CN101016571A - 一种果树主要病毒的pcr检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒及其使用方法。该试剂盒由RNA提取试剂和PCR检测试剂组成，利用PCR技术原理，根据科学研究优化的试剂组合结果整合而成，可用于苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒、苹果花叶病毒、李属坏死环斑病毒、葡萄卷叶病毒和李矮缩病毒的PCR检测，需要配合PCR仪和高速冷冻离心机等的使用。具有灵敏度高、专一性强、操作简便、用时短等特点。适用于植病检疫检验部门、高等院校、科研院所。

Description

一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒及使用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及果树主要病毒的检测。

技术背景

果树病毒病是难以控制的病害，一旦侵染，在自然条件下难以清除，终生保存在树体内。感染病毒病的果树，体内的生理机能遭到破坏，生长不良、产量下降、品质变劣，并且对果树形成长期的慢性危害，严重时致树体死亡，给生产带来巨大的经济损失。

果树病毒种类多，危害持久，迄今尚无有效的药物可以控制。目前较为可行的控制措施是实行检疫，控制其扩展。因此，建立高效灵敏的检测技术，成为解决种苗检疫、抗病性早期鉴定等基本问题的前提，并能为果树无毒化栽培提供基本保障。

果树病毒常用的检测方法有：植物学症状鉴定法、指示植物鉴定法、电子显微镜技术检测法、血清学检测法、分子生物学检测法等。每一类方法都有其优缺点，在使用上也具有一定的局限性，其中分子生物学检测法以其灵敏度高、特异性更强、检测病毒范围广、可批量检测等优势正逐渐受到广泛的重视。

逆转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)技术是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法，是近几年被广泛的应用于生物学各个领域的前沿性生物技术，该技术用于植物病毒的检测具有特异性强、灵敏度高、快速简便、结果可靠等优点，目前我国在这一领域的研究还刚刚起步。

本发明经过反复验证，此次申报的试剂盒及检测方法在原有的基础上进一步优化。具有如下特点：

1.检测成本进一步降低，不足国外同类检测成本的一半。

2.检测所需时间缩短，3-4h即可检测完毕。

3.该试剂盒使用简便，重复性强，准确性高。

4.该试剂盒检测果树病毒时，不受检测时间和检测部位的限制，可以周年使用。

发明内容

本发明旨在提供一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，该试剂盒由果树病毒RNA提取试剂和PCR检测试剂组成。该试剂盒需要保存在-70℃的低温下。

果树病毒RNA提取试剂为：液氮、RNA提取缓冲液、酚、氯仿、异戊醇、氯化锂、0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液、3mol/L醋酸钠(pH5.3)、无水乙醇。

PCR检测试剂为：dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer缓冲液(pH8.8)、RNasin(RNA酶抑制剂)、MgCl₂、Pc引物、P_h引物、Mo-MLV RTase(逆转录酶)、总RNA模板、Taq酶、无菌双蒸水。

反应中所使用的Pc引物为：

Cl-P_c(苹果褪绿叶斑病毒互补引物)5′-cagaccctta ttgaagtcga a-3′

Sg-P_c(苹果茎沟病毒互补引物)5′-ctgcaagacc gcgaccaagt tt-3′

Ap-P_c(苹果花叶病毒互补引物)5′-ttctagcagg tcttcatcga-3′

Nr-P_c(李属坏死环斑病毒互补引物)5′-acgcgcaaaa gtgtcgaaat ctaaa-3’

Lr-P_c(葡萄卷叶病毒互补引物)5′-cggcacgatc gtactttcta a-3′

Pd-P_c(李矮缩病毒互补引物)5′-tagtgcaggt taaccaaaag gat-3′

反应中所使用的P_h引物为：

Cl-P_h(苹果褪绿叶斑病毒同源引物)5′-ggcaaccctg gaacaga-3′

Sg-P_h(苹果茎沟病毒同源引物)5′-cccgctgttg gatttgatac acctc-3

Ap-P_h(苹果花叶病毒同源引物)5′-caaccgagag gttggca-3′

Nr-P_h(李属坏死环斑病毒同源引物)5′-tggtcccact cagagctcaa caaag-3

Lr-P_h(葡萄卷叶病毒同源引物)5′-gatgctttcg cgtatttctt g-3′

Pd-P_h(李矮缩病毒同源引物)5′-atggatggga tggataaaat agt-3′

本发明中，果树主要病毒的PCR检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：

第一步：果树病毒RNA提取

①取200-300mg果树组织，加液氮研磨成粉末状，并快速移入1.5ml离心管中，加300-600μl RNA提取缓冲液和500-800μl热酚，振荡30-60秒，4℃，10000-12000转/分，离心5-10分钟；

②取水相，加入1-2倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，4℃，10000-12000rpm，离心5-10分钟；

③取水相，加入2.5倍体积的氯化锂，于4℃条件下保存2小时；

④沉淀溶于0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液250μl中，室温下放置1.5小时后，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次，4℃，10000-12000rpm，离心5-10分钟；

⑤取水相，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置0.5小时后，于4℃，10000-12000rpm，离心5-10分钟；

⑥沉淀用70％乙醇洗1-2次，干燥后溶于30-50μl无菌双蒸水或0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液中，得到总RNA模板，于-20℃或-70℃保存备用；

第二步：逆转录

取dNTPs 100-300μmol/L、0.67mol/L Buffer缓冲液(pH8.8)1.0μl、RNasin(RNA酶抑制剂)8-10U、氯化镁0.5-1.1mmol/L、Pc引物0.35-0.60μmol/L、Mo-MLV RTase(逆转录酶)50U、总RNA模板0.5-1.0μl，以无菌双蒸水或焦碳酸二乙酯的水溶液补足10μl，于37-42℃反应1h，再于95℃反应5min；

第三步：PCR扩增

取上述RT反应产物10μl、dNTPs 80-100μmol/L、PCR Buffer2.5μl、MgCl₂0.6-1.2mmol/L、引物0.3-0.5μmol/L、P_h 0.35-0.6μmol/L、TaqE 1U，用无菌双蒸水补足25μl，于90-94℃反应30-6s，再于50-60℃反应30s-2min，接着于72℃反应1-2min，反应循环30-35次，最后一轮反应延伸7min。

第四步：对扩增产物进行电泳、染色，产生特异DNA谱带，进行结果判断。

本发明主要用于苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒、苹果花叶病毒、李属坏死环斑病毒、葡萄卷叶病毒和李属矮缩病毒的PCR检测。

本发明中所使用的无菌双蒸水与0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液可以相互替换。

本发命中所使用的RNA提取缓冲液的组成为：50mmol/L TrisCl pH8.0、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS、2％PVP、10U RNasin、2％巯基乙醇，其中的RNasin和2％巯基乙醇为临用前加入。

具体实施方式

实施例一：一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，由果树病毒RNA提取试剂和PCR检测试剂组成，其中，

果树病毒RNA提取试剂为：液氮、RNA提取缓冲液、酚、氯仿、异戊醇、氯化锂(LiCl)、焦碳酸二乙酯的水溶液(浓度？)、3mol/L NaAc(pH5.3)、无水乙醇；

PCR检测试剂为：dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer缓冲液(pH8.8)、RNA酶抑制剂(RNasin)、MgCl₂、引物、Mo-MLV RTase(逆转录酶)、总RNA模板、Taq酶、无菌双蒸水。

该试剂盒用于检测苹果褪绿叶斑病毒时按如下程序操作：

第一步：果树病毒RNA提取

①取200果树组织，加液氮研磨成粉末状，并快速移入1.5ml离心管中，加300μl RNA提取缓冲液和500μl热酚，振荡30秒，4℃，10000转/分，离心5分钟；

②取水相，加入1倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，4℃，10000rpm，离心5分钟；

③取水相，加入2.5倍体积的LiCl，于4℃条件下保存2小时；

④沉淀溶于250μl 0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液中，室温下放置1.5小时后，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次，4℃，10000rpm，离心5分钟；

⑤取水相，加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置0.5小时后，于4℃，10000rpm，离心5分钟；

⑥沉淀用70％乙醇洗1次，干燥后溶于30μl DEPC H₂O(焦碳酸二乙酯的水溶液)中，得到总RNA模板，于-20℃保存备用；

第二步：逆转录

取dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer缓冲液(pH8.8)1.0μl、RNasin(RNA酶抑制剂)10U、MgCl₂ 0.8mmol、Cl-Pc 0.40uM、Mo-MLV RTase(逆转录酶)50U、总RNA模板1.0μl，用DEPC ddH₂O补足10μl，混合，于42℃温育1h，再于95℃反应5min；

第三步：PCR扩增

取dNTPs 80μmol/L、PCR Buffer2.5μl、MgCl₂ 1.2mmol/L、C1-Pc 0.5μmol/L、Cl-P_h 0.5μmol/L、TaqE 1U、RT产物10μl，用DEPC水补足25μl，依次于94℃反应30s；55℃反应1min；72℃反应1min；将反应循环30次，最后延伸7min；

第四步：对扩增产物进行电泳、染色，产生特异DNA谱带，进行结果判断。

实施例二：一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其组成同实施例一，用于检测葡萄卷叶病毒时按如下程序操作：

第一步：果树病毒RNA提取，同实施例一；

第二步：逆转录

取dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer(10x)缓冲液(pH8.8)1μl、RNasin10U、MgCl₂ 0.8mmol/L、GLR-Pc 0.4μmol/L、MMLV RTase50U、总RNA 1μl(0.5-1.0μg)。用DEPC ddH₂O补足10μl，混合后于42℃温育1h；

第三步：PCR扩增

取dNTPs 80μmol/L、PCR Buffer 2.5μl、MgCl₂ 1.0mmol/L、GLR-Pc0.45μmol/L、GLR-P_h 0.50μmol/L、Taq DNA聚合酶1U，用DEPC ddH₂O补足25μl。混合后依次于94℃反应30s，52℃反应1min，72℃反应1min，将反应循环30次，最后一轮延伸7min；

第四步：对扩增产物进行电泳、染色，产生特异DNA谱带，进行结果判断。

实施例三：一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其组成同实施例一，用于检测苹果茎沟病毒时按如下程序操作：

第一步：果树病毒RNA提取

①取300mg果树组织，加液氮研磨成粉末状，并快速移入1.5ml离心管中，加600μl RNA提取缓冲液和800μl热酚，振荡60秒，4℃，12000转/分，离心10分钟；

②取水相，加入2倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，4℃，12000rpm，离心10分钟；

③取水相，加入2.5倍体积的LiCl，于4℃条件下保存2小时；

④沉淀溶于250μl 0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液中，室温下放置1.5小时后，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次，4℃，12000rpm，离心10分钟；

⑤取水相，加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置0.5小时后，于4℃，12000rpm，离心5-10分钟；

⑥沉淀用70％乙醇洗2次，干燥后溶于50μl DEPC H₂O(焦碳酸二乙酯的水溶液)中，得到总RNA模板，于-70℃保存备用；

第二步：逆转录

取dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer缓冲液(pH8.8)1.0μl、RNasin 10U、MgCl₂ 0.8mmol/L、Sg-Pc 0.40μmol/L、Mo-MLV RTase 50U、总RNA 1.0μl，用无菌双蒸水补足10μl，混合后依次于42℃温育1.5h，95℃温育5min；

第三步：PCR扩增

取dNTPs 80μmol/L、PCR Buffer 2.5μl、MgCl₂ 1.0mmol/L、Sg-Pc 0.30μmol/L、Sg-P_h 0.35μmol/L、TaqE 1U、RT产物10μl，用DEPC ddH₂O补足25μl。混合后依次于94℃反应1min，60℃反应1min，72℃反应1min，将反应循环30次，最后延伸7min；

第四步：对扩增产物进行电泳、染色，产生特异DNA谱带，进行结果判断。

实施例四：一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其组成同实施例一，用于检测苹果花叶病毒时按如下程序操作：

第一步：果树病毒RNA提取，同实施例一；

第二步：逆转录

取0.67mol/L Buffer(5×)缓冲液(pH8.8)2μl、Pc0.7μmol/L；RNasin 6U、dNTPs0.25 mmol/L、MgCl₂0.5mmol/L、Mo-MLV RTase 100U、总RNA 2μl，用无菌双蒸水补足10μl，混合后依次于37℃温育30分钟，95℃温育5分钟；

第三步：PCR扩增

取0.2mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer 2.5μl、MgCl₂ 0.5mmol/L、Pc0.68μmol/L、Ph 0.84μmol/L、Taq DNA聚合酶1U，用无菌双蒸水补足25μl，混合后依次于90℃反应45秒、50℃反应45秒、72℃反应45秒，将反应循环40次，之后在72℃下延伸7分钟；

第四步：对扩增产物进行电泳、染色，产生特异DNA谱带，进行结果判断。

实施例五：一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其组成同实施例一，用于检测李矮缩病毒时按如下程序操作：

第一步：果树病毒RNA提取，同实施例二；

第二步：逆转录

取0.67mol/L Buffer(5×)缓冲液(pH8.8)2μl、Pd-Pc 0.6μmol/L、RNasin 8U、dNTPs125μmol/L、MgCl₂0.5mmol/L、M-MLV RTase 50U、总RNA 0.5μl，用无菌双蒸水补足10μl，混合后于37℃温育30分钟；

第三步：PCR扩增

取100μmol/L dNTPs、10×PCR Buffer 2.5μl、MgCl₂ 0.9mmol/L、Pd-Pc0.3μmol/L、Pd-P_h 0.3μmol/L、Taq DNA聚合酶1U，用无菌双蒸水补足25μl，依次于94℃预变性3分钟、94℃反应45秒、60℃反应30秒、72℃反应45秒，将反应循环30次，最后一轮延伸为72℃7分钟，4℃保存；

第四步：对扩增产物进行电泳、染色，产生特异DNA谱带，进行结果判断。

实施例六：一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其组成同实施例一，用于检测李属坏死环斑病毒时按如下程序操作：

第一步：第一步：果树病毒RNA提取，同实施例二；

第二步：逆转录

取dNTPs125μmol/L、0.67mol/L Buffer缓冲液(pH8.8)1.0μl、RNasin 8U、MgCl₂1.13mmol/L、Nr-Pc 0.496μmol/L、Mo-MLV RTase 50U、总RNA 0.5μl，用无菌双蒸水补足10μl，依次于37℃温育1小时，95℃温育5分钟；

第三步：PCR扩增

取dNTPs100μmol/L、PCR Buffer 2.5μl、MgCl₂1.2mmol/L、Nr-Pc0.396μmol/L、Nr-Pb0.456μmol/L、TaqE 1U、RT产物1U，用无菌双蒸水补足25μl，混合后依次于94℃反应30秒、54℃反应1分钟、72℃反应1分钟，将反应循环25次，最后一轮延伸为5分钟；

第四步：对扩增产物进行电泳、染色，产生特异DNA谱带，进行结果判断。

SEQUENCE LISTING

<110>侯义龙

<120>一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒及使用方法

<160>12

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus)

<400>1

cagaccctta ttgaagtcga a                                                       21

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus)

<400>2

ctgcaagacc gcgaccaagt tt                                                      22

<210>3

<211>20

<212>RNA

<213>苹果花叶病毒(Apple mosaic virus)

<400>3

ttctagcagg tcttcatcga                                                         20

<210>4

<211>25

<212>RNA

<213>李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus)

<400>4

acgcgcaaaa gtgtcgaaat ctaaa                                                   25

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>葡萄卷叶病毒(Grapevine leaf roll-associated virus)

<400>5

cggcacgatc gtactttcta a                                                 21

<210>6

<211>23

<212>RNA

<213>李矮缩病毒(Prune dwarf virus)

<400>6

tagtgcaggt taaccaaaag gat                                               23

<210>7

<211>17

<212>RNA

<213>苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus)

<400>7

ggcaaccctg gaacaga                                                      17

<210>8

<211>25

<212>RNA

<213>苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus)

<400>8

cccgctgttg gatttgatac acctc                                             25

<210>9

<211>17

<212>RNA

<213>苹果花叶病毒(Apple mosaic virus)

<400>9

caaccgagag gttggca                                                      17

<210>10

<211>25

<212>RNA

<213>李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus)

<400>10

tggtcccact cagagctcaa caaag                                               25

<210>11

<211>21

<212>RNA

<213>葡萄卷叶病毒(Grapevine leaf roll-associated virus)

<400>11

gatgctttcg cgtatttctt g                                                   21

<210>12

<211>23

<212>RNA

<213>李矮缩病毒(Prune dwarf virus)

<400>12

atggatggga tggataaaat agt                                                 23

Claims (9)

1、一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于由果树病毒RNA提取试剂和PCR检测试剂组成，其中，

果树病毒RNA提取试剂为：液氮、RNA提取缓冲液、酚、氯仿、异戊醇、氯化锂、0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液、3mol/L醋酸钠(pH5.3)、无水乙醇；

PCR检测试剂为：dNTPs 100μmol/L、0.67mol/L Buffer缓冲液(pH8.8)、RNA酶抑制剂、氯化镁、Pc引物、P_h引物、Mo-MLV RTase、总RNA模板、Taq酶、无菌双蒸水。

2、根据权利要求1所述的一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于反应中所使用的Pc引物为：

Cl-P_c 5′-cagaccctta ttgaagtcga a-3′

Sg-P_c 5′-ctgcaagacc gcgaccaagt tt-3′

Ap-P_c 5′-ttctagcagg tcttcatcga-3′

Nr-P_c 5′-acgcgcaaaa gtgtcgaaat ctaaa-3’

Lr-P_c 5′-cggcacgatc gtactttcta a-3′

Pd-P_c 5′-tagtgcaggt taaccaaaag gat-3′

3、根据权利要求1所述的一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所使用的P_h引物为：

Cl-P_h 5′-ggcaaccctg gaacaga-3′

Sg-P_h 5′-cccgctgttg gatttgatac acctc-3

Ap-P_h 5′-caaccgagag gttggca-3′

Nr-P_h 5′-tggtcccact cagagctcaa caaag-3

Lr-P_h 5′-gatgctttcg cgtatttctt g-3′

Pd-P_h 5′-atggatggga tggataaaat agt-3′

4、根据权利要求1所述的一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒需要保存在-70℃的低温下。

5、根据权利要求1所述的一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于使用时按如下方法进行操作：

第一步：果树病毒RNA提取

①取200-300mg果树组织，加液氮研磨成粉末状，并快速移入1.5ml离心管中，加300-600μl RNA提取缓冲液和500-800μl热酚，振荡30-60秒，4℃，10000-12000转/分，离心5-10分钟；

②取水相，加入1-2倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，4℃，10000-12000rpm，离心5-10分钟；

③取水相，加入2.5倍体积的氯化锂，于4℃条件下保存2小时；

④沉淀溶于250μl 0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液中，室温下放置1.5小时后，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次，4℃，10000-12000rpm，离心5-10分钟；

⑤取水相，加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置0.5小时后，于4℃，10000-12000rpm，离心5-10分钟；

⑥沉淀用70％乙醇洗1-2次，干燥后溶于30-50μl DEPC H₂O(焦碳酸二乙酯的水溶液)中，得到总RNA模板，于-20℃保存备用；

第二步：逆转录

取dNTPs 100-300μmol/L、0.67mol/L Buffer缓冲液(pH8.8)1.0μl、RNA酶抑制剂8-10U、MgCl₂0.5-1.1 mmol/L、Pc引物0.35-0.60μmol/L、Mo-MLV RTase50U、总RNA模板0.5-1.0μl，以无菌双蒸水补足10μl，于37-42℃反应1h，再于95℃反应5min；

第三步：PCR扩增

取上述逆转录反应产物10μl、dNTPs 80-100μmol/L、PCR Buffer2.5μl、氯化镁0.6-1.2mmol/L、Pc引物0.3-0.5μmol/L、P_h引物0.35-0.6μmol/L、Taq酶1U，用无菌双蒸水补足25μl，于90-94℃反应30-60s，再于50-60℃反应30s-2min，接着于72℃反应1-2min，反应循环30-35次，最后一轮反应延伸7min；

第四步：对扩增产物进行电泳、染色，产生特异DNA谱带，进行结果判断。

6、根据权利要求1所述的一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于可用于苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒、苹果花叶病毒、李属坏死环斑病毒、葡萄卷叶病毒和李属矮缩病毒的PCR检测。

7、根据权利要求1所述的一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所使用的无菌双蒸水可以由焦碳酸二乙酯的水溶液替换。

8、根据权利要求1所述的一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于RNA提取缓冲液的组成为：50mmol/L TrisCl pH8.0、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS、2％PVP、10U RNasin、2％巯基乙醇。

9、根据权利要求1所述的一种果树主要病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于其RNA提取缓冲液中的RNasin和2％巯基乙醇为临用前加入。