生物试剂为酶类。
4.根据权利要求1中所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理步骤包括多次对生物组织进行冷冻、融化并震荡清洗后，放入生物试剂来溶解DNA和RNA，震荡溶解以后获得所述支架层(10)。
5.根据权利要求4中所述的生物补片的制备方法，其特征在于，将所述生物组织平铺放置于超低温冷冻冰箱内超低温冷冻4.5～6.5h，以对生物组织进行冷冻；取出冷冻后的生物组织融化，并放置于生理盐水内震荡清洗；其中，所述超低温冷冻冰箱内的温度为-80℃～-40℃；
将经过多次冷冻、融化并震荡清洗步骤的生物组织浸入生理盐水中；第一摇床震荡清洗18～24h，间隔一段时间更换一次生理盐水；经过第一摇床清洗完成后，浸入用于的溶解DNA和RNA的Dnase和Rnase混合液中，放入第二摇床振荡18～24h；第二摇床振荡震荡完毕后，浸入生理盐水中，并经过第三摇床震荡清洗48h，其中每间隔一段时间更换一次生理盐水；所述第一摇床震荡的温度为0℃～8℃，所述第二摇床震荡的温度为35℃～37℃，所述第三摇床震荡的温度为0℃～8℃。
6.根据权利要求1中所述的生物补片的制备方法，其特征在于，将水凝胶填充所述支架层(10)的空隙(12)时包括多次将所述支架层(10)浸泡在水凝胶单体溶液中，进行第四摇床震荡处理并放入压膜机中进行压膜处理。
7.根据权利要求1中所述的生物补片的制备方法，其特征在于，在所述水凝胶填充所述支架层(10)的空隙(12)之前还包括将脱细胞处理后形成的所述支架层(10)放入注射水中，加入与所述支架层(10)重量比为2：1的丙烯酸，并且将溶液的PH调节为9，震荡处理18～24h。
8.根据权利要求1中所述的生物补片的制备方法，其特征在于，所述水凝胶的材料选用天然亲水性高分子和/或合成的亲水高分子；所述天然亲水性高分子包括透明质酸和胶原，所述合成的亲水高分子聚丙烯酸、聚丙烯酰胺；所述交联剂包括以下一种或多种：α-氨基油酸(AOA)、环氧化合物、甲苯胺蓝、叠氮化合物以及原花青素溶液；所述生物组织包括以下一种或者多种：动物的真皮、小肠以及心包膜。
9.一种生物补片，其特征在于，所述生物补片是采用如权利要求1-8中任一项所述的生物补片的制备方法制得。
10.根据权利要求9中所述的生物补片，其特征在于：所述生物补片可以是单层，或者是多层叠加。
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