ES2939121T3 - Recipiente de reacción para preparación de muestras - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un recipiente de preparación de muestras para la purificación y/o enriquecimiento de compuestos bioorgánicos a partir de material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus, comprendiendo el recipiente una cámara de reacción y un medio cromatográfico; en el que dicha cámara de reacción es para contener dicho material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus y está configurada de manera que en ella se puede realizar al menos una de las siguientes reacciones: lyis, por ejemplo, mediante sonicación y/o o hirviendo; purificación cromatográfica; reducción; alquilación; y reacciones enzimáticas tales como proteólisis; en el que dicho medio de cromatografía está configurado para purificar y/o enriquecer dichos compuestos bioorgánicos; donde (a) dicho medio de cromatografía está ubicado en una pared de dicha cámara de reacción, y dicha pared está cerrada o sellada y configurada para abrirse para obtener compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos; o (b) dicho contenedor de preparación de muestras comprende además una cámara receptora para recibir dichos compuestos bioorgánicos, siendo dicha cámara receptora adyacente a dicho medio cromatográfico de manera que dicho medio cromatográfico separa dicha cámara de reacción de dicha cámara receptora, y la cara exterior de dicho la cámara receptora está cerrada y configurada para ser abierta para la obtención de compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Recipiente de reacción para preparación de muestras
Esta invención se refiere a un contenedor de preparación de muestras para la purificación y/o enriquecimiento de compuestos bioorgánicos a partir de material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus, el contenedor comprende una cámara de reacción y un medio de cromatografía; en donde dicha cámara de reacción es para contener dicho material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus y está configurada de manera que en esta puede realizarse al menos una de las siguientes reacciones: lisis, por ejemplo, mediante sonicación y/o ebullición; purificación cromatográfica; reducción; alquilación; y reacciones enzimáticas tales como proteólisis; en donde dicho medio de cromatografía está configurado para purificar y/o enriquecer dichos compuestos bioorgánicos; en donde (a) dicho medio de cromatografía está ubicado en una pared de dicha cámara de reacción, y dicha pared está cerrada o sellada y configurada para abrirse para obtener compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos; o (b) dicho contenedor de preparación de muestras comprende además una cámara receptora para recibir dichos compuestos bioorgánicos, siendo dicha cámara receptora adyacente a dicho medio de cromatografía de manera que dicho medio de cromatografía separa dicha cámara de reacción de dicha cámara receptora, y la cara exterior de dicho la cámara receptora está cerrada y configurada para abrirla para la obtención de compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos.
En esta descripción se citan una serie de documentos que incluyen solicitudes de patentes y manuales del fabricante. Las descripciones de estos documentos, aunque no se consideran relevantes para la patentabilidad de la presente invención, se incorporan al presente como referencia en su totalidad. Más específicamente, todos los documentos a los que se hace referencia se incorporan por referencia en la misma medida que si cada documento individual se indicara específica e individualmente para ser incorporado por referencia.
Los métodos de preparación de muestras que se usan para enriquecer determinados materiales biológicos, incluida la lisis celular, se aplican actualmente en prácticamente todos los campos de la investigación biológica. La extracción, purificación y procesamiento de ADN, ARN y proteínas son los pasos iniciales para el análisis in vitro de estos y otros materiales biológicos. Los métodos actuales implican pasos de clarificación previa y la transferencia de estos materiales a diferentes recipientes de reacción para evitar la obstrucción de los dispositivos de análisis como las columnas analíticas y, en ocasiones, para enriquecer los materiales biológicos deseados. La pureza de la muestra se considera importante en determinados campos de la investigación biológica, tales como la cristalografía y la microscopía electrónica. Estos pasos de limpieza previa y transferencia de muestras muestran algunas desventajas importantes en términos de pérdida de muestras, tiempos prolongados de preparación de muestras, modificaciones no deseadas, por ejemplo, de las proteínas que se analizarán, introducción de contaminaciones, peligros potenciales en el manejo de materiales nocivos o infecciosos y costos de materiales. Sin embargo, generalmente se consideran indispensables.
La pérdida de muestras se produce en el paso de limpieza previa de los lisados crudos debido a la extracción incompleta y al contacto prolongado con las superficies de los recipientes donde se produce la absorción de la muestra. Las soluciones actuales para reducir la pérdida de muestras incluyen métodos de extracción muy estrictos y superficies de baja unión en los tubos de reacción.
Las transferencias de muestras repetidas toman tiempo; especialmente prácticas donde el investigador tiene que estar presente y necesita manipular la muestra. La exposición prolongada a la luz ultravioleta o al oxígeno puede dañar la muestra y provocar modificaciones químicas no deseadas. Las soluciones a estos problemas son el uso de recipientes ligeros protegidos y de gas de protección, respectivamente. Sin embargo, estas medidas hacen que el manejo de las muestras sea aún más difícil y lento. Además, pueden introducirse contaminaciones durante las transferencias de muestras entre recipientes y actualmente solo pueden evitarse mediante el trabajo en costosos bancos limpios, bajo flujo laminar o con precauciones similares. Además, las muestras nocivas, como los patógenos, presentan el riesgo de contaminar a las personas o las máquinas que entran en contacto con los tubos de muestras. Finalmente, cualquiera de estas ineficiencias en la preparación de muestras, así como el uso de más de una cantidad mínima de materiales de uso único, puede aumentar significativamente los costos de procesamiento.
Los dispositivos tales como puntas de pipeta que comprenden material cromatográfico son conocidos en la técnica y están disponibles de varios fabricantes e incluyen puntas Pierce C-18 (Thermo Fisher) y cartuchos C18-SD (3M). Estos dispositivos están abiertos en ambos extremos. Dichos dispositivos no son adecuados para la preparación de muestras en un solo recipiente de reacción. La preparación de muestras en este contexto incluye la preparación de péptidos y polipéptidos para el análisis espectrométrico de masas a partir de material celular y/o la preparación de ácidos nucleicos para el perfilado de expresión a partir de material celular.
Rapsilber y otros. (Anal Chem.; 75(3):663-70 (2003)) describen un dispositivo también denominado "StageTips" que está abierto en ambos extremos y permite la modalidad de cromatografía en un formato compacto. El documento de EE.UU 2006/269980 A1 muestra un método y un kit de prueba para analizar proteínas o péptidos directamente en el chip.
La solicitud de patente europea EP 1033 169 describe un cartucho absorbente para la extracción en fase sólida. El cartucho de acuerdo con el documento EP 1033169 se caracteriza por tener una abertura en el extremo distal de la punta, esta abertura está designada con la referencia (18), abertura que es indispensable para el funcionamiento del cartucho. El extremo distal es donde se proporciona el material de extracción en fase sólida, preferiblemente en forma de perlas. Mientras que una tapa (32) cierra el extremo proximal del cartucho absorbente, el extremo distal debe estar abierto o abrirse para poner en contacto la materia prima con las perlas. El fondo del dispositivo de la presente invención, que es el "extremo distal" al usar la nomenclatura del documento EP 1033 169, está hecho de una pared que está cerrada o sellada, o se proporciona en forma de una cámara de recepción cerrada. No obstante, es posible cargar con materia prima, concretamente en el extremo superior ("proximal"). Carga de muestras de acuerdo con el documento EP 1033 169, sin embargo, solo es posible cuando el extremo distal está abierto. En vista de las limitaciones de los medios y métodos disponibles en la técnica, el problema técnico que subyace a la presente invención puede verse en la provisión de dispositivos y métodos para la preparación de muestras, en donde dicha preparación de muestras debe efectuarse en un solo recipiente de reacción sin cualquier paso de transferencia.
En consecuencia, la presente invención se refiere en un primer aspecto a un contenedor de preparación de muestras para la purificación y/o enriquecimiento de compuestos bioorgánicos a partir de material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus, dicho contenedor comprende una cámara de reacción y un medio de cromatografía; en donde dicha cámara de reacción es para contener dicho material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus y está configurada de tal manera que en ella puede realizarse al menos una de las siguientes reacciones: lisis, por ejemplo, mediante sonicación y/o o ebullición; purificación cromatográfica; reducción; alquilación; y reacciones enzimáticas tales como proteólisis; en donde dicho medio de cromatografía está configurado para purificar y/o enriquecer dichos compuestos bioorgánicos; en donde (a) dicho medio de cromatografía está ubicado en una pared de dicha cámara de reacción, y dicha pared está cerrada o sellada y configurada para abrirse para obtener compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos; o (b) dicho contenedor de preparación de muestras comprende además una cámara receptora para recibir dichos compuestos bioorgánicos, siendo dicha cámara receptora adyacente a dicho medio de cromatografía de manera que dicho medio de cromatografía separa dicha cámara de reacción de dicha cámara receptora, y la cara exterior de dicha cámara receptora está cerrada y configurada para abrirla para la obtención de compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos.
El término "muestra" se refiere a una composición que está lista para su posterior análisis. Por ejemplo, si dichos compuestos bioorgánicos son péptidos o polipéptidos, un análisis posterior preferido es por espectrometría de masas. El contenedor de preparación de muestras de acuerdo con la presente invención es un medio para obtener dicha muestra. En términos generales, dicha muestra comprende o consiste en dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos, también denominados "analitos" en la presente descripción.
En general, el contenedor de preparación de muestras puede tener forma de cono, forma de caja o cilíndrico. El volumen del contenedor puede ser adecuado para volúmenes de muestra de 10 pl a 150 pl, incluidos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 pl, así como cualquier volumen mayor también por encima de 150 pl. Sin embargo, el volumen total del contenedor de preparación de muestras puede ser significativamente mayor que el volumen para el que es adecuado. Por ejemplo, en el caso de un contenedor en forma de cono, el radio de la base puede estar entre 1 y 5, tal como 1,5, 2 o 3 mm, y la altura puede estar entre 10 y 150, tal como 25 mm.
Se entiende que una cámara de reacción que está configurada de manera que puede realizarse la lisis en esta, está configurada para realizar los métodos de lisis establecidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, sonicación, molienda en perlas y/o ebullición.
En el caso de la opción (a), el contenedor de preparación puede comprender además cerca de la pared que está cerrada o sellada un acoplamiento, por ejemplo, un acoplamiento roscado, para acoplar dentro de una cámara receptora externa. Dicha cámara de recepción externa comprende la contraparte correspondiente del acoplamiento, por ejemplo, una rosca macho que se acopla con una rosca hembra del contenedor de preparación. La cámara de recepción externa puede comprender adicionalmente medios de apertura que están configurados para abrir la pared cuando se une firmemente a la pared. Estos medios pueden ser una prolongación con bordes afilados al final de una rosca que penetra en la pared cuando la cámara receptora está firmemente enroscada en el acoplamiento roscado del contenedor de preparación. En consecuencia, la pared puede ser de un material plástico rígido de paredes delgadas o de un material plástico flexible, ambos configurados para ser penetrados con dicha extensión de bordes afilados.
En el caso de la opción (b), la cara exterior de la cámara de recepción, es decir, el extremo libre de la cámara de recepción que está opuesto al medio de cromatografía y la cámara de reacción, puede tener una pared delgada de manera que pueda cortarse por tijeras o bisturí. Por ejemplo, cuando el contenedor tiene forma de cono, la cara exterior puede ser la punta del cono que puede despegarse para obtener compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos.
El contenedor de acuerdo con la invención prevé la preparación de muestras en un único recipiente de reacción. Los presentes inventores descubrieron que las etapas de limpieza previa y transferencia de muestras no solo son desventajosas sino también prescindibles para purificaciones tales como el enriquecimiento de polipéptidos o péptidos o la purificación de la proteólisis de proteínas para el análisis posterior mediante proteómica que se basa en espectrometría de masas. Este hallazgo es particularmente ventajoso para proteínas de unión a membranas y ácidos nucleicos, principalmente porque la solubilización completa de tales proteínas en líquidos es difícil e incluso puede ser imposible en determinadas circunstancias debido a su comportamiento bioquímico. En particular, los inventores descubrieron que la lisis de la muestra, la modificación de la muestra, la reacción enzimática, la purificación y el enriquecimiento pueden realizarse en un único recipiente de reacción. Esta solución de recipiente único reduce significativamente la pérdida de la muestra, lo que es más importante cuando se trabaja con cantidades de muestra minúsculas. La invención permite el análisis de cantidades de muestra muy pequeñas o de un número muy bajo de células. Además, realizar todas las reacciones en un solo contenedor reduce el tiempo de procesamiento, especialmente el tiempo de manipulación.
Estas mejoras permiten la automatización del paso de procesamiento con una combinación simple de maquinarias de última generación en un grado mucho más alto de lo que era posible anteriormente.
Las modificaciones no deseadas de los analitos, como las proteínas y los ácidos nucleicos, provocadas por la preparación de muestras se reducen gracias a la mayor velocidad de preparación de las muestras. La alta eficiencia del procedimiento reduce la cantidad de productos químicos necesarios, así como la cantidad de tubos o puntas de uso único, lo que lleva a una reducción de costos; en consecuencia, la automatización de los pasos de procesamiento reduce el tiempo de manipulación, los costos en términos de tiempo de trabajo y los costos en términos de dispositivos de uso único.
Se entiende que el término "que comprende" incluye "que consiste en". Además, se entiende que "que comprende" cuando va seguido de una lista de reactivos, proporciona una lista cerrada de reactivos, pero no excluye la presencia de compuestos adicionales cuyos compuestos no se consideran reactivos. Un compuesto que no sería visto como un reactivo es, por ejemplo, el agua. Esto se aplica también a las soluciones tamponadas.
En una modalidad preferida, dichos compuestos bioorgánicos o analitos comprenden al menos uno de los siguientes: proteínas; péptidos; polipéptidos; ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos desoxirribonucleicos y ácidos ribonucleicos; lípidos que incluyen ácidos grasos; y metabolitos.
En términos generales, un compuesto bioorgánico es un compuesto orgánico que ocurre naturalmente en los sistemas biológicos. Un compuesto orgánico es un compuesto que comprende uno o más átomos de carbono. Un sistema biológico puede ser un organismo que incluye organismos unicelulares y multicelulares, un tejido, un tipo de célula de un organismo o tejido, células en cultivo, un subcomponente de material celular como un organelo, organelos que incluyen mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, peroxisomas, aparato de Golgi, retículo endoplasmático, nucléolo, núcleo, ribosomas, microtúbulos, centriolos y proteasomas. Los sistemas biológicos incluyen además virus y subcomponentes de los mismos. El término "subcomponentes" incluye ensamblajes macromoleculares.
Los péptidos y polipéptidos son policondensados de aminoácidos, preferiblemente de los veinte aminoácidos naturales. Normalmente, los péptidos contienen entre dos y treinta aminoácidos, mientras que los polipéptidos contienen más de treinta aminoácidos.
Los ácidos nucleicos son policondensados de nucleótidos. El término "ácido nucleico" de acuerdo con la invención incluye ADN, tal como ADNc y ADN genómico, y ARN. El ARN comprende todas las formas de ARN, incluido el ARNm, el ARN no codificante, el ARNt y el ARNr. Los ejemplos de Ar N no codificantes incluyen ARNip, miARN, ARN asociados a repeticiones, ARN nucleolar pequeño y ARN nuclear pequeño.
El término "lípido" es bien conocido en la técnica y se refiere a moléculas predominantemente lipofílicas/hidrofóbicas que pueden portar un grupo de cabeza polar, y convertir así a la molécula de lípido en anfifílica. Los lípidos incluyen lípidos simples como hidrocarburos (triacontano, escualeno, carotinoides), alcoholes (alcohol de cera, retinol, colesterol, hidrocarburos lineales mono- o polihidroxilados, preferiblemente con dos a aproximadamente 30 átomos de carbono), éteres, ácidos grasos y ésteres como mono-, di- y triacilgliceroles. Además se incluyen lípidos complejos tales como lipoproteínas, fosfolípidos y glicolípidos. Los fosfolípidos a su vez comprenden glicerofosfolípidos tales como ácido fosfatídico, ácido lisofosfatídico, fosfatidilglicerol, cardiolipina, ácido lisobisfosfatídico, fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol y fosfonolípidos. Los glicolípidos incluyen glicoglicerolípidos tales como mono- y digalactosildiacilgliceroles y sulfoquinovosildiacilgliceroles. También se incluyen en el término "lípido" de acuerdo con la presente invención la esfingomielina, los glucoesfingolípidos y las ceramidas.
El término "metabolitos" se define comúnmente como pequeñas moléculas involucradas como intermediarios y productos en el metabolismo y la señalización. Estos incluyen metabolitos categorizados como intermediarios metabólicos, moléculas de señalización como hormonas y metabolitos secundarios.
En otra modalidad preferida, el contenedor comprende una tapa, dicha tapa está configurada para sellar una abertura de la cámara de reacción y configurada para permitir la alimentación de una muestra, por ejemplo mediante penetración con una aguja, y preferiblemente configurada para autosellarse después de la alimentación. Esta modalidad preferida proporciona un contenedor de preparación de muestras (totalmente) cerrado.
La opción de configurar una tapa para sellar el tubo permite trabajar fácilmente bajo gas de protección cuando sea necesario, lo que reduce las oxidaciones. El sellado del tubo también reduce significativamente las contaminaciones introducidas durante la preparación de la muestra. Un dispositivo limpio y sellado, por ejemplo, con una tapa de goma penetrable, garantiza una reducción significativa de las contaminaciones. Al mismo tiempo, un recipiente sellado también evita que la muestra contamine el exterior, haciendo más seguro y factible el trabajo con materiales nocivos o tóxicos.
Se prefiere que la tapa pueda fusionarse con el resto de la cámara, por ejemplo, mediante soldadura ultrasónica. Alternativamente, esta tapa puede estar pegada al resto de la cámara. La tapa puede ser de cualquier material que pueda ser atravesado por un objeto afilado, por ejemplo, una aguja o una lanceta. Además, la tapa también puede configurarse para volver a cerrarse después de la penetración con el objeto afilado.
De acuerdo con la invención, la cámara de reacción está abierta. La abertura está en la parte superior. En ese caso, se prefiere que el medio de cromatografía esté ubicado en el fondo de dicha cámara de reacción. Los términos "superior" y "fondo" se definen con respecto a la dirección de la gravedad. La gravedad es una fuerza impulsora preferida para realizar la cromatografía.
En otra modalidad preferida, la superficie de dicho medio de cromatografía está configurada para actuar como una superficie de filtración y/o comprende una capa de filtración adicional y/o capa reactiva, dicha superficie o capa orientada hacia el interior de dicha cámara de reacción.
La opción de que la superficie de dicho medio de cromatografía esté configurada para actuar como superficie de filtración y/o comprenda una capa de filtración adicional y/o una capa reactiva permite eliminar las impurezas microscópicas y/o mesoscópicas de la muestra y, en la medida en que dicha capa esté reactiva, permite realizar más reacciones químicas. La filtración puede realizarse mediante una malla que se incorpora en la superficie de filtración. Además, la malla puede recubrirse con material reactivo, por ejemplo, grupos químicamente reactivos o enzimas tales como péptido-N-glucosidasas (PNGasas) que actúan como capa reactiva. Alternativamente, la filtración puede realizarse mediante un filtro tejido o un filtro de papel. En este caso, el material tejido o el papel también pueden estar recubiertos o tratados con un material reactivo.
Alternativamente, dicha superficie de filtración, capa de filtración y/o capa reactiva pueden ser prescindibles, en particular si dicho medio de cromatografía se construye para lograr contrapresiones más bajas, tal como mediante el uso de tamaños de partículas de cromatografía más grandes, tales como 5 pm, 10 pm y más, o mediante el uso de materiales poliméricos tales como micro o macroporos de poli(estireno-divinilbenceno) y, por lo tanto, proporcionar un riesgo reducido de obstrucción.
En otra modalidad preferida del aspecto (b) de la modalidad principal, así como de las modalidades preferidas descritas anteriormente, en la medida en que se refieran a la modalidad (b) de la modalidad principal, el contenedor comprende además un sello en donde dicho sello está configurado para sellar dicha cámara receptora y configurado para obtener dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos. Por ejemplo, el sello puede estar en la cara exterior de la cámara receptora o puede reemplazar completamente dicha cara exterior.
En cuanto a la tapa antes mencionada, también se prefiere que este sello pueda fusionarse con la cámara receptora, por ejemplo, mediante soldadura ultrasónica. Alternativamente, dicho sello puede pegarse a la cámara receptora como puede pegarse la tapa a la cámara de reacción. En consecuencia, el sello también puede ser de cualquier material que pueda ser atravesado por un objeto puntiagudo, por ejemplo, una aguja o una lanceta, y puede estar configurado para volver a sellar después de la penetración con el objeto punzante.
En otra modalidad preferida, dicho contenedor comprende al menos uno de: polipropileno; polietileno; material configurado para conducir calor, microondas, ondas de choque, ondas de sonido y/o electricidad; material con superficie de unión baja; material que es transparente, opaco o que transmite selectivamente radiación electromagnética, preferiblemente luz, más preferiblemente radiación UV.
La opción de que el contenedor comprenda material configurado para conducir calor, microondas, ondas de choque, ondas de sonido o electricidad, puede mejorar las diferentes formas de lisis, por ejemplo, mediante sonicación o ebullición. Un material que está configurado para conducir el calor puede ser un metal, por ejemplo, cobre y/o plata y/u oro y/o aluminio o plásticos duros. El metal puede estar recubierto en la parte exterior o interior del contenedor. Además, dicho metal también está configurado para conducir ondas de choque u ondas sonoras en caso de sonicación. En el caso de que se apliquen microondas al contenedor, se prefiere que el contenedor comprenda principalmente material plástico.
En otra modalidad preferida, al menos una pared interna del contenedor de preparación de muestras tiene características de baja unión y/o baja retención al menos parcialmente, preferiblemente mediante un recubrimiento al menos parcial con politetrafluoroetileno.
Alternativamente, las características de baja retención pueden resultar de una muy alta repelencia a los fluidos, por ejemplo, superhidrofobicidad. La alta repelencia a los fluidos puede lograrse mediante nanorrecubrimientos que tengan un ángulo de contacto alto, es decir, el ángulo entre el fluido y la superficie sólida de la pared interna, preferiblemente de más de 150°. Las características de baja retención también pueden lograrse mediante tratamiento de la superficie, por ejemplo, mediante la formación de una estructura similar a una papila del tamaño de una micra.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una cámara receptora configurada para acoplarse al contenedor de preparación de muestras de acuerdo con la invención en acuerdo con el punto (a) de la modalidad principal, y configurada para recibir compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos.
En una modalidad preferida del segundo aspecto, dicha cámara receptora comprende un elemento de acoplamiento, preferiblemente una rosca de tornillo, que está configurada para acoplarse a un elemento de acoplamiento correspondiente, preferiblemente una rosca de tornillo correspondiente, de un contenedor de preparación de muestras de acuerdo con la invención en acuerdo con el punto (a) de la modalidad principal.
Este aspecto de la invención prevé una cámara de recepción separada en la medida en que el contenedor de preparación de muestras de acuerdo con la invención no comprenda ya dicha cámara de recepción. La configuración mencionada para recibir compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos puede implementarse de tal manera que dicha cámara de recepción, cuando se acopla a dicho contenedor de preparación de muestras, esté separada de la cámara de reacción en dicho contenedor por dicho medio de cromatografía. Además y de manera análoga al punto (b) de la modalidad principal, la cámara receptora de acuerdo con el segundo aspecto está cerrada con la excepción de aquellas características que prevén una configuración para recibir compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos cuya configuración puede implementarse por el mencionado elemento de acoplamiento. La cara exterior cerrada está preferentemente configurada para abrirla para la obtención de compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos desde dicha cámara receptora.
La figura 1 muestra una modalidad ilustrativa del contenedor de preparación de muestras 100 de acuerdo con la invención. El contenedor de preparación de muestras 100 comprende una tapa de goma autosellante o un tapón de goma 101, una cámara de reacción 102, una superficie de un medio de cromatografía 104 que actúa como superficie de filtración 103. Se usa un sello 105 para sellar completamente la cámara de reacción 102 antes de la lisis de la muestra.
La tapa de goma autosellante o el tapón de goma 101 pueden ser penetrados por una aguja o varias agujas para introducir muestras, productos químicos o gas de protección. Además, la tapa de goma o el tapón de goma 101 se sella nuevamente después de retirar la aguja. La cámara de reacción 102 está construida para determinadas reacciones, como la lisis celular por sonicación, la alquilación de proteínas, por ejemplo, por yodoacetamida, y la proteólisis. La cámara de reacción 102 es preferiblemente de polipropileno o polietileno. Las paredes internas del contenedor de preparación de muestras 100 tienen preferiblemente características de baja retención. Por lo tanto, puede recubrirse con politetrafluoretileno (PTFE).
Junto a la cámara de reacción 102 hay un medio de cromatografía 104 que se usa para unir, purificar y/o en el que se encuentra el material celular de interés. En este contexto, la matriz puede diseñarse para realizar una cromatografía multidimensional que puede efectuarse mediante el uso de múltiples pilas de medios de cromatografía. La superficie 103 después del medio de cromatografía actúa como superficie de filtración. Sin embargo, también se podrían aplicar otras superficies encima de la superficie 103 del medio de cromatografía, por ejemplo, una matriz de filtración no vinculante como un filtro Millipore.
En el extremo del contenedor de preparación de muestras 100 opuesto a la tapa de goma autosellante 101, se forma un sello 105 que se usa para sellar completamente la cámara de reacción antes de la lisis de la muestra. Dado que el contenedor de preparación de muestras es de polietileno, el sello puede abrirse con unas tijeras o un cuchillo, de modo que se puedan realizar posteriormente los pasos de lavado, purificación y elución. Por lo tanto, se prefiere que en esta parte del contenedor de preparación de muestras 100 el grosor de la pared disminuya en comparación con el resto del contenedor de preparación de muestras 100.
En esta realización, el contenedor de preparación de muestras 100 tiene forma de cono. En consecuencia, el sello 105 puede quitarse fácilmente con tijeras en comparación con un contenedor de preparación de muestras 100 únicamente cilíndrico.
La figura 2 muestra una modalidad ilustrativa de un sistema que comprende un contenedor de preparación de muestras 100 y una cámara receptora 200 de acuerdo con la invención. En esta realización, el contenedor de preparación de muestras 100 puede tener forma cilíndrica. En lugar de un sello 105 en el lado opuesto del tapón de goma 101 de la tapa de caucho autosellante, el contenedor de preparación de muestras 100 comprende una pared 107 que está cerrada y sellada, en donde esa pared 107 está configurada para abrirse para la obtención de compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos. Por lo tanto, la pared 102 tiene un grosor pequeño en comparación con las otras paredes del contenedor de preparación de muestras 100. En consecuencia, la pared 107 puede atravesarse fácilmente con cualquier objeto afilado.
La figura 2 muestra además una cámara receptora 200 que está configurada para recibir dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos desde el contenedor de preparación de muestras 100. Por lo tanto, el lado superior de la cámara de recepción 200 puede estar abierto. Alternativamente, el lado superior de la cámara receptora se sella y el sello se abre inmediatamente antes de que la cámara receptora 200 reciba dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos desde el contenedor de preparación de muestras 100.
El contenedor de preparación de muestras 100 comprende además una rosca 108 en la proximidad de la pared 107 que está configurada para acoplarse con una rosca 208 correspondiente de la cámara receptora externa 200. Para acoplarse con el contenedor de preparación de muestras 100, la cámara de recepción 200 comprende una rosca de tornillo 208 que se ajusta a la rosca de tornillo 108 correspondiente del contenedor de preparación de muestras 100. Además, la rosca de tornillo 208 de la cámara receptora 200 tiene una extensión de borde afilado 208a en el extremo de la rosca de tornillo 208 que se orienta hacia el contenedor de preparación de muestras 100. Cuando la cámara receptora 200 se acopla al contenedor de preparación de muestras 100 mediante el acoplamiento roscado de ambas roscas 108 y 208, la extensión de borde afilado 208a penetra en la pared 107 del contenedor de preparación de muestras y el producto purificado y/o enriquecido con los compuestos bioorgánicos pueden recibirse a través de la pared penetrada 107.
Después de recibir los compuestos bioorgánicos, la cámara receptora 200 puede desacoplarse para su uso posterior.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos a partir de material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus, comprendiendo dicho método (a) introducir dicho material celular, virus y/o subcompuestos de dicho material celular y/o virus en una cámara de reacción de un contenedor, comprendiendo dicho contenedor además un medio cromatográfico y una cámara receptora, mediante la separación de dicho medio cromatográfico de dicha cámara de reacción de dicha cámara receptora, en donde la cara exterior de dicha cámara receptora está cerrada y configurada para abrirse para obtener dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos; (b) romper dicho material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus dentro de dicha cámara de reacción; y (c) dejar pasar el resultado del paso (b) a través de dicho medio cromatográfico, obteniendo así dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos en dicha cámara receptora; en donde los compuestos bioorgánicos comprenden al menos uno de los siguientes: proteínas; péptidos; polipéptidos; ácidos nucleicos tales como ácidos desoxirribonucleicos y ácidos ribonucleicos; lípidos que incluyen ácidos grasos y metabolitos; y en donde dicho método se realiza exclusivamente en dicho contenedor.
Dicha introducción puede efectuarse por cualquier medio, incluida una aguja de inyección que se usa preferentemente en este caso donde la cámara de reacción de dicho contenedor se cierra con una tapa, preferentemente una tapa de goma autosellante. Otros medios de introducción, en particular en aquellos casos en los que dicha cámara de reacción está abierta en lugar de estar cerrada por una tapa, incluye el pipeteo.
El término "perturbar" tiene el significado como se establece en la técnica. Se refiere a la desintegración de dicho material celular, virus y/o subcomponentes de los mismos, por lo tanto hace accesibles para análisis los constituyentes interiores de dicho material celular, virus y subcomponentes de los mismos. Los medios preferidos de interrupción se detallan más adelante.
Dicho permiso de acuerdo con el paso (c) puede comprender o consistir en colocar el contenedor de manera que la cámara de reacción esté ubicada por encima del medio cromatográfico de manera que la gravedad, la centrifugación y/o el aumento de la presión permitan que el resultado del paso (b) pase a través dicho medio cromatográfico; y/o apertura de la cámara receptora, apertura que puede permitir no sólo el paso del resultado del paso (b) por el medio cromatográfico, sino además la obtención de dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos. El término "obtención" se refiere a una eliminación de dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos de la cámara receptora, por ejemplo, con fines de análisis.
Un aspecto clave de la presente invención es que el método se realiza exclusivamente en dicho contenedor una vez que se han introducido dichos virus de material celular y/o subcompuestos de los mismos de acuerdo con el paso (a). Esto evita los engorrosos pasos de transferencia que pueden provocar la pérdida o contaminación de la muestra, como se detalla en la sección de antecedentes anterior en la presente descripción. La figura 3 proporciona evidencia de un rendimiento superior en comparación con los procedimientos establecidos en la técnica. Una aplicación práctica se muestra en el ejemplo 2. El método puede identificar y cuantificar proteomas completos como los descritos en este ejemplo (Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe). La mejora en la precisión proporcionada por la presente invención, entre otras cosas, permite estimar el número de copias de proteínas del proteoma completo. Los valores del número de copias son especialmente valiosos para la biología de sistemas, el modelado de sistemas (proporcionan cantidades iniciales y/o constantes de proteínas), así como el control de actividades biológicas como la degradación de proteínas.
En una modalidad preferida, dicha interrupción se efectúa mediante (a) sonicación; (b) ebullición en presencia de un agente caotrópico y/o un agente desnaturalizante; y/o (c) molienda de perlas en presencia de un agente físico tal como perlas de molienda. Estos son medios comunes de perturbación y pueden ser empleados por el experto en la técnica sin más preámbulos.
En una modalidad preferida tanto del primer como del tercer aspecto de la presente invención, dicho medio de cromatografía comprende (a) al menos uno de los siguientes materiales: materiales de fase inversa, materiales de intercambio catiónico, materiales de intercambio aniónico, materiales de modo mixto materiales de intercambio iónico, materiales formadores de complejos de iones, una matriz acoplada por afinidad que se acopla con anticuerpo y/o acopla con lectina; y/o (b) dos o más pilas de diferentes medios de cromatografía.
Los materiales cromatográficos preferidos son los materiales de fase inversa poli(estireno-divinilbenceno), material C4, C8, C18 como se usa en el ejemplo 1, material de intercambio catiónico tales como superficies de unión sulfonadas y material de intercambio de aniones como iones de amonio cuaternario tales como superficie de unión. Pueden usarse dos o más pilas o capas de diferentes medios de cromatografía para implementar dos o más pasos de cromatografía cuando se usa dicho contenedor de acuerdo con el primer aspecto y/o se realiza el paso (c) del método de acuerdo con el tercer aspecto.
En otra modalidad preferida del contenedor de acuerdo con el primer aspecto o el método de acuerdo con el tercer aspecto, (a) dichos compuestos bioorgánicos comprenden proteínas, péptidos y/o polipéptidos y dicho contenedor se caracteriza por uno, dos, tres o todos los siguientes (i) a (iv): (i) dicho contenedor comprende una proteasa, (ii) dicho contenedor comprende un agente alquilante; (iii) dicho contenedor comprende un patrón para análisis espectrométrico de masas; y (iv) el valor de pH en dicho contenedor está entre 8 y 9, preferiblemente 8,5; y/o (b) dichos compuestos bioorgánicos comprenden ácidos nucleicos y dicho contenedor se caracteriza por uno, dos o todos los siguientes: (i) dicho contenedor comprende una o más nucleasas, incluyendo preferiblemente una endonucleasa; (ii) dicho contenedor comprende reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, preferiblemente por PCR, y (iii) el valor de pH en dicho contenedor está entre 8 y 9, preferiblemente 8,5.
En otra modalidad preferida del contenedor de acuerdo con el primer aspecto o el método de acuerdo con el tercer aspecto, (a) dichos compuestos bioorgánicos comprenden una o más proteínas, péptidos y/o polipéptidos y dicho contenedor se caracteriza por uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o todos los siguientes (i) a (viii): (i) dicho contenedor comprende un detergente, preferiblemente SDC; (ii) dicho contenedor comprende un agente reductor, preferiblemente TCEP; (iii) dicho contenedor comprende un agente alquilante, preferiblemente cloroacetamida; (iv) el valor de pH en dicho contenedor está entre 7 y 9, preferentemente entre 8 y 9, con mayor preferencia entre 8,5; (v) dicho contenedor comprende un estándar para análisis espectrométrico de masas; (vi) dicho contenedor comprende un agente caotrópico, preferiblemente GdmCI; (vii) dicho contenedor comprende un producto químico estabilizador del analito tal como un antioxidante y/o un absorbente de UV; y (viii) dicho contenedor comprende al menos una enzima seleccionada de proteasas, preferiblemente tripsina y/o Lys-C; glicosidasas, preferiblemente PNGasa F; y quinasas; y/o (b) dichos compuestos bioorgánicos comprenden ácidos nucleicos y dicho contenedor se caracteriza por uno, dos o todos los siguientes: (i) dicho contenedor comprende una o más nucleasas, incluyendo preferiblemente una endonucleasa; (ii) dicho contenedor comprende reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, preferentemente por PCR; y (iii) el valor de pH en dicho contenedor está entre 8 y 9, preferiblemente 8,5; y/o (b) dichos compuestos bioorgánicos comprenden ácidos nucleicos y dicho contenedor se caracteriza por uno, dos o todos los siguientes: (i) dicho contenedor comprende una o más nucleasas, incluyendo preferiblemente una endonucleasa; (ii) dicho contenedor comprende reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, preferentemente por PCR; y (iii) el valor de pH en dicho contenedor está entre 7 y 9, preferentemente entre 8 y 9, con mayor preferencia 8,5.
Los subpuntos anteriores (i) a (viii) del punto (a) se presentan en orden de preferencia.
En dependencia del tipo de aplicación y/o del tipo de compuestos bioorgánicos a purificar y/o enriquecer, dicho contenedor puede prellenarse con uno o más agentes, los cuales son útiles, requeridos y/o específicos para la purificación y /o enriquecimiento de la clase específica de compuestos bioorgánicos en consideración. El apartado (a) proporciona agentes y/o condiciones adecuadas para la purificación y/o el enriquecimiento de proteínas, péptidos y/o polipéptidos.
Un detergente preferido es el desoxicolato de sodio (SDC).
Un agente reductor preferido es TCEP.
Los agentes alquilantes preferidos son yodoacetamida y cloroacetamida. Particularmente preferida es la cloroacetamida (CAA).
Particularmente preferido es el uso combinado de un agente alquilante que es cloroacetamida y un agente reductor que es TCEP.
El valor de pH de acuerdo con el punto (a) o (b), respectivamente, puede establecerse mediante el llenado previo del contenedor con material tampón, ya sea en forma de una solución acuosa tamponada o en forma de los constituyentes secos necesarios para la preparación de una solución tamponada.
Un estándar preferido para el análisis espectrométrico de masas es un estándar SUPER-SILAC como se describe en el documento WO2011/042467. Normalmente, dicho estándar muestra una distribución de isótopos que se desvía de la distribución de isótopos que se produce de forma natural. Por ejemplo, puede estar enriquecido con respecto a isótopos pesados o ligeros. Preferiblemente, y como se revela en el documento WO2011/042467, dicho estándar se obtiene mediante un método para preparar una mezcla estándar para cuantificar una o una pluralidad de primeras biomoléculas en una muestra, que comprende extraer una pluralidad de segundas biomoléculas que comprenden una o una pluralidad de biomoléculas de referencia de una mezcla de al menos dos células diferentes poblaciones, en donde dichas al menos dos poblaciones celulares diferentes son poblaciones de (i) células de diferentes tipos celulares, (ii) células de diferentes líneas celulares; (iii) células de diferentes linajes celulares; o (iv) células de diferentes cultivos celulares, en donde los cultivos se han sometido a diferentes condiciones de cultivo, en donde dicha una o dicha pluralidad de biomoléculas de referencia son una forma metabólicamente marcada con isótopos de dicha una o dicha pluralidad de primeras biomoléculas, y en donde dichas biomoléculas son proteínas o péptidos.
Como es evidente a partir de esta modalidad preferida, los contenedores de preparación de muestras precargados son de particular interés. Dado que el punto (a) de la modalidad preferida descrita anteriormente proporciona una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o todas las opciones especificadas, la reivindicación especifica inherentemente un número limitado de subcombinaciones de agentes o condiciones para establecerse en dicho contenedor de preparación de muestras. Las subcombinaciones particularmente preferidas son las siguientes. Cada una de las subcombinaciones proporcionadas a continuación se refiere a compuestos bioorgánicos (en la presente descripción también denominados "analitos") que son o comprenden una o más proteínas, péptidos y/o polipéptidos.
Las enzimas preferidas son las proteasas. Las proteasas preferidas son una o una combinación de Lys-C, Tripsina, AspN, GluC y Quimotripsina. Como se describió anteriormente, se prefieren particularmente tripsina y Lys-C, solas o una combinación de las mismas.
Como es evidente a partir de esta modalidad preferida, los contenedores de preparación de muestras precargados son de particular interés. Dado que el punto (a) de la modalidad preferida descrita anteriormente proporciona una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o todas las opciones especificadas, la reivindicación especifica inherentemente un número limitado de subcombinaciones de agentes o condiciones para establecerse en dicho contenedor de preparación de muestras. Las subcombinaciones particularmente preferidas son las siguientes. Cada una de las subcombinaciones proporcionadas a continuación se refiere a compuestos bioorgánicos (en la presente descripción también denominados "analitos") que son o comprenden una o más proteínas, péptidos y/o polipéptidos.
(1) Un contenedor de preparación de muestras, en donde dicho contenedor comprende, preferiblemente como únicos reactivos, un agente alquilante, un agente reductor, un detergente, y el valor de pH en dicho contenedor está entre 8 y 9. Particularmente preferido es un contenedor de preparación de muestras que comprende, preferiblemente como los únicos reactivos, CAA, TCEP, SDC y tampón Tris a pH 8,5.
(2) La modalidad (1) anterior, en donde dicho contenedor comprende además un patrón para análisis espectrométrico de masas, preferiblemente un patrón SILAC o un patrón SUPER-SILAC.
(3) La modalidad de acuerdo con (1) o (2), que además comprende una glicosidasa, una glicosidasa preferida es la PNGasa F.
De acuerdo con la modalidad preferida descrita anteriormente, dichas modalidades particularmente preferidas (1) a (3) definen al mismo tiempo también la implementación preferida del método de acuerdo con la presente invención. Como se describe en el presente documento, se prefiere que se añada una proteasa o una mezcla de proteasas inmediatamente antes de realizar la proteólisis, es decir, después de que se haya efectuado la lisis, la reducción y la alquilación.
Por consiguiente, se entiende que la presente invención proporciona, en otro aspecto, un contenedor cerrado para preparación de muestras, el contenedor comprende una cámara de reacción y un medio de cromatografía; en donde dicha cámara de reacción comprende, preferiblemente como únicos reactivos, un agente alquilante, un agente reductor, un detergente, y el valor de pH en dicho contenedor está entre 8 y 9; en donde (a) dicho medio de cromatografía está ubicado en una pared de dicha cámara de reacción, y dicha pared está cerrada o sellada y configurada para abrirse; o (b) dicho contenedor de preparación de muestras comprende además una cámara receptora, siendo dicha cámara receptora adyacente a dicho medio cromatográfico de manera que dicho medio cromatográfico separa dicha cámara de reacción de dicha cámara receptora, y la cara exterior de dicha cámara receptora está cerrada y configurada para abrirse. Los agentes alquilantes, agentes reductores y detergentes particularmente preferidos, así como los valores de pH, son aquellos de acuerdo con las modalidades particularmente preferidas (1) a (3) como se definió anteriormente en la presente descripción.
Un ácido nucleico preferido de acuerdo con el punto (b) es el ARNm. Una reacción preferida a realizar con dichos reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos es la creación de una biblioteca de ARN poli(A) para el análisis de RNA-seq (también denominado en la técnica como "secuenciación profunda de ARN") a partir de una pluralidad de ARNm comprendidos en dicho material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus. Los reactivos preferidos para la amplificación de ácidos nucleicos son sales adecuadas para RT-PCR, desoxinucleótidos (dNTP), cebadores (comúnmente cebadores poli-dT) y una transcriptasa inversa.
En otra modalidad preferida tanto del primer como del tercer aspecto de la presente invención, dicho contenedor comprende además (a) al menos uno de los siguientes productos químicos: perlas de molienda, detergentes, preferiblemente detergentes que se sabe que no interfieren con la cromatografía, caotrópicos tales como urea, tiourea o clorhidrato de guanidinio (GdmCI), agentes alquilantes como yodoacetamida y cloroacetamida, agentes reductores como ditiotreitol (DTT) o tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), disolventes orgánicos como acetonitrilo o metanol, patrones para análisis de espectrometría de masas como una mezcla SUPER-SILAC como se describe más arriba; y/o (b) al menos una de las siguientes enzimas: proteasa, nucleasa, descarboxilasa.
Un agente caotrópico preferido es GdmCI.
En una modalidad preferida adicional tanto del primer como del tercer aspecto de la presente invención, (a) dicho material celular es uno de: células intactas, lisado celular no clarificado, tejido, patógenos; y/o (b) dichos subcomponentes son estructuras subcelulares, en particular organelos. Los organelos ejemplares se mencionan más arriba.
Se entiende que el lisado celular no clarificado comprende desechos, formándose típicamente dichos desechos en el curso de la alteración de dicho material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus.
En otra modalidad preferida del método de la invención, en la medida en que dichos compuestos bioorgánicos sean proteínas, péptidos o polipéptidos, la etapa (b) de dicho método comprende además la reducción y la alquilación. En otra modalidad preferida del método de la invención, el paso (b) de dicho método comprende además la digestión proteolítica. Se prefiere que la digestión proteolítica se vea afectada después de la reducción y la alquilación. Se prefiere además que una o más proteasas requeridas para la digestión proteolítica se añadan al contenedor o a la mezcla de reacción inmediatamente antes de realizar dicha digestión proteolítica, es decir, después de que se haya realizado la reducción y la alquilación. En la medida en que la presente invención se refiere a contenedores de preparación de muestras precargados, es decir, contenedores de preparación de muestras que ya contienen uno o más reactivos, se prefiere que una proteasa no esté entre los agentes incluidos en el contenedor de preparación de muestras precargado.
En otra modalidad preferida, dicha obtención de dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos en dicha cámara receptora se efectúa (i) permitiendo que los productos del paso (b) entren y sean retenidos en dicho medio cromatográfico, y (ii) eluir dichos compuestos bioorgánicos.
Una vez que dicho material celular, virus y/o subcomponentes de dicho material celular y/o virus ha sido disgregado, y preferiblemente también sometido a los pasos de procesamiento adicionales detallados anteriormente en la presente descripción, dichos pasos de procesamiento adicionales preferidos incluyen reducción, alquilación y digestión proteolítica, se deja pasar la mezcla presente en dicha cámara de reacción a través de dicho medio cromatográfico. Típicamente, el material de alto peso molecular, que en esta etapa del procesamiento se considerará como contaminante, quedará retenido dentro de la cámara de reacción, más específicamente en la superficie del medio cromatográfico que mira hacia dicha cámara de reacción. Por otro lado, los compuestos de bajo peso molecular como la sal y, además, los agentes reductores y los agentes alquilantes, en la medida en que estén presentes, pasarán al medio cromatográfico. El medio cromatográfico generalmente retendrá los compuestos bioorgánicos, preferiblemente dichos péptidos, polipéptidos y péptidos. En la medida en que se haya efectuado la digestión proteolítica, dichos compuestos bioorgánicos, en esta etapa del procesamiento, estarán generalmente presentes en forma de péptidos. Con el propósito de eluir de acuerdo con el paso (ii) de la modalidad preferida descrita anteriormente, pueden usarse eluyentes establecidos en la técnica que se describen, por ejemplo, en Rappsilber y otros. (loc. cit.). Para proporcionar ejemplos preferidos, observamos que puede usarse acetonitrilo o metanol en caso de que el medio cromatográfico sea un material de fase inversa, como un material C18 o C8. Puede usarse amoníaco, acetato de amonio o formiato de amonio en caso de que se haya usado SCX como material cromatográfico. Puede usarse ácido fórmico, ácido acético y/o cloruro de sodio en caso de que se haya usado SAX como medio cromatográfico. Los eluyentes adicionales pueden ser elegidos por el experto en la técnica sin más preámbulos y en dependencia del medio cromatográfico.
En otra modalidad preferida del método en acuerdo con el tercer aspecto de la invención, dicho contenedor es un contenedor de acuerdo con la modalidad (b) del primer aspecto de la presente invención.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende o consiste en (a) un contenedor de preparación de muestras de acuerdo con el primer aspecto de la invención; y (b)(i) una proteasa, un agente alquilante, un estándar para análisis espectrométrico de masas y/o medios para establecer un valor de pH en dicho contenedor de entre 8 y 9, preferiblemente 8,5; y/o (ii) una nucleasa, preferiblemente una endonucleasa; y/o reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, preferentemente por PCR.
En relación con esto, la presente invención proporciona un kit que comprende o consiste en (a) un contenedor de preparación de muestras de acuerdo con el primer aspecto de la invención; y (b) (i) una proteasa, preferiblemente tripsina y/o Lys-C; un agente alquilante, preferiblemente cloroacetamida; un agente reductor, preferiblemente TCEP; un estándar para el análisis espectrométrico de masas; un agente caotrópico, preferiblemente GdmCI, o un detergente, preferiblemente SDC; y/o medios para establecer un valor de pH en dicho contenedor de entre 7 y 9, preferiblemente 8 y 9, con mayor preferencia 8,5; y/o (ii) una nucleasa, preferiblemente una endonucleasa; y/o reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, preferentemente por PCR.
Como se explicó más arriba, un contenedor de acuerdo con la presente invención puede llenarse previamente con uno o más agentes. Como alternativa, puede proporcionarse un contenedor vacío o solo parcialmente prellenado como componente (a) del kit de acuerdo con la invención, mientras que el agente adecuado para purificar y/o enriquecer determinados compuestos bioorgánicos puede proporcionarse como componente(s) separado(s) del kit de acuerdo con la invención.
En una modalidad preferida del kit, comprende además (a) al menos uno de los siguientes productos químicos: material de molienda de perlas, detergentes, agentes caotrópicos, agentes alquilantes como yodoacetamida, agentes reductores, solventes orgánicos, estándares para análisis de espectrometría de masas; (b) al menos una de las siguientes enzimas: proteasa, nucleasa, quinasa, glucosidasa; y/o (c) un manual con instrucciones para realizar el método de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención.
En una modalidad preferida del kit, comprende además (a) al menos uno de los siguientes productos químicos: material de molienda de perlas, detergentes, agentes caotrópicos, agentes alquilantes como yodoacetamida, agentes reductores, solventes orgánicos, antioxidantes, absorbentes de UV, patrones para análisis de espectrometría de masas; (b) al menos una de las siguientes enzimas: proteasa, nucleasa, quinasa, glicosidasa; y/o (c) un manual con instrucciones para realizar el método de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención. En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un sistema que comprende (a) un contenedor de preparación de muestras de acuerdo con la invención en acuerdo con el punto (a) de la modalidad principal; y (b) una cámara receptora de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.
Las figuras muestran:
Figura 1: Modalidad ilustrativa de un contenedor de preparación de muestras de acuerdo con la invención. A continuación se muestra una descripción de los elementos indicados por los números de referencia.
(100) Contenedor de preparación de muestras.
(101) Una aguja o agujas pueden penetrar una tapa de goma autosellante o un tapón de goma para introducir muestras, productos químicos o gas de protección. El tapón de goma se vuelve a sellar después de retirar la aguja.
(102) Se construye una cámara de reacción para determinadas reacciones, como la lisis celular mediante sonicación, la alquilación de proteínas, por ejemplo, mediante yodoacetamida, y la proteólisis.
(103) Una superficie del medio de cromatografía actúa como superficie de filtración. Se podrían aplicar otras superficies en la parte superior o en lugar de la superficie de filtración, por ejemplo, una matriz de filtración no vinculante tal como un filtro de microporos Millipore.
(104) Se usa un medio de cromatografía para unir, purificar y enriquecer el material celular de interés. La matriz puede diseñarse para realizar una cromatografía multidimensional que puede efectuarse mediante el uso de múltiples pilas de medios de cromatografía.
(105) Se usa un sello para sellar completamente la cámara de reacción antes de la lisis de la muestra. El sello puede abrirse para los pasos de lavado, purificación y elución.
Figura 2: Modalidad ilustrativa de un sistema que comprende un contenedor de preparación de muestras y una cámara receptora de acuerdo con la invención. A continuación se muestra una descripción de los elementos indicados por los números de referencia.
(100) Contenedor de preparación de muestras.
(101) Una aguja o agujas pueden penetrar una tapa de goma autosellante o un tapón de goma para introducir muestras, productos químicos o gas de protección. El tapón de goma se vuelve a sellar después de retirar la aguja.
(102) Se construye una cámara de reacción para determinadas reacciones, como la lisis celular mediante sonicación, la alquilación de proteínas, por ejemplo, mediante yodoacetamida, y la proteólisis.
(103) Una superficie del medio de cromatografía actúa como superficie de filtración. Se podrían aplicar otras superficies en la parte superior o en lugar de la superficie de filtración, por ejemplo, una matriz de filtración no vinculante tal como un filtro de microporos Millipore.
(104) Se usa un medio de cromatografía para unir, purificar y enriquecer el material celular de interés. La matriz puede diseñarse para realizar una cromatografía multidimensional que puede efectuarse mediante el uso de múltiples pilas de medios de cromatografía.
(107) Una pared que se cierra y sella, la pared se configura para abrirla para la obtención de compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos.
(108) Rosca de tornillo, por ejemplo, una rosca de tornillo hembra, configurada para acoplarse con una rosca de tornillo correspondiente, por ejemplo, una rosca de tornillo macho.
(200) Cámara receptora configurada para recibir dichos compuestos bioorgánicos purificados y/o enriquecidos.
El lado superior de la cámara receptora puede estar abierto o sellado.
(208) Rosca de tornillo, por ejemplo, una rosca de tornillo macho, configurada para acoplarse con una rosca de tornillo correspondiente, por ejemplo, una rosca de tornillo hembra.
(208a) Prolongación de bordes afilados en el extremo de la rosca de la cámara receptora que penetra en la pared del contenedor de preparación de muestras cuando la rosca de la cámara receptora está firmemente enroscada en la rosca correspondiente del contenedor de preparación.
Figura 3: Comparación del método de la presente invención con un protocolo en solución basado en SDC publicado. Este último método es el preferido de acuerdo con el estado de la técnica; ver León y otros. (Molecular & cellular proteomics 12 (10), 2992 (2013)). Se muestran las medianas de las identificaciones de péptidos únicos de triplicados técnicos ± S.E.M.
Figura 4: Reproducibilidad cuantitativa del proteoma en profundidad de S. cerevisiae y estimación del número de copias. (a) Frecuencia de identificación de proteínas de cuatro réplicas biológicas. Las proteínas identificadas en las cuatro ejecuciones se designan como proteoma central. (b) Señales de MS (intensidades de cuantificación sin marca (LFQ) de la salida de MaxQuant) de cinco proteínas representativas que abarcan todo el rango dinámico) en cuatro réplicas biológicas (c) Comparación de las intensidades de LFQ determinadas en el análisis de disparo único con las intensidades de LFQ determinadas en el análisis de 6 fracciones.
Figura 5: Cobertura en profundidad de los proteomas de levadura y estimación del número de copias de levadura, (a), (b) y (c) en base al conjunto de datos de S. cerevisiae. (d) y (e) en base al conjunto de datos de S. pombe. (a) Comparación de proteínas identificadas mediante el uso de análisis de 6 fracciones de iST-SCX con el Sproteoma experimental más profundo de S. cerevisiae (Peng y otros, Nature methods 9 (6), 524 (2012)). (b) Correlación de los números de copias estimados mediante el uso del análisis 6 fracciones iST-SCX con los números de copias informados mediante el uso de 21 estándares de péptidos sintéticos (Picotti y otros, Cell 138 (4), 795 (2009)). (c) Distribución de números estimados de copias. La línea roja vertical indica 100 copias por célula. Los contenedores azules representan proteínas que se identifican de forma única en el análisis de 6 fracciones iST-SCX. (d) Comparación de proteínas identificadas mediante el uso de análisis de 6 fracciones iST-SCX con proteínas reportadas en un estudio reciente que presenta el proteoma más profundo de S. pombe (Gunaratne y otros, Molecular & cellular proteomics (12(6):1741-51 (2013)). (e) Correlación de los números de copias estimados mediante el uso del análisis de 6 fracciones iST-SCX con los números de copias informados en otro análisis en profundidad reciente de S. pombe (Marguerat y otros, Cell 151 (3), 671 (2012)).
Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplo 1:
Purificación de péptidos para análisis de proteómica mediante espectrometría de masas
El sistema se ha probado en el campo de la proteómica mediante el uso de tubos completamente sellados o tubos sellados solo en un lado (generalmente el fondo, el fondo es la ubicación de la cámara receptora o donde puede unirse la cámara receptora, respectivamente). Las células se lisaron dentro del tubo descrito así como fuera del tubo sin ninguna desventaja notable para la lisis en el tubo. Las proteínas contenidas se digirieron proteolíticamente y los contaminantes brutos se filtraron en la superficie de la matriz de purificación de fase inversa C18, que se incrustó en material de teflón. Los péptidos se enriquecieron y desalinizaron sobre el material C18. Se eluyeron péptidos limpios del material C18 y posteriormente se analizaron por LC-MS/MS.
Los resultados demuestran una alta estabilidad y la capacidad de escalar hacia arriba o hacia abajo en términos de cantidades de muestra. La eficiencia aumentó considerablemente, de modo que no se observó pérdida alguna. La eficiencia del enfoque permite el procesamiento de unas pocas células individuales, lo que no era posible con las técnicas de vanguardia establecidas, como se muestra mediante el procesamiento de tan solo 500 células HeLa S3. La velocidad de procesamiento aumenta considerablemente en comparación con los métodos actuales con una preparación completa de la muestra en 1 h en comparación con al menos aproximadamente 4 h, o más comúnmente 12 h, con otros métodos vanguardia de la técnica. No se requiere conocimiento experto porque cada paso se simplifica y la fuente de fallo se reduce al mínimo. Se observaron muy pocas modificaciones no deseadas de los analitos (oxidación, modificación por luz ultravioleta, etc.). Se observaron tasas de identificación reproduciblemente altas mediante análisis LC-MS (tasa de identificación MS/MS del 60 %). La cantidad de contaminaciones se redujo significativamente, también cuando se trabajaba con muestras de baja cantidad. Los polímeros o plásticos pueden presentarse como fuente de contaminación, debido a uno o más pasos de transferencia, según se requiera para los procedimientos previamente conocidos. La preparación de muestras puede implicar trabajar con productos químicos nocivos y venenosos, tales como DTT y yodoacetamida, que pueden proporcionarse en un contenedor prellenado y sellado de la invención, lo que reduce el riesgo de daño. Los materiales separados, que podrían usarse para producir los recipientes de reacción, son bien conocidos y descritos y podrían combinarse de una manera muy económica. Una versión automatizada del sistema es factible y puede implementarse fácilmente.
Ejemplo 2:
Número de copias en S. cerevisiae y S. pombe
Los números de copias de proteínas son de gran interés para las comunidades biológicas y biológicas de sistemas y razonamos que un método minimalista de procesamiento de muestras y simplificado podría proporcionar valores particularmente imparciales. Para evaluar el método minimalista de procesamiento de muestras en el sistema modelo de levadura bien caracterizado, cultivamos S. cerevisiae en cuatro réplicas biológicas y se procesaron en paralelo en el formato de 96 pocillos (100 uL de cultivo a OD600 = 0,8). Cuatro análisis juntos de la única ejecución identificaron 4270 grupos de proteínas distinguibles y, sorprendentemente, el 97 % de ellos se detectaron en al menos tres de las cuatro réplicas con alta reproducibilidad cuantitativa (Cobertura de secuencia media total: 34,4 %, número total de identificaciones de péptidos únicos: 46 125; Figura 4a, b). En nuestro reciente análisis de proteoma de levadura en modo de ejecución única, que utilizó la misma configuración de LC-MS/MS aguas abajo (Nagaraj y otros, Molecular & cellular proteomics: MCP 11 (3), M111 013722 (2012)), la identificación media en cada ejecución individual fue de 4084 grupos de proteínas (33 122 ± 405 identificaciones de péptidos de secuencia única, mediana de cobertura de secuencias del 23,4 %), mientras que el método de procesamiento minimalista produjo números aún más altos (4144 grupos de proteínas, 37880 ± 1771 identificaciones de péptidos de secuencia única, cobertura de secuencia media 27,2 %).
El fraccionamiento SCX de una muestra de levadura directamente desde el dispositivo de reacción en seis viales del muestreador automático, seguido esencialmente por el mismo análisis LC-MS/MS que antes, cuantificó 4577 grupos de proteínas, el proteoma de levadura expresado más grande informado hasta la fecha. Es importante destacar que no identificamos ninguno de los 656 marcos de lectura abiertos dudosos, que se cree que no representan mensajes o proteínas expresadas. La excelente correlación de los valores de intensidad sin marca con los de un análisis de una sola ejecución (R2 = 0,91) muestra que el fraccionamiento en StageTip no introdujo ningún sesgo, incluso en la región de muy baja intensidad (Figura 4c).
El proteoma anterior más profundo de crecimiento exponencial de S. cerevisiae usó cinco enzimas proteolíticas diferentes, así como un extenso fraccionamiento de péptidos SCX basado en columnas (Peng y otros, Nature methods 9 (6), 524 (2012)). Nuestro único conjunto de datos de seis fracciones abarcó en gran medida el estudio anterior (94,9 %) y agregó 400 proteínas, entre las cuales las proteínas de membrana intrínsecas se enriquecieron significativamente (p = 9,4x10'6) (Figura 5a). A continuación, usamos la señal de MS sin etiqueta para cada proteína como una fracción de la señal de MS total del proteoma (Wisniewski y otros, Molecular systems biology 8, 611 (2012)) para estimar el número de copias de 4570 proteínas de levadura. El número de
previamente para 21 proteínas de levadura mediante el uso de 6 estándares de péptidos sintéticos y nuestros valores concuerdan bien dentro de las incertidumbres esperadas (R2 = 0,82) (Figura 5b). La proteína de levadura más abundante, con 1,6*106 copias por célula, fue la enzima glucolítica Tdh3p, que está codificada en tres loci genómicos. La proteína de levadura mediana tenía aproximadamente 800 copias por célula y un rango de número de copias de un factor de 2000 contenía más del 90 % de las proteínas. Los seis miembros del complejo ORC tienen un número medio de copias de 332 ± 150, una relación interesante con los 500 orígenes de replicación estimados en S. cerevisiae (Nieduszynski y otros, Nucleic acids research 35 (edición de la base de datos), D40 (2007)).
Nos intrigó que más de 763 proteínas de levadura tuvieran menos de 100 copias por célula (Figura 5c), una proporción mucho mayor que en un estudio clásico del número de copias de levadura (Ghaemmaghami y otros, Nature 425 (6959), 737 (2003)). Esta población se enriqueció significativamente para los términos del proceso del ciclo celular GO y la reparación del ADN (p <9*10'10 y <1,8*10'4, respectivamente).
Para proteínas de muy baja abundancia, una señal de MS débil puede introducir incertidumbres, sin embargo, medimos números de copias en gran medida consistentes para los miembros del complejo promotor de la anafase (APC), lo que indica alrededor de 30 APC por célula. Las proteínas que solo están presentes en determinados estados celulares se encontraron a menudo con un número de copias aparente muy bajo, como la ciclina CLB2 (fase G2/M), con 100 copias o el inhibidor de la quinasa FAR1 (fase G1) con unas 50 copias. Esto ilustra que nuestro conjunto de datos ya incluye contribuciones de varios estados proteómicos diferentes.
S. pombe divergió de S. cerevisiae hace más de 400 millones de años y proporciona un modelo comparativo interesante. El estudio proteómico más profundo de ese organismo empleó muy recientemente varias condiciones de crecimiento y un fraccionamiento ortogonal muy extenso para identificar 3542 proteínas (Gunaratne y otros, Molecular & cellular proteomics: MCP (2013)). Mediante el uso del enfoque de seis fracciones solo en células en crecimiento exponencial, obtuvimos 4087 proteínas mediante la búsqueda en la misma base de datos. Esto representa el 80 % del ORF de S. pombe y cubre el 96,5 % del proteoma anterior, así como 670 adicionales, generalmente de baja abundancia (Figura 5d). En referencia a otro proteoma profundo de S. pombe (Marguerat y otros, Cell 151 (3), 671 (2012)), nuestros números de copias de S. pombe coincidieron muy bien con los informados para 34 proteínas para las que se sintetizaron estándares marcados con isótopos (R2 = 0,89) y no hubo un sesgo aparente contra ninguna clase de proteína, incluidas las proteínas de membrana intrínsecas (Figura 5e). Las proteínas más abundantes tenían alrededor de 106 copias por célula, similar a S. cerevisiae, pero la proporción por debajo de 100 copias se redujo mucho (17 % vs. 3 %). El número medio de copias fue de 5137, aproximadamente seis veces mayor que en S. cerevisiae. El 5 % expresado más bajo del proteoma se enriqueció significativamente para el procesamiento de la horquilla de replicación y las proteínas relacionadas con la reparación del ADN (p <1,1*10-6 y <1,2*10-6, respectivamente). Esta fracción del proteoma contiene muchos ORF de S. pombe no caracterizados hasta ahora (59 de 207 proteínas; p <3,9x10-5).

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un kit que comprende o consiste en
(a) un contenedor de preparación de muestras (100) para la purificación o enriquecimiento de péptidos o polipéptidos a partir de material celular o virus, el contenedor comprende una cámara de reacción (102) y un medio de cromatografía (104);
en donde dicha cámara de reacción
(i) es para contener dicho material celular o virus y está configurado de manera que se pueden realizar en este las siguientes reacciones: lisis; purificación cromatográfica; reducción; alquilación; y reacciones enzimáticas; y
(ii) tiene una abertura en la parte superior;
en donde dicho medio de cromatografía está configurado para purificar o enriquecer dichos péptidos o polipéptidos;
en donde dicho medio de cromatografía está
(i) ubicado en una pared (107) en el fondo de dicha cámara de reacción, y dicha pared está cerrada o sellada y configurada para abrirla para la obtención de los péptidos o polipéptidos purificados o enriquecidos; y
(ii) configurado para realizar cromatografía de la parte superior al fondo con la gravedad como fuerza impulsora;
en donde la superficie (103) de dicho medio de cromatografía está configurada para actuar como una superficie de filtración o comprende otra capa de filtración o capa reactiva, con dicha superficie o capa orientada hacia el interior de dicha cámara de reacción;
(b) una proteasa;
(c) un agente alquilante; y
(d) un agente reductor.
2. El kit de la reivindicación 1, en donde al menos una pared interior del contenedor de preparación de muestras tiene al menos un recubrimiento parcial con politetrafluoroetileno.
3. El kit de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha proteasa es tripsina o Lys-C.
4. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho agente alquilante es cloroacetamida.
5. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho agente reductor es TCEP.
6. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho contenedor de preparación de muestras comprende además una tapa, dicha tapa está adyacente a dicha cámara de reacción y está configurada para permitir la alimentación de una muestra.
7. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha alimentación de una muestra es mediante la penetración con una aguja.
8. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha tapa está configurada para autosellarse después de dicha alimentación.
9. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho medio de cromatografía comprende al menos uno de los siguientes materiales: materiales de fase inversa, materiales de intercambio catiónico, materiales de intercambio aniónico, materiales de intercambio iónico de modo mixto, materiales que forman complejos iónicos, una matriz acoplada por afinidad que está acoplada a anticuerpos o acoplada a lectina.
10. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho medio de cromatografía comprende dos o más pilas de diferentes medios de cromatografía.
11. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho material celular es uno de: células intactas, lisado celular no clarificado, tejido, patógenos.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014096136A2 (en) 2012-12-19 2014-06-26 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Reaction vessel for sample preparation
TWI500915B (zh) * 2014-07-18 2015-09-21 Agricultural Chemicals And Toxic Substances Res Inst Council Of Agriculture 用於農產品農藥殘留檢測程序的快速萃取套件及使用該快速萃取套件從農產樣品取得檢液原液的方法
EP3274452B1 (en) 2015-05-27 2021-03-03 Qiagen GmbH Composition and method for disrupting tissue material
GB201519565D0 (en) * 2015-11-05 2015-12-23 Alere San Diego Inc Sample preparation device
IL259931B2 (en) 2015-12-16 2024-02-01 Gritstone Bio Inc Identification of neo-antigens, preparation, and use
WO2017151103A1 (en) * 2016-02-29 2017-09-08 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Enzymatic sample purification
CN105866317B (zh) * 2016-03-31 2018-06-29 南方科技大学 集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器及其应用
WO2018078106A1 (en) * 2016-10-28 2018-05-03 Preomics Gmbh Hydrophobicity-based flow prevention in sample preparation
JP7013804B2 (ja) * 2016-12-15 2022-02-01 株式会社リコー 容器及び校正用標準プレート
GB2563875B (en) * 2017-06-28 2020-08-19 Sutura Therapeutics Ltd Improvements in drug delivery
WO2019075112A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Gritstone Oncology, Inc. IDENTIFICATION OF NEO-ANTIGENS USING HOT POINTS
CA3083097A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Gritstone Oncology, Inc. Reducing junction epitope presentation for neoantigens
EP3759497A1 (en) * 2018-02-27 2021-01-06 Pierce Biotechnology, Inc. Improved methods for immunoaffinity enrichment and mass spectrometry
EP3586963A1 (en) 2018-06-29 2020-01-01 PreOmics GmbH Means and methods for lysing biological cells
CN113234598A (zh) * 2021-05-12 2021-08-10 深圳华大因源医药科技有限公司 一种微生物裂解方法及其试剂盒
CN113842672B (zh) * 2021-09-16 2023-02-03 暨南大学 一种固相微萃取薄膜及其制备方法与应用
CN115184526A (zh) * 2022-05-31 2022-10-14 南方科技大学 一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器及其应用
CN117169489A (zh) * 2023-07-18 2023-12-05 西湖实验室(生命科学和生物医学浙江省实验室) 一种用于处理生物样品以鉴定其中蛋白质的方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5137031A (en) * 1989-09-18 1992-08-11 La Mina Ltd. Urine testing apparatus with urinary sediment device
US5228988A (en) * 1989-10-27 1993-07-20 Helena Laboratories Corporation Column analyzer system and improved chromatograph column for use in the system
DE4420732A1 (de) * 1994-06-15 1995-12-21 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe
US6120985A (en) * 1997-10-31 2000-09-19 Bbi Bioseq, Inc. Pressure-enhanced extraction and purification
US6153147A (en) * 1998-10-06 2000-11-28 Craig; James J. Beverage analysis sample
CZ9900769A3 (cs) * 1999-03-04 2000-10-11 Petr Ing. Drsc. Hušek Použití špičky s filtrem k vytvoření sloupce sorbentu s definovaným objemem v prostoru pod filtrem
CA2445587A1 (en) 2001-04-26 2002-11-07 Boston Biomedica, Inc. Multichamber device and uses thereof for processing of biological samples
EP1495332A2 (en) * 2002-04-15 2005-01-12 Thermo Finnigan LLC Quantitation of biological molecules
JP2003339374A (ja) * 2002-05-24 2003-12-02 Hitachi Ltd 核酸分離カラム、装置及び核酸抽出方法
US20040242855A1 (en) * 2003-05-14 2004-12-02 Libert Sharon Ann Protein treatment process
US9097723B2 (en) * 2005-04-01 2015-08-04 Caliper Life Sciences, Inc. Method and apparatus for performing peptide digestion on a microfluidic device
US7622273B2 (en) * 2005-05-11 2009-11-24 Gibbs Bernard F Method for chemical and enzymatic treatment of posttranslationally modified proteins bound to a protein chip
JP5301287B2 (ja) * 2007-01-19 2013-09-25 ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 担体・流体封入分注チップ、担体・流体封入分注チップ処理装置、および担体・流体封入分注チップ処理方法
WO2008103828A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 William Brewer Pipette tips for extraction, sample collection and sample cleanup and methods for their use
WO2009016431A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Digilab, Inc. Sample preparation method and apparatus
EP2460002A4 (en) * 2009-07-31 2013-11-27 Waters Technologies Corp METHOD AND DEVICE FOR CARRYING OUT MASS SPECTROSCOPIES
DE102009041895A1 (de) 2009-09-18 2011-04-07 Heinrich, Hans-Werner, Prof. Dr. Einweg-Vorrichtung zur Aufbewahrung von biologischen Flüssigkeiten und deren Verwendung zum Nachweis von Stoffen, Partikel und/oder Zellen
EP2309262A1 (en) * 2009-10-06 2011-04-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for quantifying biomolecules
DE102010003223B4 (de) * 2010-03-24 2014-09-18 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Vorrichtung zum Einsetzen in einen Rotor einer Zentrifuge, Zentrifuge und Verfahren zum fluidischen Koppeln von Kavitäten
WO2014096136A2 (en) 2012-12-19 2014-06-26 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Reaction vessel for sample preparation

Also Published As

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US20180067021A1 (en) 2018-03-08
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WO2014096136A2 (en) 2014-06-26
HK1216867A1 (zh) 2016-12-09
SG11201504866XA (en) 2015-07-30
JP2016503163A (ja) 2016-02-01

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