JP2004536292A - マルチチャンバデバイスおよび生物試料の加工処理のためのその用途 - Google Patents
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Abstract
昆虫、真菌、細菌、ならびに植物および動物の組織などの生物試料の、均質化、加工処理、検出および分析のためのデバイスおよび方法が記載されている。上記デバイス内の複数のチャンバにより、得られた均質化産物をさらに加工処理し、精製し、分析することができるか、および／または代謝物、タンパク質、核酸などの生体分子、あるいは薬学的生成物を検出することができるというように、各段階において異なる加工処理機能を実施することができる。本デバイスは、静水圧装置内で用いることができ、該装置内において、様々な作業、すなわちインキュベーション、試薬の添加または更新、およびシグナルの発生と検出を適切なチャンバ内で実施することができる。本方法では、従来の手法と比較して、化学的および酵素的分解からの生体分子の保護性が向上している。さらに、本方法は、試料の調製と分析的プロセスの自動化を可能にする。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、随意で試料由来の材料の分析および／または検出を伴う、生物試料の調製（例えば、均質化）および加工処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）のための方法およびマルチチャンバデバイスの分野に関する。個々の実施形態は、バイオテクノロジー、医学的診断、農業、食品、科学捜査、薬学、環境学および獣医学における用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
生物試料はその単離後に処理工程や分析にかけられることが多い。このような試料の加工処理には、典型的には、生物組織の均質化、細胞の溶解、固体粒子の懸濁または可溶化、および固体材料の液化のうちの１つ以上が含まれる。また試料調製には、長時間にわたる酵素的消化、過酷な化学薬品、および／または機械的破砕を伴うことも多い。この最初の調製に続いて、試料は、試料中の核酸および／またはタンパク質などの目的の特定の分子を精製または増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはゲル電気泳動などの技術を用いてさらなる加工処理にかけることもできる。加工処理後、試料は典型的には分析および／または検出の工程にかけられる。
【０００３】
植物および動物の組織、ならびに強靱な細胞壁を有する例えばある種のマイコバクテリアなどの細菌に分子的技術を応用する場合、ある困難に直面することがある。このような試料から生物分子を抽出するための現行の方法は、複数の工程を用いた複雑な加工処理を必要とするために限界があり、非常な時間と労力、ならびに費用を要することもある。細菌または組織の加工処理は、例えば、リゾチームまたはプロテイナーゼＫなどの酵素による長時間にわたる前処理またはガラスビーズを用いた粉砕を必要とする場合もある。細胞や組織によっては、乳棒と乳鉢、ビーズミル、ロータ−ステータホモジナイザー、ブレードブレンダ、超音波破砕機、粉砕機、乳鉢とチューブグラインダー、肉ひき機、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）、またはフレンチプレス（登録商標）などの道具を必要とする、さらなる機械的破砕が必要とされることも多い。例えば、組み換え細菌構築物の高レベル発現によって生産されるような、不溶性（封入体）タンパク質の調製や抽出のためには、長時間にわたる加工処理工程が要求される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
試料の生物学的特性の分析では、核酸、タンパク質、抗体、因子または該試料から抽出される活性を検出するなどの、さらなる加工処理が必要になることもある。このようなさらなる加工処理は、核酸と特異的なプライマーまたはプローブとのハイブリダイゼーション、増幅、および特異的シグナルの検出などのさらに別の工程を必要とすることもある。タンパク質または抗体活性の分析のためには、特異的リガンドへの結合または該リガンドからの溶離、抗原抗体反応性、または他の「加工処理」システムが、所望の生成物の同定および／または精製のために必要とされることもある。生物活性試験は、抽出物を酵素および／または補因子のカスケードとともにインキュベートして、検出可能な生成物を生成させることを含んでいてもよい。これらの分子を遊離するための緩和でありながらも効率的な方法が望まれている。
【０００５】
プロセス全体を簡略化し、広範な標本タイプにわたって方法を標準化し、自動化しやすく、試料成分、特に生体分子の分解を制限するように設計された装置および手法を用いて、生物試料を調製、加工処理および分析することが非常に望ましい。
【０００６】
試料調製工程の簡略化または自動化によって、時間と費用を節約することができ、例えば、試料の手動操作の減少により、分析技術からより信頼性のある出力が得られるようになる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、自動化しやすく、所望のプロセスのうちの少なくとも１つが高圧を用いて実施されるようなマルチチャンバデバイスのチャンバ内で、様々な精製および／または分析工程を実施することを可能にする。
【０００８】
本発明は、貫通可能および／または多孔性バリアによって分離された複数のチャンバを有するデバイス内の試料に、周期的圧力、可変温度、またはその両方を与えることにより、生物試料を制御および自動化された方法で処理することが可能になるという発見に少なくとも部分的に基づいている。この新しいデバイスは液体試料とともに使用するのに適しているが、同様にして、植物全体または動物組織などの固体または半固体試料、およびガス状試料とともに使用することもできる。
【０００９】
新規のデバイスおよび方法は試料を装入および装出するための単純な形式を提供し、上記方法は一般的に自動化が可能でありながらも、組織試料を効果的に分断化、均質化、加工処理することができる。本方法およびデバイスでは、試料が一般的に連続して処理されるため、試料および試薬の移送の必要性が軽減される。本発明の１つの実施形態において、組織の大きな塊はまず最初により小さい小片に分断化された後、完全に均質化されるが、試料のさらなる加工処理前に、標的とする生体分子が容認できないほど分解されることは回避される。核酸やタンパク質などの生体分子の遊離は効率的であり、これらの分子の機能（例えば溶解物中）はよく維持されている。試料を均質化して、生体分子を遊離させた後、試料は、典型的にはマルチチャンバデバイスの後続のチャンバに押込まれた後に、さらなる加工処理を受ける。試料のさらなる加工処理としては、特に限定されないが、以下の工程の１つまたは組み合わせが挙げられる。クロマトグラフィー、固相捕捉、またはゲル電気泳動による精製；酵素的加工処理；生体分子の増幅（例えばＰＣＲ）；タンパク質相互作用の加工処理および／または検出；化学的修飾；基質ラベリング；基質の可溶化；および基質検出。
【００１０】
本方法の均質化の態様は、高静水圧サイクル技術（「ＰＣＴ」）と連結して容易に用いられる。生物試料の分析にＰＣＴ技術を使用することは、以下の文献中など、他所に一般的に記載されている。下記の文献は、引用によりその全体が本願に組み込まれる。ローハーン・ジュニア（Ｌａｕｇｈａｒｎ，Ｊｒ．）らの米国特許第６，１１１，０９６号；ローハーン・ジュニアらの米国特許第６，１２０，９８５号；ヘス（Ｈｅｓｓ），Ｒとローハーン・ジュニアらの米国特許第６，１２７，５３４号；ヘス，Ｒとローハーン・ジュニアの米国特許第６，２４５，５０６号；ローハーン・ジュニアらの米国特許第６，２５８，５３４号；ローハーン・ジュニアらの米国特許第６，２７０，７２３号；ローハーン・ジュニアらの米国特許第６，２７４，７２６号および国際出願国際公開第９９／２２８６８号。試料に与えられる物理的変化としては、固体または他の物質がスクリーンを通過する際の、例えば、圧力による相変化、高圧下における体積変化および、均質化などが挙げられる。このようなプロセスは、自動化に容易に適用可能である。
【００１１】
１つの実施形態において、本発明は、圧力調節装置において用いるための試料調製デバイスを特徴とする。このデバイスは、複数のチャンバと、２つのチャンバ間に配置された少なくとも１つのバリアと、少なくとも１つの加圧部材であって、試料を高圧に供して少なくとも１つのバリアに試料を強制通過させるように配置されたラムなどの加圧部材とを含む。バリアは、多孔性または貫通可能性（例えば隔壁）のいずれであってもよく、あるいは、物理的、化学的または機械的刺激に暴露することにより多孔性または貫通可能にするようにしてもよい。チャンバのうちの１つ以上を単一の一体化成形されたデバイスの一部としてもよい。
【００１２】
いくつかの場合において、スクリーンまたはシュレッダなどのバリアを、第１のチャンバと第２のチャンバとの間に配置して、バリア内の開口部が第１のチャンバと第２のチャンバとの間の材料（例えば、固体、半固体、液体または気体）の連通を可能にするようにしてもよい。
【００１３】
他の場合において、前記デバイスは、各チャンバ間に配置された複数のバリアを有する３つ以上のチャンバを含んでいてもよい。バリアのうちの少なくとも１つを、多孔性または貫通可能なものとしてもよいし、あるいは物理的、化学的または機械的刺激に暴露することによって多孔性または貫通可能なものとしてもよい。このデバイスは、それぞれ独立して、例えば異なる静水圧で作動させることのできる２つ以上の加圧部材をさらに含んでいてもよい。少なくとも１つの加圧部材、例えばラムは、試料を高圧に供して、該試料を少なくとも１つのバリアを強制通過させる位置に配置されている。チャンバのうちの２つ以上をネジ込み機械的インターロックまたはネジ付機構によって互いに連結することもできる。
【００１４】
チャンバはプラスチック、ゴム、セラミック、金属またはガラス、あるいはこれらの材料の任意の組み合わせで作成することができる。例えば、チャンバの最大容量は、約１００μＬ、約５００μＬ、約１ｍＬ、約１００ｍＬ、あるいは約５００ｍＬとすることができる。１つ以上のチャンバの表面を、生体分子に対して不活性化してもよい。１つ以上のチャンバの表面を、生体分子または薬学的有効成分または金属キレート剤などの小さい有機分子を用いて、共有結合、イオン相互作用、または非特異的吸着を介して誘導化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）することもできる。いくつかの場合において、少なくとも１つのバリアは穿刺可能（すなわち鋭利な物を用いて穿孔可能）であり、少なくとも１つのバリアは有機溶媒に溶解可能であり（例えば、テトラヒドロフランまたは酢酸エチルによって溶解可能なポリ（メタクリル酸メチル）バリア）、少なくとも１つのバリアは機械的に除去可能であり（例えば、ラムまたは他のデバイスの作用によって）、少なくとも１つのバリアは温度変化を介して除去可能であり（例えば、ワックスバリアは加熱によって溶解させることができ、低融点ポリマーで閉塞された多孔性セラミックバリアは、加熱によって多孔性にすることができる）、少なくとも１つのバリアはバルブ（例えば、一方向弁）を含んでいてもよく、あるいは少なくとも１つのバリアは以下の機構のいずれか１つまたは組み合わせによって除去することができる。上記機構としては、穿刺、溶媒和、融解、破壊、および機械的除去（例えば、ネジを外す、こじ開ける）が挙げられる。バリアは、ポリマー、金属、またはセラミックから作成することができる。バリアは、複合固体材料または固体材料の層（例えば、砂やシリカゲル）から構成することもできる。バリアは、精製または分析のために所望の基質を捕捉または除外するためのフィルタを含んでいてもよい。フィルタは、塩化ポリビニル、ポリエーテルスルフォン、ナイロン、ニトロセルロース、セルロースエステル、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリフルオロエチレン（ＰＦＴＡ）、ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたは他の材料から作成することができる。バリアは、例えば、複数の開口部を有していてもよく、該開口部は、例えば円形であってもよく、約１μｍ〜約３ｃｍ（例えば、約１μｍ〜約１００μｍ、約０．１ｍｍ〜１ｍｍ、約１ｍｍ〜１ｃｍ、約１ｃｍ〜３ｃｍ、または前記範囲または中間範囲の任意の組み合わせ）の直径を有していてもよい。バリアは、例えばポリマー、金属またはセラミックからなる複数の固体の尖った凸部を含んでいてもよい。尖った凸部は、例えば、ピラミッドまたは円錐形状とすることができ、例えば、スクリーンの基部の上方に、約０．０１〜３ｃｍ（例えば、０．０１ｃｍ、０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．５ｃｍ、０．８ｃｍ、１ｃｍ、１．５ｃｍ、２ｃｍ、２．５ｃｍ、または３ｃｍ、あるいは任意の中間範囲）延びるものであってよい。
【００１５】
加圧部材は、例えば、チャンバに関して相対移動するように取り付けられ、例えばポリマー、金属またはセラミックからなるものであってよい、少なくとも１つのラムを含むもの（もしくはそれ自体）であってよい。加圧部材は、例えば、円形の断面（例えば部材は円柱または円錐状であってもよい）を有していてもよい。チャンバは、例えば、壁を含んでいてもよく、加圧部材は、該加圧部材が移動する際に前記壁と接触する１つ以上の環状封止材（例えば、ゴムまたはテフロンＯリング）を含んでいてもよい。封止材は、例えば、高分子、金属またはセラミック材料から作成することができる。加圧部材は、例えば、その周囲に封止リングを有するシリンダであってもよく、その場合チャンバは略円筒状とすることができる。いくつかの場合において、デバイスは、一方はバリアの第１の側に配置され、他方はバリアの第１の側と対向する第２の側に配置される、少なくとも２つの加圧部材を含んでいてもよい。２つ以上のチャンバに加圧部材を取り付けてもよい（図１５）。
【００１６】
デバイスは、オリフィスを有する容器を含んでいてもよく、この場合チャンバはオリフィス内に配置することができる。１つ以上のチャンバを流体で充填してもよい。また１つ以上のチャンバは、温度制御デバイス、温度サイクルデバイス、圧力制御デバイス、圧力サイクルデバイス、または適当なセンサを含んでいてもよい。
【００１７】
またデバイスの複数のチャンバは、随意で圧力調節装置内で相互接続されていてもよい。いくつかの場合において、多数のデバイス（例えば、２，３，４，６，８，１０，１２またはそれ以上のデバイス）を細長い列を形成するように相互接続してもよいし、あるいは２次元マトリクス（例えば、８×１２，４×４，２×２，４×６または３×５）を形成するように相互接続してもよい。
【００１８】
いくつかの場合において、試薬を収容した１つ以上のチャンバが、試料を収容するチャンバを環状に包囲するようにしてもよく、この場合、圧力によって作動されるバルブを介して試薬を試料に導入することができる。
【００１９】
チャンバのうちの少なくとも１つは、試料の加工処理の間にチャンバに電流を通過させる電極を備えていてもよい。
他の実施形態において、本発明は、圧力調節装置において使用するための試料加工処理デバイスを特徴とする。このデバイスは、垂直配置で配置された複数のチャンバと、チャンバ対間に配置された複数の一時的バリアと、バリアに試料を強制通過させるように配置された加圧部材とを含んでいる（図１４を参照）。随意で、このデバイスは第１のチャンバと第２のチャンバの間に配置された多孔性バリアを含んでいてもよい。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、生物試料の加工処理方法を特徴とする。この方法は、上述のようなデバイスを提供することと、試料を該デバイスの第１のチャンバに添加することと、該デバイスを高圧力（例えば、少なくとも約６９０ｋＰａ（１００ｐｓｉ）、約１７２４ｋＰａ（２５０ｐｓｉ）、約３，４４８ｋＰａ（５００ｐｓｉ）、約５，１７１ｋＰａ（７５０ｐｓｉ）、約６，８９５ｋＰａ（１，０００ｐｓｉ）、約３４，４７５ｋＰａ（５，０００ｐｓｉ）、約６８，９５０ｋＰａ（１０，０００ｐｓｉ）、約１３７，９００ｋＰａ（２０，０００ｐｓｉ）、約２０６，８５０ｋＰａ（３０，０００ｐｓｉ）、約２７５，８００ｋＰａ（４０，０００ｐｓｉ）、約３４４，７５０ｋＰａ（５０，０００ｐｓｉ）、約４１３，７００ｋＰａ（６０，０００ｐｓｉ）、約４８２，６５０ｋＰａ（７０，０００ｐｓｉ）、約５５１，６００ｋＰａ（８０，０００ｐｓｉ）、約６２０，５５０ｋＰａ（９０，０００ｐｓｉ）、約６８９，５００ｋＰａ（１００，０００ｐｓｉ）、あるいはそれ以上）に供して、加圧部材が、試料を強制的に第１のチャンバと第２のチャンバの間のバリアを通過させて第２のチャンバに流入させるようにすることを含む。
【００２１】
試料は、例えば、加圧部材によって複数のバリアを強制通過されるようにしてもよい。生物試料としては、例えば、固体材料、半固体材料、および／または液体が挙げられる。特定の実施形態において、生物試料としては、例えば、昆虫または小動物、真菌、植物または動物組織、食品または農産物、科学捜査試料、ヒト組織（筋肉、腫瘍または臓器など）、血清、唾液、血液または尿が挙げられる。生物試料は随意で凍結されていてもよい。生物試料の大きさは、例えば、約０．１ｍｇ〜５００ｇ（例えば、０．１ｍｇ〜１．０ｍｇ、１．０ｍｇ〜１０ｍｇ、１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１００ｍｇ〜１ｇ、１ｇ〜２０ｇ、２０ｇ〜１００ｇ、１００ｇ〜２００ｇ、２００ｇ〜５００ｇ）とすることができる。
【００２２】
高圧力は、例えば、周囲温度または周囲温度より高い温度もしくは低い温度にて、印加することができる。そのような温度としては、例えば、周囲温度、その温度を下回ると大気圧下で試料が凍結するような温度（すなわち、試料の大気圧凍結温度）、試料の大気圧凍結温度から約４℃までの範囲の温度、４℃から周囲温度の間の温度、周囲温度から９０℃の間の温度、あるいはそれ以上（例えば、−８０℃、−４０℃、−２０℃、０℃、４℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、あるいはそれ以上）が挙げられる。
【００２３】
高圧力は、（例えば、ミリ秒の範囲の頻度で（すなわち、１〜１０，０００Ｈｚ）、秒の範囲の頻度で（すなわち、０．０１〜１Ｈｚ）、分の範囲の頻度で（すなわち、０．１〜１０ｍＨｚ）周期的に反復することもできる。
【００２４】
本方法は、試料の調製後または試料の調製の一環として、試料を分析する工程と、生物試料から特定の物質を抽出する工程と、および／または、生物試料からの特定の物質を加工処理する工程とをさらに含んでいてもよい。例えば、試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または薬学的組成物（例えば、薬学的に活性な分子、天然の生成物、薬物、または薬物代謝物）は、試料調製の後またはその一環として単離してもよく、および／または、試料の一部（例えば核酸）を増幅させ（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いて）、リガンドに結合させ、リガンドから溶離させ、配列決定するか、ハイブリダイズさせてもよく、および／または、試料の一部を、特に限定されないが、抗原抗体反応、酵素反応、触媒反応、またはデバイスの各チャンバ内で異なる工程が起こる段階的反応などを含む化学反応に供してもよい。
【００２５】
特に明記しない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書に記載したものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料については以下に記載する。本明細書中で述べたすべての出版物、特許出願、特許、および他の引例は、その全体が引用により本願に組み込まれる。抵触の場合には、定義を含めた本明細書が支配することになる。さらに、材料、方法および実施例は説明のためのものにすぎず、限定することを意図していない。
【００２６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記載のなかに挙げる。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明および図面から、ならびに請求項から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
様々な図面中で用いる同様の参照符号は、同様の要素を示している。
圧力駆動式細胞溶解方法は、米国特許第６，１１１，０９６号に記載されており、この特許の全体を引用により本願に組み込む。本発明は、高圧に供することのできる１つ以上の浸透性または貫通可能なバリアによって分割された複数の区画（すなわち、チャンバ）を有するデバイスを特徴とする。本発明は、試料を均質化することにより、またいくつかの実施形態においては試料をさらなる加工処理または分析に供することにより、有機試料または無機試料を調製するために用いられる。この新規のデバイスは、とりわけ、試料の回収、輸送、加工処理、および／または保存、ならびに有機体（ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の生育のために用いることができる。
【００２８】
本特許出願の１つの実施形態において、本発明は、圧力調節装置に挿入されるデバイスを特徴とする。デバイスの基本成分としては、複数の区画／チャンバと、区画を分割する１つ以上のバリアと、キャップと、１つ以上の加圧部材（例えばラム）が挙げられる。
【００２９】
個々の区画中で行う加工処理と試料の大きさのどちらにも適した容量を有する様々な容積の区画を具現することができる。容量は典型的には、２５マイクロリットル〜１リットルの範囲、あるいはそれ以上（例えば、２５μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、または１Ｌ、あるいは中間の容積）である。区画は、デバイス内において垂直配置または水平配置のいずれか、あるいはその組み合わせで配置することができる。さらに、デバイスの区画は、一体物に形成してもよいし、あるいは、例えば９６ウェル形式に配置してモジュール式に連結してもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明は、半固体状または固体状の組織などの生物試料を調製、特に均質化し、全組織から微細に刻まれた組織またはスラリーを生成するための、スクリーンやシュレッダなどの少なくとも１つの多孔性バリアを特徴とする。本発明のこの均質化の態様は、試料をまず最初に分断化し、続いて均質化するという２つの基本的なプロセスのいずれか一方または両方を含んでいる。必要であれば、均質化された試料を除去する必要なく、そのままデバイス内でさらに加工処理することもできる。最初の均質化／加工処理は、例えば酵素、界面活性剤、変性剤またはカオトロピック塩などを用いた標準的な抽出または分析手順と組み合わせることもできる。
【００３１】
本発明において用いる多孔性バリアは、ポリマー、金属、ガラスまたはセラミックなどの固体材料から作成することができる。オリフィスは、固体試料の分断化を容易にするための鋭いエッジを含んでいてもよい。加圧部材は、デバイス内部の試料と外側の加圧媒体との間の効果的な遮蔽物として作用しながら、バリアの一方側から他方側に試料を送達する１つ以上の封止材を有するピストンとして機能することができる。このプロセスを一次分断化という。圧力を周期的に印加することにより、一次分断化プロセスが反復されて、均質なスラリーが得られる。
【００３２】
本デバイスは、典型的には１０ミリグラムから少なくとも１５グラムまでの様々な量の標本を分析用途のために加工処理することができ、調製作業のために大規模化することもできる。一次分断化において印加される圧力は、約６８，９５０ｋＰａ（１０，０００ｐｓｉ）〜約３４４，７５０ｋＰａ（５０，０００ｐｓｉ）（ｐｓｉ：ポンド／平方インチ）のオーダーの比較的低いものであってよい。区画の１つまたはそれ以上に、所定の容積の適当な溶解、捕捉、または加工処理溶液を予め装入しておくこともできる。多孔性バリア設計の詳細は、一部には使用する溶解／捕捉／反応流体の体積、および標本、例えば血液、尿、血清、肝臓、脳、骨格筋、植物の葉、幹、根または動物の歯もしくは骨などの性質によって決定される。使用される個々の標本に対する適切なデバイス（すなわち適切なスクリーンまたは多孔性バリア、容器、溶解／捕捉／試薬流体）が使用され、圧力サイクル条件は、加工処理する試料の大きさの試料特性に対して、および当該試料に対して実施される下流の分析に対して選択される。
【００３３】
デバイスは、非多孔性の貫通可能バリアによって分割されたさらなる区画を含んでいてもよい。これらの区画は、例えば、試料の精製、反応または分析に適した試薬を含有していてもよい。１つ以上の区画の表面は、該表面を生体分子に対して不活性にする材料によって被覆されていてもよいし、あるいは、表面は生体分子と相互作用することのできる生体分子または分子で誘導化されて（すなわち、共有結合的に固着またはイオン結合されて）いてもよい。圧力調節装置からの圧力を用いて、試料を連続的に上記さらなる区画中に押し込むことができる。例えば、圧力を継続的に高めて、試料を連続した隣接する区画中に押し込むようにしてもよい。圧力の周期的印加により、後続のチャンバ内の試料および試薬は十分に混合される。連続した各区画は、試料を追加の加工処理工程にかけることができる。各デバイスにおいて必要とされる連続する区画の数は、個々の試料に対して要求される加工処理の程度によって異なる。
【００３４】
試料を強制的にデバイス内を通過させるために圧力を用いているが、バリアは様々な他の条件下で貫通されるものであってよい。例えば、バリアは、設定温度において崩壊する温度感受性のもの（例えば、ワックスバリア、当初ワックスで孔が塞がれている多孔性セラミックバリア）としてもよい。また、バリアは、溶媒に暴露してバリアを溶液中に溶解させることによって貫通されるものであってもよい。さらに、バリアは、機械的または電子的に除去可能なバルブであってもよい。
【００３５】
適当なバリアと試薬とを選択した後、試料をホルダに装入し、１つ以上の加圧部材（例えばラム）をデバイスの形式によって必要なだけ設置することができる。次にこのデバイスを適当な温度に予め平衡化された圧力サイクル装置の内部に配置する。バリアおよび適当な圧力サイクルプロファイルの選択は、例えば以下に説明する原理に基づいて、標本の要件に応じてカスタマイズすることができる。
【００３６】
本発明のデバイスおよび方法に馴染みやすい加工処理の１つの様式としては、組織試料の機械的分断化が挙げられる。スクリーンに組み込まれた鋭い縁または点の周りに圧力を局在化させる。圧力パルスを印加することにより、試料をスクリーンに（通常は複数の通路で）通過させる。試料と、隣接する区画中の捕捉流体との間の圧力差は小さいため（例えば、一平方インチあたり数百ポンド未満の範囲）、より穏和に組織を処理できるとともに、生物学的構造および活性をより良好に保つことができる。多孔性バリア前後での圧力降下は比較的小さいので、ＤＮＡやＲＮＡなどの大きい分子は、過酷な機械的剪断力を受けることがない。このプロセスは自動化に適しているとともに、より低い温度で実施することができ（典型的には約４℃の標準的な低温室の温度未満）、核酸分子などの無傷の分子の保持率を高める。
【００３７】
大抵の液体は、高圧下において部分的に圧縮可能であり、圧力が解放されると膨張する。試料は最初のうち、第１の圧力サイクルプロセスの間、反復してバリア（例えば、シュレッダまたはスクリーン）を強制的に通過させられる。各サイクルで、圧力が解放されると、細砕（ｍａｃｅｒａｔｅ）されていない試料は試料装入区画に押し戻されることができる。プロセスの間に、溶解／捕捉溶液は試料に浸透し、組織試料内部の生体分子の遊離と可溶化を助けることができる。
【００３８】
もう１つの形の加工処理である均質化もまた、周期的圧力をかけて、大きい多分子構造（細胞膜など）を摂動させてそれらを崩壊に至らしめることにより、達成することができる。この均質化プロセスは、上述の方法または他の方法によってすでに分断化されている材料に対して適用することもできるし、あるいは、細胞破壊にさらに寄与する、液／固（凍結）相変換などの相変換を反復導入することによりスラリーになっている場合もある凍結材料に対して適用することもできる。低温で実施することにより、プロセスの際の生物学的活性の保持を助けることができる。このプロセスは、例えば、半固体試料および固体試料の小断片に適用された場合に特に実用的かつ効果的である。
【００３９】
本明細書に記載するＰＣＴプロセスは、上述したものに加えて様々な機構によって細胞の破壊に寄与する。本発明の実用化成功は、その動作のどの特定の理論にも依存したものではない。
【００４０】
均質化は、５０℃〜９０℃などの比較的高い温度、もしくは、−５℃、０℃、４℃、１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、または４５℃などの中程度の温度で圧力サイクルを実施することによって達成することができる。脂質や多糖類などの生体分子の溶解性が高温においては高まることがあるため、高温均質化の機構は、低温での機構とは異なる場合もある。生体分子の分解は高温で増大しうる、また高温で高められたプロテアーゼまたはヌクレアーゼの活性がこれをさらに悪化させうるという潜在的な問題がある。それにもかかわらず、高温における高圧力プロセスは、適当な温度および圧力におけるある種の安定なタンパク質、核酸、および他の分子に対しては適切であるか好適であることもある。例えば、過酷な化学物質を用いることなく高収率かつ高品質のＲＮＡを得るためにＲＮアーゼを不活性化してもよい。
【００４１】
ＰＣＴ法は、閉じた容器内の試料に対して均一に与えられる静水圧または機械的圧力を使用する。ＰＣＴデバイスは、無処理の組織試料を受け入れることができる。バリア（例えばシュレッダ）内の複数の孔およびより大きな径を有する孔により、高い剪断力または開口部間での突然の圧力降下が起こることがなく、そのかわりに、剪断と変性を最小限に抑えながらより穏和かつ制御された様式で材料を通過させることができる。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、デバイス内への試料の装入とともに生じる空気をチャンバ内に捕捉させることを含む。加圧部材からの圧力が増大すると、この空気は圧縮されて、試料中に溶解させることができる。圧力を迅速に解放すると、空気の体積が迅速に膨張し、これにより試料に破壊効果を導入することができる。
【００４３】
この迅速かつ、それでいて穏和なプロセスにより、遊離された分子の完全性と生物学的活性を維持しながら、細胞内容物を効果的に遊離させることができる。この理由のひとつとしては、上記プロセスが界面活性剤、過酷な化学物質または過剰な剪断力を必要としないことがある。あるいは、このデバイスは、生物学的活性の維持と両立可能な場合、あるいは生物学的活性の維持が必要とされないか望まれない場合には、洗剤および他の化学物質とともに使用することもできる。さらに、このプロセスは、細胞および組織中のタンパク質含有量および活性を調べるためにも適している。タンパク質の安定性に寄与する現行の方法の重要な特徴としては、低剪断、迅速溶解および高タンパク質濃度が挙げられる。安定化添加剤、例えばプロテアーゼ阻害剤、グリセロール、ＤＴＴ、または特異的補因子などをバッファにさらに添加して、所望のタンパク質の完全性をさらに保護するようにしてもよい。多くの酵素、特に単量体タンパク質の酵素の生物学的活性は、処理後も完全に機能したまま残っている。これらのタンパク質は、一次元または二次元ゲル電気泳動、質量分析または酵素活性アッセイによる後続の精製および分析に適している。様々の細胞および組織から生物学的に活性なタンパク質を迅速かつ効率的に単離することができるため、研究において、また医学、薬学およびバイオテクノロジー産業において、非常に広い用途を有することになる。デバイスおよび方法の重要な用途としては特に限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００４４】
１．微生物（例えば、大腸菌）中で生産された封入体から、または植物組み換え系からの組み換えタンパク質の遊離および可溶化。
２．初期癌発症の組織特異的マーカーのマッピングおよび同定に著しい進歩をもたらすことになる、腫瘍組織（例えば、植物または動物の腫瘍組織）の生検標本からの完全なタンパク質の単離。そのようなマーカーは、特定の癌の型を診断し早期に同定するために用いることができる。
【００４５】
３．脳または他の組織からのプリオンの遊離。
４．生物組織の研究によって得られたデータに基づいて、薬剤の有効性と安全性を効果的にモニタできる可能性をもつバイオマーカーの同定。
【００４６】
５．様々な薬用植物、真菌、および他の有機体からの迅速なタンパク質の抽出と、癌、感染性および遺伝性疾病に対する潜在的な新しい薬剤の供給源、ならびに他の治療法を見つけ出すための有機体スクリーニングの容易化。
【００４７】
６．創薬の初期段階における毒性および動物実験に適したタンパク質量決定の容易化。
７．本願の別の箇所に記載の供給源（例えば、植物または動物組織などの有機材料、あるいは土壌などの無機材料）からの、鉛もしくは他の重金属、薬剤、農薬、または他の無機もしくは有機化学物質または成分の抽出。このような抽出は、例えば、環境モニタリング、有害物質の放出（例えば、化学物質流出、バイオテロによるもの）または有機体による摂取を追跡するために有用であろう。
【００４８】
ある実施形態において、デバイスは、均質化された試料をさらに加工処理するさらに別の区画またはチャンバを含んでいてもよい。これらの区画は、互いに隣接して配置されてもよく、試料を強制的にデバイス内の連続するチャンバを通過させながら、試料を連続的に処理するのに適した種々の材料を含んでいてもよい。例えば、区画は、試料を精製するために用いられる様々な結合リガンドまたは固相粒子などの捕捉要素を含んでいてもよい。区画は様々な化学物質を含んでいてもよい。これらの化学物質は、酵素、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に必要とされる基質、酸または塩基、触媒、および／または試料を加工処理することのできる他の生体分子であってもよい。さらに、区画には、試料の分析のために用いられる標識を装填することもできる。
【００４９】
区画の表面は、試料と所望の加工処理に適した方法で誘導化することもできる。１つの実施形態において、表面を、該表面を生体分子に対して不活性にする材料で被覆して、その生体分子の付着または吸着を防ぐようにしてもよい。別の実施形態において、表面を、均質化された試料の要素と相互作用することができるか、あるいはそのような要素を捕捉することのできる生体分子または薬品（すなわち、小有機化合物）に共有結合させるか、イオン結合させることもできる。
【００５０】
別の実施形態において、区画の１つ以上が、試料の分析および／または検出を可能にする装置（例えば、光量計）を備えていてもよい。分析の形態としては、特に限定されないが、温度、圧力、放射線、吸光度、蛍光または濁度が挙げられる。
【００５１】
本デバイスによって加工処理される材料としては、広範な種類の標本がカバーされる。その例を以下に示す。加工処理できる試料の種類としては、特に限定されないが、血液、血清、科学捜査試料、真菌、昆虫、植物組織（例えば、生、凍結、または乾燥状態のいずれであってもよい、花粉、葉、根、花または他の植物部分）、および動物組織（例えば、鳥類、は虫類、魚類、または哺乳類組織、たとえばヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ネズミ、ブタの組織など）が挙げられる。組織には生検標本、農作物、または食品も含まれる。
【００５２】
要約すると、従来の方法を越える本発明の利点としては、とりわけ以下のものが挙げられる。
・凍結試料を解凍することなく加工処理することができる。
【００５３】
・最小限の手作業で、断片化、均質化および加工処理を一工程にて実施することができる。
・分析に必要かつ追跡アッセイに適した材料を予めデバイスに装入しておき、溶解プロトコールを特定の生物試料用に合ったものとすることができる。
【００５４】
・ミリグラムから数百グラムにわたる柔軟な範囲の試料サイズを扱うことができ、試料を全片とすることもできる。
・プロセスを、液体、固体または半固体の組織など、広い範囲の種類の試料に適用することができる。
【００５５】
・溶解およびさらなる試料加工処理、および／または分析を、手動操作が不要な自動圧力サイクル装置において実施することができる。
・酵素消化工程を必要とするような長いインキュベーションを行う必要なく、均質化プロセスを迅速に行える。
【００５６】
・プロセスは、自動核酸抽出法（例えば、米国特許第６，１１１，０９６号を参照）などの自動分子抽出法、あるいは、より従来的な抽出方法を１つのデバイス内に含むものであってもよい。
【００５７】
・本方法は、ＲＮＡや酵素などの生物分子の完全性が分解から保護され機能性を維持するように、サブゼロ温度（すなわち＞０℃）において実施することができる。
・試料を閉じた使い捨て可能なホルダ内で加工処理することができ、標本の交差汚染を防止できる。標本を野外で採集し、加工処理までデバイス内に入れて保存することができ、標本の操作を最小限に抑えることができる。
【００５８】
・プロセスを同時または連続加工処理に適応させることができる。
・デバイスは、例えば、９６ウェル形式などのマトリクスにセットすることにより、複数の試料を加工処理するように構成することができる。
【００５９】
・プロセスは、科学捜査、臨床、病理、農学、食品安全、薬学、バイオテロ、および環境分析などの多くの用途に適応させることができる。
・有機体をデバイス（例えば、培養用または輸送用培地を含むデバイス）内で、培養、加工処理、分析、および／または不活性化することができる。特に重要なのは、潜在的に危険な、もしくは選好性の有機体を扱う場合に、上記方法は、試料の採集／装入から不活性化までの間にデバイスを開けることを必要とするか必要としないかを問わず実施することができ、これにより、このような有機体の取扱いに伴って起こりうる危険を最小限に抑えることができる。
【００６０】
・植物または動物の供給源、または土壌などの無機物質から、全体の、完全な、生育可能な微生物およびその抽出物を抽出することができる。
第１部：２チャンバ均質化モジュール
試料加工処理デバイスに対する１つの設計として、図１に示すような２チャンバモジュールがある。この設計は、その構成要素として、ラム（Ａ）である加圧部材と、２つのチャンバを有する区画（Ｂ）と、シュレッダスクリーンまたは多孔性バリアのいずれであってもよいバリア（Ｄ）と、キャップ（Ｆ）とを有している。別の設計において、このデバイスはＯリングを有した第２の加圧部材（例えばラム）（図２）を有していてもよい。この均質化モジュールは、米国特許第６，１１１，０９６号の４〜９頁、２９〜４４頁ならびに図１および４に記載されているような、圧力サイクル装置内に嵌合するように構成されている。
【００６１】
試料を装入する前に、オプションの第２ラムをモジュール内に挿入してもよい。モジュールを直立させた状態で、所定体積の捕捉流体を添加し、バリア（例えばスクリーン）を上部から挿入するとよい。圧力サイクル装置の圧力区画と、モジュールとは、随意で−２０℃または−３０℃などの所定温度に予め冷却しておいてもよい。そして試料を試料チャンバ内に配置するとよい。上側の加圧部材をモジュール本体内の試料の上方に配置する。そしてモジュールを圧力サイクル装置の区画内に配置して、ここで該モジュールを温度平衡化加圧流体内に浸漬する。その後、圧力区画を封止する。
【００６２】
チャンバ内の圧力が増大されると、モジュール内の加圧部材が第１のチャンバのモジュールの内部に向かって移動し、試料をバリア（例えばシュレッダスクリーン）内のオリフィスを介して第２の試料捕捉チャンバ内に押しやり、ここで、試料が捕捉流体と混合される。上記のプロセスにおいて、上部加圧部材と捕捉流体との間の空気は、液体に溶解されるようにしてもよい。スクリーンに向かって移動する加圧部材によって組織試料が加圧されると、組織と捕捉流体との混合液の体積は、例えば、大気圧下において全体積の約８５〜９０％まで減少する。圧力が減少されると、組織／捕捉流体混合液と閉じ込められた空気とが膨張し、上部加圧部材を押し戻し、混合物をスクリーンを介して後退させる。チャンバ内の圧力が周期的に変えられることにより、圧力サイクルと加圧部材の移動との組み合わせによって、溶液を繰り返しスクリーンを通過させることができ、これにより細胞と組織の物理的崩壊がより効果的に進む。
【００６３】
加圧部材は、モジュール本体内に配置された試料に対して最大圧力を送るように設計することもできる。加圧部材は、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ｐ‐フェニレンスルフィド、ガラス強化ＰＥＩ樹脂などの熱可塑物質）、ガラス、石、セラミック材料などの固い材料から作成することができる。接触点における加圧部材またはバリアの表面は、例えば、鋭利な点または縁を組み込むことにより、試料の崩壊をさらに補助するように設計することもできる。加圧部材の円筒形の壁は、加圧部材とモジュールの内壁の間を封止して試料をモジュールの内区画内に閉じ込めておくことのできる、１つ以上のＯリングを組み込んだものとしてもよい。いくつかの構成に対しては、加圧部材は、試料とは反対側の表面上に、モジュールへの該加圧部材の挿入または除去を容易にするためのハンドルまたはループを組み込んだものであってもよい。加圧部材は、均質化プロセスの間に内部に高圧力を伝達するようにモジュール本体内で自在に移動できるように設計してもよいし、試料と加圧流体の間の効果的バリアとして機能するような特徴（例えば、封止材）を組み込んだものであってもよい。
【００６４】
モジュール本体は、加圧部材が試料材料を推進してシュレッダスクリーン／多孔性バリアを通過させるように設計することも可能である。モジュール本体は、例えば、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ｐ−フェニレンスルフィド、ガラス強化ＰＥＩ樹脂などの熱可塑物質）、ガラス、石、セラミック材料などの剛性、または半剛性の材料から作成することができる。モジュール本体は、均質化プロセスの間にモジュール本体内の適切な圧力を維持できるように、加圧部材およびキャップと連結して設計することもできる。
【００６５】
加圧部材が自在に移動できることにより、区画内部の静水圧を試料チャンバの内部に伝達することができるようになる。モジュールの内外で圧力平衡を維持することができ、モジュール材料そのものは、圧力平衡に達する前の均質化モジュールの内外の小さな圧力差に対して安定なものとすればよい。このようにして、モジュールの一体性を維持できる。モジュールは、流体がそれぞれの圧力サイクルでバリアを通過することができるように、隙間に対する適当な比率の試料および捕捉流体容積を収容するように設計される。
【００６６】
バリア（例えば、スクリーン）は、試料を多孔性バリアの所定のオリフィスを通過させる際に、該試料の均質化をさらに支援するように設計することもできる。孔の大きさと数に関して、オリフィスの設計は、試料の種類、大きさおよび均質化プロセスの要件に応じて変えることができる。バリア、スクリーンは、試料を可溶化するのに適した、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ｐ−フェニレンスルフィド、ガラス強化ＰＥＩ樹脂などの熱可塑物質）、ガラス、石、セラミック材料から作成することができる。さらに、バリアはフィルタを含んでいてもよい。バリア上の試料との接触点は、適切な表面特徴、例えば鋭利な点または縁、あるいはオリフィス構造を組み込むことにより、試料の均質化を助けるように設計することもできる。バリアは、砂、微細ガラスビーズ、炭素、および／または燒結金属の固体マトリクスを含む任意の多孔性材料とすることもできる。バリアは、モジュール本体との一体部分として、あるいはデバイスの２つの区画間の均質化モジュールに挿入される構成要素として設計することもできる。
【００６７】
キャップは、モジュール本体試料捕捉区画を封止して、均質化プロセス時の圧力維持を助け、加工処理後の試料捕捉区画へのアクセスを可能にするように設計することができる。キャップは、試料を可溶化するのに適した、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ｐ‐フェニレンスルフィド、ガラス強化ＰＥＩ樹脂などの熱可塑物質）、ガラス、石、セラミック材料から作成することができる。キャップには、加圧部材をモジュール本体内に保持するための特徴（例えば、螺旋状のネジ山など）を組み込んでいてもよい。上部加圧部材の上方には、上側キャップを用いてもよい。この上側キャップは加圧流体にアクセスできるようにしてもよいが、加圧部材が圧力サイクルの間中モジュール内に確実に保持されるように設計することができる。
【００６８】
捕捉流体を随意で含むモジュール全体は、使用者が標本を装入して、上部加圧部材上に置き、ユニットを圧力チャンバ内に挿入するだけでよいように、製造業者によって予め組立てられたものであってもよい。この構成において、デバイスは、ＰＣＴ処理後に圧力チャンバから除去される。組織が最初に載置される側の加圧部材を、組織を最初に装入したときの方向とは反対の方向に、組織側を下にしてバリアに対して一気に押し込むとよい。キャップ（および、下部加圧部材が使用されるときには該部材も）は着脱可能で、溶液をピペットで取り出すこともできる。キャップは、操作を最小限に抑え、材料の直接輸送を図るために、バルブを組み込んで、溶液を該バルブを介して回収チューブに滴下できるように設計することもできる。あるいは、キャップの代わりに、デバイスは、該デバイス上に設けられた、ミクロタイタープレートシーラーにおいて用いられるエチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）材料などの穿刺可能な膜と嵌合させてもよい。この膜は、キャップによって定位置に固定して、熱または高周波によってデバイスの壁に融着させることもできるし、あるいは、接着剤または他の機構を介して固定してもよい。加圧部材の移動を制限することにより、膜全体にかかる圧力は最小限になり、これによりデバイスの内外での圧力平衡が得られる。ＰＣＴ処理に続いて、膜を破壊して開けて得られる流体を回収チャンバ内に放出することのできる鋭い穿刺デバイスを含む回収チューブの上方に、デバイスを配置することができる。
【００６９】
細胞および組織に加えて、流体（例えば、唾液、粘液、または、ハチミツ、糖蜜やコーンシロップなどの食品）もこのデバイス内で加工処理することができる。本デバイスは、例えば、微生物を殺傷するか、または殺傷せずに、同微生物をバッファまたは培地中に放出させるために、上記流体の粘度を低下させるか、あるいは試料を液化するために用いることができる。例えば、一般には化学物質を用いて液化される唾液は、さらなる分析または他の処理のために結核菌などの微生物を放出するために圧力を用いて、本発明のデバイスにおいて液化することができる。
第２部：加工処理モジュール
新規の試料加工処理デバイスは、随意で、試料のさらなる加工処理を行うための別のチャンバを含んでいてもよい。例えば、デバイスは、「加工処理モジュール」の形態をとるか、これを含んでいてもよい。このような加工処理モジュールに対する設計は典型的には、均質化モジュールに対する設計と同一または非常に類似したものであるが、加工処理モジュール内での試料のさらなる加工処理は、試料をさらに別のバリアを介してさらに別のチャンバに通すことによって達成することができる。例えば、均質化モジュールにおいて記載したような２つのチャンバしか有しないものの代わりに、加工処理モジュールは、均質化された試料の所望の加工処理または分析に必要とされる数の貫通可能バリアによって分離されたチャンバを有していてもよい。試料を加工処理するために用いられる加工処理モジュールのさらに別のチャンバは、典型的には、均質化プロセスにおいて用いた多孔性バリアではなく貫通可能バリアによって分離される。加工処理チャンバの分離により、チャンバ内に含まれる試薬を試料の導入の前に反応しないようにしておくことができる。
【００７０】
図１４は、チャンバが垂直方向に配置された加工処理モジュールを示している。図１５は、チャンバが水平方向に配置された加工処理モジュールを示している。図１６は、チャンバが水平、垂直の両方向に配置され、感圧性バリアによって分離されている加工処理モジュールを示している。
【００７１】
図１８は、チャンバが垂直方向に配置され、下方のチャンバを上方のチャンバおよびバリアに対して放射方向に移動可能として、試料を加工処理によって生じる廃棄物、デブリスおよび不純物から分離できるようにした加工処理モジュールを示している。上側チャンバを除去して所望の産物（例えば、精製された核酸）を回収することができる。加工処理モジュールのすべての操作は、コンピュータによる自動化およびプログラミングが可能である。さらに、デバイス全体は使い捨て可能である。
【００７２】
バリアは、高圧に限定されることなく様々な条件下で貫通されるものであってよい。例えば、バリアは、設定温度において破壊する温度感受性のものとしてもよい。バリアは、溶媒に曝してバリアを溶液中に溶解させることによって貫通されるものであってもよい。さらに、バリアは、機械的または電子的のいずれかによって除去されるバルブであってもよい。
【００７３】
バリアが貫通されると、加圧部材からの圧力により試料は隣接するチャンバに押し遣られて、当該チャンバ内に含まれる試薬と相互作用できるようになる。試料を後続のチャンバに押し遣るプロセスを続けることにより、試料の段階的加工処理および必要な場合には後続の分析が行われる。デバイス内の区画の性質によって、手動操作を行わずに試料の加工処理が行えるようになる。
第３部：チャンバ試薬
各チャンバ内の試薬の実体は、当該チャンバ内で行う加工処理によって異なる。
【００７４】
例えば、均質化工程において捕捉流体中で用いられる試薬の物理的および化学的性質は、圧力サイクルの均質化効率に影響を与えることができるとともに、分子成分の完全性および安定性を維持することもできる。上述のように、可能な均質化機構のひとつとして、サブゼロ温度における「凍結解凍」効果があり、この効果は捕捉流体の特性に依存するものである。第２に、捕捉流体の組成は対象とする生体分子の遊離および可溶化に対して影響を及ぼす。第３に、捕捉流体の体積は、例えば加圧部材からの過剰な圧力への耐性を与えることにより、モジュールの統合性の維持に関係するため重要である。最後に、捕捉流体は、下流のアッセイと適合できるものでなければならない。
【００７５】
捕捉流体の例は「実施例」の部に記載する。最も簡単な実施形態において、溶解流体は、水などの低張溶液、あるいは、細胞から出た細胞性材料の可溶化を促進する低塩トリスまたはリン酸バッファである。あるいは、溶解溶液は、下流のアッセイに適合する保存剤または化学物質を含んでいてもよい。捕捉溶液は、試料の破壊を助けるため酵素を含んでいてもよい。あるいは、タンパク質および核酸の完全性を維持するために、捕捉溶液にヌクレアーゼまたはプロテアーゼインヒビターを添加してもよい。リボ核酸の抽出を必要とする用途に対しては、変性剤（たとえば、グアニジン塩および尿素）または界面活性剤（ＳＤＳおよびＣＨＡＰＳ）を加えてもよい。
【００７６】
試料の均質化に続いてチャンバ内で用いられる試薬には、幅広い加工処理工程を可能にするのに十分な広範のものが含まれる。例えば、区画には、核酸または疎水性ペプチドなどの試料の特定の要素の分離を可能にする、捕捉要素が含まれていてもよい。試料の分離および／または精製は、クロマトグラフィー試薬、あるいはチャンバ内の電流を介して達成することもできる。
【００７７】
１つ以上のチャンバが、有機体を接種して、これを本発明のデバイス内で直接インキュベートすることができるように、随意で増殖用および／または輸送用培地を含んでいてもよい。このような有機体の例としては、特に限定されないが、細胞、ウィルス、細菌、または寄生虫が挙げられる。例えば、血液細胞および他の動物または植物細胞、ＨＩＶ、ＨＡＶ，ＨＢＶ、ＨＣＶ、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｓｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）およびプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）を本デバイス内で生育させることができる。培地は液体または固体のいずれであってもよく、所与の有機体に対して特異的であってもよいし、非特異的なものであってもよい。適切な培地の例としては、ヒツジ血液寒天（ＳＢＡ）、トリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）、またはトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（例えば、炭疽菌の培養用）；マッコンキー寒天（例えば、グラム陰性細菌の培養用）；あるいは三糖鉄（ＴＳＩ）ブロスが挙げられる。輸送用培地としては、例えば、Ｔｒｉｓ‐ＥＤＴＡ（ＴＥ）などの緩衝化溶液が挙げられる。デバイスは、所与の有機体に対して適当な温度で（例えば、炭疽菌に対しては３５〜３７℃）、集団が検出可能となるのに十分な時間、あるいはＰＣＲにより増幅するのに十分なＤＮＡまたはＲＴ‐ＰＣＲもしくは他の方法によるＲＮＡの増幅（例えば、続いて検出が行われる）を与えるのに十分な時間インキュベートすることができる。増殖中の有機体をデバイスを開けることなく上述のように加工処理して（そして随意で不活性化して）、試料または環境の混入の機会を制限する。
【００７８】
チャンバは、核酸抽出に続いてＤＮＡハイブリダイゼーションを行えるような要素を含んでいてもよい。例えば、区画内に含まれる様々な蛍光標識オリゴヌクレオチドへの競合的結合によって、ＤＮＡはハイブリッド形成することができる。次に、例えば米国特許第６，２５８，５３４号に記載されているように、ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドの結合または解離を高めるために、圧力を印加することもできる。
【００７９】
試薬としては、核酸配列の増幅に必要とされるようなもの、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）に用いられるようなものが挙げられる。これらの試薬を含むチャンバにおける圧力サイクルは、これらの反応を高めるために用いることもできる。これらの反応条件には温度サイクルを組み込んでもよい。
【００８０】
ＤＮＡ配列決定は、必要な試薬を有した１つ以上のチャンバ内で行うことができる。この場合も、反応を高めるために圧力サイクル（例えばＰＣＴ）を用いることもできる。例えば、高い圧力によってエキソヌクレアーゼ活性を調節して、ヌクレオチドポリマーをヌクレオチドモノマーに分解することもできる。
【００８１】
加工処理チャンバ内の試薬は、試料中のタンパク質を加工処理するために用いることもできる。細胞溶解によってタンパク質を遊離させた後、カラムクロマトグラフィーやゲル電気泳動などの技術を用いて試料からタンパク質を精製することもできる。精製は、分子量または、大きさ、疎水性、イオン相互作用、金属キレート性などの物理的または化学的性質、および免疫学的反応性に基づいて行うことができる。圧力および圧力サイクルは、本加工処理の特徴となりうる。
【００８２】
さらに、チャンバは、イムノアッセイまたは酵素的アッセイに関与する試薬を含んでいてもよい。例えば、分子の会合および／または解離を、チャンバ内の条件を介して、特定の複合体の特異性と親和性とを制御することにより調節することができる。この技術は、免疫学的相互作用だけでなく酵素的相互作用にも適用できる。
第４部：検出モジュール
チャンバの１つを、試料に施された様々な加工処理工程により得られた生成物が発するシグナルの捕捉のための検出モジュールとして用いることができる。この検出モジュールは、モジュール内で発生したシグナルを検出器が読み取るように、検出器に隣接して配置することができる。モジュールは、光または放射線を検出器に向けて通過させる透過性材料で作成することができる。レーザーまたは他のイオン化発生器を検出器の反対側に設置して、検出モジュール内でのシグナル発生を誘起することができる。検出器は、照度計、蛍光計、光量計、分光光度計、イオン化検出器、流量計、シンチレーションカウンター、カメラまたは他の分析機器であってもよい。検出器によって受信されたシグナルは、物理的または電子的に記録器に送られ、試料中の測定する特定の分析物に反応して発生したシグナルの測定値が生成される。これらの測定値を、プリントアウトによって視覚的にあるいは他の手段によって、コンピュータ内に記録することができる。
第５部：細砕しにくい試料に対するシュレッダであるバリア
動物の骨や歯、植物の幹あるいは根などの非常に細砕しにくい（ｈａｒｄ−ｔｏ−ｍａｃｅｒａｔｅ）試料には、たいていの場合、粉砕器またはアンビルなどの特別な均質化装置が必要になる。固い試料を均質化するための１つの手法としては、本発明のデバイス内で、鋼鉄や高品質プラスチックなどの剛性の高い材料からなるシュレッダスクリーンであるバリアを用いることがある。場合によっては、貫通穴を有する金属ディスクを用いて通常のプラスチック製溶解ディスクを強化するようにしてもよい。剛性材料からなるバリアの使用に加えて、疑似アンビル型構造または剛性固体材料からなるピラミッドをバリアに組み込んでもよい（例えば、図３Ｂを参照）。より強いモジュール、圧力部材、およびシュレッダスクリーンであるバリアの使用に加えて、ｐＨ２など非常にｐＨの低い捕捉流体を用いて骨または歯を柔らかくするようにしてもよい。そうした流体はその腐食性のために、通常は手動工程による取扱いが難しいが、ＰＣＴ均質化について記載したような閉じた系の中へは簡単に収容することができる。試料のさらなる細砕は、より少ない量の試料を用いることにより、細砕が不完全な場合に行うことができる。しかしながら、これは感度の低下を招くこともある。
第６部：生物試料を溶解するためのシュレッダの代替形式
ＰＣＴ均質化原理は、組織の破壊と細胞内容物の放出を促進することのできる以下の２つの特徴を組み合わせたものである。すなわち２つの特徴とは、組織材料を物理的に押し遣ってデバイス内の小さな開口部を通過させることは、組織の大きな塊を破壊することに寄与するということ、ならびに、低い温度および圧力サイクルは、試料を繰り返し凍結解凍することになり、細胞破壊にさらに寄与するということである。本デバイスの代替形式は、これらの原理の一方または両方に基づいて設計することができる。種々のモジュールサイズと材料の組み合わせが可能であるとともに、モジュールの崩壊を防ぎ、流体の漏れを防ぎ、均質化効率を高め、試料への容易な接近可能性を与え、複数試料加工処理を容易にし、圧力チャンバへのモジュールの挿入および除去を容易にし、感染性材料を確実に封じ込めるための特徴を備えることが可能な、様々なモジュール構成が想定される。
第７部：９６ウェルプレートのための使い捨て可能設計
デバイスは、その規模を拡大または縮小することにより、対応する試料の大きさ、区画の大きさ、および試薬の容積を変えることもできる。さらに、モジュールおよびチャンバの規模は、複数の試料を収容するように調整することもできる。複数の試料のためのキャップの設計は、単一のデバイスのそれとは違ったものとすることができる。最も簡単な構成は、圧縮中に空になる空間に破断なく伸張するのに十分な可撓性を有する封止可能および／または剥離可能な膜のシートの形状であろう。剛性のシート上で繋ぎ合わせられた一連の加圧部材を、９６ウェル形式などの個々のウェル中に一斉に押し込むようにすることができる。９６個の試料を圧力サイクル装置に嵌合させるために、シュレッダを６つの４×４または３つの４×８ブロックなどの規則的な配列で配置することもでき、このような配置のシュレッダは、容易に圧力チャンバに嵌合し、必要であれば、後続の加工処理のための９６ウェル形式と適合するウェル内にそのまま転移することもできる（図１３を参照）。
【００８３】
図１３は、９６ウェルプレートの１つのウェルに嵌合している圧力サイクル機器を示している。バリアが２つのチャンバを分割し、加圧部材は加圧部材とチャンバ壁の間のＯリングによって封止されている。試料をバリアの上面に載置し、加圧部材によってバリアを強制通過させる。圧力サイクルが終了すると、バリアおよび加圧部材を除去して、第２のチャンバ内の溶液をさらなる加工処理のために移送することができる。このチャンバは、米国特許第６，０３６，９２３号に記載されているような圧力サイクル反応器に嵌合させることができる。
【００８４】
本デバイスは、スクリーンと加圧部材とをプロセスの終了後に一体物として除去できるように設計することもできる。
より多数の試料を加工処理するために、９６ウェル系を用いることもできるが、この場合は、まず試料を溶解した後、別のチャンバまたはウェルに移して洗浄し、ろ液を回収する。あるいは、複数のチャンバを有する使い捨て可能なミクロウェル形式を用いて全抽出プロセスを扱うこともできる。この構成においては、試料を含む最初のチャンバを圧力溶解に供することができる。そしてウェル内のバルブを解放して、試料を洗浄し、廃棄物を除去するようにしてもよい。最後に、核酸回収チャンバに繋がる別のバルブによって、精製された核酸を溶出させるようにしてもよい。プロセス全体を流体交換が最小限ですむ単一の精製モジュール内で達成することができて、理想的である。
【００８５】
本デバイスの構成要素の簡略化模式図が図１５Ａ〜１５Ｆに示されている。図１５Ａは、試料が第１のチャンバの上半部に装入されているが、圧力は与えられていない状態のマルチチャンバデバイスの図である。図１５Ｂは、マルチチャンバデバイスへの第１回目の圧力印加の結果を示した図であり、試料が加工処理され、第１のバリアを通過して押し込まれている。図１５Ｃは、さらに圧力を増加させた結果を示しており、試料は水平方向へ押されてチャンバ２に入っている。図１５Ｃ〜図１５Ｆは、圧力の増加に従って、水平方向に互いに連結されたチャンバを通る試料の移動を示した図である。このデバイスは、高度な熟練技術や、有毒または有害な化学物質を手動で扱うことを必要とせず好適である。精製された核酸産物は、増幅、配列決定または他の分析のための他の自動機器と適合可能な９６ウェル配置で利用できるようにすることが可能である。
第７部：ＰＣＴプロセスによるオンチップ均質化
均質化プロセスはさらに小型化して、核酸または抗原の検出などの特定の実験用途に対する複数の機能を組み込むようにすることもできる。シュレッダスクリーン、加圧部材、捕捉流体、およびホルダは、均質化プロセスの終了時にチップ上の別の場所に抽出された材料を沈積させることのできる一体型使い捨て可能ユニットの一部とすることもできる。その後、チップを分析器に挿入し、ヒートシンクを用いて試料均質化領域の周りの温度を平衡化する。圧力は２つのピストンを介して、一方は加圧部材側から、もう一方はキャップ側から伝達することができる。圧力プロセスは、単一のシュレッダ動作と類似している。圧力は、従来の油圧ポンプを用いるのではなく、電磁ピストンによって発生させることもできる。電磁ピストンを用いる１つの利点は、電磁ピストンはミリ秒などのスケールのより高い頻度で移動可能なことである。圧力プロセスが終了すると直ちに、捕捉流体および／またはＰＣＴプロセスを受けた試料は、例えば「キャップを穿刺する」ことにより、「キャップ」側から抜去することができる。
第８部：使い捨て可能デバイスの設計と製造
デバイスは、試料の調製ならびに個々の細胞および組織の溶解に対しての適性を維持しながらも、例えば高分子材料からなる使い捨て可能なモジュールとすることができる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例において本発明についてさらに説明するが、実施例は請求項に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：低温における圧力サイクルを用いたラット肝臓試料の溶解
ドライアイス上で急速凍結し、ドライアイス上または−７０℃のいずれかで保存された、新鮮な凍結ラット肝臓の全片をＰｅｌ‐Ｆｒｅｅｚ（米国アーカンソー州ロジャーズ所在）より入手した。該凍結組織を、ドライアイスの塊の上で剃刀の刃を用いて、電子秤で計量して約０．２０ｇとなるように裁断した。この裁断手順のあいだ試料は凍結状態に保ち、使用時まで微量遠心管中、−７０℃で保存した。
【００８７】
実験に使用したデバイスを、本体と、２つのラムと、ポリプロピレンからなるシュレッダ台とを含めて構成した（図２を参照）。本体は、長さが３８．１ｍｍ、外径が１３．８ｍｍ、内径が１１．６ｍｍ円筒形のチューブとした。チューブの一方端は、キャップを受容するようにねじ切りした。キャップを用いて、チューブの端部にラムを封止かつ保持した。ラムは、長さ１２．７ｍｍ、直径１１．５ｍｍの円筒形の部品とした。それぞれのラムには、本体の内面に対して封止されるＯリング封止材を設けた。シュレッダ台は、長さ９．５３ｍｍ、外径１１．５ｍｍ、内径１０．７ｍｍの円筒チューブの形状を有し、その一方端部にはスクリーンを取り付けた。スクリーンは、直径１１．５ｍｍのなかに、適当な間隔をおいて直径０．９４ｍｍの４９個の穴を有するものとした（図３Ａを参照）。
【００８８】
デバイスは、まず最初に底部ラムを本体のネジ付端部に入れ、底部ラムを本体に保持するようにキャップを締めることにより組立てた。０．７ｍＬの捕捉流体（飽和塩酸グアニジン、１％ＣＨＡＰＳ；飽和ＧＴＣ，０．１％ＮＰ４０または独自仕様の溶解溶液）を開放端から挿入した。次に、シュレッダ台であるバリアを、穴を有する端部がネジ付端部の反対側にくるように本体の内部に配置した。約０．２０ｇの凍結組織片を本体内のシュレッダ台上に載置した。試料をシュレッダ台の上面に配置したところで、封止リングと本体との間が封止されるように上部ラムを本体に挿入した。
【００８９】
圧力サイクルのために、Ｎｅｓｌａｂ社の循環冷却器を用いて予め冷却し、−２０℃に平衡化しておいた圧力チャンバ（ＢａｒｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）V ２．４，米国カリフォルニア州ガーデングローブ所在のＢＢＩ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社により特注）内にモジュールを配置した。シュレッダは試料とともに２分間この温度に平衡化した。試料に約１０３，４２５ｋＰａ（１５ｋｐｓｉ）の圧力を印加し、この圧力で２０秒間保持し、２０秒間大気圧に戻した。圧力の上昇および下降時間は１０秒未満とし、上述の保持時間には含めていない。この一連の動作を全部で５回繰り返した。これらの約１０３，４２５ｋＰａ（１５ｋｐｓｉ）圧力サイクルに続いて、約２４１，３２５ｋＰａ（３５，０００ｐｓｉ）で２０秒間と大気圧で２０秒間の圧力サイクルをさらに３回繰り返した。すべての圧力サイクルは、プログラムに組み込み、プログラムを実行することにより実施した。最後の圧力サイクルの終了後、シュレッダモジュールを反応チャンバから取り出し、上下反転させた。元々底部にあったキャップとその下の隣接するラムとを除去し、組織のデブリスを含んだ捕捉流体を新しい微量遠心管に移した。試料を７，４００×ｇで１分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してドライアイス上で維持した。
【００９０】
粗上清の一部についてはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（在イリノイ州インディアナポリス）のＰＣＲ鋳型精製キットによりさらに精製し、上清中の遊離核酸を抽出した。プロテイナーゼＫを用いる溶解工程を省略したことを除いては、キットに示されている手順に従った。２００μＬの試料を、２００μＬのキット添付の結合バッファと、１４０μＬの二重蒸留水と、１００ｍＬイソプロパノールと混合した。溶液をボルテックスにより混合し、ｈｉｇｈ ｐｕｒｅ（登録商標）フィルタ・チューブに移し、８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。遠心分離後、フィルタを、５００μＬの洗浄バッファを用い、もう一度８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより洗浄した。１回目の洗浄の後、この洗浄工程を繰り返し、遠心分離を行った。１３，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離することにより、残留している洗浄バッファを除去した。核酸を溶出するために、２００μＬの予め温めておいた（７０℃）の溶出バッファをフィルタ・チューブに加え、８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【００９１】
ＰＣＴ均質化手順によって遊離された核酸の収率とサイズを推定するために、アガロースゲル分析を、０．５’ＴＢＥバッファ中の０．６７％アガロースを用い、１２０Ｖの一定電圧で、６０分間泳動することによって実施した。アガロースゲルは臭化エチジウムで予備染色し、ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ（登録商標）およびＡｌｐｈａＥａｓｅ（登録商標）Ｖ５．５ソフトウェア（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ，在カリフォルニア州サンレアンドロ）を用いて撮影した。
【００９２】
図１２は、精製手順を一切実施していない粗溶解物中に存在する全核酸を示したものであり（レーンＥ１〜Ｅ７）、試料１（飽和塩酸グアニジン、１％ＣＨＡＰＳ）、試料３（飽和ＧＴＣ，１％ＮＰ４０）および試料５（独自仕様の溶解バッファ）は、２×１００ＭＰａおよび３×２３５ＭＰａ、−２５℃、２０秒高圧／２０秒大気圧保持の条件によるＰＣＴ組織シュレッダ処理により得たものである。試料２，４および６は、それぞれ試料１，３および５に対する圧力制御を行っていない対照である。試料７は、乳鉢と乳棒で均質化したものである。また図１２において、レーンＤ１〜Ｄ７およびＲ１〜Ｒ７は、Ｒｏｃｈｅ社のＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ鋳型キットを用いて抽出し、ＤＮａｓｅ（Ｄ１〜Ｄ７）またはＲＮａｓｅ（Ｒ１〜Ｒ７）で処理した試料である。これらの結果から、ＰＣＴ処理した試料は、アガロースゲルのバンド強度（図１２、レーンＲ１，Ｒ３，Ｒ５およびＲ７）または２６０ｎｍでの吸光度によって判別される、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒキットの場合と同様のゲノムＤＮＡレベルを達成することが分かった。陰性対照は、実験の間に圧力を大気圧に維持したことを除いては、同じ処理を行うことにより得た。
【００９３】
図１２に示されるように、非加圧対照（レーンＤ２，Ｒ２，Ｄ４，Ｒ４）と比較すると、ＰＣＴシュレッダを用いた場合、大量のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ；レーンＲ１，Ｒ３）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ；レーンＤ１，Ｄ３）が維持および遊離されていた。ｇＤＮＡの収率は、本実験において、抽出前に組織を可溶化するためにプロテイナーゼＫと４時間プレインキュベーションするＲｏｃｈｅのキット手順を用いて得られた陽性対照と比較しても（レーンＲ２，Ｒ４対Ｒ７）実際のところ大きかった。
実施例２：組織溶解効率の研究と２チャンバ均質化モジュール設計の向上
モデルとしてラットの肝臓を用い、圧力プロファイル（約１０３，４２５ｋＰａ（１５ｋｐｓｉ）から約３４４，７５０ｋＰａ（５０ｋｐｓｉ））、サイクル回数プロファイル（２回から４５回）、温度プロファイル（−３０℃から０℃）、シュレッダオリフィスの数（同一面積に１０個から８９個）、および様々な捕捉流体（Ｇｄｎ／１％ＣＨＡＰＳ；リン酸緩衝生理食塩水、ＧＴＣ／１％ ＮＰ４０）について試験を行った。各試験条件に続いて、捕捉流体を新しい微量遠心管に移し、７，６００×ｇで手短に遠心分離した。上清を回収し新しい微量遠心管に保存した。この上清から市販のキットを用いて核酸を抽出した。ＤＮＡ収率を分析するために、精製された核酸をＲＮａｓｅ処理して、アガロースゲル電気泳動によって分析した。回収した材料をＲＮａｓｅ処理してから、０．５×ＴＢＥバッファ中、０．８％アガロースで、１２０Ｖの一定電圧下で６０分間電気泳動した。
【００９４】
図４は、圧力サイクルプロファイルの１つを示したものである。ゲル上のｇＤＮＡに対するバンド強度のデンシトメトリ走査の積分によって決定された、５サイクルのＰＣＴによって遊離されたｇＤＮＡの収率（レーン３）は、２サイクルのＰＣＴによって遊離された収率（レーン２）よりも大きく、Ｒｏｃｈｅキットを用いた対照方法によって得られたものと同等であった。−２５℃および大気圧下に保持した組織由来の上清を同様に処理して、陰性対照（レーン１）とした。
【００９５】
上記の結果から、２チャンバ均質化モジュール処理方法では、長時間にわたる（４時間）プロテイナーゼＫ消化を必要とすることなく、標準的な方法によって達成されるのと少なくとも同等に組織からの核酸を遊離させうることが実証された。ゲノムＤＮＡの収率は、陽性対照によって得られるものと類似していた。ＲＮＡは、リボゾームＲＮＡバンドによって判別したところ、よく保存されていた。非加圧対照の１つである図１２の試料２に見られた比較的高いバックグラウンドの核酸は、これらの組織試料に対して典型的なものではなく、他の実験においては見られなかった。レーンＤ７にはＲＮＡバンドが全く見られないが、これはＲｏｃｈｅキット手順に明記されているプロテイナーゼＫとの長いインキュベーション工程の間に、内在性ＲＮａｓｅが遊離されたあらゆるＲＮＡを効果的に分解したためである。これらの研究に用いられたＰＣＴシュレッダ自体は、比較的圧力に安定であり、清浄後に再使用可能であるようである。シュレッダ中で用いられ、ＰＣＴ条件にかけられたのと同様のプラスチックからなる密閉されたチューブとは異なり、上記モジュールに対しては圧力かぶりが全く見られなかったが、これはおそらくモジュールの内外の圧力がラムの移動によって容易に平衡化されたことによると思われる。
実施例３：ラット脳、膵臓、大腸および骨格筋のＰＣＴ均質化
抽出が明らかに困難であるいくつかのさらなる組織について、ＰＣＴ均質化の有効性も調べた。脳組織はタンパク質および脂質を特に多く含み、通常は水性‐有機液相抽出において水相中に白色の綿状物質を与える。膵臓はヌクレアーゼ濃度が非常に高く、通常はＲＮＡが分解されてしまい、従来の方法では回収が困難である。大腸および骨格筋は、結合組織成分を有した繊維組織であるため、均質化が難しい。
【００９６】
上記組織について、２００μＬではなく１００μＬの溶解物をＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ鋳型キットを用いて抽出したことを除いては、図１２に用いた肝臓の場合と同じ実験手順でＰＣＴプロセスを行った。最終溶出液の体積は６０μＬであった。ｇＤＮＡおよびｒＲＮＡはアガロースゲルによって判定した。図５は、大腸および筋肉に対するＰＣＴプロセスの均質化の有効性が、従来のプロテイナーゼＫ法に匹敵することを示している。レーン１〜５は、大腸から遊離されたゲノムＤＮＡを含むものである。レーン６〜１０は、骨格筋から遊離されたゲノムＤＮＡを含むものである。レーン１，３，６および８は、ＰＣＴモジュールを用いて均質化した試料である。レーン２，４，７および９は、それぞれレーン１，３，６および８に対応する非加圧対照である。レーン５および１０は、プロテイナーゼＫを用いた均質化による陽性対照である。レーン１，２，６および７は、飽和Ｇｄｎ／１％ＣＨＡＰＳの存在下で加工処理したものである。レーン３，４，８および９は、６Ｍ ＧＴＣ／１％ＮＰ４０によって加工処理したものである。非加圧対照を除く全ての試料は、粗溶解物からの上清であり、プロテイナーゼＫ処理を除いたＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ鋳型キットを用いて抽出した。
【００９７】
ＰＣＴ溶解物中に見られるゲノムＤＮＡバンドは増幅させることができ、陽性対照によるものと同一のＰＣＲ産物が産生された（図６）。図６は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のβ‐アクチンプライマーセットを用いて骨格筋試料から増幅したゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅物を示している。レーン１，２および３は、ＰＣＴ処理された鋳型の１：５、１：２５および１：６２５希釈物からのＰＣＲ産物である。レーン４，５および６は、「陽性対照」鋳型の１：５、１：２５および１：６２５希釈物からのＰＣＲ産物である。レーン７は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のβ‐アクチンｃＤＮＡ対照を用いたＰＣＲ産物を示している。
【００９８】
図７は、ラット脳溶解抽出物を示している。レーン１，２，６および７は、飽和Ｇｄｎ／１％ＣＨＡＰＳの存在下で加工処理した。レーン１および６は、ＰＣＴ均質化試料からのものである。図２および７は、非加圧対照からの試料である。レーン３，４，８および９は、６Ｍ ＧＴＣ／１％ ＮＰ４０で処理したものである。レーン３および８は、圧力処理した試料であり、レーン４および９は非加圧対照である。レーン５および１０は、Ｒｏｓｃｈｅのキットの「陽性対照」からのものである。レーン１〜５はＲＮａｓｅで処理したものである。レーン６〜１０は、ＤＮａｓｅで処理したものである。試料１０はプロテイナーゼＫ工程が原因でＲＮＡを欠如している。
【００９９】
ＰＣＴ処理した組織または非加圧組織の上清からのＲＴ‐ＰＣＲ ＲＮＡ鋳型は、プロテイナーゼＫ予備消化工程は省略したが、ＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ鋳型キットの手順を用いた抽出により得た。「陽性対照」は、プロテイナーゼＫ消化工程を含むＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ＲＮＡの手順を用いて同一の組織標本から作成した。得られた抽出物を、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ‐ＰＣＲプロトコールおよびＣｌｏｎｔｅｃｈ社（在カリフォルニア州パロアルト）から入手したβ‐アクチンに対するプライマーを用いたＲＴ‐ＰＣＲに供した。ＰＣＴ均質化手順によって遊離された核酸の収率を推定するために、０．８％アガロースを用いてアガロースゲル分析を実施した。この結果、ＰＣＴ鋳型から回収されたＲＴ‐ＰＣＲ産物が、キット対照に匹敵することが分かった。興味深いことに、対照であるＲｏｃｈｅのキットよりもＰＣＴ法によって、より多くのｍＲＮＡが膵臓試料から回収されているようである。図８は、ラット脳鋳型からのβ‐アクチンＲＴ‐ＰＣＲ産物を示したものである。レーン１〜３は、圧力抽出された試料からの物である。レーン４〜６は、ＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）組織ＲＮＡキットを用いて調製した陽性対照試料からのものである。１〜３および４〜６に対する鋳型の希釈係数は、それぞれ１：５，１：２５および１：６２５とした。レーン７は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈプライマーセット対照を含んでいる。
【０１００】
図９は、ＰＣＴモジュールによって均質化されたラット膵臓を示している。レーン１〜５は抽出物中のゲノムＤＮＡを示しており、レーン６〜１０はＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ ＲＮＡキットを用いて精製した同一の抽出物からのｒＲＮＡを示している。試料は図７に示したラット脳に対して行ったのと同様にして処理した。膵臓からのレーンａ〜ｇは、上述のラット脳からの図８に記載したレーン１〜７と同等であった。
【０１０１】
図９のレーンａ中にシグナルが欠如しているが、おそらくは鋳型中にＰＣＲインヒビタが存在していることが原因であろう。この実験を繰り返したところ、データは同様の結果を示した。最も重要な観察結果は、従来の組織均質化方法によっては特に困難な作業であった、膵臓からｍＲＮＡを遊離させて保護することに、ＰＣＴ方法が有効であるということである。
実施例４：植物組織の均質化：トウモロコシ葉核酸の遊離およびＰＣＲ増幅
トウモロコシの葉由来のゲノムＤＮＡ、リボソームＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡの均質化および遊離を実証するために、さらなる実験を行った。核酸をトウモロコシの葉から遊離させる標準的な方法では、剃刀の刃を用いて細分化した後に乳鉢と乳棒を用いて均質化する必要がある。核酸を分解から保護するために、均質化プロセスは典型的には液体窒素の存在下で行われる。次に組織をプロテイナーゼＫとともにインキュベートして核酸を遊離させた後、標準的な抽出方法またはキットを用いたゲノムＤＮＡの抽出を行う。
【０１０２】
ＰＣＴ均質化実験において、７日間発芽させた後に新鮮なトウモロコシ葉を採集した。０．２ｇの新鮮な葉を冷蒸留水で洗浄し、微量遠心管中、−７０℃で一時的に保存した。本実験のためには、０．７ｍＬの抽出バッファ（６Ｍグアニジン／１％ＣＨＡＰＳ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ［ＴＥ］、またはＧＴＣ／１％ＮＰ４０）を、シュレッダモジュールの捕捉区画に添加し、動物組織に対して記載したようなＰＣＴ処理に供した。圧力パルスシーケンスは実施例１に記載したものと同様である。圧力処理後、捕捉流体を回収し、８，４００×ｇで１分間手短に遠心分離し、デブリスを除去した。上清を回収し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１０３】
図１０は、ＰＣＴモジュールを用いたＤＮＡの遊離を示したものである。レーン１および２は、６Ｍ Ｇｄｎ／１％ＣＨＡＰＳバッファ中で加工処理した試料を示している。レーン３および４は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ［ＴＥ］バッファ中で加工処理したものである。レーン５および６は、ＧＴＣ／１％ＮＰ４０バッファ中で加工処理したものである。非加圧試料については、レーン２，４および６に示されている。ＱＩＡＧＥＮの植物ＤＮＡ抽出キットプロセスをレーン７の試料に適用した。図１０に示したように、トウモロコシからは、抽出前に液体窒素中での乳鉢と乳棒による長時間にわたる粉砕を必要としたＱＩＡＧＥＮ（登録商標）のＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ（登録商標）キットによって得られたのと同様の量のＤＮＡが得られることが分かった（図１０）。興味深いことに、ＴＥバッファを回収溶液として用いた場合でさえ、相当な量のＤＮＡが回収された。すべてのＤＮＡ試料はＰＣＲ反応の鋳型として効率的に働き、乳鉢と乳棒を使って抽出した対照の鋳型の場合と同様の結果を与えた。
【０１０４】
これらの例において示された結果から、プロテイナーゼＫによる長時間にわたる消化を必要とすることなく、あるいは乳鉢と乳棒を使った均質化を必要とすることなく、ＰＣＴ処理を用いて様々な動物や植物組織から核酸を遊離させることができることが証明された。ＲＮＡの消化が殆ど観察されることなく、ＲＮＡとＤＮＡのいずれも効率的に回収された。界面活性剤を含まないバッファ中（例えば、ＴＥ）でさえ、ＰＣＴによって核酸を遊離させることができる。
【０１０５】
粗溶解物は、ＰＣＲなどの下流の加工処理における鋳型として用いるのにも適している。図１１は、上述のプロセスによって遊離されたトウモロコシ葉ＤＮＡのＰＣＲ増幅を示したものである。プライマーセットがトウモロコシゲノム中の「ＭＴＴＣ」領域を増幅した。レーン１ａ〜１ｃ、２ａ〜２ｃ、および３ａ〜３ｃには、ＰＣＴモジュールによって遊離された試料を含めた。レーン４ａ〜４ｃには、陽性対照試料を含めた。レーン１ａ，２ａ，３ａおよび４ａには、１：５の鋳型濃度のものを含めた。レーン１ｂ，２ｂ，３ｂおよび４ｂには、１：２５の鋳型濃度のものを含めた。レーン１ｃ，２ｃ，３ｃおよび４ｃには、１：６２５の鋳型濃度のものを含めた。これらの結果から、ＰＣＴモジュールを用いて得られたＤＮＡは、「陽性対照」と同一の産物を産生することが実証された。したがって記載の方法は、従来の方法に比べて少ない工程を用いて、はるかに迅速かつ容易に実施することができるとともに、良質の核酸を高収率で与えることができる。
実施例５：圧力と電流によって核酸を精製するためのマルチチャンバデバイス
１つの構成において、細胞から核酸を遊離させ、それらを精製するために圧力を電界と組み合わせることができる（図１７Ａ〜図１７Ｂ）。図１７Ａは抽出モジュールの７つの部品と組立体が示されている（例えば、上部キャップ、加圧部材（ラム）、モジュール本体、電極、モジュールの下部に配置されたバリア、および封止部材（Ｏリング）、ならびに底部キャップ）。これらの特徴は断面図でも示されている。図１７Ｂは、組立モジュールの機能を示している。試料をチャンバ１内に配置し、ラムを移動させて「装入」期間のあいだにチャンバ１内に試料を送給する。本デバイスは、チャンバ１とチャンバ２の間に、組織を可溶化するためのバリア（例えば、シュレッダ）も備えている。適当な温度下で周期的圧力をかけた後、細胞の溶解と核酸の遊離が起こる。細胞の溶解に続いて、加圧によって区画間のバリア（シュレッダ）を通過させることにより、溶解物をチャンバ２に移送する。圧力駆動凍結解凍効果を誘導するためには温度も重要である。「装入」に続いて、周期的な高圧印加を伴う「溶解／タンパク質除去」を開始する。電極Ｅ１〜Ｅ２をオンにし、１５ＭＰａ〜７５ＭＰａの間で圧力を周期的に変える。次に、電極Ｅ３〜Ｅ４を起動した状態で圧力を高くすることにより、「抽出」を開始する。チャンバ２において、遊離された核酸は核酸に対する特異的な親和性を有する樹脂に結合することになる。チャンバに電流を印加することにより、核酸が、チャンバ２Ａ内の結合樹脂からチャンバ２Ｂ内の電極へと移動する（図１７Ｂを参照）。チャンバ２Ａからチャンバ２Ｂへの核酸の移動により、該核酸単離手順にクロマトグラフィーの要素が導入され、圧力と電界の強度を変えることにより、異なるサイズの核酸を分離することができるようになる。試料の性質に応じて、このプロセスは１〜１５分間かけて行うことができる。電気泳動分離に続き、核酸を回収チャンバであるチャンバ３B 中に溶出し、その後このチャンバ３B から結合している膜を回収することにより精製核酸を取り出す。細胞溶解と核酸分離の両方を助けることのできる高圧装置（例えば、ＢＢＩ社のＢａｒｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標））により、高出力の加工処理と分析の両方が可能になる。反応チャンバは、複数のモジュールを収容するように設計することもできる。
実施例６：圧力および樹脂への結合による核酸の精製
核酸調製モジュールは、一連のチャンバを介した段階的経過による細胞溶解と核酸の精製を可能にする（図１８）。このデバイスは、試料が装入されて細胞溶解を行う上側試料チャンバからなる。このチャンバは、ゴム製ガスケットを有するラムによって外部の圧力流体に対して密閉されている。このチャンバは、多孔性支持体（細胞用）、または多孔性「シュレッダ」を含んでいてもよく、組織の塊をより小さい小片に細分化することを容易にし、圧力下で組織をこれらの多孔に通過させることによって核酸の抽出を促進することができる。キャップまたはラムは、モジュールを封止する役目と、試料に圧力を伝達する役目の両方を果たす。ＰＣＴ（高圧サイクル）に続いて、核酸の精製のために、核酸を含む抽出バッファをチャンバ１からチャンバ２に移送する。核酸は、シリカやイオン交換樹脂などのマトリクス、あるいはＱＩＡＧＥＮ（登録商標）のプラスミド抽出カラムまたはＱＩＡａｍｐ（登録商標）抽出カラムなどの市販の試薬に結合させることもできる。区画間の液体の移送は、圧力の印加を介して区画間のバリアを破裂させることにより媒介される。温度または機械的手段を用いることもできる。あるいは、マルチチャンバデバイスに一連のバルブおよびチューブを組み込んで、チャンバから次のチャンバへの試薬の移送だけでなく、流体の追加と除去もできるようにすることが可能である。
【０１０６】
チャンバ２は、核酸と結合するＤＮＡ（またはＲＮＡ）結合樹脂（例えば、シリカＤＥＡＥ）を含んでいる。液体入力／出力装置を用いて、デブリスと不純物をチャンバ２中へ洗い流すことができる液体を導入および除去する。次に精製された核酸を回収チャンバ（チャンバ３）中に溶出する。バルブは、洗浄バッファ流を廃棄容器に向け、精製された核酸を回収チャンバの方向に向ける。
【０１０７】
この構成において、試料は溶解バッファおよび結合マトリクスを含むチャンバに移送される。抽出モジュールは封止して、ＢａｒｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）中に挿入する。圧力処理に続いて、デブリスを低圧力にて洗い流し、高圧力にてＤＮＡを回収チャンバ内に溶出する。この柔軟な設計により、様々な溶解バッファおよび洗浄バッファ、ならびに核酸結合マトリクスの選択が可能になり、後続の各加工処理工程に必要とされる圧力条件のプログラミングも可能になる。
【０１０８】
抽出された核酸は、それ以上精製することなくそのままマイクロアレイ分析または増幅に用いることができる。あるいは、同溶質を、ＤＮＡのサイズ決定および分離のための要素、または全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの分離のための要素を備えたラボオンチップ（ｌａｂ‐ｏｎ‐ｃｈｉｐ）システムの１つに適用することもできる。必要であれば、市販の抽出キットを用いて全核酸調製物からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出することもできる。実施例７：低塩条件における溶解
界面活性剤を含まない低塩溶液中で細胞溶解を行うことができれば、ＰＣＲおよび配列決定を含む多くの後続の分析的手順に対して十分な純度をもつ核酸を得ることができる。タンパク質や他のデブリスなどの不純物は、核酸を溶液中に残して、様々なマトリクス、例えば、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）またはＰｒｏｃｉｐｉｔａｔｅ（登録商標）に結合させることができる。この構成において（図１８を参照）、デブリスおよび不純物はチャンバ１に保持され、可溶性核酸は単純な濾過によってチャンバ２内に回収される。その後この遊離された核酸はそのまま、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定および他の分析的手法を含む様々な生化学的および酵素的用途において用いられる。
【０１０９】
本発明に記載のデバイスは、核酸の精製に対する完全な自立した系を提供し、圧力によって媒介される溶解およびタンパク質除去と、それに続く精製をうまく利用して、濃縮された核酸生成物を得ることができる。その後の核酸の加工処理には、低圧でデブリスを洗い流すことと、ＢＢＩ ＢａｒｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ｖ３．０を用いて第２の工程において精製された核酸を高圧下で溶出する工程とが含まれる。
実施例８：二重Ｏリングデバイス
図１９は、ラム１０４およびスクリューキャップ１０６の両方の上に二重Ｏリング１０２を有する本発明のマルチチャンバデバイス１００を示した図である。また、ラムおよびキャップ内には、チューブの内側または外側からいずれかのＯリングを通過してきたあらゆる流体を捕捉することのできる溝１０８も設けられている。デバイスは、溶解ディスク１１０と、試料チャンバ１１２と、流体／反応チャンバ１１４も備えている。デバイス１００の典型的な使用において、流体／反応チャンバ１１４にバッファ溶液を入れ、スクリューキャップ１０６をチャンバ１１４に隣接するデバイス１００のねじ切り部分１１８内に螺合し、加工処理または細砕しようとする試料を試料チャンバ１１２に入れ、ラム１０４を、随意でラムを所定の深さまで挿入させることのできる工具を用いて、試料チャンバ内に挿入する。このような工具の例が図２０に示されている。図２０に示される工具の一方端部は、キャップ１０６を螺合または脱螺合させるねじ回しとして機能する。工具の他方端部は、ラム１０４を所定の適切な深さに設定する支柱を有している。そしてデバイス１００を、ＢＢＩ ＢａｒｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）などの圧力サイクル装置に入れ、該装置は、ラムに試料を溶解ディスク１１０を通過させるようにして、一般にはチャンバ１１４内のバッファ溶液内に溶解試料の溶液または懸濁液が得られることになる。
【０１１０】
デバイス１００がチューブの内側または外側から「漏れている」かどうかを、既知濃度のフルオレセイン溶液を用いて、チューブ内側の溶液の蛍光またはチューブ外側のバッグ内の流体の蛍光を測定することにより、確かめることができる。適当なバッファ中のフルオレセインから作成した用量応答曲線と蛍光を比較する際には、蛍光の量を体積に変換することができる。この方法は非常に感度が高く、０．１μＬの体積の漏れを検出するためにも用いることができる。本方法は、新しく作られたチューブを評価するために、品質管理のために、あるいは加工処理された試料について用いることができる。
実施例９：ＰＣＴによるラット尾部の溶解
ラット尾部はＰｅｌ‐Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手し、新鮮な間に凍結しドライアイス上または−７０℃で保存した。ラット尾部の０．２ｇの小片を、図１９に示されるような本発明のマルチチャンバデバイス中、ＢＢＩ Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｖ２．４を用いて約２４１，３２５ｋＰａ（３５ｋｐｓｉ）、４℃で１分間のサイクルを５回繰り返して、加工処理した。それぞれのデバイスには、図３Ａに示されるような２０個の２ｍｍの穴を有するステンレス鋼ディスクを補足した。金属ディスクの目的は、デバイス本体内のプラスチック製溶解ディスクを強化することである。この試料セットに対して用いたバッファを表１の第３欄に示す。
【０１１１】
【表１】
溶解バッファによって決まる３つの異なる方法から粗溶解物を得た後、プロテイナーゼＫ処理工程を「ＰＣＴ」および「乳棒と乳鉢」試料（すなわち、試料３〜５）に対しては省略したことを除いては、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ組織キットプロトコールを行って、試料からゲノムＤＮＡを精製した。陰性対照試料は、圧力処理を行わなかったことを除き、同様にして試料を処理することによって得た。表１に示したそれぞれのＤＮＡ収率は、２６０ｎｍの読取り値によって得たものである。
【０１１２】
図２１に示される試料１〜６から精製されたゲノムＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によって実証されるように、圧力サイクル（「ＰＣＴ」）を用いて得られる溶解効率は、従来のプロテイナーゼＫ消化または乳鉢と乳棒の方法を用いた場合と同等であった。アガロースゲルは表Ｘに示した通りであった。同一体積の精製ＤＮＡ試料を各レーンに流した。他の実験（データ示さず）によって、乳鉢と乳棒を用いた方法と比較して類似量の全ＲＮＡをラット尾部から首尾良く抽出できることが実証された。ＰＣＴ処理からのＤＮＡおよびＲＮＡ収率は、β‐アクチンプライマーセットを用いたＰＣＲまたはＲＴ‐ＰＣＲによ
って示されるようにＰＣＲ増幅可能であった。
実施例１０：ラット脳の加工処理およびラット脳からの分子抽出
ラット脳試料は、Ｐｅｌ‐Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手した。試料は新鮮凍結され、ドライアイス上または−７０℃で保存した。試料を、１％ＣＨＡＰＳを含有する飽和塩酸グアニジン溶液中、ＰＣＴにより、約２４１，３２５ｋＰａ（３５，０００ｐｓｉ）、℃で、１分間のサイクルを５回繰り返すことにより処理した。図２２Ａは、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）のＱＩＡａｍｐＤＮＡ組織キットを用いて精製された（プロテイナーゼＫ消化工程は省略）粗溶解物中に抽出されたゲノムＤＮＡが存在することを実証するアガロースゲルである。
【０１１３】
ラット脳タンパク質についても、ＰＣＴ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、２５℃で１分間のサイクルを５回）、非加圧対照、および液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いた後のＯｍｎｉのホモジナイザーによる均質化、を用いて抽出を行った（図２２Ｂ）。該ラットタンパク質を、ウェスタンブロット分析を用いて調べた（図２２Ｃ）。ウェスタンブロットアッセイにおいて、一次抗体は、ユニバーサルな抗一酸化窒素シンターゼモノクローナル抗体（マウス）、二次抗体は、抗マウスＩｇＭ抗体（ｍ鎖特異的）‐アルカリホスファターゼコンジュゲートとした（いずれの抗体も、在ミズーリー州セントルイスのＳｉｇｍａ社より入手した）。脳組織はＰＢＳ中で均質化した。
【０１１４】
この実施例は、ＰＣＴがＤＮＡおよびタンパク質を動物の脳組織から抽出できることを実証するものである。ＰＣＴプロセスは、ＤＮＡ分析のためのＰＣＲ増幅と適合するものであった。一酸化窒素シンターゼの抗原活性も維持されていた。ＥＬＩＳＡアッセイ（データ示さず）からも、ラット脳をＰＣＴによって加工処理することにより、その他の天然のタンパク質が得られることが実証された。
（他の実施形態）
本発明の多数の実施形態を記載してきた。それでもなお、本発明の精神と範囲から逸脱しない限りにおいて様々な改変が可能であることが理解されよう。したがって、他の実施形態も請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】生物試料を調製するためのデバイスの断面図。
【図２】２つのラムを含むマルチチャンバデバイス組立体の斜視図。
【図３Ａ】シュレッダ面を有するバリアの例を描いた図。シュレッダ面は単純な円形孔によって構成されている。
【図３Ｂ】シュレッダ面を有するバリアの例を描いた図。シュレッダ面は、孔だけでなく、孔間に試料の粉砕を助ける固体の尖った凸部を有している。
【図４】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図５】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図６】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図７】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図８】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図９】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図１０】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図１１】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図１２】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図１３】９６ウェルプレートの１つのウェル内に嵌合するシュレッダ要素を有する試料調製デバイスの図。
【図１４】１つの多孔性バリアと、複数の貫通可能バリアと、１つの圧力調節装置とを有する試料調製デバイスの断面図。
【図１５Ａ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｂ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｃ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｄ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｅ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｆ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１６Ａ】垂直方向および水平方向のいずれの試料区画にも試料または試薬が導入されるデバイスの上面図。
【図１６Ｂ】垂直方向および水平方向のいずれの試料区画にも試料または試薬が導入されるデバイスの側面図。
【図１７Ａ】圧力および電流を用いて核酸を抽出することのできるデバイスの図。
【図１７Ｂ】圧力および電流を用いて核酸を抽出することのできるデバイスの図。
【図１８Ａ】シリンダの部分に分割された様々な区画に試料が送達されているデバイスの図。試料チャンバと洗浄チャンバとの相対位置を説明する。
【図１８Ｂ】シリンダの部分に分割された様々な区画に試料が送達されているデバイスの図。試料がバルブを通して送達され、また下側の区画が円運動で機械的に移動する仕組みを説明する図。
【図１９】二重Ｏリングを有する本発明のマルチチャンバデバイスの断面図。
【図２０】図２４のデバイスのキャップとラムを設定するための工具の図。
【図２１】本発明のデバイスを用いて加工処理されたラットの尾部から精製したゲノムＤＮＡを示す、アガロース電気泳動ゲルの写真。
【図２２Ａ】本発明のデバイスおよび他の方法を用いて加工処理したラット脳から抽出されたＤＮＡのアガロースゲルの写真。
【図２２Ｂ】本発明のデバイスおよび他の方法を用いて加工処理したラット脳から抽出されたＤＮＡのアガロースゲルの写真。
【図２２Ｃ】本発明のデバイスおよび他の方法を用いて加工処理したラット脳から抽出されたタンパク質のウェスタンブロットの写真。
【０００１】
本発明は、一般には、随意で試料由来の材料の分析および／または検出を伴う、生物試料の調製（例えば、均質化）および加工処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）のための方法およびマルチチャンバデバイスの分野に関する。個々の実施形態は、バイオテクノロジー、医学的診断、農業、食品、科学捜査、薬学、環境学および獣医学における用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
生物試料はその単離後に処理工程や分析にかけられることが多い。このような試料の加工処理には、典型的には、生物組織の均質化、細胞の溶解、固体粒子の懸濁または可溶化、および固体材料の液化のうちの１つ以上が含まれる。また試料調製には、長時間にわたる酵素的消化、過酷な化学薬品、および／または機械的破砕を伴うことも多い。この最初の調製に続いて、試料は、試料中の核酸および／またはタンパク質などの目的の特定の分子を精製または増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはゲル電気泳動などの技術を用いてさらなる加工処理にかけることもできる。加工処理後、試料は典型的には分析および／または検出の工程にかけられる。
【０００３】
植物および動物の組織、ならびに強靱な細胞壁を有する例えばある種のマイコバクテリアなどの細菌に分子的技術を応用する場合、ある困難に直面することがある。このような試料から生物分子を抽出するための現行の方法は、複数の工程を用いた複雑な加工処理を必要とするために限界があり、非常な時間と労力、ならびに費用を要することもある。細菌または組織の加工処理は、例えば、リゾチームまたはプロテイナーゼＫなどの酵素による長時間にわたる前処理またはガラスビーズを用いた粉砕を必要とする場合もある。細胞や組織によっては、乳棒と乳鉢、ビーズミル、ロータ−ステータホモジナイザー、ブレードブレンダ、超音波破砕機、粉砕機、乳鉢とチューブグラインダー、肉ひき機、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）、またはフレンチプレス（登録商標）などの道具を必要とする、さらなる機械的破砕が必要とされることも多い。例えば、組み換え細菌構築物の高レベル発現によって生産されるような、不溶性（封入体）タンパク質の調製や抽出のためには、長時間にわたる加工処理工程が要求される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
試料の生物学的特性の分析では、核酸、タンパク質、抗体、因子または該試料から抽出される活性を検出するなどの、さらなる加工処理が必要になることもある。このようなさらなる加工処理は、核酸と特異的なプライマーまたはプローブとのハイブリダイゼーション、増幅、および特異的シグナルの検出などのさらに別の工程を必要とすることもある。タンパク質または抗体活性の分析のためには、特異的リガンドへの結合または該リガンドからの溶離、抗原抗体反応性、または他の「加工処理」システムが、所望の生成物の同定および／または精製のために必要とされることもある。生物活性試験は、抽出物を酵素および／または補因子のカスケードとともにインキュベートして、検出可能な生成物を生成させることを含んでいてもよい。これらの分子を遊離するための緩和でありながらも効率的な方法が望まれている。
【０００５】
プロセス全体を簡略化し、広範な標本タイプにわたって方法を標準化し、自動化しやすく、試料成分、特に生体分子の分解を制限するように設計された装置および手法を用いて、生物試料を調製、加工処理および分析することが非常に望ましい。
【０００６】
試料調製工程の簡略化または自動化によって、時間と費用を節約することができ、例えば、試料の手動操作の減少により、分析技術からより信頼性のある出力が得られるようになる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、自動化しやすく、所望のプロセスのうちの少なくとも１つが高圧を用いて実施されるようなマルチチャンバデバイスのチャンバ内で、様々な精製および／または分析工程を実施することを可能にする。
【０００８】
本発明は、貫通可能および／または多孔性バリアによって分離された複数のチャンバを有するデバイス内の試料に、周期的圧力、可変温度、またはその両方を与えることにより、生物試料を制御および自動化された方法で処理することが可能になるという発見に少なくとも部分的に基づいている。この新しいデバイスは液体試料とともに使用するのに適しているが、同様にして、植物全体または動物組織などの固体または半固体試料、およびガス状試料とともに使用することもできる。
【０００９】
新規のデバイスおよび方法は試料を装入および装出するための単純な形式を提供し、上記方法は一般的に自動化が可能でありながらも、組織試料を効果的に分断化、均質化、加工処理することができる。本方法およびデバイスでは、試料が一般的に連続して処理されるため、試料および試薬の移送の必要性が軽減される。本発明の１つの実施形態において、組織の大きな塊はまず最初により小さい小片に分断化された後、完全に均質化されるが、試料のさらなる加工処理前に、標的とする生体分子が容認できないほど分解されることは回避される。核酸やタンパク質などの生体分子の遊離は効率的であり、これらの分子の機能（例えば溶解物中）はよく維持されている。試料を均質化して、生体分子を遊離させた後、試料は、典型的にはマルチチャンバデバイスの後続のチャンバに押込まれた後に、さらなる加工処理を受ける。試料のさらなる加工処理としては、特に限定されないが、以下の工程の１つまたは組み合わせが挙げられる。クロマトグラフィー、固相捕捉、またはゲル電気泳動による精製；酵素的加工処理；生体分子の増幅（例えばＰＣＲ）；タンパク質相互作用の加工処理および／または検出；化学的修飾；基質ラベリング；基質の可溶化；および基質検出。
【００１０】
本方法の均質化の態様は、高静水圧サイクル技術（「ＰＣＴ」）と連結して容易に用いられる。生物試料の分析にＰＣＴ技術を使用することは、以下の文献中など、他所に一般的に記載されている。下記の文献は、引用によりその全体が本願に組み込まれる。ローハーン・ジュニア（Ｌａｕｇｈａｒｎ，Ｊｒ．）らの米国特許第６，１１１，０９６号；ローハーン・ジュニアらの米国特許第６，１２０，９８５号；ヘス（Ｈｅｓｓ），Ｒとローハーン・ジュニアらの米国特許第６，１２７，５３４号；ヘス，Ｒとローハーン・ジュニアの米国特許第６，２４５，５０６号；ローハーン・ジュニアらの米国特許第６，２５８，５３４号；ローハーン・ジュニアらの米国特許第６，２７０，７２３号；ローハーン・ジュニアらの米国特許第６，２７４，７２６号および国際出願国際公開第９９／２２８６８号。試料に与えられる物理的変化としては、固体または他の物質がスクリーンを通過する際の、例えば、圧力による相変化、高圧下における体積変化および、均質化などが挙げられる。このようなプロセスは、自動化に容易に適用可能である。
【００１１】
１つの実施形態において、本発明は、圧力調節装置において用いるための試料調製デバイスを特徴とする。このデバイスは、複数のチャンバと、２つのチャンバ間に配置された少なくとも１つのバリアと、少なくとも１つの加圧部材であって、試料を高圧に供して少なくとも１つのバリアに試料を強制通過させるように配置されたラムなどの加圧部材とを含む。バリアは、多孔性または貫通可能性（例えば隔壁）のいずれであってもよく、あるいは、物理的、化学的または機械的刺激に暴露することにより多孔性または貫通可能にするようにしてもよい。チャンバのうちの１つ以上を単一の一体化成形されたデバイスの一部としてもよい。
【００１２】
いくつかの場合において、スクリーンまたはシュレッダなどのバリアを、第１のチャンバと第２のチャンバとの間に配置して、バリア内の開口部が第１のチャンバと第２のチャンバとの間の材料（例えば、固体、半固体、液体または気体）の連通を可能にするようにしてもよい。
【００１３】
他の場合において、前記デバイスは、各チャンバ間に配置された複数のバリアを有する３つ以上のチャンバを含んでいてもよい。バリアのうちの少なくとも１つを、多孔性または貫通可能なものとしてもよいし、あるいは物理的、化学的または機械的刺激に暴露することによって多孔性または貫通可能なものとしてもよい。このデバイスは、それぞれ独立して、例えば異なる静水圧で作動させることのできる２つ以上の加圧部材をさらに含んでいてもよい。少なくとも１つの加圧部材、例えばラムは、試料を高圧に供して、該試料を少なくとも１つのバリアを強制通過させる位置に配置されている。チャンバのうちの２つ以上をネジ込み機械的インターロックまたはネジ付機構によって互いに連結することもできる。
【００１４】
チャンバはプラスチック、ゴム、セラミック、金属またはガラス、あるいはこれらの材料の任意の組み合わせで作成することができる。例えば、チャンバの最大容量は、約１００μＬ、約５００μＬ、約１ｍＬ、約１００ｍＬ、あるいは約５００ｍＬとすることができる。１つ以上のチャンバの表面を、生体分子に対して不活性化してもよい。１つ以上のチャンバの表面を、生体分子または薬学的有効成分または金属キレート剤などの小さい有機分子を用いて、共有結合、イオン相互作用、または非特異的吸着を介して誘導化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）することもできる。いくつかの場合において、少なくとも１つのバリアは穿刺可能（すなわち鋭利な物を用いて穿孔可能）であり、少なくとも１つのバリアは有機溶媒に溶解可能であり（例えば、テトラヒドロフランまたは酢酸エチルによって溶解可能なポリ（メタクリル酸メチル）バリア）、少なくとも１つのバリアは機械的に除去可能であり（例えば、ラムまたは他のデバイスの作用によって）、少なくとも１つのバリアは温度変化を介して除去可能であり（例えば、ワックスバリアは加熱によって溶解させることができ、低融点ポリマーで閉塞された多孔性セラミックバリアは、加熱によって多孔性にすることができる）、少なくとも１つのバリアはバルブ（例えば、一方向弁）を含んでいてもよく、あるいは少なくとも１つのバリアは以下の機構のいずれか１つまたは組み合わせによって除去することができる。上記機構としては、穿刺、溶媒和、融解、破壊、および機械的除去（例えば、ネジを外す、こじ開ける）が挙げられる。バリアは、ポリマー、金属、またはセラミックから作成することができる。バリアは、複合固体材料または固体材料の層（例えば、砂やシリカゲル）から構成することもできる。バリアは、精製または分析のために所望の基質を捕捉または除外するためのフィルタを含んでいてもよい。フィルタは、塩化ポリビニル、ポリエーテルスルフォン、ナイロン、ニトロセルロース、セルロースエステル、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリフルオロエチレン（ＰＦＴＡ）、ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたは他の材料から作成することができる。バリアは、例えば、複数の開口部を有していてもよく、該開口部は、例えば円形であってもよく、約１μｍ〜約３ｃｍ（例えば、約１μｍ〜約１００μｍ、約０．１ｍｍ〜１ｍｍ、約１ｍｍ〜１ｃｍ、約１ｃｍ〜３ｃｍ、または前記範囲または中間範囲の任意の組み合わせ）の直径を有していてもよい。バリアは、例えばポリマー、金属またはセラミックからなる複数の固体の尖った凸部を含んでいてもよい。尖った凸部は、例えば、ピラミッドまたは円錐形状とすることができ、例えば、スクリーンの基部の上方に、約０．０１〜３ｃｍ（例えば、０．０１ｃｍ、０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．５ｃｍ、０．８ｃｍ、１ｃｍ、１．５ｃｍ、２ｃｍ、２．５ｃｍ、または３ｃｍ、あるいは任意の中間範囲）延びるものであってよい。
【００１５】
加圧部材は、例えば、チャンバに関して相対移動するように取り付けられ、例えばポリマー、金属またはセラミックからなるものであってよい、少なくとも１つのラムを含むもの（もしくはそれ自体）であってよい。加圧部材は、例えば、円形の断面（例えば部材は円柱または円錐状であってもよい）を有していてもよい。チャンバは、例えば、壁を含んでいてもよく、加圧部材は、該加圧部材が移動する際に前記壁と接触する１つ以上の環状封止材（例えば、ゴムまたはテフロンＯリング）を含んでいてもよい。封止材は、例えば、高分子、金属またはセラミック材料から作成することができる。加圧部材は、例えば、その周囲に封止リングを有するシリンダであってもよく、その場合チャンバは略円筒状とすることができる。いくつかの場合において、デバイスは、一方はバリアの第１の側に配置され、他方はバリアの第１の側と対向する第２の側に配置される、少なくとも２つの加圧部材を含んでいてもよい。２つ以上のチャンバに加圧部材を取り付けてもよい（図１５）。
【００１６】
デバイスは、オリフィスを有する容器を含んでいてもよく、この場合チャンバはオリフィス内に配置することができる。１つ以上のチャンバを流体で充填してもよい。また１つ以上のチャンバは、温度制御デバイス、温度サイクルデバイス、圧力制御デバイス、圧力サイクルデバイス、または適当なセンサを含んでいてもよい。
【００１７】
またデバイスの複数のチャンバは、随意で圧力調節装置内で相互接続されていてもよい。いくつかの場合において、多数のデバイス（例えば、２，３，４，６，８，１０，１２またはそれ以上のデバイス）を細長い列を形成するように相互接続してもよいし、あるいは２次元マトリクス（例えば、８×１２，４×４，２×２，４×６または３×５）を形成するように相互接続してもよい。
【００１８】
いくつかの場合において、試薬を収容した１つ以上のチャンバが、試料を収容するチャンバを環状に包囲するようにしてもよく、この場合、圧力によって作動されるバルブを介して試薬を試料に導入することができる。
【００１９】
チャンバのうちの少なくとも１つは、試料の加工処理の間にチャンバに電流を通過させる電極を備えていてもよい。
他の実施形態において、本発明は、圧力調節装置において使用するための試料加工処理デバイスを特徴とする。このデバイスは、垂直配置で配置された複数のチャンバと、チャンバ対間に配置された複数の一時的バリアと、バリアに試料を強制通過させるように配置された加圧部材とを含んでいる（図１４を参照）。随意で、このデバイスは第１のチャンバと第２のチャンバの間に配置された多孔性バリアを含んでいてもよい。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、生物試料の加工処理方法を特徴とする。この方法は、上述のようなデバイスを提供することと、試料を該デバイスの第１のチャンバに添加することと、該デバイスを高圧力（例えば、少なくとも約６９０ｋＰａ（１００ｐｓｉ）、約１７２４ｋＰａ（２５０ｐｓｉ）、約３，４４８ｋＰａ（５００ｐｓｉ）、約５，１７１ｋＰａ（７５０ｐｓｉ）、約６，８９５ｋＰａ（１，０００ｐｓｉ）、約３４，４７５ｋＰａ（５，０００ｐｓｉ）、約６８，９５０ｋＰａ（１０，０００ｐｓｉ）、約１３７，９００ｋＰａ（２０，０００ｐｓｉ）、約２０６，８５０ｋＰａ（３０，０００ｐｓｉ）、約２７５，８００ｋＰａ（４０，０００ｐｓｉ）、約３４４，７５０ｋＰａ（５０，０００ｐｓｉ）、約４１３，７００ｋＰａ（６０，０００ｐｓｉ）、約４８２，６５０ｋＰａ（７０，０００ｐｓｉ）、約５５１，６００ｋＰａ（８０，０００ｐｓｉ）、約６２０，５５０ｋＰａ（９０，０００ｐｓｉ）、約６８９，５００ｋＰａ（１００，０００ｐｓｉ）、あるいはそれ以上）に供して、加圧部材が、試料を強制的に第１のチャンバと第２のチャンバの間のバリアを通過させて第２のチャンバに流入させるようにすることを含む。
【００２１】
試料は、例えば、加圧部材によって複数のバリアを強制通過されるようにしてもよい。生物試料としては、例えば、固体材料、半固体材料、および／または液体が挙げられる。特定の実施形態において、生物試料としては、例えば、昆虫または小動物、真菌、植物または動物組織、食品または農産物、科学捜査試料、ヒト組織（筋肉、腫瘍または臓器など）、血清、唾液、血液または尿が挙げられる。生物試料は随意で凍結されていてもよい。生物試料の大きさは、例えば、約０．１ｍｇ〜５００ｇ（例えば、０．１ｍｇ〜１．０ｍｇ、１．０ｍｇ〜１０ｍｇ、１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１００ｍｇ〜１ｇ、１ｇ〜２０ｇ、２０ｇ〜１００ｇ、１００ｇ〜２００ｇ、２００ｇ〜５００ｇ）とすることができる。
【００２２】
高圧力は、例えば、周囲温度または周囲温度より高い温度もしくは低い温度にて、印加することができる。そのような温度としては、例えば、周囲温度、その温度を下回ると大気圧下で試料が凍結するような温度（すなわち、試料の大気圧凍結温度）、試料の大気圧凍結温度から約４℃までの範囲の温度、４℃から周囲温度の間の温度、周囲温度から９０℃の間の温度、あるいはそれ以上（例えば、−８０℃、−４０℃、−２０℃、０℃、４℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、あるいはそれ以上）が挙げられる。
【００２３】
高圧力は、（例えば、ミリ秒の範囲の頻度で（すなわち、１〜１０，０００Ｈｚ）、秒の範囲の頻度で（すなわち、０．０１〜１Ｈｚ）、分の範囲の頻度で（すなわち、０．１〜１０ｍＨｚ）周期的に反復することもできる。
【００２４】
本方法は、試料の調製後または試料の調製の一環として、試料を分析する工程と、生物試料から特定の物質を抽出する工程と、および／または、生物試料からの特定の物質を加工処理する工程とをさらに含んでいてもよい。例えば、試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または薬学的組成物（例えば、薬学的に活性な分子、天然の生成物、薬物、または薬物代謝物）は、試料調製の後またはその一環として単離してもよく、および／または、試料の一部（例えば核酸）を増幅させ（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いて）、リガンドに結合させ、リガンドから溶離させ、配列決定するか、ハイブリダイズさせてもよく、および／または、試料の一部を、特に限定されないが、抗原抗体反応、酵素反応、触媒反応、またはデバイスの各チャンバ内で異なる工程が起こる段階的反応などを含む化学反応に供してもよい。
【００２５】
特に明記しない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書に記載したものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料については以下に記載する。本明細書中で述べたすべての出版物、特許出願、特許、および他の引例は、その全体が引用により本願に組み込まれる。抵触の場合には、定義を含めた本明細書が支配することになる。さらに、材料、方法および実施例は説明のためのものにすぎず、限定することを意図していない。
【００２６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記載のなかに挙げる。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明および図面から、ならびに請求項から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
様々な図面中で用いる同様の参照符号は、同様の要素を示している。
圧力駆動式細胞溶解方法は、米国特許第６，１１１，０９６号に記載されており、この特許の全体を引用により本願に組み込む。本発明は、高圧に供することのできる１つ以上の浸透性または貫通可能なバリアによって分割された複数の区画（すなわち、チャンバ）を有するデバイスを特徴とする。本発明は、試料を均質化することにより、またいくつかの実施形態においては試料をさらなる加工処理または分析に供することにより、有機試料または無機試料を調製するために用いられる。この新規のデバイスは、とりわけ、試料の回収、輸送、加工処理、および／または保存、ならびに有機体（ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の生育のために用いることができる。
【００２８】
本特許出願の１つの実施形態において、本発明は、圧力調節装置に挿入されるデバイスを特徴とする。デバイスの基本成分としては、複数の区画／チャンバと、区画を分割する１つ以上のバリアと、キャップと、１つ以上の加圧部材（例えばラム）が挙げられる。
【００２９】
個々の区画中で行う加工処理と試料の大きさのどちらにも適した容量を有する様々な容積の区画を具現することができる。容量は典型的には、２５マイクロリットル〜１リットルの範囲、あるいはそれ以上（例えば、２５μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、または１Ｌ、あるいは中間の容積）である。区画は、デバイス内において垂直配置または水平配置のいずれか、あるいはその組み合わせで配置することができる。さらに、デバイスの区画は、一体物に形成してもよいし、あるいは、例えば９６ウェル形式に配置してモジュール式に連結してもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明は、半固体状または固体状の組織などの生物試料を調製、特に均質化し、全組織から微細に刻まれた組織またはスラリーを生成するための、スクリーンやシュレッダなどの少なくとも１つの多孔性バリアを特徴とする。本発明のこの均質化の態様は、試料をまず最初に分断化し、続いて均質化するという２つの基本的なプロセスのいずれか一方または両方を含んでいる。必要であれば、均質化された試料を除去する必要なく、そのままデバイス内でさらに加工処理することもできる。最初の均質化／加工処理は、例えば酵素、界面活性剤、変性剤またはカオトロピック塩などを用いた標準的な抽出または分析手順と組み合わせることもできる。
【００３１】
本発明において用いる多孔性バリアは、ポリマー、金属、ガラスまたはセラミックなどの固体材料から作成することができる。オリフィスは、固体試料の分断化を容易にするための鋭いエッジを含んでいてもよい。加圧部材は、デバイス内部の試料と外側の加圧媒体との間の効果的な遮蔽物として作用しながら、バリアの一方側から他方側に試料を送達する１つ以上の封止材を有するピストンとして機能することができる。このプロセスを一次分断化という。圧力を周期的に印加することにより、一次分断化プロセスが反復されて、均質なスラリーが得られる。
【００３２】
本デバイスは、典型的には１０ミリグラムから少なくとも１５グラムまでの様々な量の標本を分析用途のために加工処理することができ、調製作業のために大規模化することもできる。一次分断化において印加される圧力は、約６８，９５０ｋＰａ（１０，０００ｐｓｉ）〜約３４４，７５０ｋＰａ（５０，０００ｐｓｉ）（ｐｓｉ：ポンド／平方インチ）のオーダーの比較的低いものであってよい。区画の１つまたはそれ以上に、所定の容積の適当な溶解、捕捉、または加工処理溶液を予め装入しておくこともできる。多孔性バリア設計の詳細は、一部には使用する溶解／捕捉／反応流体の体積、および標本、例えば血液、尿、血清、肝臓、脳、骨格筋、植物の葉、幹、根または動物の歯もしくは骨などの性質によって決定される。使用される個々の標本に対する適切なデバイス（すなわち適切なスクリーンまたは多孔性バリア、容器、溶解／捕捉／試薬流体）が使用され、圧力サイクル条件は、加工処理する試料の大きさの試料特性に対して、および当該試料に対して実施される下流の分析に対して選択される。
【００３３】
デバイスは、非多孔性の貫通可能バリアによって分割されたさらなる区画を含んでいてもよい。これらの区画は、例えば、試料の精製、反応または分析に適した試薬を含有していてもよい。１つ以上の区画の表面は、該表面を生体分子に対して不活性にする材料によって被覆されていてもよいし、あるいは、表面は生体分子と相互作用することのできる生体分子または分子で誘導化されて（すなわち、共有結合的に固着またはイオン結合されて）いてもよい。圧力調節装置からの圧力を用いて、試料を連続的に上記さらなる区画中に押し込むことができる。例えば、圧力を継続的に高めて、試料を連続した隣接する区画中に押し込むようにしてもよい。圧力の周期的印加により、後続のチャンバ内の試料および試薬は十分に混合される。連続した各区画は、試料を追加の加工処理工程にかけることができる。各デバイスにおいて必要とされる連続する区画の数は、個々の試料に対して要求される加工処理の程度によって異なる。
【００３４】
試料を強制的にデバイス内を通過させるために圧力を用いているが、バリアは様々な他の条件下で貫通されるものであってよい。例えば、バリアは、設定温度において崩壊する温度感受性のもの（例えば、ワックスバリア、当初ワックスで孔が塞がれている多孔性セラミックバリア）としてもよい。また、バリアは、溶媒に暴露してバリアを溶液中に溶解させることによって貫通されるものであってもよい。さらに、バリアは、機械的または電子的に除去可能なバルブであってもよい。
【００３５】
適当なバリアと試薬とを選択した後、試料をホルダに装入し、１つ以上の加圧部材（例えばラム）をデバイスの形式によって必要なだけ設置することができる。次にこのデバイスを適当な温度に予め平衡化された圧力サイクル装置の内部に配置する。バリアおよび適当な圧力サイクルプロファイルの選択は、例えば以下に説明する原理に基づいて、標本の要件に応じてカスタマイズすることができる。
【００３６】
本発明のデバイスおよび方法に馴染みやすい加工処理の１つの様式としては、組織試料の機械的分断化が挙げられる。スクリーンに組み込まれた鋭い縁または点の周りに圧力を局在化させる。圧力パルスを印加することにより、試料をスクリーンに（通常は複数の通路で）通過させる。試料と、隣接する区画中の捕捉流体との間の圧力差は小さいため（例えば、一平方インチあたり数百ポンド未満の範囲）、より穏和に組織を処理できるとともに、生物学的構造および活性をより良好に保つことができる。多孔性バリア前後での圧力降下は比較的小さいので、ＤＮＡやＲＮＡなどの大きい分子は、過酷な機械的剪断力を受けることがない。このプロセスは自動化に適しているとともに、より低い温度で実施することができ（典型的には約４℃の標準的な低温室の温度未満）、核酸分子などの無傷の分子の保持率を高める。
【００３７】
大抵の液体は、高圧下において部分的に圧縮可能であり、圧力が解放されると膨張する。試料は最初のうち、第１の圧力サイクルプロセスの間、反復してバリア（例えば、シュレッダまたはスクリーン）を強制的に通過させられる。各サイクルで、圧力が解放されると、細砕（ｍａｃｅｒａｔｅ）されていない試料は試料装入区画に押し戻されることができる。プロセスの間に、溶解／捕捉溶液は試料に浸透し、組織試料内部の生体分子の遊離と可溶化を助けることができる。
【００３８】
もう１つの形の加工処理である均質化もまた、周期的圧力をかけて、大きい多分子構造（細胞膜など）を摂動させてそれらを崩壊に至らしめることにより、達成することができる。この均質化プロセスは、上述の方法または他の方法によってすでに分断化されている材料に対して適用することもできるし、あるいは、細胞破壊にさらに寄与する、液／固（凍結）相変換などの相変換を反復導入することによりスラリーになっている場合もある凍結材料に対して適用することもできる。低温で実施することにより、プロセスの際の生物学的活性の保持を助けることができる。このプロセスは、例えば、半固体試料および固体試料の小断片に適用された場合に特に実用的かつ効果的である。
【００３９】
本明細書に記載するＰＣＴプロセスは、上述したものに加えて様々な機構によって細胞の破壊に寄与する。本発明の実用化成功は、その動作のどの特定の理論にも依存したものではない。
【００４０】
均質化は、５０℃〜９０℃などの比較的高い温度、もしくは、−５℃、０℃、４℃、１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、または４５℃などの中程度の温度で圧力サイクルを実施することによって達成することができる。脂質や多糖類などの生体分子の溶解性が高温においては高まることがあるため、高温均質化の機構は、低温での機構とは異なる場合もある。生体分子の分解は高温で増大しうる、また高温で高められたプロテアーゼまたはヌクレアーゼの活性がこれをさらに悪化させうるという潜在的な問題がある。それにもかかわらず、高温における高圧力プロセスは、適当な温度および圧力におけるある種の安定なタンパク質、核酸、および他の分子に対しては適切であるか好適であることもある。例えば、過酷な化学物質を用いることなく高収率かつ高品質のＲＮＡを得るためにＲＮアーゼを不活性化してもよい。
【００４１】
ＰＣＴ法は、閉じた容器内の試料に対して均一に与えられる静水圧または機械的圧力を使用する。ＰＣＴデバイスは、無処理の組織試料を受け入れることができる。バリア（例えばシュレッダ）内の複数の孔およびより大きな径を有する孔により、高い剪断力または開口部間での突然の圧力降下が起こることがなく、そのかわりに、剪断と変性を最小限に抑えながらより穏和かつ制御された様式で材料を通過させることができる。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、デバイス内への試料の装入とともに生じる空気をチャンバ内に捕捉させることを含む。加圧部材からの圧力が増大すると、この空気は圧縮されて、試料中に溶解させることができる。圧力を迅速に解放すると、空気の体積が迅速に膨張し、これにより試料に破壊効果を導入することができる。
【００４３】
この迅速かつ、それでいて穏和なプロセスにより、遊離された分子の完全性と生物学的活性を維持しながら、細胞内容物を効果的に遊離させることができる。この理由のひとつとしては、上記プロセスが界面活性剤、過酷な化学物質または過剰な剪断力を必要としないことがある。あるいは、このデバイスは、生物学的活性の維持と両立可能な場合、あるいは生物学的活性の維持が必要とされないか望まれない場合には、洗剤および他の化学物質とともに使用することもできる。さらに、このプロセスは、細胞および組織中のタンパク質含有量および活性を調べるためにも適している。タンパク質の安定性に寄与する現行の方法の重要な特徴としては、低剪断、迅速溶解および高タンパク質濃度が挙げられる。安定化添加剤、例えばプロテアーゼ阻害剤、グリセロール、ＤＴＴ、または特異的補因子などをバッファにさらに添加して、所望のタンパク質の完全性をさらに保護するようにしてもよい。多くの酵素、特に単量体タンパク質の酵素の生物学的活性は、処理後も完全に機能したまま残っている。これらのタンパク質は、一次元または二次元ゲル電気泳動、質量分析または酵素活性アッセイによる後続の精製および分析に適している。様々の細胞および組織から生物学的に活性なタンパク質を迅速かつ効率的に単離することができるため、研究において、また医学、薬学およびバイオテクノロジー産業において、非常に広い用途を有することになる。デバイスおよび方法の重要な用途としては特に限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００４４】
１．微生物（例えば、大腸菌）中で生産された封入体から、または植物組み換え系からの組み換えタンパク質の遊離および可溶化。
２．初期癌発症の組織特異的マーカーのマッピングおよび同定に著しい進歩をもたらすことになる、腫瘍組織（例えば、植物または動物の腫瘍組織）の生検標本からの完全なタンパク質の単離。そのようなマーカーは、特定の癌の型を診断し早期に同定するために用いることができる。
【００４５】
３．脳または他の組織からのプリオンの遊離。
４．生物組織の研究によって得られたデータに基づいて、薬剤の有効性と安全性を効果的にモニタできる可能性をもつバイオマーカーの同定。
【００４６】
５．様々な薬用植物、真菌、および他の有機体からの迅速なタンパク質の抽出と、癌、感染性および遺伝性疾病に対する潜在的な新しい薬剤の供給源、ならびに他の治療法を見つけ出すための有機体スクリーニングの容易化。
【００４７】
６．創薬の初期段階における毒性および動物実験に適したタンパク質量決定の容易化。
７．本願の別の箇所に記載の供給源（例えば、植物または動物組織などの有機材料、あるいは土壌などの無機材料）からの、鉛もしくは他の重金属、薬剤、農薬、または他の無機もしくは有機化学物質または成分の抽出。このような抽出は、例えば、環境モニタリング、有害物質の放出（例えば、化学物質流出、バイオテロによるもの）または有機体による摂取を追跡するために有用であろう。
【００４８】
ある実施形態において、デバイスは、均質化された試料をさらに加工処理するさらに別の区画またはチャンバを含んでいてもよい。これらの区画は、互いに隣接して配置されてもよく、試料を強制的にデバイス内の連続するチャンバを通過させながら、試料を連続的に処理するのに適した種々の材料を含んでいてもよい。例えば、区画は、試料を精製するために用いられる様々な結合リガンドまたは固相粒子などの捕捉要素を含んでいてもよい。区画は様々な化学物質を含んでいてもよい。これらの化学物質は、酵素、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に必要とされる基質、酸または塩基、触媒、および／または試料を加工処理することのできる他の生体分子であってもよい。さらに、区画には、試料の分析のために用いられる標識を装填することもできる。
【００４９】
区画の表面は、試料と所望の加工処理に適した方法で誘導化することもできる。１つの実施形態において、表面を、該表面を生体分子に対して不活性にする材料で被覆して、その生体分子の付着または吸着を防ぐようにしてもよい。別の実施形態において、表面を、均質化された試料の要素と相互作用することができるか、あるいはそのような要素を捕捉することのできる生体分子または薬品（すなわち、小有機化合物）に共有結合させるか、イオン結合させることもできる。
【００５０】
別の実施形態において、区画の１つ以上が、試料の分析および／または検出を可能にする装置（例えば、光量計）を備えていてもよい。分析の形態としては、特に限定されないが、温度、圧力、放射線、吸光度、蛍光または濁度が挙げられる。
【００５１】
本デバイスによって加工処理される材料としては、広範な種類の標本がカバーされる。その例を以下に示す。加工処理できる試料の種類としては、特に限定されないが、血液、血清、科学捜査試料、真菌、昆虫、植物組織（例えば、生、凍結、または乾燥状態のいずれであってもよい、花粉、葉、根、花または他の植物部分）、および動物組織（例えば、鳥類、は虫類、魚類、または哺乳類組織、たとえばヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ネズミ、ブタの組織など）が挙げられる。組織には生検標本、農作物、または食品も含まれる。
【００５２】
要約すると、従来の方法を越える本発明の利点としては、とりわけ以下のものが挙げられる。
・凍結試料を解凍することなく加工処理することができる。
【００５３】
・最小限の手作業で、断片化、均質化および加工処理を一工程にて実施することができる。
・分析に必要かつ追跡アッセイに適した材料を予めデバイスに装入しておき、溶解プロトコールを特定の生物試料用に合ったものとすることができる。
【００５４】
・ミリグラムから数百グラムにわたる柔軟な範囲の試料サイズを扱うことができ、試料を全片とすることもできる。
・プロセスを、液体、固体または半固体の組織など、広い範囲の種類の試料に適用することができる。
【００５５】
・溶解およびさらなる試料加工処理、および／または分析を、手動操作が不要な自動圧力サイクル装置において実施することができる。
・酵素消化工程を必要とするような長いインキュベーションを行う必要なく、均質化プロセスを迅速に行える。
【００５６】
・プロセスは、自動核酸抽出法（例えば、米国特許第６，１１１，０９６号を参照）などの自動分子抽出法、あるいは、より従来的な抽出方法を１つのデバイス内に含むものであってもよい。
【００５７】
・本方法は、ＲＮＡや酵素などの生物分子の完全性が分解から保護され機能性を維持するように、サブゼロ温度（すなわち＞０℃）において実施することができる。
・試料を閉じた使い捨て可能なホルダ内で加工処理することができ、標本の交差汚染を防止できる。標本を野外で採集し、加工処理までデバイス内に入れて保存することができ、標本の操作を最小限に抑えることができる。
【００５８】
・プロセスを同時または連続加工処理に適応させることができる。
・デバイスは、例えば、９６ウェル形式などのマトリクスにセットすることにより、複数の試料を加工処理するように構成することができる。
【００５９】
・プロセスは、科学捜査、臨床、病理、農学、食品安全、薬学、バイオテロ、および環境分析などの多くの用途に適応させることができる。
・有機体をデバイス（例えば、培養用または輸送用培地を含むデバイス）内で、培養、加工処理、分析、および／または不活性化することができる。特に重要なのは、潜在的に危険な、もしくは選好性の有機体を扱う場合に、上記方法は、試料の採集／装入から不活性化までの間にデバイスを開けることを必要とするか必要としないかを問わず実施することができ、これにより、このような有機体の取扱いに伴って起こりうる危険を最小限に抑えることができる。
【００６０】
・植物または動物の供給源、または土壌などの無機物質から、全体の、完全な、生育可能な微生物およびその抽出物を抽出することができる。
第１部：２チャンバ均質化モジュール
試料加工処理デバイスに対する１つの設計として、図１に示すような２チャンバモジュールがある。この設計は、その構成要素として、ラム（Ａ）である加圧部材と、２つのチャンバを有する区画（Ｂ）と、シュレッダスクリーンまたは多孔性バリアのいずれであってもよいバリア（Ｄ）と、キャップ（Ｆ）とを有している。別の設計において、このデバイスはＯリングを有した第２の加圧部材（例えばラム）（図２）を有していてもよい。この均質化モジュールは、米国特許第６，１１１，０９６号の４〜９頁、２９〜４４頁ならびに図１および４に記載されているような、圧力サイクル装置内に嵌合するように構成されている。
【００６１】
試料を装入する前に、オプションの第２ラムをモジュール内に挿入してもよい。モジュールを直立させた状態で、所定体積の捕捉流体を添加し、バリア（例えばスクリーン）を上部から挿入するとよい。圧力サイクル装置の圧力区画と、モジュールとは、随意で−２０℃または−３０℃などの所定温度に予め冷却しておいてもよい。そして試料を試料チャンバ内に配置するとよい。上側の加圧部材をモジュール本体内の試料の上方に配置する。そしてモジュールを圧力サイクル装置の区画内に配置して、ここで該モジュールを温度平衡化加圧流体内に浸漬する。その後、圧力区画を封止する。
【００６２】
チャンバ内の圧力が増大されると、モジュール内の加圧部材が第１のチャンバのモジュールの内部に向かって移動し、試料をバリア（例えばシュレッダスクリーン）内のオリフィスを介して第２の試料捕捉チャンバ内に押しやり、ここで、試料が捕捉流体と混合される。上記のプロセスにおいて、上部加圧部材と捕捉流体との間の空気は、液体に溶解されるようにしてもよい。スクリーンに向かって移動する加圧部材によって組織試料が加圧されると、組織と捕捉流体との混合液の体積は、例えば、大気圧下において全体積の約８５〜９０％まで減少する。圧力が減少されると、組織／捕捉流体混合液と閉じ込められた空気とが膨張し、上部加圧部材を押し戻し、混合物をスクリーンを介して後退させる。チャンバ内の圧力が周期的に変えられることにより、圧力サイクルと加圧部材の移動との組み合わせによって、溶液を繰り返しスクリーンを通過させることができ、これにより細胞と組織の物理的崩壊がより効果的に進む。
【００６３】
加圧部材は、モジュール本体内に配置された試料に対して最大圧力を送るように設計することもできる。加圧部材は、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ｐ‐フェニレンスルフィド、ガラス強化ＰＥＩ樹脂などの熱可塑物質）、ガラス、石、セラミック材料などの固い材料から作成することができる。接触点における加圧部材またはバリアの表面は、例えば、鋭利な点または縁を組み込むことにより、試料の崩壊をさらに補助するように設計することもできる。加圧部材の円筒形の壁は、加圧部材とモジュールの内壁の間を封止して試料をモジュールの内区画内に閉じ込めておくことのできる、１つ以上のＯリングを組み込んだものとしてもよい。いくつかの構成に対しては、加圧部材は、試料とは反対側の表面上に、モジュールへの該加圧部材の挿入または除去を容易にするためのハンドルまたはループを組み込んだものであってもよい。加圧部材は、均質化プロセスの間に内部に高圧力を伝達するようにモジュール本体内で自在に移動できるように設計してもよいし、試料と加圧流体の間の効果的バリアとして機能するような特徴（例えば、封止材）を組み込んだものであってもよい。
【００６４】
モジュール本体は、加圧部材が試料材料を推進してシュレッダスクリーン／多孔性バリアを通過させるように設計することも可能である。モジュール本体は、例えば、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ｐ−フェニレンスルフィド、ガラス強化ＰＥＩ樹脂などの熱可塑物質）、ガラス、石、セラミック材料などの剛性、または半剛性の材料から作成することができる。モジュール本体は、均質化プロセスの間にモジュール本体内の適切な圧力を維持できるように、加圧部材およびキャップと連結して設計することもできる。
【００６５】
加圧部材が自在に移動できることにより、区画内部の静水圧を試料チャンバの内部に伝達することができるようになる。モジュールの内外で圧力平衡を維持することができ、モジュール材料そのものは、圧力平衡に達する前の均質化モジュールの内外の小さな圧力差に対して安定なものとすればよい。このようにして、モジュールの一体性を維持できる。モジュールは、流体がそれぞれの圧力サイクルでバリアを通過することができるように、隙間に対する適当な比率の試料および捕捉流体容積を収容するように設計される。
【００６６】
バリア（例えば、スクリーン）は、試料を多孔性バリアの所定のオリフィスを通過させる際に、該試料の均質化をさらに支援するように設計することもできる。孔の大きさと数に関して、オリフィスの設計は、試料の種類、大きさおよび均質化プロセスの要件に応じて変えることができる。バリア、スクリーンは、試料を可溶化するのに適した、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ｐ−フェニレンスルフィド、ガラス強化ＰＥＩ樹脂などの熱可塑物質）、ガラス、石、セラミック材料から作成することができる。さらに、バリアはフィルタを含んでいてもよい。バリア上の試料との接触点は、適切な表面特徴、例えば鋭利な点または縁、あるいはオリフィス構造を組み込むことにより、試料の均質化を助けるように設計することもできる。バリアは、砂、微細ガラスビーズ、炭素、および／または燒結金属の固体マトリクスを含む任意の多孔性材料とすることもできる。バリアは、モジュール本体との一体部分として、あるいはデバイスの２つの区画間の均質化モジュールに挿入される構成要素として設計することもできる。
【００６７】
キャップは、モジュール本体試料捕捉区画を封止して、均質化プロセス時の圧力維持を助け、加工処理後の試料捕捉区画へのアクセスを可能にするように設計することができる。キャップは、試料を可溶化するのに適した、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ｐ‐フェニレンスルフィド、ガラス強化ＰＥＩ樹脂などの熱可塑物質）、ガラス、石、セラミック材料から作成することができる。キャップには、加圧部材をモジュール本体内に保持するための特徴（例えば、螺旋状のネジ山など）を組み込んでいてもよい。上部加圧部材の上方には、上側キャップを用いてもよい。この上側キャップは加圧流体にアクセスできるようにしてもよいが、加圧部材が圧力サイクルの間中モジュール内に確実に保持されるように設計することができる。
【００６８】
捕捉流体を随意で含むモジュール全体は、使用者が標本を装入して、上部加圧部材上に置き、ユニットを圧力チャンバ内に挿入するだけでよいように、製造業者によって予め組立てられたものであってもよい。この構成において、デバイスは、ＰＣＴ処理後に圧力チャンバから除去される。組織が最初に載置される側の加圧部材を、組織を最初に装入したときの方向とは反対の方向に、組織側を下にしてバリアに対して一気に押し込むとよい。キャップ（および、下部加圧部材が使用されるときには該部材も）は着脱可能で、溶液をピペットで取り出すこともできる。キャップは、操作を最小限に抑え、材料の直接輸送を図るために、バルブを組み込んで、溶液を該バルブを介して回収チューブに滴下できるように設計することもできる。あるいは、キャップの代わりに、デバイスは、該デバイス上に設けられた、ミクロタイタープレートシーラーにおいて用いられるエチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）材料などの穿刺可能な膜と嵌合させてもよい。この膜は、キャップによって定位置に固定して、熱または高周波によってデバイスの壁に融着させることもできるし、あるいは、接着剤または他の機構を介して固定してもよい。加圧部材の移動を制限することにより、膜全体にかかる圧力は最小限になり、これによりデバイスの内外での圧力平衡が得られる。ＰＣＴ処理に続いて、膜を破壊して開けて得られる流体を回収チャンバ内に放出することのできる鋭い穿刺デバイスを含む回収チューブの上方に、デバイスを配置することができる。
【００６９】
細胞および組織に加えて、流体（例えば、唾液、粘液、または、ハチミツ、糖蜜やコーンシロップなどの食品）もこのデバイス内で加工処理することができる。本デバイスは、例えば、微生物を殺傷するか、または殺傷せずに、同微生物をバッファまたは培地中に放出させるために、上記流体の粘度を低下させるか、あるいは試料を液化するために用いることができる。例えば、一般には化学物質を用いて液化される唾液は、さらなる分析または他の処理のために結核菌などの微生物を放出するために圧力を用いて、本発明のデバイスにおいて液化することができる。
第２部：加工処理モジュール
新規の試料加工処理デバイスは、随意で、試料のさらなる加工処理を行うための別のチャンバを含んでいてもよい。例えば、デバイスは、「加工処理モジュール」の形態をとるか、これを含んでいてもよい。このような加工処理モジュールに対する設計は典型的には、均質化モジュールに対する設計と同一または非常に類似したものであるが、加工処理モジュール内での試料のさらなる加工処理は、試料をさらに別のバリアを介してさらに別のチャンバに通すことによって達成することができる。例えば、均質化モジュールにおいて記載したような２つのチャンバしか有しないものの代わりに、加工処理モジュールは、均質化された試料の所望の加工処理または分析に必要とされる数の貫通可能バリアによって分離されたチャンバを有していてもよい。試料を加工処理するために用いられる加工処理モジュールのさらに別のチャンバは、典型的には、均質化プロセスにおいて用いた多孔性バリアではなく貫通可能バリアによって分離される。加工処理チャンバの分離により、チャンバ内に含まれる試薬を試料の導入の前に反応しないようにしておくことができる。
【００７０】
図１４は、チャンバが垂直方向に配置された加工処理モジュールを示している。図１５は、チャンバが水平方向に配置された加工処理モジュールを示している。図１６は、チャンバが水平、垂直の両方向に配置され、感圧性バリアによって分離されている加工処理モジュールを示している。
【００７１】
図１８は、チャンバが垂直方向に配置され、下方のチャンバを上方のチャンバおよびバリアに対して放射方向に移動可能として、試料を加工処理によって生じる廃棄物、デブリスおよび不純物から分離できるようにした加工処理モジュールを示している。上側チャンバを除去して所望の産物（例えば、精製された核酸）を回収することができる。加工処理モジュールのすべての操作は、コンピュータによる自動化およびプログラミングが可能である。さらに、デバイス全体は使い捨て可能である。
【００７２】
バリアは、高圧に限定されることなく様々な条件下で貫通されるものであってよい。例えば、バリアは、設定温度において破壊する温度感受性のものとしてもよい。バリアは、溶媒に曝してバリアを溶液中に溶解させることによって貫通されるものであってもよい。さらに、バリアは、機械的または電子的のいずれかによって除去されるバルブであってもよい。
【００７３】
バリアが貫通されると、加圧部材からの圧力により試料は隣接するチャンバに押し遣られて、当該チャンバ内に含まれる試薬と相互作用できるようになる。試料を後続のチャンバに押し遣るプロセスを続けることにより、試料の段階的加工処理および必要な場合には後続の分析が行われる。デバイス内の区画の性質によって、手動操作を行わずに試料の加工処理が行えるようになる。
第３部：チャンバ試薬
各チャンバ内の試薬の実体は、当該チャンバ内で行う加工処理によって異なる。
【００７４】
例えば、均質化工程において捕捉流体中で用いられる試薬の物理的および化学的性質は、圧力サイクルの均質化効率に影響を与えることができるとともに、分子成分の完全性および安定性を維持することもできる。上述のように、可能な均質化機構のひとつとして、サブゼロ温度における「凍結解凍」効果があり、この効果は捕捉流体の特性に依存するものである。第２に、捕捉流体の組成は対象とする生体分子の遊離および可溶化に対して影響を及ぼす。第３に、捕捉流体の体積は、例えば加圧部材からの過剰な圧力への耐性を与えることにより、モジュールの統合性の維持に関係するため重要である。最後に、捕捉流体は、下流のアッセイと適合できるものでなければならない。
【００７５】
捕捉流体の例は「実施例」の部に記載する。最も簡単な実施形態において、溶解流体は、水などの低張溶液、あるいは、細胞から出た細胞性材料の可溶化を促進する低塩トリスまたはリン酸バッファである。あるいは、溶解溶液は、下流のアッセイに適合する保存剤または化学物質を含んでいてもよい。捕捉溶液は、試料の破壊を助けるため酵素を含んでいてもよい。あるいは、タンパク質および核酸の完全性を維持するために、捕捉溶液にヌクレアーゼまたはプロテアーゼインヒビターを添加してもよい。リボ核酸の抽出を必要とする用途に対しては、変性剤（たとえば、グアニジン塩および尿素）または界面活性剤（ＳＤＳおよびＣＨＡＰＳ）を加えてもよい。
【００７６】
試料の均質化に続いてチャンバ内で用いられる試薬には、幅広い加工処理工程を可能にするのに十分な広範のものが含まれる。例えば、区画には、核酸または疎水性ペプチドなどの試料の特定の要素の分離を可能にする、捕捉要素が含まれていてもよい。試料の分離および／または精製は、クロマトグラフィー試薬、あるいはチャンバ内の電流を介して達成することもできる。
【００７７】
１つ以上のチャンバが、有機体を接種して、これを本発明のデバイス内で直接インキュベートすることができるように、随意で増殖用および／または輸送用培地を含んでいてもよい。このような有機体の例としては、特に限定されないが、細胞、ウィルス、細菌、または寄生虫が挙げられる。例えば、血液細胞および他の動物または植物細胞、ＨＩＶ、ＨＡＶ，ＨＢＶ、ＨＣＶ、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｓｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）およびプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）を本デバイス内で生育させることができる。培地は液体または固体のいずれであってもよく、所与の有機体に対して特異的であってもよいし、非特異的なものであってもよい。適切な培地の例としては、ヒツジ血液寒天（ＳＢＡ）、トリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）、またはトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（例えば、炭疽菌の培養用）；マッコンキー寒天（例えば、グラム陰性細菌の培養用）；あるいは三糖鉄（ＴＳＩ）ブロスが挙げられる。輸送用培地としては、例えば、Ｔｒｉｓ‐ＥＤＴＡ（ＴＥ）などの緩衝化溶液が挙げられる。デバイスは、所与の有機体に対して適当な温度で（例えば、炭疽菌に対しては３５〜３７℃）、集団が検出可能となるのに十分な時間、あるいはＰＣＲにより増幅するのに十分なＤＮＡまたはＲＴ‐ＰＣＲもしくは他の方法によるＲＮＡの増幅（例えば、続いて検出が行われる）を与えるのに十分な時間インキュベートすることができる。増殖中の有機体をデバイスを開けることなく上述のように加工処理して（そして随意で不活性化して）、試料または環境の混入の機会を制限する。
【００７８】
チャンバは、核酸抽出に続いてＤＮＡハイブリダイゼーションを行えるような要素を含んでいてもよい。例えば、区画内に含まれる様々な蛍光標識オリゴヌクレオチドへの競合的結合によって、ＤＮＡはハイブリッド形成することができる。次に、例えば米国特許第６，２５８，５３４号に記載されているように、ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドの結合または解離を高めるために、圧力を印加することもできる。
【００７９】
試薬としては、核酸配列の増幅に必要とされるようなもの、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）に用いられるようなものが挙げられる。これらの試薬を含むチャンバにおける圧力サイクルは、これらの反応を高めるために用いることもできる。これらの反応条件には温度サイクルを組み込んでもよい。
【００８０】
ＤＮＡ配列決定は、必要な試薬を有した１つ以上のチャンバ内で行うことができる。この場合も、反応を高めるために圧力サイクル（例えばＰＣＴ）を用いることもできる。例えば、高い圧力によってエキソヌクレアーゼ活性を調節して、ヌクレオチドポリマーをヌクレオチドモノマーに分解することもできる。
【００８１】
加工処理チャンバ内の試薬は、試料中のタンパク質を加工処理するために用いることもできる。細胞溶解によってタンパク質を遊離させた後、カラムクロマトグラフィーやゲル電気泳動などの技術を用いて試料からタンパク質を精製することもできる。精製は、分子量または、大きさ、疎水性、イオン相互作用、金属キレート性などの物理的または化学的性質、および免疫学的反応性に基づいて行うことができる。圧力および圧力サイクルは、本加工処理の特徴となりうる。
【００８２】
さらに、チャンバは、イムノアッセイまたは酵素的アッセイに関与する試薬を含んでいてもよい。例えば、分子の会合および／または解離を、チャンバ内の条件を介して、特定の複合体の特異性と親和性とを制御することにより調節することができる。この技術は、免疫学的相互作用だけでなく酵素的相互作用にも適用できる。
第４部：検出モジュール
チャンバの１つを、試料に施された様々な加工処理工程により得られた生成物が発するシグナルの捕捉のための検出モジュールとして用いることができる。この検出モジュールは、モジュール内で発生したシグナルを検出器が読み取るように、検出器に隣接して配置することができる。モジュールは、光または放射線を検出器に向けて通過させる透過性材料で作成することができる。レーザーまたは他のイオン化発生器を検出器の反対側に設置して、検出モジュール内でのシグナル発生を誘起することができる。検出器は、照度計、蛍光計、光量計、分光光度計、イオン化検出器、流量計、シンチレーションカウンター、カメラまたは他の分析機器であってもよい。検出器によって受信されたシグナルは、物理的または電子的に記録器に送られ、試料中の測定する特定の分析物に反応して発生したシグナルの測定値が生成される。これらの測定値を、プリントアウトによって視覚的にあるいは他の手段によって、コンピュータ内に記録することができる。
第５部：細砕しにくい試料に対するシュレッダであるバリア
動物の骨や歯、植物の幹あるいは根などの非常に細砕しにくい（ｈａｒｄ−ｔｏ−ｍａｃｅｒａｔｅ）試料には、たいていの場合、粉砕器またはアンビルなどの特別な均質化装置が必要になる。固い試料を均質化するための１つの手法としては、本発明のデバイス内で、鋼鉄や高品質プラスチックなどの剛性の高い材料からなるシュレッダスクリーンであるバリアを用いることがある。場合によっては、貫通穴を有する金属ディスクを用いて通常のプラスチック製溶解ディスクを強化するようにしてもよい。剛性材料からなるバリアの使用に加えて、疑似アンビル型構造または剛性固体材料からなるピラミッドをバリアに組み込んでもよい（例えば、図３Ｂを参照）。より強いモジュール、圧力部材、およびシュレッダスクリーンであるバリアの使用に加えて、ｐＨ２など非常にｐＨの低い捕捉流体を用いて骨または歯を柔らかくするようにしてもよい。そうした流体はその腐食性のために、通常は手動工程による取扱いが難しいが、ＰＣＴ均質化について記載したような閉じた系の中へは簡単に収容することができる。試料のさらなる細砕は、より少ない量の試料を用いることにより、細砕が不完全な場合に行うことができる。しかしながら、これは感度の低下を招くこともある。
第６部：生物試料を溶解するためのシュレッダの代替形式
ＰＣＴ均質化原理は、組織の破壊と細胞内容物の放出を促進することのできる以下の２つの特徴を組み合わせたものである。すなわち２つの特徴とは、組織材料を物理的に押し遣ってデバイス内の小さな開口部を通過させることは、組織の大きな塊を破壊することに寄与するということ、ならびに、低い温度および圧力サイクルは、試料を繰り返し凍結解凍することになり、細胞破壊にさらに寄与するということである。本デバイスの代替形式は、これらの原理の一方または両方に基づいて設計することができる。種々のモジュールサイズと材料の組み合わせが可能であるとともに、モジュールの崩壊を防ぎ、流体の漏れを防ぎ、均質化効率を高め、試料への容易な接近可能性を与え、複数試料加工処理を容易にし、圧力チャンバへのモジュールの挿入および除去を容易にし、感染性材料を確実に封じ込めるための特徴を備えることが可能な、様々なモジュール構成が想定される。
第７部：９６ウェルプレートのための使い捨て可能設計
デバイスは、その規模を拡大または縮小することにより、対応する試料の大きさ、区画の大きさ、および試薬の容積を変えることもできる。さらに、モジュールおよびチャンバの規模は、複数の試料を収容するように調整することもできる。複数の試料のためのキャップの設計は、単一のデバイスのそれとは違ったものとすることができる。最も簡単な構成は、圧縮中に空になる空間に破断なく伸張するのに十分な可撓性を有する封止可能および／または剥離可能な膜のシートの形状であろう。剛性のシート上で繋ぎ合わせられた一連の加圧部材を、９６ウェル形式などの個々のウェル中に一斉に押し込むようにすることができる。９６個の試料を圧力サイクル装置に嵌合させるために、シュレッダを６つの４×４または３つの４×８ブロックなどの規則的な配列で配置することもでき、このような配置のシュレッダは、容易に圧力チャンバに嵌合し、必要であれば、後続の加工処理のための９６ウェル形式と適合するウェル内にそのまま転移することもできる（図１３を参照）。
【００８３】
図１３は、９６ウェルプレートの１つのウェルに嵌合している圧力サイクル機器を示している。バリアが２つのチャンバを分割し、加圧部材は加圧部材とチャンバ壁の間のＯリングによって封止されている。試料をバリアの上面に載置し、加圧部材によってバリアを強制通過させる。圧力サイクルが終了すると、バリアおよび加圧部材を除去して、第２のチャンバ内の溶液をさらなる加工処理のために移送することができる。このチャンバは、米国特許第６，０３６，９２３号に記載されているような圧力サイクル反応器に嵌合させることができる。
【００８４】
本デバイスは、スクリーンと加圧部材とをプロセスの終了後に一体物として除去できるように設計することもできる。
より多数の試料を加工処理するために、９６ウェル系を用いることもできるが、この場合は、まず試料を溶解した後、別のチャンバまたはウェルに移して洗浄し、ろ液を回収する。あるいは、複数のチャンバを有する使い捨て可能なミクロウェル形式を用いて全抽出プロセスを扱うこともできる。この構成においては、試料を含む最初のチャンバを圧力溶解に供することができる。そしてウェル内のバルブを解放して、試料を洗浄し、廃棄物を除去するようにしてもよい。最後に、核酸回収チャンバに繋がる別のバルブによって、精製された核酸を溶出させるようにしてもよい。プロセス全体を流体交換が最小限ですむ単一の精製モジュール内で達成することができて、理想的である。
【００８５】
本デバイスの構成要素の簡略化模式図が図１５Ａ〜１５Ｆに示されている。図１５Ａは、試料が第１のチャンバの上半部に装入されているが、圧力は与えられていない状態のマルチチャンバデバイスの図である。図１５Ｂは、マルチチャンバデバイスへの第１回目の圧力印加の結果を示した図であり、試料が加工処理され、第１のバリアを通過して押し込まれている。図１５Ｃは、さらに圧力を増加させた結果を示しており、試料は水平方向へ押されてチャンバ２に入っている。図１５Ｃ〜図１５Ｆは、圧力の増加に従って、水平方向に互いに連結されたチャンバを通る試料の移動を示した図である。このデバイスは、高度な熟練技術や、有毒または有害な化学物質を手動で扱うことを必要とせず好適である。精製された核酸産物は、増幅、配列決定または他の分析のための他の自動機器と適合可能な９６ウェル配置で利用できるようにすることが可能である。
第７部：ＰＣＴプロセスによるオンチップ均質化
均質化プロセスはさらに小型化して、核酸または抗原の検出などの特定の実験用途に対する複数の機能を組み込むようにすることもできる。シュレッダスクリーン、加圧部材、捕捉流体、およびホルダは、均質化プロセスの終了時にチップ上の別の場所に抽出された材料を沈積させることのできる一体型使い捨て可能ユニットの一部とすることもできる。その後、チップを分析器に挿入し、ヒートシンクを用いて試料均質化領域の周りの温度を平衡化する。圧力は２つのピストンを介して、一方は加圧部材側から、もう一方はキャップ側から伝達することができる。圧力プロセスは、単一のシュレッダ動作と類似している。圧力は、従来の油圧ポンプを用いるのではなく、電磁ピストンによって発生させることもできる。電磁ピストンを用いる１つの利点は、電磁ピストンはミリ秒などのスケールのより高い頻度で移動可能なことである。圧力プロセスが終了すると直ちに、捕捉流体および／またはＰＣＴプロセスを受けた試料は、例えば「キャップを穿刺する」ことにより、「キャップ」側から抜去することができる。
第８部：使い捨て可能デバイスの設計と製造
デバイスは、試料の調製ならびに個々の細胞および組織の溶解に対しての適性を維持しながらも、例えば高分子材料からなる使い捨て可能なモジュールとすることができる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例において本発明についてさらに説明するが、実施例は請求項に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：低温における圧力サイクルを用いたラット肝臓試料の溶解
ドライアイス上で急速凍結し、ドライアイス上または−７０℃のいずれかで保存された、新鮮な凍結ラット肝臓の全片をＰｅｌ‐Ｆｒｅｅｚ（米国アーカンソー州ロジャーズ所在）より入手した。該凍結組織を、ドライアイスの塊の上で剃刀の刃を用いて、電子秤で計量して約０．２０ｇとなるように裁断した。この裁断手順のあいだ試料は凍結状態に保ち、使用時まで微量遠心管中、−７０℃で保存した。
【００８７】
実験に使用したデバイスを、本体と、２つのラムと、ポリプロピレンからなるシュレッダ台とを含めて構成した（図２を参照）。本体は、長さが３８．１ｍｍ、外径が１３．８ｍｍ、内径が１１．６ｍｍ円筒形のチューブとした。チューブの一方端は、キャップを受容するようにねじ切りした。キャップを用いて、チューブの端部にラムを封止かつ保持した。ラムは、長さ１２．７ｍｍ、直径１１．５ｍｍの円筒形の部品とした。それぞれのラムには、本体の内面に対して封止されるＯリング封止材を設けた。シュレッダ台は、長さ９．５３ｍｍ、外径１１．５ｍｍ、内径１０．７ｍｍの円筒チューブの形状を有し、その一方端部にはスクリーンを取り付けた。スクリーンは、直径１１．５ｍｍのなかに、適当な間隔をおいて直径０．９４ｍｍの４９個の穴を有するものとした（図３Ａを参照）。
【００８８】
デバイスは、まず最初に底部ラムを本体のネジ付端部に入れ、底部ラムを本体に保持するようにキャップを締めることにより組立てた。０．７ｍＬの捕捉流体（飽和塩酸グアニジン、１％ＣＨＡＰＳ；飽和ＧＴＣ，０．１％ＮＰ４０または独自仕様の溶解溶液）を開放端から挿入した。次に、シュレッダ台であるバリアを、穴を有する端部がネジ付端部の反対側にくるように本体の内部に配置した。約０．２０ｇの凍結組織片を本体内のシュレッダ台上に載置した。試料をシュレッダ台の上面に配置したところで、封止リングと本体との間が封止されるように上部ラムを本体に挿入した。
【００８９】
圧力サイクルのために、Ｎｅｓｌａｂ社の循環冷却器を用いて予め冷却し、−２０℃に平衡化しておいた圧力チャンバ（ＢａｒｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）V ２．４，米国カリフォルニア州ガーデングローブ所在のＢＢＩ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社により特注）内にモジュールを配置した。シュレッダは試料とともに２分間この温度に平衡化した。試料に約１０３，４２５ｋＰａ（１５ｋｐｓｉ）の圧力を印加し、この圧力で２０秒間保持し、２０秒間大気圧に戻した。圧力の上昇および下降時間は１０秒未満とし、上述の保持時間には含めていない。この一連の動作を全部で５回繰り返した。これらの約１０３，４２５ｋＰａ（１５ｋｐｓｉ）圧力サイクルに続いて、約２４１，３２５ｋＰａ（３５，０００ｐｓｉ）で２０秒間と大気圧で２０秒間の圧力サイクルをさらに３回繰り返した。すべての圧力サイクルは、プログラムに組み込み、プログラムを実行することにより実施した。最後の圧力サイクルの終了後、シュレッダモジュールを反応チャンバから取り出し、上下反転させた。元々底部にあったキャップとその下の隣接するラムとを除去し、組織のデブリスを含んだ捕捉流体を新しい微量遠心管に移した。試料を７，４００×ｇで１分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してドライアイス上で維持した。
【００９０】
粗上清の一部についてはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（在イリノイ州インディアナポリス）のＰＣＲ鋳型精製キットによりさらに精製し、上清中の遊離核酸を抽出した。プロテイナーゼＫを用いる溶解工程を省略したことを除いては、キットに示されている手順に従った。２００μＬの試料を、２００μＬのキット添付の結合バッファと、１４０μＬの二重蒸留水と、１００ｍＬイソプロパノールと混合した。溶液をボルテックスにより混合し、ｈｉｇｈ ｐｕｒｅ（登録商標）フィルタ・チューブに移し、８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。遠心分離後、フィルタを、５００μＬの洗浄バッファを用い、もう一度８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより洗浄した。１回目の洗浄の後、この洗浄工程を繰り返し、遠心分離を行った。１３，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離することにより、残留している洗浄バッファを除去した。核酸を溶出するために、２００μＬの予め温めておいた（７０℃）の溶出バッファをフィルタ・チューブに加え、８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【００９１】
ＰＣＴ均質化手順によって遊離された核酸の収率とサイズを推定するために、アガロースゲル分析を、０．５’ＴＢＥバッファ中の０．６７％アガロースを用い、１２０Ｖの一定電圧で、６０分間泳動することによって実施した。アガロースゲルは臭化エチジウムで予備染色し、ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ（登録商標）およびＡｌｐｈａＥａｓｅ（登録商標）Ｖ５．５ソフトウェア（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ，在カリフォルニア州サンレアンドロ）を用いて撮影した。
【００９２】
図１２は、精製手順を一切実施していない粗溶解物中に存在する全核酸を示したものであり（レーンＥ１〜Ｅ７）、試料１（飽和塩酸グアニジン、１％ＣＨＡＰＳ）、試料３（飽和ＧＴＣ，１％ＮＰ４０）および試料５（独自仕様の溶解バッファ）は、２×１００ＭＰａおよび３×２３５ＭＰａ、−２５℃、２０秒高圧／２０秒大気圧保持の条件によるＰＣＴ組織シュレッダ処理により得たものである。試料２，４および６は、それぞれ試料１，３および５に対する圧力制御を行っていない対照である。試料７は、乳鉢と乳棒で均質化したものである。また図１２において、レーンＤ１〜Ｄ７およびＲ１〜Ｒ７は、Ｒｏｃｈｅ社のＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ鋳型キットを用いて抽出し、ＤＮａｓｅ（Ｄ１〜Ｄ７）またはＲＮａｓｅ（Ｒ１〜Ｒ７）で処理した試料である。これらの結果から、ＰＣＴ処理した試料は、アガロースゲルのバンド強度（図１２、レーンＲ１，Ｒ３，Ｒ５およびＲ７）または２６０ｎｍでの吸光度によって判別される、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒキットの場合と同様のゲノムＤＮＡレベルを達成することが分かった。陰性対照は、実験の間に圧力を大気圧に維持したことを除いては、同じ処理を行うことにより得た。
【００９３】
図１２に示されるように、非加圧対照（レーンＤ２，Ｒ２，Ｄ４，Ｒ４）と比較すると、ＰＣＴシュレッダを用いた場合、大量のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ；レーンＲ１，Ｒ３）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ；レーンＤ１，Ｄ３）が維持および遊離されていた。ｇＤＮＡの収率は、本実験において、抽出前に組織を可溶化するためにプロテイナーゼＫと４時間プレインキュベーションするＲｏｃｈｅのキット手順を用いて得られた陽性対照と比較しても（レーンＲ２，Ｒ４対Ｒ７）実際のところ大きかった。
実施例２：組織溶解効率の研究と２チャンバ均質化モジュール設計の向上
モデルとしてラットの肝臓を用い、圧力プロファイル（約１０３，４２５ｋＰａ（１５ｋｐｓｉ）から約３４４，７５０ｋＰａ（５０ｋｐｓｉ））、サイクル回数プロファイル（２回から４５回）、温度プロファイル（−３０℃から０℃）、シュレッダオリフィスの数（同一面積に１０個から８９個）、および様々な捕捉流体（Ｇｄｎ／１％ＣＨＡＰＳ；リン酸緩衝生理食塩水、ＧＴＣ／１％ ＮＰ４０）について試験を行った。各試験条件に続いて、捕捉流体を新しい微量遠心管に移し、７，６００×ｇで手短に遠心分離した。上清を回収し新しい微量遠心管に保存した。この上清から市販のキットを用いて核酸を抽出した。ＤＮＡ収率を分析するために、精製された核酸をＲＮａｓｅ処理して、アガロースゲル電気泳動によって分析した。回収した材料をＲＮａｓｅ処理してから、０．５×ＴＢＥバッファ中、０．８％アガロースで、１２０Ｖの一定電圧下で６０分間電気泳動した。
【００９４】
図４は、圧力サイクルプロファイルの１つを示したものである。ゲル上のｇＤＮＡに対するバンド強度のデンシトメトリ走査の積分によって決定された、５サイクルのＰＣＴによって遊離されたｇＤＮＡの収率（レーン３）は、２サイクルのＰＣＴによって遊離された収率（レーン２）よりも大きく、Ｒｏｃｈｅキットを用いた対照方法によって得られたものと同等であった。−２５℃および大気圧下に保持した組織由来の上清を同様に処理して、陰性対照（レーン１）とした。
【００９５】
上記の結果から、２チャンバ均質化モジュール処理方法では、長時間にわたる（４時間）プロテイナーゼＫ消化を必要とすることなく、標準的な方法によって達成されるのと少なくとも同等に組織からの核酸を遊離させうることが実証された。ゲノムＤＮＡの収率は、陽性対照によって得られるものと類似していた。ＲＮＡは、リボゾームＲＮＡバンドによって判別したところ、よく保存されていた。非加圧対照の１つである図１２の試料２に見られた比較的高いバックグラウンドの核酸は、これらの組織試料に対して典型的なものではなく、他の実験においては見られなかった。レーンＤ７にはＲＮＡバンドが全く見られないが、これはＲｏｃｈｅキット手順に明記されているプロテイナーゼＫとの長いインキュベーション工程の間に、内在性ＲＮａｓｅが遊離されたあらゆるＲＮＡを効果的に分解したためである。これらの研究に用いられたＰＣＴシュレッダ自体は、比較的圧力に安定であり、清浄後に再使用可能であるようである。シュレッダ中で用いられ、ＰＣＴ条件にかけられたのと同様のプラスチックからなる密閉されたチューブとは異なり、上記モジュールに対しては圧力かぶりが全く見られなかったが、これはおそらくモジュールの内外の圧力がラムの移動によって容易に平衡化されたことによると思われる。
実施例３：ラット脳、膵臓、大腸および骨格筋のＰＣＴ均質化
抽出が明らかに困難であるいくつかのさらなる組織について、ＰＣＴ均質化の有効性も調べた。脳組織はタンパク質および脂質を特に多く含み、通常は水性‐有機液相抽出において水相中に白色の綿状物質を与える。膵臓はヌクレアーゼ濃度が非常に高く、通常はＲＮＡが分解されてしまい、従来の方法では回収が困難である。大腸および骨格筋は、結合組織成分を有した繊維組織であるため、均質化が難しい。
【００９６】
上記組織について、２００μＬではなく１００μＬの溶解物をＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ鋳型キットを用いて抽出したことを除いては、図１２に用いた肝臓の場合と同じ実験手順でＰＣＴプロセスを行った。最終溶出液の体積は６０μＬであった。ｇＤＮＡおよびｒＲＮＡはアガロースゲルによって判定した。図５は、大腸および筋肉に対するＰＣＴプロセスの均質化の有効性が、従来のプロテイナーゼＫ法に匹敵することを示している。レーン１〜５は、大腸から遊離されたゲノムＤＮＡを含むものである。レーン６〜１０は、骨格筋から遊離されたゲノムＤＮＡを含むものである。レーン１，３，６および８は、ＰＣＴモジュールを用いて均質化した試料である。レーン２，４，７および９は、それぞれレーン１，３，６および８に対応する非加圧対照である。レーン５および１０は、プロテイナーゼＫを用いた均質化による陽性対照である。レーン１，２，６および７は、飽和Ｇｄｎ／１％ＣＨＡＰＳの存在下で加工処理したものである。レーン３，４，８および９は、６Ｍ ＧＴＣ／１％ＮＰ４０によって加工処理したものである。非加圧対照を除く全ての試料は、粗溶解物からの上清であり、プロテイナーゼＫ処理を除いたＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ鋳型キットを用いて抽出した。
【００９７】
ＰＣＴ溶解物中に見られるゲノムＤＮＡバンドは増幅させることができ、陽性対照によるものと同一のＰＣＲ産物が産生された（図６）。図６は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のβ‐アクチンプライマーセットを用いて骨格筋試料から増幅したゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅物を示している。レーン１，２および３は、ＰＣＴ処理された鋳型の１：５、１：２５および１：６２５希釈物からのＰＣＲ産物である。レーン４，５および６は、「陽性対照」鋳型の１：５、１：２５および１：６２５希釈物からのＰＣＲ産物である。レーン７は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のβ‐アクチンｃＤＮＡ対照を用いたＰＣＲ産物を示している。
【００９８】
図７は、ラット脳溶解抽出物を示している。レーン１，２，６および７は、飽和Ｇｄｎ／１％ＣＨＡＰＳの存在下で加工処理した。レーン１および６は、ＰＣＴ均質化試料からのものである。図２および７は、非加圧対照からの試料である。レーン３，４，８および９は、６Ｍ ＧＴＣ／１％ ＮＰ４０で処理したものである。レーン３および８は、圧力処理した試料であり、レーン４および９は非加圧対照である。レーン５および１０は、Ｒｏｓｃｈｅのキットの「陽性対照」からのものである。レーン１〜５はＲＮａｓｅで処理したものである。レーン６〜１０は、ＤＮａｓｅで処理したものである。試料１０はプロテイナーゼＫ工程が原因でＲＮＡを欠如している。
【００９９】
ＰＣＴ処理した組織または非加圧組織の上清からのＲＴ‐ＰＣＲ ＲＮＡ鋳型は、プロテイナーゼＫ予備消化工程は省略したが、ＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲ鋳型キットの手順を用いた抽出により得た。「陽性対照」は、プロテイナーゼＫ消化工程を含むＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ＲＮＡの手順を用いて同一の組織標本から作成した。得られた抽出物を、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ‐ＰＣＲプロトコールおよびＣｌｏｎｔｅｃｈ社（在カリフォルニア州パロアルト）から入手したβ‐アクチンに対するプライマーを用いたＲＴ‐ＰＣＲに供した。ＰＣＴ均質化手順によって遊離された核酸の収率を推定するために、０．８％アガロースを用いてアガロースゲル分析を実施した。この結果、ＰＣＴ鋳型から回収されたＲＴ‐ＰＣＲ産物が、キット対照に匹敵することが分かった。興味深いことに、対照であるＲｏｃｈｅのキットよりもＰＣＴ法によって、より多くのｍＲＮＡが膵臓試料から回収されているようである。図８は、ラット脳鋳型からのβ‐アクチンＲＴ‐ＰＣＲ産物を示したものである。レーン１〜３は、圧力抽出された試料からの物である。レーン４〜６は、ＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）組織ＲＮＡキットを用いて調製した陽性対照試料からのものである。１〜３および４〜６に対する鋳型の希釈係数は、それぞれ１：５，１：２５および１：６２５とした。レーン７は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈプライマーセット対照を含んでいる。
【０１００】
図９は、ＰＣＴモジュールによって均質化されたラット膵臓を示している。レーン１〜５は抽出物中のゲノムＤＮＡを示しており、レーン６〜１０はＲｏｃｈｅのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ ＲＮＡキットを用いて精製した同一の抽出物からのｒＲＮＡを示している。試料は図７に示したラット脳に対して行ったのと同様にして処理した。膵臓からのレーンａ〜ｇは、上述のラット脳からの図８に記載したレーン１〜７と同等であった。
【０１０１】
図９のレーンａ中にシグナルが欠如しているが、おそらくは鋳型中にＰＣＲインヒビタが存在していることが原因であろう。この実験を繰り返したところ、データは同様の結果を示した。最も重要な観察結果は、従来の組織均質化方法によっては特に困難な作業であった、膵臓からｍＲＮＡを遊離させて保護することに、ＰＣＴ方法が有効であるということである。
実施例４：植物組織の均質化：トウモロコシ葉核酸の遊離およびＰＣＲ増幅
トウモロコシの葉由来のゲノムＤＮＡ、リボソームＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡの均質化および遊離を実証するために、さらなる実験を行った。核酸をトウモロコシの葉から遊離させる標準的な方法では、剃刀の刃を用いて細分化した後に乳鉢と乳棒を用いて均質化する必要がある。核酸を分解から保護するために、均質化プロセスは典型的には液体窒素の存在下で行われる。次に組織をプロテイナーゼＫとともにインキュベートして核酸を遊離させた後、標準的な抽出方法またはキットを用いたゲノムＤＮＡの抽出を行う。
【０１０２】
ＰＣＴ均質化実験において、７日間発芽させた後に新鮮なトウモロコシ葉を採集した。０．２ｇの新鮮な葉を冷蒸留水で洗浄し、微量遠心管中、−７０℃で一時的に保存した。本実験のためには、０．７ｍＬの抽出バッファ（６Ｍグアニジン／１％ＣＨＡＰＳ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ［ＴＥ］、またはＧＴＣ／１％ＮＰ４０）を、シュレッダモジュールの捕捉区画に添加し、動物組織に対して記載したようなＰＣＴ処理に供した。圧力パルスシーケンスは実施例１に記載したものと同様である。圧力処理後、捕捉流体を回収し、８，４００×ｇで１分間手短に遠心分離し、デブリスを除去した。上清を回収し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１０３】
図１０は、ＰＣＴモジュールを用いたＤＮＡの遊離を示したものである。レーン１および２は、６Ｍ Ｇｄｎ／１％ＣＨＡＰＳバッファ中で加工処理した試料を示している。レーン３および４は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ［ＴＥ］バッファ中で加工処理したものである。レーン５および６は、ＧＴＣ／１％ＮＰ４０バッファ中で加工処理したものである。非加圧試料については、レーン２，４および６に示されている。ＱＩＡＧＥＮの植物ＤＮＡ抽出キットプロセスをレーン７の試料に適用した。図１０に示したように、トウモロコシからは、抽出前に液体窒素中での乳鉢と乳棒による長時間にわたる粉砕を必要としたＱＩＡＧＥＮ（登録商標）のＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ（登録商標）キットによって得られたのと同様の量のＤＮＡが得られることが分かった（図１０）。興味深いことに、ＴＥバッファを回収溶液として用いた場合でさえ、相当な量のＤＮＡが回収された。すべてのＤＮＡ試料はＰＣＲ反応の鋳型として効率的に働き、乳鉢と乳棒を使って抽出した対照の鋳型の場合と同様の結果を与えた。
【０１０４】
これらの例において示された結果から、プロテイナーゼＫによる長時間にわたる消化を必要とすることなく、あるいは乳鉢と乳棒を使った均質化を必要とすることなく、ＰＣＴ処理を用いて様々な動物や植物組織から核酸を遊離させることができることが証明された。ＲＮＡの消化が殆ど観察されることなく、ＲＮＡとＤＮＡのいずれも効率的に回収された。界面活性剤を含まないバッファ中（例えば、ＴＥ）でさえ、ＰＣＴによって核酸を遊離させることができる。
【０１０５】
粗溶解物は、ＰＣＲなどの下流の加工処理における鋳型として用いるのにも適している。図１１は、上述のプロセスによって遊離されたトウモロコシ葉ＤＮＡのＰＣＲ増幅を示したものである。プライマーセットがトウモロコシゲノム中の「ＭＴＴＣ」領域を増幅した。レーン１ａ〜１ｃ、２ａ〜２ｃ、および３ａ〜３ｃには、ＰＣＴモジュールによって遊離された試料を含めた。レーン４ａ〜４ｃには、陽性対照試料を含めた。レーン１ａ，２ａ，３ａおよび４ａには、１：５の鋳型濃度のものを含めた。レーン１ｂ，２ｂ，３ｂおよび４ｂには、１：２５の鋳型濃度のものを含めた。レーン１ｃ，２ｃ，３ｃおよび４ｃには、１：６２５の鋳型濃度のものを含めた。これらの結果から、ＰＣＴモジュールを用いて得られたＤＮＡは、「陽性対照」と同一の産物を産生することが実証された。したがって記載の方法は、従来の方法に比べて少ない工程を用いて、はるかに迅速かつ容易に実施することができるとともに、良質の核酸を高収率で与えることができる。
実施例５：圧力と電流によって核酸を精製するためのマルチチャンバデバイス
１つの構成において、細胞から核酸を遊離させ、それらを精製するために圧力を電界と組み合わせることができる（図１７Ａ〜図１７Ｂ）。図１７Ａは抽出モジュールの７つの部品と組立体が示されている（例えば、上部キャップ、加圧部材（ラム）、モジュール本体、電極、モジュールの下部に配置されたバリア、および封止部材（Ｏリング）、ならびに底部キャップ）。これらの特徴は断面図でも示されている。図１７Ｂは、組立モジュールの機能を示している。試料をチャンバ１内に配置し、ラムを移動させて「装入」期間のあいだにチャンバ１内に試料を送給する。本デバイスは、チャンバ１とチャンバ２の間に、組織を可溶化するためのバリア（例えば、シュレッダ）も備えている。適当な温度下で周期的圧力をかけた後、細胞の溶解と核酸の遊離が起こる。細胞の溶解に続いて、加圧によって区画間のバリア（シュレッダ）を通過させることにより、溶解物をチャンバ２に移送する。圧力駆動凍結解凍効果を誘導するためには温度も重要である。「装入」に続いて、周期的な高圧印加を伴う「溶解／タンパク質除去」を開始する。電極Ｅ１〜Ｅ２をオンにし、１５ＭＰａ〜７５ＭＰａの間で圧力を周期的に変える。次に、電極Ｅ３〜Ｅ４を起動した状態で圧力を高くすることにより、「抽出」を開始する。チャンバ２において、遊離された核酸は核酸に対する特異的な親和性を有する樹脂に結合することになる。チャンバに電流を印加することにより、核酸が、チャンバ２Ａ内の結合樹脂からチャンバ２Ｂ内の電極へと移動する（図１７Ｂを参照）。チャンバ２Ａからチャンバ２Ｂへの核酸の移動により、該核酸単離手順にクロマトグラフィーの要素が導入され、圧力と電界の強度を変えることにより、異なるサイズの核酸を分離することができるようになる。試料の性質に応じて、このプロセスは１〜１５分間かけて行うことができる。電気泳動分離に続き、核酸を回収チャンバであるチャンバ３B 中に溶出し、その後このチャンバ３B から結合している膜を回収することにより精製核酸を取り出す。細胞溶解と核酸分離の両方を助けることのできる高圧装置（例えば、ＢＢＩ社のＢａｒｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標））により、高出力の加工処理と分析の両方が可能になる。反応チャンバは、複数のモジュールを収容するように設計することもできる。
実施例６：圧力および樹脂への結合による核酸の精製
核酸調製モジュールは、一連のチャンバを介した段階的経過による細胞溶解と核酸の精製を可能にする（図１８）。このデバイスは、試料が装入されて細胞溶解を行う上側試料チャンバからなる。このチャンバは、ゴム製ガスケットを有するラムによって外部の圧力流体に対して密閉されている。このチャンバは、多孔性支持体（細胞用）、または多孔性「シュレッダ」を含んでいてもよく、組織の塊をより小さい小片に細分化することを容易にし、圧力下で組織をこれらの多孔に通過させることによって核酸の抽出を促進することができる。キャップまたはラムは、モジュールを封止する役目と、試料に圧力を伝達する役目の両方を果たす。ＰＣＴ（高圧サイクル）に続いて、核酸の精製のために、核酸を含む抽出バッファをチャンバ１からチャンバ２に移送する。核酸は、シリカやイオン交換樹脂などのマトリクス、あるいはＱＩＡＧＥＮ（登録商標）のプラスミド抽出カラムまたはＱＩＡａｍｐ（登録商標）抽出カラムなどの市販の試薬に結合させることもできる。区画間の液体の移送は、圧力の印加を介して区画間のバリアを破裂させることにより媒介される。温度または機械的手段を用いることもできる。あるいは、マルチチャンバデバイスに一連のバルブおよびチューブを組み込んで、チャンバから次のチャンバへの試薬の移送だけでなく、流体の追加と除去もできるようにすることが可能である。
【０１０６】
チャンバ２は、核酸と結合するＤＮＡ（またはＲＮＡ）結合樹脂（例えば、シリカＤＥＡＥ）を含んでいる。液体入力／出力装置を用いて、デブリスと不純物をチャンバ２中へ洗い流すことができる液体を導入および除去する。次に精製された核酸を回収チャンバ（チャンバ３）中に溶出する。バルブは、洗浄バッファ流を廃棄容器に向け、精製された核酸を回収チャンバの方向に向ける。
【０１０７】
この構成において、試料は溶解バッファおよび結合マトリクスを含むチャンバに移送される。抽出モジュールは封止して、ＢａｒｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）中に挿入する。圧力処理に続いて、デブリスを低圧力にて洗い流し、高圧力にてＤＮＡを回収チャンバ内に溶出する。この柔軟な設計により、様々な溶解バッファおよび洗浄バッファ、ならびに核酸結合マトリクスの選択が可能になり、後続の各加工処理工程に必要とされる圧力条件のプログラミングも可能になる。
【０１０８】
抽出された核酸は、それ以上精製することなくそのままマイクロアレイ分析または増幅に用いることができる。あるいは、同溶質を、ＤＮＡのサイズ決定および分離のための要素、または全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの分離のための要素を備えたラボオンチップ（ｌａｂ‐ｏｎ‐ｃｈｉｐ）システムの１つに適用することもできる。必要であれば、市販の抽出キットを用いて全核酸調製物からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出することもできる。実施例７：低塩条件における溶解
界面活性剤を含まない低塩溶液中で細胞溶解を行うことができれば、ＰＣＲおよび配列決定を含む多くの後続の分析的手順に対して十分な純度をもつ核酸を得ることができる。タンパク質や他のデブリスなどの不純物は、核酸を溶液中に残して、様々なマトリクス、例えば、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）またはＰｒｏｃｉｐｉｔａｔｅ（登録商標）に結合させることができる。この構成において（図１８を参照）、デブリスおよび不純物はチャンバ１に保持され、可溶性核酸は単純な濾過によってチャンバ２内に回収される。その後この遊離された核酸はそのまま、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定および他の分析的手法を含む様々な生化学的および酵素的用途において用いられる。
【０１０９】
本発明に記載のデバイスは、核酸の精製に対する完全な自立した系を提供し、圧力によって媒介される溶解およびタンパク質除去と、それに続く精製をうまく利用して、濃縮された核酸生成物を得ることができる。その後の核酸の加工処理には、低圧でデブリスを洗い流すことと、ＢＢＩ ＢａｒｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ｖ３．０を用いて第２の工程において精製された核酸を高圧下で溶出する工程とが含まれる。
実施例８：二重Ｏリングデバイス
図１９は、ラム１０４およびスクリューキャップ１０６の両方の上に二重Ｏリング１０２を有する本発明のマルチチャンバデバイス１００を示した図である。また、ラムおよびキャップ内には、チューブの内側または外側からいずれかのＯリングを通過してきたあらゆる流体を捕捉することのできる溝１０８も設けられている。デバイスは、溶解ディスク１１０と、試料チャンバ１１２と、流体／反応チャンバ１１４も備えている。デバイス１００の典型的な使用において、流体／反応チャンバ１１４にバッファ溶液を入れ、スクリューキャップ１０６をチャンバ１１４に隣接するデバイス１００のねじ切り部分１１８内に螺合し、加工処理または細砕しようとする試料を試料チャンバ１１２に入れ、ラム１０４を、随意でラムを所定の深さまで挿入させることのできる工具を用いて、試料チャンバ内に挿入する。このような工具の例が図２０に示されている。図２０に示される工具の一方端部は、キャップ１０６を螺合または脱螺合させるねじ回しとして機能する。工具の他方端部は、ラム１０４を所定の適切な深さに設定する支柱を有している。そしてデバイス１００を、ＢＢＩ ＢａｒｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）などの圧力サイクル装置に入れ、該装置は、ラムに試料を溶解ディスク１１０を通過させるようにして、一般にはチャンバ１１４内のバッファ溶液内に溶解試料の溶液または懸濁液が得られることになる。
【０１１０】
デバイス１００がチューブの内側または外側から「漏れている」かどうかを、既知濃度のフルオレセイン溶液を用いて、チューブ内側の溶液の蛍光またはチューブ外側のバッグ内の流体の蛍光を測定することにより、確かめることができる。適当なバッファ中のフルオレセインから作成した用量応答曲線と蛍光を比較する際には、蛍光の量を体積に変換することができる。この方法は非常に感度が高く、０．１μＬの体積の漏れを検出するためにも用いることができる。本方法は、新しく作られたチューブを評価するために、品質管理のために、あるいは加工処理された試料について用いることができる。
実施例９：ＰＣＴによるラット尾部の溶解
ラット尾部はＰｅｌ‐Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手し、新鮮な間に凍結しドライアイス上または−７０℃で保存した。ラット尾部の０．２ｇの小片を、図１９に示されるような本発明のマルチチャンバデバイス中、ＢＢＩ Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｖ２．４を用いて約２４１，３２５ｋＰａ（３５ｋｐｓｉ）、４℃で１分間のサイクルを５回繰り返して、加工処理した。それぞれのデバイスには、図３Ａに示されるような２０個の２ｍｍの穴を有するステンレス鋼ディスクを補足した。金属ディスクの目的は、デバイス本体内のプラスチック製溶解ディスクを強化することである。この試料セットに対して用いたバッファを表１の第３欄に示す。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
図２１に示される試料１〜６から精製されたゲノムＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によって実証されるように、圧力サイクル（「ＰＣＴ」）を用いて得られる溶解効率は、従来のプロテイナーゼＫ消化または乳鉢と乳棒の方法を用いた場合と同等であった。アガロースゲルは表Ｘに示した通りであった。同一体積の精製ＤＮＡ試料を各レーンに流した。他の実験（データ示さず）によって、乳鉢と乳棒を用いた方法と比較して類似量の全ＲＮＡをラット尾部から首尾良く抽出できることが実証された。ＰＣＴ処理からのＤＮＡおよびＲＮＡ収率は、β‐アクチンプライマーセットを用いたＰＣＲまたはＲＴ‐ＰＣＲによ
って示されるようにＰＣＲ増幅可能であった。
実施例１０：ラット脳の加工処理およびラット脳からの分子抽出
ラット脳試料は、Ｐｅｌ‐Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手した。試料は新鮮凍結され、ドライアイス上または−７０℃で保存した。試料を、１％ＣＨＡＰＳを含有する飽和塩酸グアニジン溶液中、ＰＣＴにより、約２４１，３２５ｋＰａ（３５，０００ｐｓｉ）、℃で、１分間のサイクルを５回繰り返すことにより処理した。図２２Ａは、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）のＱＩＡａｍｐＤＮＡ組織キットを用いて精製された（プロテイナーゼＫ消化工程は省略）粗溶解物中に抽出されたゲノムＤＮＡが存在することを実証するアガロースゲルである。
【０１１３】
ラット脳タンパク質についても、ＰＣＴ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、２５℃で１分間のサイクルを５回）、非加圧対照、および液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いた後のＯｍｎｉのホモジナイザーによる均質化、を用いて抽出を行った（図２２Ｂ）。該ラットタンパク質を、ウェスタンブロット分析を用いて調べた（図２２Ｃ）。ウェスタンブロットアッセイにおいて、一次抗体は、ユニバーサルな抗一酸化窒素シンターゼモノクローナル抗体（マウス）、二次抗体は、抗マウスＩｇＭ抗体（ｍ鎖特異的）‐アルカリホスファターゼコンジュゲートとした（いずれの抗体も、在ミズーリー州セントルイスのＳｉｇｍａ社より入手した）。脳組織はＰＢＳ中で均質化した。
【０１１４】
この実施例は、ＰＣＴがＤＮＡおよびタンパク質を動物の脳組織から抽出できることを実証するものである。ＰＣＴプロセスは、ＤＮＡ分析のためのＰＣＲ増幅と適合するものであった。一酸化窒素シンターゼの抗原活性も維持されていた。ＥＬＩＳＡアッセイ（データ示さず）からも、ラット脳をＰＣＴによって加工処理することにより、その他の天然のタンパク質が得られることが実証された。
（他の実施形態）
本発明の多数の実施形態を記載してきた。それでもなお、本発明の精神と範囲から逸脱しない限りにおいて様々な改変が可能であることが理解されよう。したがって、他の実施形態も請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】生物試料を調製するためのデバイスの断面図。
【図２】２つのラムを含むマルチチャンバデバイス組立体の斜視図。
【図３Ａ】シュレッダ面を有するバリアの例を描いた図。シュレッダ面は単純な円形孔によって構成されている。
【図３Ｂ】シュレッダ面を有するバリアの例を描いた図。シュレッダ面は、孔だけでなく、孔間に試料の粉砕を助ける固体の尖った凸部を有している。
【図４】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図５】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図６】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図７】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図８】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図９】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図１０】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図１１】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図１２】発明を実施するための最良の形態に記載のゲル電気泳動の結果を示す図。
【図１３】９６ウェルプレートの１つのウェル内に嵌合するシュレッダ要素を有する試料調製デバイスの図。
【図１４】１つの多孔性バリアと、複数の貫通可能バリアと、１つの圧力調節装置とを有する試料調製デバイスの断面図。
【図１５Ａ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｂ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｃ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｄ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｅ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１５Ｆ】複数の貫通可能バリアと、ラムである複数の加圧部材とを有する試料調製デバイスの簡略化模式図。
【図１６Ａ】垂直方向および水平方向のいずれの試料区画にも試料または試薬が導入されるデバイスの上面図。
【図１６Ｂ】垂直方向および水平方向のいずれの試料区画にも試料または試薬が導入されるデバイスの側面図。
【図１７Ａ】圧力および電流を用いて核酸を抽出することのできるデバイスの図。
【図１７Ｂ】圧力および電流を用いて核酸を抽出することのできるデバイスの図。
【図１８Ａ】シリンダの部分に分割された様々な区画に試料が送達されているデバイスの図。試料チャンバと洗浄チャンバとの相対位置を説明する。
【図１８Ｂ】シリンダの部分に分割された様々な区画に試料が送達されているデバイスの図。試料がバルブを通して送達され、また下側の区画が円運動で機械的に移動する仕組みを説明する図。
【図１９】二重Ｏリングを有する本発明のマルチチャンバデバイスの断面図。
【図２０】図２４のデバイスのキャップとラムを設定するための工具の図。
【図２１】本発明のデバイスを用いて加工処理されたラットの尾部から精製したゲノムＤＮＡを示す、アガロース電気泳動ゲルの写真。
【図２２Ａ】本発明のデバイスおよび他の方法を用いて加工処理したラット脳から抽出されたＤＮＡのアガロースゲルの写真。
【図２２Ｂ】本発明のデバイスおよび他の方法を用いて加工処理したラット脳から抽出されたＤＮＡのアガロースゲルの写真。
【図２２Ｃ】本発明のデバイスおよび他の方法を用いて加工処理したラット脳から抽出されたタンパク質のウェスタンブロットの写真。
Claims (99)
- 圧力調節装置において用いるための試料加工処理デバイスであって、該デバイスは、
複数のチャンバと、
２つのチャンバ間に配置される少なくとも１つのバリアであって、多孔性もしくは貫通可能であるか、あるいは物理的、化学的もしくは機械的刺激への暴露によって多孔性または貫通可能なものとすることができるバリアと、
試料を高圧に供して、少なくとも１つのバリアに試料を強制通過させるような位置に配置された少なくとも１つの加圧部材とを含むことを特徴とするデバイス。 - 少なくとも１つのチャンバは、成型されたデバイスの一部であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- ２つまたはそれ以上のチャンバと、
複数のバリアであって、該複数のバリアのうちの少なくとも１つが多孔性であるか、あるいは物理的、化学的もしくは機械的刺激への暴露によって多孔性または貫通可能なものとすることができる、複数のバリアと、
異なる静水圧で独立して作動される２つまたはそれ以上の加圧部材であって、少なくとも１つの部材は、試料を高圧に供して、少なくとも１つのバリアに試料を強制通過させるような位置に配置されている加圧部材とを含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。 - チャンバの少なくとも２つが、ネジ込み機械的インターロックまたはネジ付機構によって互いに連結されていることを特徴とする請求項３に記載のデバイス。
- チャンバの少なくとも１つがプラスチック、セラミック、金属またはガラスからなることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの少なくとも１つが１００μＬまでの容積を有することを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの少なくとも１つが１００ｍＬまでの容積を有することを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの少なくとも１つが５００ｍＬまでの容積を有することを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- １つ以上のチャンバの表面が、生体分子に対して不活性であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- １つ以上のチャンバの表面が生体分子で誘導化されていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- １つ以上のチャンバの表面が、生体分子と相互作用する分子で誘導化されていることを特徴とする請求項１０に記載のデバイス。
- 分子は小有機分子からなることを特徴とする請求項１１に記載のデバイス。
- 少なくとも１つのバリアは、フィルタをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- フィルタは、塩化ポリビニル、ポリエステルスルホン、ナイロン、ニトロセルロース、セルロースエステル、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＦＴＡ）、ビニル、ポリプロピレン、およびポリカーボネートからなる群より選択される材料からなることを特徴とする請求項１３に記載のデバイス。
- 前記バリアは、第１のチャンバと第２のチャンバとの間に配置され、バリア内の開口部は、第１のチャンバと第２のチャンバとの間を連通していることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 少なくとも１つのバリアが穿刺可能であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 少なくとも１つのバリアが有機溶媒によって溶解可能であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 少なくとも１つのバリアが、機械的に除去可能であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 少なくとも１つのバリアが、温度変化を介して除去可能であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 少なくとも１つのバリアが、バルブからなることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 少なくとも１つのバリアが、穿刺、溶媒和、融解、破壊、および機械的除去からなる機構の任意の１つまたは組み合わせによって除去可能であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 前記バリアは、ポリマー、金属またはセラミックからなることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 前記バリアは、固体材料の複合体または層からなることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 前記バリアは複数の開口部を有することを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 前記開口部は略円形であることを特徴とする請求項２４に記載のデバイス。
- 開口部の直径は、約１μｍ〜約１００μｍであることを特徴とする請求項２４に記載のデバイス。
- 開口部の直径は、０．１ｍｍ〜１ｍｍであることを特徴とする請求項２４に記載のデバイス。
- 開口部の直径は、１ｍｍ〜１ｃｍであることを特徴とする請求項２４に記載のデバイス。
- 開口部の直径は、１ｃｍ〜３ｃｍであることを特徴とする請求項２４に記載のデバイス。
- バリアは、複数の固体の尖った凸部を含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 前記固体は、ポリマー、金属またはセラミックからなることを特徴とする請求項３０に記載のデバイス。
- 前記尖った凸部は、ピラミッドまたは円錐の形状であることを特徴とする請求項３０に記載のデバイス。
- 前記凸部は、前記スクリーンの基部の上方に０．０１ｃｍ〜０．１ｃｍ延びることを特徴とする請求項３０に記載のデバイス。
- 前記凸部は、前記スクリーンの基部の上方に０．１ｃｍ〜１ｃｍ延びることを特徴とする請求項３０に記載のデバイス。
- 前記凸部は、前記スクリーンの基部の上方に１ｃｍ〜３ｃｍ延びることを特徴とする請求項３０に記載のデバイス。
- 前記加圧部材は、チャンバ内で移動するように取り付けられた少なくとも１つのラムを含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 前記加圧部材は、ポリマー、金属またはセラミック材料からなることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 前記加圧部材は、断面が円形であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバは壁を備え、加圧部材は加圧部材が移動すると前記壁と接触する１つ以上の環状封止材を含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 前記封止材は、ポリマー、金属、またはセラミック製であることを特徴とする請求項３９に記載のデバイス。
- 少なくとも１つの加圧部材は、周囲に封止リングを有するシリンダからなり、チャンバは略円筒形であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- デバイスは、少なくとも２つの加圧部材を含み、一方の加圧部材はバリアの第１の側に配置され、他方のラムは、バリアの第１の側と対向するバリアの第２の側に配置されていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- １つ以上のチャンバに加圧部材が取り付けられていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- オリフィスを有する容器をさらに含み、前記チャンバは該オリフィス内に配置されていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの１つ以上に流体が充填されていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの１つ以上が、温度制御デバイスをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの１つ以上が、温度サイクルデバイスをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの１つ以上が、圧力制御デバイスをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの１つ以上が、圧力サイクルデバイスをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの１つ以上に内蔵された検出モジュールをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 圧力調節装置において使用するための試料加工処理デバイスであって、該デバイスは、
垂直配置で配置された複数のチャンバと、
チャンバ対の間に配置された少なくとも１つの一時的バリアと、
バリアの少なくとも１つに試料を強制通過させるように配置された１つの加圧部材と、を含むことを特徴とするデバイス。 - 第１のチャンバと第２のチャンバとの間に配置された多孔性バリアをさらに含むことを特徴とする請求項５１に記載のデバイス。
- 生物試料の加工処理方法であって、
請求項１に記載のデバイスを提供することと、
第１のチャンバに試料を添加することと、
デバイスを高い圧力に供して、加圧部材が試料を前記第１のチャンバと第２のチャンバとの間のバリアに強制通過させて、第２のチャンバに流入させるようにすることと、を含む方法。 - 生物試料は、加圧部材によって複数のバリアを強制通過させられることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料は、固体材料、半固体材料、気体および液体からなる群より選ばれることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料は、昆虫または小動物、真菌、植物または動物組織、食品または農産物、科学捜査試料、およびヒト組織からなる群より選択されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料は、ヒト血液、血清または尿からなることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料は凍結されていることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料の大きさは１０ｍｇ〜１００ｍｇであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料の大きさは０．１ｍｇ〜１．０ｍｇであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料の大きさは１０ｍｇ〜１ｇであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料の大きさは１ｇ〜２０ｇであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料の大きさは２０ｇ〜５００ｇであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 高い圧力は、約３４４７．５ｋＰａ（５００ｐｓｉ）より高いことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 高い圧力は、約３４４７５ｋＰａ（５，０００ｐｓｉ）より高いことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 高い圧力は、約６８９５０ｋＰａ（１０，０００ｐｓｉ）より高いことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 高い圧力は、約３４４７５０ｋＰａ（５０，０００ｐｓｉ）より高いことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記高い圧力は、試料の大気圧凍結温度より低い温度にて試料に印加されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記高い圧力は、４℃から周囲温度の間の温度にて印加されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記高い圧力は、周囲温度にて印加されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記高い圧力は、周囲温度から９０℃の間の温度にて印加されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記高い圧力は周期的に反復されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記高い圧力は、ミリ秒の範囲の頻度で周期的に反復されることを特徴とする請求項７２に記載の方法。
- 前記高い圧力は、秒の範囲の頻度で周期的に反復されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記高い圧力は、分の範囲の頻度で周期的に反復されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記試料の調製の後あるいはその一環として、試料を分析することをさらに含むことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料から特定の物質を抽出することをさらに含むことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは少なくとも１つの細胞タンパク質が、前記試料調製の後またはその一環として単離されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 前記試料調製の後またはその一環として、生物試料から薬学的組成物が単離されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 生物試料からの存在する特定の物質を加工処理することをさらに含む請求項５３に記載の方法。
- 加工処理工程は、特定の物質の増幅、リガンドへの特異的結合、リガンドからの特異的溶出、化学反応の実施、１つ以上の酵素反応の実施、１つ以上の核酸配列決定反応の実施、封入体からの組み換えタンパク質の可溶化、および１つ以上の触媒反応の実施からなる群より選択されることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
- 増幅はポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われることを特徴とする請求項８１に記載の方法。
- 化学反応は、核酸ハイブリダイゼーションを含むことを特徴とする請求項８１に記載の方法。
- 化学反応は抗原と抗体とを相互作用させることを含むことを特徴とする請求項８１に記載の方法。
- 加工処理は、段階的反応を実施することからなり、デバイスの各チャンバ内で異なる工程が起こることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
- 請求項１に記載の複数デバイスは、前記圧力調節装置内で互いに連結されていることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
- 請求項１に記載の８〜１２個のデバイスが互いに連結されて、細長い列を形成していることを特徴とする請求項８６に記載の方法。
- 請求項１に記載の複数のデバイスが互いに連結されて、デバイスの２次元マトリクスを形成していることを特徴とする請求項８６に記載の方法。
- 試薬を含む１つ以上のチャンバが、試料を収容したチャンバを環状に囲み、前記試薬は圧力によって作動されるバルブを介して試料に導入されることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- チャンバの少なくとも１つは、試料の加工処理の間にチャンバに電流を通過させることのできる電極を備えることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- デバイスの端部にキャップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- キャップは、ネジ込み機械的インターロックまたはネジ付機構によってデバイスの端部においてチャンバに連結されることを特徴とする請求項９１に記載のデバイス。
- キャップは、穿刺、溶媒和、融解、破壊および機械的除去の機構のうちの任意の１つまたは組み合わせによって除去可能であることを特徴とする請求項９１に記載のデバイス。
- デバイスの端部のチャンバは壁を備え、キャップは、該キャップがチャンバに連結されている際に壁と接触する１つ以上の環状封止材をさらに含むことを特徴とする請求項９２
に記載のデバイス。 - デバイスに高い圧力をかける前に、試料を保存するのに適した温度で試料を保存するのに必要な時間だけ、試料をデバイス中に維持しておくことをさらに含む請求項５３に記載の方法。
- デバイスに高い圧力をかけた後に、試料を保存するのに適した温度で試料を保存するのに必要な時間だけ、試料をデバイス中に維持しておくことをさらに含む請求項５３に記載の方法。
- 検出モジュールは、照度計、蛍光計、光量計、分光光度計、イオン化検出器、流量計、シンチレーションカウンター、およびカメラからなる群より選択されることを特徴とする請求項５０に記載のデバイス。
- チャンバの少なくとも１つが５００μＬまでの容積を有することを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
- 生物試料の大きさが１．０ｍｇ〜１０ｍｇであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
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