CN106222308B - 用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用 - Google Patents

用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106222308B
CN106222308B CN201610895317.5A CN201610895317A CN106222308B CN 106222308 B CN106222308 B CN 106222308B CN 201610895317 A CN201610895317 A CN 201610895317A CN 106222308 B CN106222308 B CN 106222308B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mosaic virus
cucumber green
green mottle
cgmmv
mottle mosaic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610895317.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106222308A (zh
Inventor
张永江
霍亚云
赵文军
李为民
朱罗罗
胡林
尤其敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotechnology Research Institute of CAAS
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Ustar Biotechnologies Hangzhou Ltd
Original Assignee
Biotechnology Research Institute of CAAS
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Ustar Biotechnologies Hangzhou Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology Research Institute of CAAS, Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ, Ustar Biotechnologies Hangzhou Ltd filed Critical Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority to CN201610895317.5A priority Critical patent/CN106222308B/zh
Publication of CN106222308A publication Critical patent/CN106222308A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106222308B publication Critical patent/CN106222308B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用。本发明提供的特异引物组，由引物CGMMV‑BF、引物CGMMV‑MBF、引物CGMMV‑DF、引物CGMMV‑CPR和引物CGMMV‑BR组成，上述各个引物依次如序列表的序列1至5所示。所述特异引物组的用途为鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒或检测待测植物样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。本发明具有特异性好，灵敏度高，操作简单方便，检测效率高等优点，能满足口岸和田间检测的基本需求。

Description

用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用
技术领域
本发明属于植物检疫技术领域，涉及生物检测技术，具体设计一种用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条以及应用该试纸条鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒检测或者含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的植物材料的方法。
背景技术
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)属芜菁花叶病毒科(Tymoviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是我国重要的检疫性有害生物，主要通过土壤和种子传播，对黄瓜、西瓜和甜瓜等葫芦科作物具有重要威胁。在2005年左右随着进口瓜类种子进入我国，使得辽宁、北京等地瓜类作物损失惨重。因此加强对该病毒的检测，做好防疫控制对减少瓜类作物的损失具有重要意义。
黄瓜绿斑驳花叶病毒属正单链RNA病毒，病毒粒体为杆状，长为300nm，直径15nm，致死温度为80-90℃10分钟，体外保毒期为240天以上(20℃)。
黄瓜绿斑驳花叶病毒的寄主主要为葫芦科作物，包括黄瓜(Cucumis sativus)、葫芦(Lagenaria siceraria)、甜瓜(Cucumis meloL.)、丝瓜(Luffa cylindrica)、苦瓜(Momordica charantia)、西瓜(Citrullus lanatus)；此外还有藜科植物(Chenopodiumamaranticolor)、杏树等。
CGMMV侵染植物产生的症状因寄主、环境条件等不同而有差异，一般会使植株生长缓慢、矮化，结果延迟，严重的导致不孕；叶片出现色斑、水疱及变形；果实外部通常没有症状或出现色斑，内部果肉往往出现变色、纤维化及腐烂。黄瓜感染病毒症状：开始在新叶出现黄色小斑点，以后黄色部分扩展成花叶，并发生浓绿瘤状突起，有时黄色小斑点沿叶脉扩展成星状，或脉间褪色出现叶脉绿带；果实在病轻时只发生淡黄色圆形小斑点，病重时出现浓绿色瘤状突起变成畸形，严重时可以造成绝产。西瓜感染病毒症状：在植株的幼叶出现不规则的褪绿色或淡黄色，呈斑驳花叶状，使绿色部分隆起叶面凸凹不平，叶缘向上翻卷，叶片略变窄细；叶片老化后症状逐渐不明显，与健叶无大区别。病果表面出现浓绿色略圆的斑纹，有时在中央出现坏死斑；果梗再现褐色坏死条纹；果肉周边接近果皮部呈黄色水渍状，进而种子周围的果肉变紫红色或暗红色水渍状，果肉内出现块状黄色纤维，逐渐成为空洞；成熟果果肉全变成暗红色，内有大量空洞呈丝瓜瓤状，软化，腐烂变味，不能食用。甜瓜感染病毒症状：生长初期接种后7d～10d，顶部第3片～4片幼叶出现黄色斑或花叶，远看顶部附近呈黄色，以后展开的3片～4片叶症状反而减轻，再后的3片～4片叶又出现黄花叶，不断变化；成株侧枝叶出现不整形或星状黄花叶，生育后期顶部叶片有时再现大型黄色轮斑；果实有两类症状，一种在幼果再现绿色花叶，肥大后期呈绿色斑，另一种在绿色部的中心出现灰白色部分。
黄瓜绿斑驳花叶病毒的现有检测方法主要基于致病症状观察和RT-PCR等，耗时长、灵敏度低或需要昂贵的操作仪器，不利于在基层单位的推广使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用。
本发明首先提供了一种特异引物组，由引物CGMMV-BF、引物CGMMV-MBF、引物CGMMV-DF、引物CGMMV-CPR和引物CGMMV-BR组成；
所述引物CGMMV-BF为如下(a1)或(a2)；
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物CGMMV-MBF为如下(a3)或(a4)；
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物CGMMV-DF为如下(a5)或(a6)；
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物CGMMV-CPR为如下(a7)或(a8)；
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物CGMMV-BR为如下(a9)或(a10)；
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。
所述特异引物组为基于交叉引物恒温扩增原理设计的引物组。
引物CGMMV-MBF的5'末端进行生物素标记。
引物CGMMV-DF的5'末端进行6-FAM标记。
所述特异引物组的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒；
(b2)制备用于鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒；
(b3)检测待测植物样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；
(b4)制备用于检测待测植物样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒。
本发明还保护所述特异引物组的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒；
(b2)制备用于鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒；
(b3)检测待测植物样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；
(b4)制备用于检测待测植物样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒。
本发明还保护含有所述特异引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒；
(c2)检测待测植物样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。
所述试剂盒还可包括用于交叉引物恒温扩增的试剂，例如Bst DNA聚合酶。
所述试剂盒还可包括一次性核酸检测装置。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用所述特异引物组进行反转录交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述特异引物组可以实现以所述总RNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果采用所述特异引物组不能实现以所述总RNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为非黄瓜绿斑驳花叶病毒。
本发明还保护一种鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的总RNA并反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用所述特异引物组进行交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述特异引物组可以实现以所述cDNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果采用所述特异引物组不能实现以所述cDNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为非黄瓜绿斑驳花叶病毒。
本发明还保护一种鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
检测待测病毒的RNA对应的DNA中是否含有所述特异引物组的靶序列，然后进行如下判断：如果待测病毒的RNA对应的DNA中含有所述特异引物组的靶序列，待测病毒为或候选为黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果待测病毒的RNA对应的DNA中不含有所述特异引物组的靶序列，待测病毒为或候选为非黄瓜绿斑驳花叶病毒。
本发明还保护一种鉴定待测植物材料是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测植物材料的总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用所述特异引物组进行反转录交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述特异引物组可以实现以所述总RNA为模板的特异性扩增，待测植物材料含有或疑似含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果采用所述特异引物组不能实现以所述总RNA为模板的特异性扩增，待测植物材料不含有或疑似不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。
本发明还保护一种鉴定待测植物材料是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测植物材料的总RNA并反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用所述特异引物组进行交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述特异引物组可以实现以所述cDNA为模板的特异性扩增，待测植物材料含有或疑似含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果采用所述特异引物组不能实现以所述cDNA为模板的特异性扩增，待测植物材料不含有或疑似不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。
本发明还保护一种鉴定待测植物材料是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
检测待测植物材料的RNA对应的DNA中是否含有所述特异引物组的靶序列，然后进行如下判断：如果待测植物材料的RNA对应的DNA中含有所述特异引物组的靶序列，待测植物材料含有或疑似含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果待测植物材料的RNA对应的DNA中不含有所述特异引物组的靶序列，待测植物材料不含有或疑似不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。
以上任一所述方法中，交叉引物恒温扩增的反应体系中，引物CGMMV-CPR的浓度为1.5μmol/L、引物CGMMV-MBF的浓度为0.9μmol/L、引物CGMMV-DF的浓度为0.9μmol/L、引物CGMMV-BF的浓度为0.3μmol/L、引物CGMMV-BR的浓度为0.3μmol/L。
以上任一所述方法中，交叉引物恒温扩增的反应体系中，引物CGMMV-CPR的浓度为1.5μmol/L、5'末端具有生物素标记的引物CGMMV-MBF的浓度为0.9μmol/L、5'末端具有6-FAM标记的引物CGMMV-DF的浓度为0.9μmol/L、引物CGMMV-BF的浓度为0.3μmol/L、引物CGMMV-BR的浓度为0.3μmol/L。
以上任一所述方法中，反转录交叉引物恒温扩增的反应体系如下(20μl)：引物CGMMV-CPR 1.5μmol/L、5'末端具有生物素标记的引物CGMMV-MBF 0.9μmol/L、5'末端具有6-FAM标记的引物CGMMV-DF 0.9μmol/L、引物CGMMV-BF 0.3μmol/L、引物CGMMV-BR 0.3μmol/L，dNTP 0.4mmol、10×Thermopol buffer 2μl、AMV逆转录酶10个单位、Bst DNA聚合酶8个单位、MgSO4 2mmol、模板1μl，余量为无菌水。
以上任一所述方法中，交叉引物恒温扩增的反应条件具体可为：59℃，90min。
所述待测病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草花叶病毒、番茄花叶病毒或小西葫芦黄花叶病毒。
以上任一所述待测植物材料具体可为黄瓜材料、西瓜材料或甜瓜材料，更具体可为黄瓜叶片、西瓜叶片或甜瓜叶片。
完成交叉引物恒温扩增后，可采用一次性核酸检测装置进行检测。检测条带和质控条带均显色，结果为阳性。质控条带显色且检测条带不显色，结果为阴性。质控条带不显色，判断检测过程有误，需重新检测。
本发明提供了基于逆转录和交叉引物恒温扩增技术建立的黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条检测法。该方法以样品总DNA或者菌液为模板，进行逆转录和交叉引物恒温扩增反应，反应结束后利用一次性核酸检测装置内含的核酸试纸条进行结果判定。本发明具有特异性好，灵敏度高，操作简单方便，检测效率高等优点，能满足口岸和田间检测的基本需求。
附图说明
图1为特异性试验的结果。
图2为灵敏度试验的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。一次性核酸检测装置(Disposable Nucleic Acid Detection Device)：杭州优思达生物技术有限公司，型号D001-3。10×Thermopol buffer为BstDNA聚合酶自带。
实施例1、引物的设计与合成
经过大量序列分析、序列设计、人工筛选优化、效果验证，最终获得了一组用于鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异引物组。特异引物组由引物CGMMV-BF、引物CGMMV-MBF、引物CGMMV-DF、引物CGMMV-CPR和引物CGMMV-BR组成。
CGMMV-BF(序列1)：5'-CCTCAACGGTCCTGTGTTG-3'；
CGMMV-MBF(序列2)：5'-Biotin-GGCCTATCTTCGTTTCGCT-3'；
CGMMV-DF(序列3)：5'-CTTAGCTCCACGGATACGC-3'；
CGMMV-CPR(序列4)：5'-AACCTCAATGACCCTATTAGCGGCCTATCTTCGTTTCGCT-3'；
CGMMV-BR(序列5)：5'-GTGGGATTGCTAGGATCTA-3'。
CGMMV-MBF的5'末端进行生物素标记，CGMMV-DF的5'末端进行6-FAM标记。
CGMMV-BF为正向置换引物。CGMMV-MBF为检测探针1。CGMMV-DF为检测探针2。CGMMV-CPR为交叉引物。CGMMV-BR为反向置换引物。
实施例2、方法的建立
一、鉴定待测病毒是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法
1、提取待测病毒的总RNA。
2、以步骤1中提取的总RNA为模板，采用实施例1设计的引物组进行反转录交叉引物恒温扩增。
反应体系(20μl)：引物CGMMV-CPR 1.5μmol/L、5'末端具有生物素标记的引物CGMMV-MBF 0.9μmol/L、5'末端具有6-FAM标记的引物CGMMV-DF 0.9μmol/L、引物CGMMV-BF0.3μmol/L、引物CGMMV-BR 0.3μmol/L，dNTP 0.4mmol、10×Thermopol buffer 2μl、AMV逆转录酶10个单位、Bst DNA聚合酶8个单位、MgSO4 2mmol、模板1μl，余量为无菌水。
反应条件：59℃，90min。
3、取步骤2的产物，采用一次性核酸检测装置进行检测(按说明书操作)。检测条带和质控条带均显色，结果为阳性；质控条带显色且检测条带不显色，结果为阴性；质控条带不显色，判断检测过程有误，需重新检测。
二、鉴定待测植物材料是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法
1、提取待测植物材料的总RNA。
2、同步骤一的2。
3、同步骤一的3。
实施例3、特异性实验
待测病毒如下：
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)：参考文献：陈笑瑜,张永江,李桂芬等.黄瓜绿斑驳花叶病毒疫情处置效果的研究[J].植物检疫,2010,24(4):16-19.。
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)：参考文献：李桂芬,朱水芳,周群等.侵染紫松果菊的黄瓜花叶病毒分离物鉴定[J].植物保护,2007,33(1):54-56.。
辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV-S)：参考文献：张永江,李桂芬,马洁等.辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的检测[J].安徽农业科学,2007,35(14):4228-4229.。
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)：参考文献：张永江,马荣群,辛言言等.烟草花叶病毒属条形码鉴定方法的建立[J].湖北农业科学,2015,54(11):2624-2627.。
番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)：参考文献：于翠,吴建祥,周雪平.番茄花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用[J].微生物学报,2002,42(4):453-457.。
小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)：参考文献：张永江.一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒[J].植物检疫,2005,19(3):141-142.。
按照实施例2的步骤一的方法进行检测。将等体积无菌水作为模板，即为空白对照。
结果见图1。图1中，1对应空白对照，2对应黄瓜绿斑驳花叶病毒，3对应黄瓜花叶病毒，4对应辣椒轻斑驳病毒，5对应烟草花叶病毒，6对应番茄花叶病毒，7对应小西葫芦黄花叶病毒。黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测结果为阳性，空白对照的检测结果为阴性，黄瓜绿斑驳花叶病毒以外的6种病毒的检测结果均为阴性。
实施例4、灵敏度试验
待测病毒如下：
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)：参考文献：陈笑瑜,张永江,李桂芬等.黄瓜绿斑驳花叶病毒疫情处置效果的研究[J].植物检疫,2010,24(4):16-19.。
1、提取黄瓜绿斑驳花叶病毒的总RNA。
2、取步骤1得到的总RNA，用无菌水进行十倍梯度稀释，分别得到如下RNA溶液：RNA浓度为243.10ng/μl的RNA溶液1，RNA浓度为24.31ng/μl的RNA溶液2，RNA浓度为2.43ng/μl的RNA溶液3。
3、以步骤2得到的RNA溶液为模板，采用实施例1设计的引物组进行反转录交叉引物恒温扩增。将等体积无菌水作为模板，即为空白对照。
反应体系和反应条件同实施例2的步骤一的2。
4、取步骤3的产物，采用一次性核酸检测装置进行检测(按说明书操作)。检测条带和质控条带均显色，结果为阳性；质控条带显色且检测条带不显色，结果为阴性；质控条带不显色，判断检测过程有误，需重新检测。
结果见图2。图2中，1对应空白对照、2对应RNA溶液1、3对应RNA溶液2，4对应RNA溶液3。结果表明，模板中病毒RNA浓度为24.31ng/μl以上时检测结果为阳性。
实施例5、检测待测植物样本
1、黄瓜样本
取若干具有黄瓜绿斑驳花叶病发病症状的黄瓜叶片，作为待测植物材料。各个待测植物材料取自不同黄瓜植株。
取待测植物材料，按照实施例2的步骤二的方法进行检测。结果均为阳性。
取待测植物材料，分离纯化菌株并进行形态学特征鉴定、致病性鉴定、培养性状鉴定和血清学反应鉴定，结果均为阳性。
以上结果表明，各个待测植物材料均含有黄瓜绿斑驳花叶病毒，本发明提供的方法的准确性为100％。
2、西瓜样本
取若干具有黄瓜绿斑驳花叶病发病症状的西瓜叶片，作为待测植物材料。各个待测植物材料取自不同西瓜植株。
取待测植物材料，按照实施例2的步骤二的方法进行检测。结果均为阳性。
取待测植物材料，分离纯化菌株并进行形态学特征鉴定、致病性鉴定、培养性状鉴定和血清学反应鉴定，结果均为阳性。
以上结果表明，各个待测植物材料均含有黄瓜绿斑驳花叶病毒，本发明提供的方法的准确性为100％。
3、甜瓜样本
取若干具有黄瓜绿斑驳花叶病发病症状的甜瓜叶片，作为待测植物材料。各个待测植物材料取自不同甜瓜植株。
取待测植物材料，按照实施例2的步骤二的方法进行检测。结果均为阳性。
取待测植物材料，分离纯化菌株并进行形态学特征鉴定、致病性鉴定、培养性状鉴定和血清学反应鉴定，结果均为阳性。
以上结果表明，各个待测植物材料均含有黄瓜绿斑驳花叶病毒，本发明提供的方法的准确性为100％。

Claims (8)

1.特异引物组，由CGMMV-BF、CGMMV-MBF、CGMMV-DF、CGMMV-CPR和CGMMV-BR五条单链DNA分子组成；
所述CGMMV-BF为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述CGMMV-MBF为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述CGMMV-DF为序列表中序列3所示的单链DNA分子；
所述CGMMV-CPR为序列表中序列4所示的单链DNA分子；
所述CGMMV-BR为序列表中序列5所示的单链DNA。
2.权利要求1所述特异引物组的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒；
(b2)制备用于鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒；
(b3)检测待测植物样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；
(b4)制备用于检测待测植物样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒。
3.含有权利要求1所述特异引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒；
(c2)检测待测植物样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用权利要求1所述特异引物组进行反转录交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述特异引物组可以实现以所述总RNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果采用所述特异引物组不能实现以所述总RNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为非黄瓜绿斑驳花叶病毒。
6.一种鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的总RNA并反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用权利要求1所述特异引物组进行交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述特异引物组可以实现以所述cDNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果采用所述特异引物组不能实现以所述cDNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为非黄瓜绿斑驳花叶病毒。
7.一种鉴定待测植物材料是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测植物材料的总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用权利要求1所述特异引物组进行反转录交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述特异引物组可以实现以所述总RNA为模板的特异性扩增，待测植物材料含有或疑似含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果采用所述特异引物组不能实现以所述总RNA为模板的特异性扩增，待测植物材料不含有或疑似不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。
8.一种鉴定待测植物材料是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测植物材料的总RNA并反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用权利要求1所述特异引物组进行交叉引物恒温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述特异引物组可以实现以所述cDNA为模板的特异性扩增，待测植物材料含有或疑似含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果采用所述特异引物组不能实现以所述cDNA为模板的特异性扩增，待测植物材料不含有或疑似不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。
CN201610895317.5A 2016-10-13 2016-10-13 用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用 Active CN106222308B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610895317.5A CN106222308B (zh) 2016-10-13 2016-10-13 用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610895317.5A CN106222308B (zh) 2016-10-13 2016-10-13 用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106222308A CN106222308A (zh) 2016-12-14
CN106222308B true CN106222308B (zh) 2019-12-20

Family

ID=58077033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610895317.5A Active CN106222308B (zh) 2016-10-13 2016-10-13 用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106222308B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108456746A (zh) * 2018-04-03 2018-08-28 中国检验检疫科学研究院 一种基于一步法rpa技术检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102140536A (zh) * 2011-01-18 2011-08-03 中国检验检疫科学研究院 快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异引物对及其应用
CN102758005A (zh) * 2012-04-13 2012-10-31 中国检验检疫科学研究院 瓜类果斑病菌交叉引物恒温扩增检测用引物及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106222308A (zh) 2016-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gucek et al. Diagnostic techniques for viroids
Lin et al. Development of a polyprobe to detect six viroids of pome and stone fruit trees
Nikam et al. Pathogenic, cultural, morphological and molecular variability among eight isolates of Alternaria solani, causing early blight of tomato
CN106916897A (zh) 一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用
CN108559783B (zh) 一种用于检测四种常见根结线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法
Xu et al. Development and application of a LAMP assay for the detection of the latent apple tree pathogen Valsa mali
Jiang et al. Sap-direct RT-PCR for the rapid detection of coleus blumei viroids of the genus Coleviroid from natural host plants
CN106222308B (zh) 用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条及其应用
CN103710463B (zh) 草莓轻型黄边病毒的快速检测试剂盒及方法
Khurana et al. Recent developments towards detection and diagnosis for management of plant viruses
Raj et al. Molecular evidence for association of Tomato leaf curl New Delhi virus with leaf curl disease of papaya (Carica papaya L.) in India
CN111534626A (zh) 一种用于钟器腐霉的lamp检测引物组合物、检测试剂盒及其可视化检测方法
Lin et al. Development of a multiplex TaqMan real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of Asian prunus viruses, plum bark necrosis stem pitting associated virus, and peach latent mosaic viroid
JP6895168B2 (ja) ウイルス診断法
Waterworth et al. An assessment of nested PCR to detect phytoplasmas in imported dormant buds and internodal tissues of quarantined tree fruit germ plasm
CN112280890A (zh) 一种基于rpa-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法
CN112176080A (zh) 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法
CN112779342A (zh) 香蕉细菌性枯萎病菌环介导等温扩增检测方法
TWI485255B (zh) 檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組及方法
Hou Identification and biological characterization of new viral pathogens affecting fruit trees
Gast et al. DGGE-based detection method for Quahog Parasite Unknown (QPX)
Ghosh et al. Duplex PCR-based assay for simultaneous detection of tristeza and greening diseases in citrus
Duman et al. Diagnosis of Peach latent mosaic viroid (PLMVd) and Hop stunt viroid (HSVd) by RT-PCR using different extraction protocols
Ivanova Advanced receptions in the methodology of extraction total and viral nucleic acids from Basidiomycetes
CN105861745B (zh) 一种病毒检测试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant