TWI485255B

TWI485255B - 檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組及方法

Info

Publication number: TWI485255B
Application number: TW102136416A
Authority: TW
Inventors: Cheng Ping Kuan
Original assignee: Agricultural Res Inst
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2015-05-21
Also published as: TW201514313A

Description

檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組及方法

本案係關於一種檢測葫蘆科作物是否受到病毒感染的引子組及方法，尤指一種檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組及方法。

瓜類為世界主要經濟作物，易受多種害蟲及病毒感染而導致重大經濟損失。台灣瓜類栽培面積廣大且種類繁多，尤以西瓜、南瓜及甜瓜等葫蘆科(Cucurbitaceae)作物為大宗。此類葫蘆科作物易受瓜類褪綠黃化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV)之危害，由於缺乏抗病材料，傳統方法迄無良方(Chang et al.1987；Huang et al.1993)。CCYV是目前全世界多數瓜類作物中最普遍發生的病毒之一，也是國內瓜類發生頻率最高的病毒之一。

瓜類褪綠黃化病毒(CCYV)為Closteroviridae科Crinivirus屬，屬於韌皮部侷限性病毒(phloem limitation virus)。CCYV為長絲狀RNA病毒，病毒顆粒大小介於650~900×12nm之間，此病毒可危害許多重要的經濟作物，造成植株的葉片呈現黃色斑點、褪綠黃化、甚至白化的病徵。植株感染至病徵出現約須14~40日，潛伏期較一般病毒為長。若發病時正值開花結果期，對果實的著果率及果型、果色影響甚大。

因此，本案提出一種檢測葫蘆科作物是否受到CCYV病毒感染的方法，以快速且準確地得到檢測結果。

本案之目的在於提出一種檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒(CCYV)感染的方法，以快速且準確地得到檢測結果，並利用提早拔除病株來防治病毒迅速感染所造成之危害。

本案之另一目的在於提出一種檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒(CCYV)感染的引子組，以透過引子組與瓜類褪綠黃化病毒之RNA序列的專一辨識，配合反轉錄恆溫環形核酸增幅法(reverse transcription Loop-mediated Isothermal Amplification,RT-LAMP)，建立葫蘆科作物是否感染CCYV之快速診斷方法。

為達上述目的，本案之一較佳實施態樣為提供一種檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組，包含4條引子，其引子序列分別如序列編號1至4所示。

根據本案之構想，該引子組係配合反轉錄恆溫環形核酸增幅法進行增幅反應。

根據本案之構想，該葫蘆科作物包含甜瓜、洋香瓜、胡瓜、西瓜、櫛瓜、南瓜、扁蒲及佛手瓜。

為達上述目的，本案之一較佳實施態樣為提供一種檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的方法，包含下列步驟：抽取待測組織之RNA；加入引子組及反轉錄恆溫環形核酸增幅法反應物以進行反轉錄恆溫環形核酸增幅反應，其中該引子組包含4條引子，其序列分別如序列編號1至4所示；以及檢測是否有目標產物產生。

根據本案之構想，該待測組織為葉子。

根據本案之構想，該反轉錄恆溫環形核酸增幅法反應物包含去氧核苷酸、反轉錄酶及DNA聚合酶。

根據本案之構想，該檢測是否有目標產物產生之步驟係利用螢光檢測法。

S10‧‧‧步驟S10

S20‧‧‧步驟S20

S30‧‧‧步驟S30

第1圖顯示本案檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組之序列。

第2圖顯示本案檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的方法之流程圖。

第3圖顯示本案檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的方法之檢測效果。

體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，然其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。

本案係提供一種檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV)感染的方法，其中，葫蘆科作物係包含甜瓜、洋香瓜、胡瓜、西瓜、櫛瓜、南瓜、扁蒲及佛手瓜等。

為快速檢測出葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV)的感染，本案開發出4條對CCYV具專一性的引子，俾利用反轉錄恆溫環形核酸增幅法(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification,RT-LAMP)增幅出具代表性之核酸片段作為CCYV之分子標記，以建立葫蘆科作物是否感染CCYV之快速診斷方法。

本案所採用的引子組係比對CCYV之RNA序列，並配合RT-LAMP方法而設計，共包含下列4條引子(如第1圖所示)：

(1)CCYV-2.3-F3 ：5’-GGGTGGTTCTTCACTGTT-3’(序列編號1)，係對應CCYV之RNA第2163-2180個核苷酸位置之序列。

(2)CCYV-2.3-B3 ：5’-GATTACCAAAAAATGCTATGTCC-3’(序列編號2)，係對應CCYV之RNA第2368-2346個核苷酸位置之序列。

(3)CCYV-2.3-FIP ：5’-TCTGGATCAATGATGCACTCTAAATGAAAATTCAAAGCGATGTAGC-3’(序列編號3)，其中前段序列5’-TCTGGATCAATGATGCACTCTAAAT-3’係對應CCYV之RNA第2249-2225個核苷酸位置之序列，而後段序列5’-GAAAATTCAAAGCGATGTAGC-3’則對應CCYV之RNA第2184-2204個核苷酸位置之序列。

(4)CCYV-2.3-BIP ：5’-AGCAGTGTCTTTTGGTTGTTCTATAACGGATGAGAATTACAATCG-3’(序列編號4)，其中前段序列5’-AGCAGTGTCTTTTGGTTGTTCTAT-3’係對應CCYV之RNA第2259-2282個核苷酸位置之序列，而後段序列5’-AACGGATGAGAATTACAATCG-3’則對應CCYV之RNA第 2342-2322個核苷酸位置之序列。

請參閱第2圖，其係顯示本案檢測葫蘆科作物是否受到CCYV感染的方法之流程圖。首先，抽取待測組織之RNA(步驟S10)，其中，待測組織可為葉子，但不以此為限。接著，加入引子組及RT-LAMP反應物以進行RT-LAMP反應(步驟S20)，其中引子組包含4條引子，其序列分別如序列編號1至4所示。待反應完畢，檢測是否有目標產物產生(步驟S30)。

以下則舉例說明本案檢測葫蘆科作物是否受到CCYV感染的方法之詳細步驟，但此處之說明僅為例示之用，並非用以限制本案發明。

首先，在步驟S10中，將0.1g新鮮葉片，置於液態氮中研磨，並參照Trizol Reagent的操作手冊抽取全RNA，抽取完成的全RNA萃取液靜置於冰上。

接著，在步驟S20中，將前述RNA萃取液加入前述4條引子以及RT-LAMP反應物，包括0.8μl之25μM FIP引子、0.8μl之25μM BIP引子、0.2μl之25μM F3引子、0.2μl之25μM B3引子、2.5μl之緩衝液、2μl之10mM去氧核苷酸(dNTP)、4μl之50mM MgSO₄ 、4μl之5M甜菜鹼(Betain)、0.8μl之反轉錄酶、1μl之DNA聚合酶、並加水至25μl，並將上述反應物於64℃下進行RT-LAMP反應60分鐘。

之後，待反應完畢，檢測是否有目標產物產生(步驟S30)。舉例來說，檢測的方法可為螢光檢測法，由於目標產物具有雙股DNA結構，因此可加入核酸染料SYBR Green，其可與雙股DNA嵌合而釋放螢光，故可用來檢測是否有目標產物產生，即可檢驗植物是否感染病毒。當然，亦可加入其他可與雙股DNA嵌合的螢光物質進行檢測，或是採用其他可檢測是否有目標產物產生的方法而不受限於本實施例中所述者。

為進一步確認本發明所設計之引子組及檢測方法能否專一的檢驗植物是否感染CCYV病毒，本案利用已知感染各種病毒的組織檢體來做測試。請參閱第3圖，其係顯示本案檢測方法之檢測效果。在第3圖中，第1管為感染CCYV之西瓜葉組織檢體，第2管為感染CCYV之洋香瓜葉組織檢體，第3管為感染CGMMV之洋香瓜葉組織檢體，第4管為感染PRSV-W之藜麥(Chenopodium quinoa )葉組織檢體，第5管為感染ZYMV之洋香瓜葉組織檢體，第6管為感染CMV之藜麥葉組織檢體，第7管為未感染之健康洋香瓜葉組織檢體，第8管為未感染之健康西瓜葉組織檢體，第9管為未感染之健康藜麥葉組織檢體，第10管為未感染之健康南瓜葉組織檢體，第11管則為負對照組。由檢測結果可知，僅第1管及第2管有螢光產生，為陽性反應，而其他管則無螢光產生，為陰性反應，顯示本案檢測方法對CCYV病毒有高度專一性，故可用來檢驗植物是否感染CCYV病毒。

綜上所述，本案開發出4條對CCYV具高度專一性的引子，並提供檢測葫蘆科作物是否受到CCYV感染的方法，亦即，利用反轉錄恆溫環形核酸增幅法(RT-LAMP)增幅出具代表性之核酸片段作為CCYV之分子標記，以建立葫蘆科作物是否感染CCYV之診斷方法，藉此快速且準確地得到檢測結果，並可利用提早拔除病株來防治病毒迅速感染所造成之危害。故本案之檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組及方法極具產業價值，爰依法提出申請。

本案得由熟習此技術之人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。

<110> 行政院農業委員會農業試驗所

<120> 檢測葫蘆科作物是否受到矮南瓜黃化嵌紋病毒感染的引子組及方法

<160> 4

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

Claims

一種檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組，包含4條引子，其引子序列分別如序列編號1至4所示。
如申請專利範圍第1項所述之檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組，其中該引子組係配合反轉錄恆溫環形核酸增幅法進行增幅反應。
如申請專利範圍第1項所述之檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組，其中該葫蘆科作物包含甜瓜、洋香瓜、胡瓜、西瓜、櫛瓜、南瓜、扁蒲及佛手瓜。
一種檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的方法，包含下列步驟：抽取待測組織之RNA；加入引子組及反轉錄恆溫環形核酸增幅法反應物以進行反轉錄恆溫環形核酸增幅反應，其中該引子組包含4條引子，其序列分別如序列編號1至4所示；以及檢測是否有目標產物產生。
如申請專利範圍第4項所述之檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的方法，其中該葫蘆科作物包含甜瓜、洋香瓜、胡瓜、西瓜、櫛瓜、南瓜、扁蒲及佛手瓜。
如申請專利範圍第4項所述之檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的方法，其中該待測組織為葉子。
如申請專利範圍第4項所述之檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的方法，其中該反轉錄恆溫環形核酸增幅法反應物包含去氧核苷酸、反轉錄酶及DNA聚合酶。
如申請專利範圍第5項所述之檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的方法，其中該檢測是否有目標產物產生之步驟係利用螢光檢測法。