JP2016503163A - 試料調製のための反応槽 - Google Patents
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Abstract
Description
用途のタイプ、および/または、精製および/または濃縮すべき生物有機化合物のタイプに依存して、前記容器は、1つ以上の薬剤で事前充填されてもよく、それらの薬剤は、検討中の特定のクラスの生物有機化合物の精製および/または濃縮にとって有用であり、必要とされており、および/または特異的である。項目(a)は、タンパク質、ペプチド、および/またはポリペプチドの精製および/または濃縮にとって好適な薬剤および/または条件を提供する。
好ましい還元剤は、TCEPである。
この発明の第1および第3の局面双方のさらに好ましい一実施形態では、(a)前記細胞物質は、無傷細胞、明らかにされていない細胞溶解物、組織、病原体のうちの1つであり、および/または(b)前記サブ成分はサブ細胞構造、特に細胞小器官である。例示的な細胞小器官は、上にさらに言及されている。
質量分光法を使用するプロテオミクス分析のためのペプチドの精製
システムが、プロテオミクスの分野で、完全に封止された管、または一方側(通常は底部、底部は受けチャンバの場所であり、または受けチャンバが取付けられ得る場所である)のみで封止された管を使用して試験された。細胞が、上述の管の内部で、および外部でも、管内溶解についての顕著な欠点なく溶解された。含有されたタンパク質がタンパク質分解消化され、未処理の汚染物質が、テフロン(登録商標)材料に埋込まれた逆相精製基質C18の表面上でろ過された。C18材料上で、ペプチドが濃縮され、脱塩された。清浄なペプチドがC18材料から溶離され、次にLC−MS/MSによって分析された。
出芽酵母および分裂酵母におけるコピー数
タンパク質コピー数は、生物系および生物群集にとって非常に興味深いものであり、我々は、合理化された最小主義の試料処理方法が、特に偏りのない値を提供し得ると推論した。よく特徴づけられた酵母モデル系に対する最小主義の試料処理方法を評価するために、我々は、出芽酵母を4つの生物学的複製で成長させ、それらを96ウェルフォーマットで並列処理した(OD600=0.8の100uL培養物)。4回の単一操業分析は合わせて4,270個の区別可能なタンパク質群を同定し、注目すべきことに、それらの97%は、4つの複製のうちの少なくとも3つで、高い量的再現性で検出された(総中央値シーケンスカバレッジ:34.4%、固有ペプチドIDの総数:46,125個、図4a、b)。同じ下流LC−MS/MSセットアップを使用した、シングル操業モードでの我々の最近の酵母プロテオーム分析(ナガラジ(Nagaraj)ら、Molecular & cellular proteomics:MCP 11(3)、M111 013722(2012))では、各個々の操業における平均同定は、4,084個のタンパク質群であった(33,122±405個のシーケンス固有ペプチド同定、中央値シーケンスカバレッジ23.4%)。一方、最小主義の処理方法は、さらに大きい数を生み出した(4,144個のタンパク質群、37,880±1771個のシーケンス固有ペプチド、中央値シーケンスカバレッジ27.2%)。
Claims (22)
- 細胞物質、ウイルス、および/または、前記細胞物質および/またはウイルスのサブ成分からの生物有機化合物の精製および/または濃縮のための試料調製容器であって、前記容器は反応チャンバとクロマトグラフィ媒体とを含み、
前記反応チャンバは、前記細胞物質、ウイルス、および/または、前記細胞物質および/またはウイルスのサブ成分を保持するためのものであり、たとえば超音波処理および/または沸騰による溶解;クロマトグラフィ精製;還元;アルキル化;およびタンパク質分解などの酵素反応、という反応のうちの少なくとも1つが内部で実行され得るように構成されており、
前記クロマトグラフィ媒体は、前記生物有機化合物を精製および/または濃縮するように構成されており、
(a)前記クロマトグラフィ媒体は前記反応チャンバの壁に位置しており、前記壁は閉鎖または封止されていて、精製および/または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されており、もしくは
(b)前記試料調製容器は、前記生物有機化合物を受けるための受けチャンバをさらに含み、前記受けチャンバは、前記クロマトグラフィ媒体が前記受けチャンバから前記反応チャンバを分離するように、前記クロマトグラフィ媒体に隣接しており、前記受けチャンバの外面は閉鎖されていて、精製および/または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されている、試料調製容器。 - 前記生物有機化合物は、タンパク質;ペプチド;ポリペプチド;核酸、たとえばデオキシリボ核酸およびリボ核酸;脂肪酸を含む脂質;および代謝産物、のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の試料調製容器。
- ふたをさらに含み、前記ふたは前記反応チャンバに隣接しており、たとえば針での貫通によって試料の供給を可能にするように構成されており、好ましくは供給後に自己再封止するように構成されている、請求項1または2に記載の試料調製容器。
- 前記クロマトグラフィ媒体の表面は、ろ過表面として作用するように構成され、および/または、さらなるろ過層および/または反応層を含み、前記表面または層は前記反応チャンバの内部に面している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の試料調製容器。
- シールをさらに含み、前記シールは前記受けチャンバに隣接しており、前記精製および/または濃縮された生物有機化合物を得るために構成されている、請求項1(b)〜4のいずれか1項に記載の試料調製容器。
- 前記容器は、ポリプロピレン;ポリエチレン;熱、マイクロ波、衝撃波、音波および/または電気を伝導するように構成された材料;低結合表面を有する材料;透明または不透明であるか、または電磁放射、好ましくは光を選択的に伝導する材料、のうちの少なくとも1つを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の試料調製容器。
- 試料調製容器の少なくとも1つの内壁は、好ましくはポリテトラフルオロエチレンを用いた少なくとも部分的なコーティングによって、少なくとも部分的に低い結合特性および/または低い保持特性を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の試料調製容器。
- 請求項1(a)に言及される範囲の、請求項1(a)〜7のいずれか1項に記載の試料調製容器に連結されるように構成され、精製および/または濃縮された生物有機化合物を受けるように構成された、受けチャンバ。
- 連結要素、好ましくはねじ山を含み、それは、請求項1(a)に言及される範囲の、請求項1(a)〜7のいずれか1項に記載の試料調製容器の対応する連結要素、好ましくは対応するねじ山に連結されるように構成されている、請求項8に記載の受けチャンバ。
- 細胞物質、ウイルス、および/または、前記細胞物質および/またはウイルスのサブ成分から、精製および/または濃縮された生物有機化合物を調製する方法であって、前記方法は、
(a)前記細胞物質、ウイルス、および/または、前記細胞物質および/またはウイルスのサブ成分を、容器の反応チャンバに導入するステップであって、前記容器はクロマトグラフィ媒体と受けチャンバとをさらに含み、前記クロマトグラフィ媒体は前記受けチャンバから前記反応チャンバを分離しており、前記受けチャンバの外面は閉鎖されていて、前記精製および/または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されているステップと、
(b)前記反応チャンバの内部で、前記細胞物質、ウイルス、および/または、前記細胞物質および/またはウイルスのサブ成分を分裂させるステップと、
(c)ステップ(b)の結果が前記クロマトグラフィ媒体を通過することを可能にし、それにより、前記受けチャンバにおいて前記精製および/または濃縮された生物有機化合物を得るステップとを含み、
生物有機化合物は、タンパク質;ペプチド;ポリペプチド;デオキシリボ核酸およびリボ核酸などの核酸;脂肪酸を含む脂質;および代謝産物、のうちの少なくとも1つを含み、
前記方法は、前記容器内でのみ行なわれる、方法。 - 前記分裂させるステップは、
(a)超音波処理、
(b)カオトロピック剤および/または変性剤の存在下での沸騰、および/または
(c)ミリングビーズなどの物理的作用物の存在下でのビーズミリング、によって遂行される、請求項10に記載の方法。 - 前記クロマトグラフィ媒体は、
(a)逆相材料、陽イオン交換材料、陰イオン交換材料、混合モードイオン交換材料、イオン錯化材料、抗体結合および/またはレクチン結合された親和性結合基質、という材料のうちの少なくとも1つ、および/または
(b)異なるクロマトグラフィ媒体の2つ以上のスタック、を含む、
請求項1〜7のいずれか1項に記載の試料調製容器、もしくは請求項10または11に記載の方法。 - (a)前記生物有機化合物は、1つ以上のタンパク質、ペプチド、および/またはポリペプチドを含み、前記容器は、
(i)前記容器が洗剤、好ましくはSDCを含むこと、
(ii)前記容器が還元剤、好ましくはTCEPを含むこと、
(iii)前記容器がアルキル化剤、好ましくはクロロアセトアミドを含むこと、
(iv)前記容器内のpH値が7〜9、好ましくは8〜9、より好ましくは8.5であること、
(v)前記容器が質量分光分析用スタンダードを含むこと、
(vi)前記容器がカオトロピック剤、好ましくはGdmClを含むこと、
(vii)前記容器が、酸化防止剤および/またはUV吸収剤などの分析物安定化化学物質を含むこと、
(viii)前記容器が、プロテアーゼ、好ましくはトリプシンおよび/またはLys−C;グリコシダーゼ、好ましくはPNGase F;およびキナーゼ、から選択される少なくとも1つの酵素を含むこと、
のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、またはすべてによって特徴づけられ、および/または
(b)前記生物有機化合物は核酸を含み、前記容器は、
(i)前記容器が、好ましくはエンドヌクレアーゼを含む1つ以上のヌクレアーゼを含むこと、
(ii)前記容器が、好ましくはPCRによる核酸増幅用試薬を含むこと、および
(iii)前記容器内のpH値が7〜9、好ましくは8〜9、より好ましくは8.5であること、
のうちの1つ、2つ、またはすべてによって特徴づけられる、
請求項1〜7または12のいずれか1項に記載の試料調製容器、もしくは請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記容器はさらに、
(a)ミリングビーズ、洗剤、カオトロピック剤、アルキル化剤、還元剤、有機溶剤、質量分光分析用スタンダード、という化学物質のうちの少なくとも1つ、および/または
(b)プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、デカルボキシラーゼ、という酵素のうちの少なくとも1つを含む、請求項1〜7または12のいずれか1項に記載の試料調製容器、もしくは請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。 - (a)前記細胞物質は、無傷細胞、明らかにされていない細胞溶解物、組織、病原体のうちの1つであり、および/または
(b)前記サブ成分はサブ細胞構造、特に細胞小器官である、請求項1〜7または12〜14のいずれか1項に記載の試料調製容器、もしくは請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。 - 前記方法のステップ(b)は、還元およびアルキル化をさらに含む、前記生物有機化合物がタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである範囲の、請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法のステップ(b)は、タンパク質分解消化をさらに含む、請求項10〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記受けチャンバにおいて前記精製および/または濃縮された生物有機化合物を得る前記ステップは、
(i)ステップ(b)の生成物が前記クロマトグラフィ媒体内に入って保持されることを可能にすること、および
(ii)前記生物有機化合物を溶離すること、によって遂行される、請求項10〜17のいずれか1項に記載の方法。 - 前記容器は、請求項1(b)〜7または12〜15のいずれか1項に定義されたような容器である、請求項10〜18のいずれか1項に記載の方法。
- (a)請求項1〜7または12のいずれか1項に記載の試料調製容器と、
(b)(i)プロテアーゼ、好ましくはトリプシンおよび/またはLys−C;アルキル化剤、好ましくはクロロアセトアミド;還元剤、好ましくはTCEP;質量分光分析用スタンダード;カオトロピック剤、好ましくはGdmCl;洗剤、好ましくはSDC;および/または、前記容器内で7〜9、好ましくは8〜9、より好ましくは8.5というpH値を確立するための手段、および/または
(ii)ヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼ;および/または、好ましくはPCRによる核酸増幅用試薬、とを含む、もしくはそれらからなる、キット。 - (a)ビーズミリング材料、洗剤、カオトロピック剤、ヨードアセトアミドなどのアルキル化剤、還元剤、有機溶剤、酸化防止剤、UV吸収剤、質量分光分析用スタンダード、という化学物質のうちの少なくとも1つ、
(b)プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、デカルボキシラーゼ、キナーゼ、グリコシダーゼ、という酵素のうちの少なくとも1つ、および/または
(c)請求項10〜19のいずれか1項に記載の方法を行なうための使用説明を有するマニュアル、をさらに含む、請求項20に記載のキット。 - (a)請求項1(a)に言及される範囲の、請求項1(a)〜7または12〜15のいずれか1項に記載の試料調製容器と、
(b)請求項8または9に記載の受けチャンバとを含む、システム。
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