JPH10505513A - 自己由来の微小血管内皮細胞を含む脂肪組織を採取する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生存微小血管内皮細胞の増大した集団を保存するように脂肪組織を採集する方法が開示される。微小血管内皮細胞を含む脂肪組織は、組織切断縁部を備えた開孔部を有する細長いカニューレが組み込まれた収集装置を用いて採取される。周囲圧力以下の圧力がカニューレの管腔に付与され、開孔部を通じて脂肪組織を引き、次いで、そこで切断縁部を用いて分離し、結合脂肪マトリックスを破壊する。この採取により、より清潔でより均質な脂肪組織試料が提供され、それによってさらなる加工によって得られた生存微小血管内皮細胞の集団が増大する。採取された脂肪組織をさらにホモゲナイズする迅速で簡単な方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 自己由来の微小血管内皮細胞を含む脂肪組織を採取する方法 発明の分野 本発明は、微小血管内皮細胞の採取方法に関する。さらに詳しくは、本発明は 、脂肪組織の収集方法および合成補綴具の表面に堆積する微小血管内皮細胞の初 期純化方法に関する。発明の背景 動脈硬化症の血管の疾患は、世界中で、主な死因になっている。動脈内膜切除 術および経皮的なバルーン膨張などの高度な医学技術が、病理学的狭窄症の発症 を治療するのにますます頻繁に適用されているが、しばしば、最も効果的な治療 は、血管の閉塞部の外科手術による除去である。このような場合、虚血組織への 血液の流れの回復は、血管移植片の移植に依存する。 自己由来の血管組織が、このような移植片における使用のための最も適切な材 料であるが、それ以前の外科手術の介入および進行した血管の疾患により、しば しば、このような組織の入手可能性が制限される。従って、近年、合成材料から 作製された血管移植片の移植が一般的になっている。商業的に入手可能な合成移 植片は、非常に耐久性がよく、閉塞組織への血液の流れをうまく回復するために 使用され得るが、付随するトロンボゲン形成による合併症により、その効果が低 下する。特に、直径が小さい血管移植片は、正常な凝固機構によりブロックされ るので、機能不全になる傾向がある。具体的には、移植片の合成表面が、フィブ リンの堆積を促進し、それに付随して細胞粘着および血管の閉塞が起こる。従っ て、コーティングされていない合成移植片の長期的の病気の予後が比較的悪い。 コーティングされていない合成血管移植片に付随する問題を回避するために、 補綴具をヒトの内皮細胞でライニングし、天然のヒトの血管に存在するようなト ロンボゲン形成性でない細胞表面を生成する方法が開発されている。天然の血管 の内皮ライニングは、非常に複雑で多機能の細胞表面であり、血液と下にある血 管壁成分との両方と相互作用し、生理学的なホメオスタシスを維持する。動物試 験によれば、合成血管移植片の内面への機能的な大血管内皮細胞のライニングの 堆積により、トロンボゲン形成による閉塞の形成が減少し、血管の中の血液流れ の阻害を最小にすることが示されている。しかし、大血管細胞の十分な数をドナ ーから採取することは、非常に困難である。 近年の分子生物学および組織培養の進歩により、大血管内皮細胞の単離および その後の増殖が可能になった。実際、培養された大血管内皮細胞の使用は、高価 であり、複雑でありそして固有の制限を受ける。１つの問題は、細胞培養技術が 、技術的に高度であり、訓練された人員および実験室条件下での専門化された設 備の使用を必要とする点である。しかし、最適な条件下においてさえ、培養され た大血管内皮細胞の収率は低くなり得る。さらに、培養細胞を用いる代表的な接 種方法には、移植片の合成表面上に、完全かつ均一に内皮細胞を堆積させるため に、複雑な条件下で特別の媒体の使用が必要である。 さらに、培養細胞は、通常、移植片を受ける患者から由来するのではなく、従 って、広範囲の免疫合併症を併発し得る。もし、患者の免疫応答が、減衰しない 場合、移植された内皮細胞は、攻撃され、体内の防御によって移植片の表面から 剥離され得る。逆に、もし、患者の免疫応答が、人工的に抑制されると、生命の 危険のある日和見性感染症を発症し得る。 補綴装置の大血管内皮細胞処置の使用に付随するこれらのおよび他の合併症を 考慮して、合成材料に固有のトロンボゲン形成性を減少させる別の方法が、開発 されてきた。特に、ヒトの微小血管内皮細胞が、合成移植片を非トロンボゲン形 成性にするために効果的に用いられ得ることが早急に認知された。 微小血管内皮細胞は、毛細血管、小動脈および小静脈から由来し、ほとんどの 体内組織に豊富に存在する。内皮細胞は、脳、肺、網膜、副腎、肝臓および筋肉 組織などの組織から単離され得るが、これらの細胞の供給源として脂肪組織の使 用が、その豊富さ、入手可能性、およびその除去は処置される患者に悪影響を与 えるべきでないという理由で好ましい。しばしば、微小血管内皮細胞は、脂肪１ グラム当たり１０⁶個またはそれ以上の濃度で存在するので、高密度堆積方法の ための材料の十分な供給源を提供する。さらに、合成移植片を処置するために使 用される微小血管細胞は、通常、自己由来、すなわち、血管補綴具の受容者から 採取されるので、免疫合併症は回避され得る。 代表的には、微小血管内皮細胞は、腎周組織脂肪、皮下脂肪、網(omentum)ま たは腹膜腔に付随する脂肪などの自己由来の脂肪組織から単離される。通常、採 取は滅菌条件下で行われ、一回の手順で必要量の脂肪を切除する。次いで、収集 された組織は洗浄され、通常、コラーゲナーゼ、パパイン、トリプシンおよびそ れらの混合物のような蛋白質分解酵素を含有する緩衝化消化溶液に移され得る。 脂肪組織は、３７℃で選択された時間消化され、結合マトリックスを破壊し、 そして微小血管内皮細胞を含む細胞成分を分散する。消化に続いて、細胞成分は 、細胞が豊富なペレットを提供するために、低速遠心分離によって分離され得る 。このペレットは洗浄され、堆積手順に用いられるかまたは連続勾配を用いてさ らに精製され得る。いずれの場合も、精製された細胞は、緩衝液で希釈され、引 き続いて、合成補綴具とインキュベートし、内皮化表面を提供する。 通常、所望の脂肪組織の収集は、針またはカニューレを有する収集装置に接続 された吸い上げポンプの使用を伴う。例えば、本明細書で参考として援用される 米国特許第5,035,708号および第4,834,703号は、必要な真空を提供するために、 吸い上げポンプを用いる脂肪組織の収集を開示している。しかし、このような収 集装置およびそれに付随する方法は、収集された組織の微小血管細胞成分に対し て非常に荒々しい、強力な制御不可能な吸い上げを用いる傾向がある。その結果 、比較的脆い細胞膜が破壊され、実質的に採取された細胞の生存率が低下し得る 。このため、堆積プロセスの効率が激減する。このような収集手順は、十分な脂 肪組織を提供し得るが、このような技術を用いて収集された試料には、最終的な 堆積のために比較的純粋な微小血管内皮細胞の十分な濃度を確実に得るために、 通常、付加的な労働集約的な調製ステップが必要である。 さらに、吸い上げポンプを用いて収集された供給源組織は、しばしば、比較的 汚く、不要な体液および非脂肪細胞破片で汚染されている。比較的純粋な脂肪組 織に見られるような、半透明で白い試料を得るのではなく、ポンプで生成された 真空を用いて収集された試料は、しばしば、脂肪内に分散した所定濃度の結合組 織または膜組織を有して血液のように見える。 取り込まれた異物が、消化用に収集された試料の最初のホモゲナイズおよび調 製を含む微小血管内皮細胞単離の各ステップを妨害する。さらに、このような異 物が、蛋白質分解酵素の酵素活性を直接阻害し、試料の消化が不完全になり、引 き続き遠心分離によって得られた非脂肪細胞成分の収率が、それに応じて低下す る。最後に、収集されペレット状になったこれらの細胞は、増加したレベルの非 内皮成分を含有する。このような汚染されたペレットの使用は、細胞堆積手順の 効率をさらに低下させ、そして補綴具表面上の内皮細胞の均質堆積を妨害する。 その結果、患者は、十分な数の微小血管細胞を提供するために必要とされ得るよ り多い脂肪吸い上げに耐えなければならない。 内皮化プロセスの効率は、異物により、工程中の各ステップで低下するので、 比較的きれいな試料でこの手順を開始することの重要性は明らかである。つまり 、最初に収集された汚染材料の量が僅かに増加すると、合成移植片表面上の堆積 に利用可能な生存微小血管内皮細胞の収率が激減し得る。最初に収集されなけれ ばならない脂肪組織の量が増加することに加えて、汚染材料に起因する細胞生存 率の不可避の減少は、堆積時間を長くすること、または精製ステップの追加によ って補われなければならない。それらの両方により、手順全体の操作効率が低下 する。これは、細胞が、補綴装置の移植の直前に収集されなければならない場合 に特に不都合であり得る。 従って、合成補綴具の移植をしようとしている患者から収集された脂肪組織か ら回収された生存内皮細胞の収率を改善する必要がある。つまり、脂肪標本に存 在する微小血管内皮細胞は、脂肪細胞、血液細胞、結合組織および標本に存在す る他の材料からより効率的に分離されるべきあり、それにより、より大量のこの ような内皮細胞が、合成移植片上に堆積されるために利用可能である。 材料の収集に付随する実際の問題に加え、吸い上げポンプの使用は操作環境を 複雑にし、そして脂肪組織収集装置を自由に操作する外科医の能力を妨害する。 より詳しくは、収集装置は、通常、厚く扱いにくいホースを介して真空供給源に 取り付けられており、収集先端部の操作性をひどく損なう。このようなポンプの ために、しばしば、収集先端部における真空の強度の正確なリアルタイムの制御 が不可能であり、このため、所望の供給源組織の一定の均一な採取を維持するこ とが困難である。この利便性および正確な制御の欠如のために、必然的に、望ま しくない組織を吸い上げることになり、これにより、試料の異物のレベルを増加 させるか、低レベルの微小血管内皮細胞を含有する、あまり好ましくない脂肪組 織の収集という結果になる。さらに、真空供給源、特に、医療手順において使用 が承認された真空供給源は、通常、維持が比較的高価な複雑な器具である。 上記に述べたような関連技術の欠点を考慮して、本発明の目的は、微小血管内 皮細胞を含む脂肪組織の収集のための効率的でコスト面で有利な方法を提供する ことにある。 本発明の別の目的は、高レベルの微小血管内皮細胞を含む実質的に純粋な脂肪 組織を、最小限の血液細胞、結合組織および他の異物で収集するための、信頼性 ある簡便な方法を提供することにある。 本発明のさらに別の目的は、微小血管内皮細胞のその後の分離を容易にするた めの、脂肪組織の急速なホモゲナイズのための信頼性ある簡便な方法を提供する ことにある。 発明の要旨 これらのおよび他の目的は、本発明によって達成され、本発明は広範な局面で 微小血管内皮細胞のような同定可能な細胞成分を含む脂肪組織の採取のための効 率的な信頼性あるコスト面で有利な方法に関する。より詳しくは、本発明は、通 常、細長いカニューレに取り付けられた、可変容量容器、代表的にはシリンジア センブリを備える収集装置を用いて、生存内皮細胞の増加した集団を保存するよ うに脂肪組織を採取する方法に関する。可変容量容器またはシリンジと流体導通 関係にある細長いカニューレは、脂肪組織の結合マトリックスを破壊しながら、 細胞成分に加えられる応力を最小にするような適切なサイズおよび構成の開孔部 を好ましくは含む。つまり、特定の構成のカニューレの開孔部を用いて、脂肪組 織を収集することによって、内皮細胞の収率が実質的に増加し得る。さらに、収 集装置は、安価、軽量、操作が容易であり、そして付与された吸い上げの正確な 制御が可能である。 本発明の組織採取方法は、通常、収集装置のカニューレの少なくとも一部分を 患者に挿入し、そしてカニューレ先端部を脂肪組織が収集される領域へ向けるこ とから始まる。採取手順は、好ましくは、無菌条件で行われる。必要に応じて、 脂肪組織マトリックスを緩めるために、採取前に、生理食塩水溶液または他の生 体適合性の液体を患者の収集領域に注入し得る。カニューレ先端部の挿入および 配置に続き、プランジャーに取り付けられた移動可能なピストンを後ろに引くこ とによって、シリンジの中央腔に周囲圧力以下の圧力が生成される。所望であれ ば、プランジャーに取り付けられ、シリンジの本体と相互作用するように設計さ れた固定機構によって、ピストンはこの引かれた形態に保持され得る。この固定 機構は、オペレーターの手を解放し、収集装置の軽量さと組み合わさると、より 高い操作性を提供する。いずれの場合にも、中央腔における周囲圧力以下の圧力 が、選択された収集領域から脂肪組織を吸い上げ、破壊を行うカニューレの開孔 部に入り、カニューレの本体を通りシリンジアセンブリの中に入る。シリンジの 中央腔は、収集された組織で満たされるので、周囲圧力以下の圧力が、ゆっくり と平衡に達する。一旦、シリンジの中央腔が、比較的均質な脂肪組織で実質的に 満たされると、カニューレ先端部は患者から取り出される。 本発明の別の局面は、収集された脂肪組織が簡単にホモゲナイズされ、そして 汚染物質を取り出すために水性溶液で洗浄されることを可能にする。患者からの カニューレ先端部の取り出しに続き、カニューレは、シリンジアセンブリから取 り外され得る。次いで、フィルターハブに収められているフィルターが、カニュ ーレが、予め取り付けられたシリンジアセンブリに取り付けられ得る。次いで、 好適には、第１のアセンブリと同じサイズの第２のシリンジアセンブリが、フィ ルターハブの対向する側に取り付けられる。このように接合されると、第１のシ リンジアセンブリのピストンは、実質的にシリンジ内の後方にあり、そして第２ のシリンジアセンブリのピストンは、実質的に前の位置にある。プランジャーを 用いて２つのピストンを移動させることによって、収集された脂肪は、試料組織 の流路を横に切開するフィルターを通じて押し流されると、急速にホモゲナイズ され得る。必要に応じて内皮細胞が豊富な脂肪組織ホモゲネートから異物を分離 するために、ホモゲナイズのあいだにリンス溶液を添加し得る。ホモゲナイズお よびリンスの後、ここでは、生の結合組織および他の異物を実質的に含まない収 集された脂肪組織が、消化およびさらなる精製のために適切な容器に移され得る 。 本発明のさらなる目的および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面を組 み合わせて考慮される本発明の例示の好適な実施形態を読めば明らかである。図 面では、同様の参照番号は、同じ構成要素または構造において類似である構成要 素を示す。 図面の簡単な説明 図１は、プランジャーが挿入位置にある、カニューレのシリンジアセンブリへ の取付けを示している、脂肪組織収集装置の斜視図である。 図２は、例示の固定機構によって引かれた位置に保持されるプランジャーを示 している、脂肪組織収集装置の部分断面図である。 図３は、フィルターハブによって相互接続された２つのシリンジアセンブリの 部分断面図であり、採取された脂肪組織のホモゲナイズに使用される本発明の構 成を示す。 図４は、本発明によるホモゲナイズフィルターを示している、図３の４−４線 に沿った断面図である。 図５は、本発明の教示に従った、微小血管内皮細胞の高収率を提供するために 使用されるカニューレの先端部の部分斜視図である。 図６は、カニューレの先端部に隣接する収集開孔部の配置を示している、図５ の６−６線に沿った断面図である。 図７は、脂肪組織を採取するために使用されるカニューレの実施形態の先端部 分の部分斜視図である。 図８は、カニューレの先端部に隣接する収集開孔部の楕円形状および配置を示 している、図７の８−８線に沿った断面図である。 図９は、脂肪組織を採取するために使用するカニューレの別の実施形態の先端 部分の部分斜視図である。 詳細な説明 本発明は、多くの異なる形態において具体化され得るが、本開示が、発明の原 理の例示として考えられるべきであり、例示された特定の実施形態に本発明を限 定することを意図しないということを理解して、図面で示し、詳細にその特定の 実施形態で記載される。特に、本発明は、広範なシリンジ本体およびカニューレ の組合せが、図に示される組合せ以外にも適用されることを強調しなければなら ない。 さらに、本発明は、脂肪組織マトリックスに付随する任意の同定可能な細胞を も採取するために使用され得、微小血管内皮細胞の採取および単離に限定されな い。本明細書で用いられる用語「同定可能な細胞成分」とは、通常使用される免 疫学的、化学的または物理的分離方法または試験によって認識され得る細胞をい う。 同様に、血管補綴具の内皮形成が本発明の重要な目的であるが、当業者は、収 集された細胞産物が、他の移植可能な装置を処置するために使用され得ることを 理解する。内皮細胞ライニングまたは被覆を生成するために処置され得る移植片 は、人工心臓、弁状補綴具および天然のまたは人工の弁小葉のような血管内装置 を含むが、それだけに限定されない。本発明の、内皮細胞が豊富な脂肪組織を採 取するための収集装置および方法は、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレ ンのような公知の合成材料、または、ヒトを含む動物供給源からの静脈、動脈、 心臓弁および他の組織などの、固定されたおよび固定されていない天然に存在す る材料からなる表面の処置に使用され得る。 図面を参照すると、図１および図２は、シリンジアセンブリ１２の形態で可変 容量容器を本質的に備える脂肪組織収集装置１０を示す。シリンジアセンブリ１ ２は、管腔２６、および、微小血管内皮細胞を含む脂肪組織の相対的に均質な収 集のために適切に構成された少なくとも１つの収集開孔部１６を有する細長いカ ニューレ１４と流体的に密な導通関係にある。シリンジアセンブリ１２は、通常 、そこに密閉して配置される移動可能なピストン２２を有する、中央腔２０を規 定している中空の管状本体１８を備える。好ましくは、ピストン２２は、中空の 管状本体１８の後ろの開口部を通して伸びる細長いプランジャー２８に取り付け られている。プランジャー２８を手動で移動させることによって、ピストン２２ は、中央腔２０の長さ方向に沿って可逆的に移動し得る。密閉リング３１が長手 方向 に移動するとき、それは、ピストン２２が管状本体１８の内部との良好な接触を 維持することを確実にする。中空の管状本体１８の前面端部の入口ポート２４は 、カニューレ管腔２６と中央腔２０との間に流体導通関係を提供する。 好ましくは、シリンジアセンブリ１２は、入口ポート２４を規定しているテー パー状の先端部３０を有するToomey型シリンジ（Sherwood Medical Co.，St.Lou is，Missouri)である。Toomey型シリンジは、カニューレまたは他の取付部の交 換の容易さにより好適であるが、ネジ型コネクター、カテーテル先端部またはlu erロックなどの他の型の接続機構を有するシリンジアセンブリも本発明に用いら れ得る。代表的には、シリンジアセンブリ１２の中空の管状本体１８は、ポリプ ロピレンまたは他の剛直なポリマー組成物のような安価な非反応性材料から形成 される。もちろん、当業者は、シリンジアセンブリ１２のサイズおよび流体容積 は、収集される脂肪組織の量に基づいて変化し得ることを認識する。しかし、明 らかな理由により、シリンジアセンブリ１２は、１回の収集手順で脂肪組織の所 望の量を採取するに十分な容量であることが好ましい。平均的な細胞堆積手順に 必要な量の内皮細胞を提供するために必要とされる脂肪組織の容量は、２０ml〜 ５０ml程度であるので、好適なシリンジ容量は約６０mlである。大部分の商業的 に入手可能なシリンジの側面にある目盛り３２は、収集された脂肪量をモニター する簡単な方法を提供する。 必要に応じて、シリンジアセンブリ１２には、プランジャー２８および取り付 けられたピストン２２を引かれた形態に保持するために、中空の管状本体１８の 後ろで、環状フランジ３８に可逆的に係合するプランジャーフランジ４８に取り 付けられる固定機構３４が設けられている。この構成は図２に示されている。図 １に示すように、プランジャー２８およびピストン２２が実質的に前方位置にあ るとき、中空の管状本体１８の内面は固定機構３４のショルダー３８に作用し、 それを閉鎖位置に維持する。しかし、プランジャー２８が引かれ、ショルダー３ ８がもはや制限を受けないある所定の点を通過すると、固定機構３４は、この機 構材料の弾性的な記憶により開く。開放位置にあるとき、固定機構３４のショル ダー３６は、環状フランジ３８およびプランジャーフランジ４８と係合するよう に配置され、それによって、プランジャー２８が、中空の管状本体１８に再び入 るのを防ぐ。しかし、プランジャー２８は、手動で固定機構３４を圧縮し、ショ ルダー３６の直径を、それらが環状フランジ３８との係合を解き、そして中空の 管状本体１８中に簡単にスライドするところまで減少させることによって、前方 の位置に簡単に移動させ得る。様々な固定機構が本発明に用いられ得るが、１つ の特に適切な装置は、商標名Grazer-Grams Lock(Gram Medical，Costa Mesa，Ca lifornia)で販売されている。様々なシリンジサイズに対して得られることに加 えて、これらの固定機構は、単一のショルダーの態様で入手可能である。 収集装置１０の最後の主な構成要素は、管腔２６、近位端部および遠位カニュ ーレ先端部４０を有するカニューレ１４である。異なる長さおよび直径を有する 多数の商業的に入手可能なカニューレが本発明に用いられ得、様々なシリンジア センブリと共に用いられ得る。本明細書中の教示に従って用いられる場合、特に 好適で、かつ比較的高い収率を提供するカニューレが、商標名Mercedes(Grams M edical，Costa Mesa，California)で販売されており、そして内径が約１mm〜８m mの範囲である。特に好適な内径は、１.５mm〜４mmの範囲である。一般に、再殺 菌および再利用の容易さのために、ステンレス鋼のような金属合金から形成され るが、これらのカニューレの表面は、収集された細胞成分に対する応力を減らす ために、生体適合性のポリマーでコーティングされ得る。 カニューレ１４の一般的な構成は、異なる実施形態に対して比較的一貫してお り、すなわち、一般的に少なくとも１つの管腔２６を有して細長い構成であるが 、使用し得るカニューレの他の特性は、著しく変化し得る。例えば、図１および 図２に示すような、カニューレ１４の近位端部におけるカニューレ接続部４２は 、テーパー状の先端部３０を有するシリンジと着座しそして着脱可能に係合する 。当業者は、シリンジアセンブリと同様に、選択されたシリンジアセンブリ１２ と係合するように適合されている限り、多くの型のカニューレ接続部が、本発明 の教示に従って用いられ得ることを認識する。例えば、luerコネクター、カテー テルコネクター、ネジ型コネクターおよび圧縮継ぎ手を有するカニューレが、そ れらが、選択されたシリンジアセンブリのコネクターと適合する限り、脂肪組織 の採取に用いられ得る。さらに、シリンジアセンブリに永久的に取り付けられ、 収集装置を形成しているカニューレもまた本発明の範囲内であり、そして同様の 結 果で使用され得る。 操作する医師の所望に依存して変化し得る、本発明のカニューレの別の重要な 特徴は、収集開孔部の構成および位置である。例えば、図５、図６、図７、図８ および図９はすべて、収集開孔部の異なる構成を示す。本発明によれば、収集開 孔部の形状および構成は、相対的に均質な収率を提供するために、採取のあいだ に、脂肪組織のマクロ構造および結合成分を破壊する応力を課すことが望ましい 。さらに、収集開孔部は、任意の非破壊組織によるブロックに抵抗するために十 分に大きくあるべきで、それにより、患者からのカニューレの取り出しおよび採 取手順の中断が必要である。このような考察に基づくと、収集開孔部は、１mm〜 ４mmの範囲が好適であり、より好適には、１.５mm〜３mmの範囲である。 図５の開孔部の構成は、開孔部４２に細長い組織切断縁部を示し、これが実質 的に細胞収率を増加させる。対照的に、図７および図９に示すような丸いまたは あまり急ではない開孔部縁部は、組織の結合マトリックスを十分に破壊する組織 切断縁部を提供しないようであり、その結果、試料組成はあまり均質ではなく細 胞収率は低い。組織切断開孔部構成は、採取された組織のマクロ結合構造を破壊 するが、それらは脂肪組織マトリックス内に分散される繊細な細胞成分に対して 、必ずしも、応力または剪断力を課すとは限らない。収集開孔部４２および収集 開孔部４６の丸い縁部は、これらの望ましくない剪断力を減少させるのに役立つ が、それらは実質的に均質な組織の収集を提供せず、従って全体的な細胞の収率 を低下させる。 様々な構成およびサイズの収集開孔部が、本発明の方法で用いられ得るのと同 様に、異なる開孔部配置スキームおよびカニューレ形状が用いられ得る。例えば 、収集開孔部を遠位カニューレ先端部４０に近い位置に限る必要はない。このよ うな配置では、収集領域がより正確に測定され得るので、試料の純度が高まり得 るが、先端部からさらに離れて配置される開孔部も同様に作用し得る。同様に、 カニューレ１４、および、さらに管腔２６は本質的に円筒形である必要はない。 例えば、より楕円形である他の形状が、図６に示す完全な円筒形と同じ細胞収率 を提供し得る。従って、シリンジアセンブリと同様に、広範囲のカニューレ形状 、サイズおよび構成が本発明の範囲内であり、個々のオペレーターの選択に基づ い て選択され得る。 何れの場合も、一旦、収集開孔部が選択され組み立てられると、脂肪組織およ び同定可能な細胞成分の実際の採取を開始し得る。全ての手順は無菌状態で行わ れるのが好ましい。収集装置１０は、予め組み立てられ予め滅菌され得るか、ま たは使用直前に操作領域で組み立てられ得る。代表的には、固定機構３４を有さ ないシリンジアセンブリ１２は、廃棄可能で予め滅菌されそして予めパッケージ された形態で商業的に入手可能である。逆に、カニューレ１４は、代表的には、 再利用可能であり、そしてその場で洗浄されパッケージされそして再び滅菌され る。従って、着脱可能に係合され得る使用可能な構成要素の選択に続いて、シリ ンジアセンブリ１２およびカニューレ１４は、通常、患者への挿入の直前に、収 集装置１０を形成するように係合される。シリンジアセンブリ１２がカニューレ １４に取り付けられるのとほぼ同時に、任意の固定機構３４がプランジャーフラ ンジ４８を介してプランジャー２８に取り付けられ得る。好ましくは、固定機構 ３４は、不注意な試料汚染の可能性を減少させるために、カニューレ１４と係合 する前に取り付けられる。 任意の予備ステップとして、生理食塩水または他の生体適合性の溶液が、所望 の材料を採取する前に、脂肪収集領域に注入され得る。液体のその領域への注入 が、脂肪マトリックスを破壊し、そして結合組織の癒着を減少させるようである 。この破壊を助けるために、流体を注入された組織は、強くマッサージされるか 、または他の外力を受け得る。当業者には理解されるように、採取前の注入され た生理食塩水の実際の容量、注入の領域および注入の時間は、患者の年齢および 健康状態、採取される組織の量ならびに脂肪収集領域の位置のような操作の状況 に依存する。代表的には、数ミリリットルの溶液が、採取が行われる約３０分〜 １時間前に注入される。標準的なシリンジおよび注入針がこの手順に用いられる 。それは、回収された試料の均質性を改善させるようであるが、十分な微小血管 内皮細胞収率が、流体の追加または採取前の外力の付加なしに得られ得る。 脂肪組織の採取の準備が整ったと考えられると、カニューレ１４の少なくとも 一部分が、患者の中の採取される脂肪組織の近くに挿入される。カニューレ１４ の代表的なサイズおよびその相対的に平滑な遠位先端部４０を考慮すると、通常 、 挿入用の小さな切開部が患者の皮膚に形成される。挿入に続いて、遠位カニュー レ先端部４０、より詳しくは、開孔部または複数の開孔部１６が、脂肪組織が採 取される領域まで進む。上記のように、脂肪組織は、通常、腎周組織脂肪、皮下 脂肪、網または腹膜腔に付随する脂肪から取られる。収集装置１０の軽量および 相対的に小さなサイズを考慮すると、操作する医師は、ほとんど問題なく、思い どおりにカニューレ１４を案内し、そしてそれを適切な位置に正確に配置する。 患者の体内へのカニューレ１４の挿入および配置の間に、プランジャー２８お よび移動可能のピストン２２は、中空の管状本体１８に完全に挿入されることに 留意することが重要である。つまり、移動可能なピストン２２の前面５０が、入 口ポート２４に隣接する中空の管状本体１８の前端部に対して、同一平面上に着 座する。同時に、任意の固定機構３４が、中空の管状本体１８の内面によって、 閉鎖位置に保持される。十分に前方位置にある移動可能なピストン２２によって 実質的な量の流体および他の体内の材料が、カニューレ１４およびシリンジアセ ンブリ１２に入るのを防ぐ。カニューレ１４が適切に配置され、そして医師が開 孔部１６を取り囲む脂肪組織の採取を開始する用意が整うまで、移動可能なピス トン２２はこの形態で保持される。 微小血管内皮細胞が豊富な脂肪組織の採取を開始するために、周囲圧力以下の 圧力がカニューレ１４に付与される。代表的には、プランジャー２８および取り 付けられたピストン２２が、オペレーターによって、中空の管状本体１８に沿っ てゆっくりと引かれる。所望であれば、任意の固定機構３４が、引かれた形態お よび周囲圧力以下の圧力を維持するために、環状フランジ３８に係合し得る。ピ ストン２２の前面５０および中空の管状本体１８によって規定される密封された 容量の増加により、シリンジアセンブリ１２中に周囲圧力以下の圧力が生成され る。これが、今度は、入口ポート２４を通じて、中央腔２０と緊密な流体導通関 係にあるカニューレ１４の管腔２６に吸い上げを生成する。収集先端部で均一な 高い吸い上げ力を維持していた先行技術の吸い上げポンプとは違って、本発明は 、簡単かつ即座に調節可能な穏やかな周囲圧力以下の圧力を提供する。収集装置 １０の「感じ」または採取されている脂肪組織の外観を判断して、オペレーター は、プランジャー２８が中空の管状本体１８から引かれる量を調節することによ って、 開孔部１６に付与される吸い上げを弱め得る。プランジャー１８を押すことによ って吸い上げが減少し、その一方それをさらに引くことによって（ピストン２２ の中空の管状本体１８への密封可能な配置を維持しながら）、開孔部での吸い上 げが急速に増加する。あるいは、オペレーターは、開孔部１６で安定な吸い上げ を維持するために、単に、固定機構３４に依存し得る。 簡単に制御可能な周囲圧力以下の圧力は、開孔部１６に特徴的な好適な組織切 断と組み合わさって、加工のためのより清潔なより均質な脂肪組織を提供する。 妨害する結合組織は、細胞成分の統合性を維持しながら破壊するのが好ましい。 さらに、オペレーターがカニューレ１４の位置を簡単にかつ効率的に調節し得る ので、汚染度がより高い領域を回避し得、得られる組織の純度がさらに高まり得 る。万一、開孔部１６またはカニューレ１４の妨害の問題があれば、オペレータ ーは、わずかに前へプランジャー２８を押して、カニューレおよび開孔部へ陽圧 を付与することによって、その妨害を除去し得る。最後に、プランジャーがオペ レーターの直接制御下にあるので、収集される脂肪組織の量は、より精密に制御 され得る。 所望量の均質な脂肪組織の採取および収集装置１０の圧力平衡に続いて、カニ ューレ１４が、患者の最初の挿入部位から、好適には、無菌状態を維持しながら 取り出される。先に議論したように、収集された脂肪組織の実際の量は、必要と される微小血管内皮細胞の数および収集装置１０の容積を含む多数の要因に依存 する。代表的な容量は約１０ｍｌ〜約１００ｍｌの範囲であり、平均容量は約４ ０ｍｌ〜約６０ｍｌの範囲である。もちろん、当業者は、より小さなまたはより 大きな容量が、本発明の方法を用いて、微小血管内皮細胞または他の細胞成分の 精製のために収集され得ることを認識する。カニューレ１４が患者から取り出さ れた後、通常、洗浄および再滅菌のために採取された組織を含んでいるシリンジ アセンブリ１２から外される。 この時点で、採取された組織は、さらに加工されまたは後の使用のために貯蔵 され得る。貯蔵のために、通常、組織は、それを採取ポート２４を通じ、次いで 冷却され得る別の容器に射出することによって、シリンジアセンブリ１２から取 り出される。加工のためには、収集された組織は、同様に、本明細書に参考とし て援用される、同時継続中の米国特許出願第08/086,778号に記載されているよう な微小血管細胞単離装置に移され得る。次いで、所望の同定可能な細胞成分は、 消化および他の先に議論された手順を用いて、脂肪組織から分離される。 あるいは、本発明の教示に従って、採取された脂肪組織は、リンスおよびホモ ゲナイズのために、シリンジアセンブリ１２を用いてさらに加工され得る。例え ば、水または他の水性溶液が、収集された試料を含む中央腔２０に注入され撹拌 され得る。その後、好適には、シリンジスタンド（図示せず）で混合物を沈降さ せ、そして分離する。脂肪細胞および圧倒的に多数の微小血管内皮細胞を含む付 随する組織は浮遊し、その一方結合組織、赤血球および他の異物は、沈むかまた は水性溶液に溶解する。次いで、リンスされた脂肪細胞および付随する組織は、 デカンテーションされ得る。もちろん、この工程は、必要な回数だけ繰り返され 得る。 別の手順では、採取された組織は、同時にホモゲナイズとリンスを行い得る。 図３を参照すると、採取された組織を含むシリンジアセンブリ１２は、フィルタ ーハブアセンブリ６０に着脱可能に取り付けられる。好適には、シリンジアセン ブリ１２と同じサイズの第２のシリンジアセンブリ２１２がフィルターハブアセ ンブリ６０の対向する側に着脱可能に取り付けられる。明確化のために、先にシ リンジアセンブリ１２に用いられた参照番号が、以下の議論において用いられる 。シリンジアセンブリ２１２の対応する構成要素は、同じ参照番号の頭に２を有 して用いられる。 図示される実施形態において、シリンジアセンブリ１２および２１２は、それ らのそれぞれの前端部に配置されるテーパー状の先端部３０および２３０を有す るToomey型のシリンジである。しかし、先に議論したように、多くの型のコネク ターが、本発明の教示に従って用いられ得る。従って、フィルターハブアセンブ リ６０と着脱可能に係合すれば、任意のタイプの先端部も用いられ得る。 フィルターハブアセンブリ６０は、着脱可能に係合され得る雄ネジ６６および 雌ネジ６８を用いて係合され得る雄ハブ６２および雌ハブ６４を備える。そのよ うに係合されると、雄ハブ６２および雌ハブ６４は、協動して通路７０を規定す る。通路７０は、テーパー状の先端部３０とテーパー状の先端部２３０と着脱可 能に係合するようにされた対向する面に開口部を有するフィルターハブアセンブ リ６０を横切り、それによってシリンジアセンブリ１２およびシリンジアセンブ リ２１２が、互いに密封された流体導通関係で配置される。図４により明確に示 されるように、フィルター部材７４は、フィルターが、係合している雄ハブ６２ と雌ハブ６４によって課された圧縮力によって定位置に置かれるので、それを横 切っている通路７０の軸上に配置される。通路７０を横切ることによって、フィ ルター７４が、それを通じる組織または流体のいかなる流れも阻止する。フィル ター部材７４に隣接する弾性グロメット７２により、確実に、ハブアセンブリ６ ０が密閉して係合される。 フィルター部材７４は、矢印線７８が示す中央部分を有する平らな半径方向に 円盤状である構造である。中央部分７８に位置する多数のフィルター開孔部８０ は、フィルター７４の厚さを横切り、それによって材料の通過を可能とする。例 示の実施形態は、約１ｍｍの直径を有するフィルター開孔部８０を有する、外径 が２４ｍｍのフィルター部材７４を用いる。図４は、また、フィルター部材７４ を囲んでいる雌ハブ６４を示す。もちろん、当業者は、所望のホモゲナイズの量 に依存して、他の開孔部直径が用いられ得ることを認識する。 代表的には、フィルター部材７４は、ステンレス鋼のような、耐久性の再滅菌 可能な金属合金から形成される。しかし、先に議論したように、脂肪組織を加工 するための金属構成要素の使用は、金属合金が本質的に高い表面エネルギーを有 するので、生存微小血管内皮細胞の収率にとって不都合であり得る。従って、も し、フィルター７４が、表面エネルギーの低い材料から形成されるか、または、 金属が用いられる場合、パリレンなどの材料でコーティングされるのが好ましい 。低い表面エネルギーは、つまり、その材料は、金属に比べて電気化学的エネル ギーが低いということを意味する。本発明を実施するために用いられ得る低い表 面エネルギーおよび良好な生体適合性を有する材料の例は、ポリエチレン、パリ レン、ポリプロピレン、ナイロンおよび他のフルオロポリマーを含むが、これに 限らない。 選択された開孔部１６のサイズおよび形態は、脂肪組織の相対的に均質な試料 を生成するが、脂肪マトリックスの結合組織を破壊するためのさらなるホモゲナ イズが、もし穏やかに行われれば、細胞収率を改善し得る。上で示したように、 収集された脂肪材料は、採取に続いて、シリンジアセンブリ１２に保持される。 この材料は、その天然の採取された状態であり得るかまたは上記のようにリンス され得る。必要に応じて、液体が、収集された材料に添加され得る。通路７０を 横切って配置されるフィルター部材７４を有するフィルターハブアセンブリ６０ が、テーパー状の先端部３０に着脱可能の係合される。シリンジアセンブリ２１ ２は、同様に、シリンジアセンブリ１２の対向する側のフィルターハブアセンブ リ６０に取り付けられる。このように接続されると、シリンジアセンブリ１２は 、通路７０を通じてシリンジアセンブリ２１２と密封された流体導通関係にある 。 次いで、プランジャー２８は、採取された脂肪組織およびテーパー状の先端部 ３０によって規定される採取ポート２４から添加された任意の液体を放出するた めに、中空の管状本体１８中に前方向に押される。次いで、射出された材料は、 フィルター部材７４のフィルター開孔部８０を通過する通路７０を横切り、その 後シリンジアセンブリ２１２によって受け入れられる。脂肪組織が、適切なサイ ズのフィルター開孔部８０を押し通されるので、結合マトリックスは、付随する 同定可能な細胞成分を過度の剪断力に曝すことなく破壊される。これが、今度は 、収集された材料の粘性を低下させ、異物を簡単に除去させ、および試料のその 後の消化が改善し、そして内皮細胞の最終的な収率を増大させる。濾過され採取 された脂肪組織が、テーパー状の先端部２３０を通ってシリンジアセンブリ２１ ２に入るにつれ、陽圧の転置によりプランジャー２２８が中空管２１８の後方に 押しやる。もちろん、シリンジアセンブリ２１２からシリンジアセンブリ１２へ 組織を移動させるためにこの操作を逆にすることによって、この手順が繰り返さ れ得る。 本発明の方法によって提供される微小血管内皮細胞の改善された収率が、以下 の制限されない実施例で説明される。 実施例１ ヒト脂肪組織を白人女性の腿部から収集した。様々なサイズおよび形態の開孔 部を有する４つの異なる商業的に入手可能なカニューレを用いて、実験の約３０ 〜６０分に行う採取手順で腿から脂肪を引き抜いた。次いで、各型のカニューレ によって収集された試料を別々に加工した。 各場合において、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水で簡単に脂肪組織をリ ンスした。次いで、採取された材料の試料の１つを、１ｍｍのフィルター開孔部 を間に挟んだフィルター部材を有する２つのシリンジの間に組織を走行させるこ とによってホモゲナイズした。次いで、１０グラムの各脂肪試料および１０ｍｌ のコラゲナーゼ溶液(４ｍｇ／ｍｌ、Boehringer Mannheim)を５０ｍｌのErlenme yerフラスコ中で組み合わせ、そして撹拌器に置き毎分１００サイクルで２０分 間３７℃でインキュベートした。 次いで、得られた消化スラリーを１５ｍｌの円錐形の遠心分離管に注ぎ、そし て１８００ｒｐｍで７分間遠心分離した。 内皮細胞および赤血球が、円錐形の遠心分離管の底に沈殿した。暗色のコラゲ ナーゼ溶液が中間層を形成し、そして不溶性の脂肪および付随する脂肪組織が遠 心分離管の上部にプラグを形成した。暗色のコラゲナーゼ溶液と脂肪の両方を廃 棄した。 ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水中の１０ｍｌの０.１％ウシ血清アルブ ミンを用いて、内皮細胞ペレットを再懸濁し、新たな滅菌した円錐形の遠心分離 管にプールし、そして１８００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を廃棄し、そ して内皮細胞ペレットを、ヒト血液血清で芝付け(Sodding)するためにＦＤＡ認 清で再懸濁した。 各場合においてこの溶液の最終容量は約９ｍｌであった。得られた内皮細胞懸 ｌに希釈した。各懸濁液の細胞収率および細胞のサイズをCoulter Multisizer I Iを用いて測定した。細胞収率を脂肪単位グラム当たりに回収された（７.７８μ ｍより大きい）細胞の数と定義した。この時点で細胞の生存率を詳細に調べなか ったが、細胞の収率を設計の適切性の指標として用いた。ウエルプレート上の単 離された細胞の粘着性を調べると、場合に応じてかなり良好な結果が得られた。 異なるシリンジおよびカニューレの形態の結果を以下の表１に示す。 これらのデータは、明らかに、本発明の方法の使用による、同定可能な細胞収 率の改善を示している。特に、この結果は、適切な開孔部サイズおよび形態の選 択が、所与の脂肪組織供給源からの微小血管内皮細胞の収率を増加させ得ること を示している。例えば、直径が３ｍｍのかなり丸い開孔部を有するCurret Speci alの使用は、直径３ｍｍの、輪郭をはっきり付けた組織切断縁部を備えた開孔部 を有するMercedesを用いて得られた生存細胞成分の約半分しか生産しなかった。 さらに、カニューレ直径単独が、細胞収率を増大させる決定的な基準ではないこ とに留意することが重要である。これは、３.７ｍｍのMercedesまたは３ｍｍのC urret Specialのいずれの使用も、組織破壊能力がより良い開孔部を有する１.５ ｍｍのLuerロックカニューレによって提供される生存細胞の約７０％しか提供し なかった事実によって示される。最後に、このデータは、本発明の教示に従って 採取された脂肪組織をホモゲナイズすることによって、微小内皮細胞収率が実質 的に増大させ得ることを示す。例えば、試料を同一の３.７ｍｍのMercedesカニ ューレを用いて収集し、１ｍｍのフィルター開孔部を有するフィルター部材を通 じて試料を４回通過させることにより脂肪組織をホモゲナイズする場合、生存細 胞の収率が４０％以上増大した。このような細胞収率の増大は、成功した内皮細 胞形成と、生命を脅かす血餅の形成に到達し得る合成移植片の不完全なコーティ ングとの相違であることが容易に証明される。 当業者は、本発明がその精神または中心思想から逸脱することなく、他の特定 の形態で具体化され得ることをさらに認識する。本発明の上記の説明が、単にそ の例示の実施形態を開示しているという点で、他の改変例が、本発明の範囲内に あると認識されることを理解すべきである。従って、本発明は、本明細書に詳細 に記載された特定の実施形態に制限されない。むしろ、本発明の範囲および内容 を限定する添付の請求項を参照すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーターソン， ロバート シー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92679, ドーブ キャニオン， モーニングスタ ー 13

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脂肪組織中の生存内皮細胞の増加した集団を保存するように脂肪組織を収 集する方法であって、該方法は以下の工程を包含する： 組織を貫通する遠位先端部および対向する近位端部を有する細長い管状カニュ ーレ、該カニューレ中に伸びる管腔、および該遠位先端部に隣接する、該カニュ ーレ上の該管腔から外側に向かって広がる開孔部を有する細長い管状のカニュー レを提供する工程であって、該開孔部が該カニューレの長さに沿った方向に細長 く、そして該開孔部の対向する遠位端部および近位端部並びに該開孔部の対向す る側縁部のそれぞれが組織切断縁部表面を有し； 該カニューレを、該開孔部が脂肪組織に通じるように患者に部分的に挿入する 工程； 該管腔に周囲圧力以下の選択的に制御されたレベルの圧力を付与する工程； 該周囲圧力以下の圧力を用いて該開孔部を通じて該管腔に該脂肪組織の一部分 を引く工程； 該カニューレの動きを用いて該縁部表面で切断することにより該患者から該脂 肪組織の一部分を取り出す工程；および 該周囲圧力以下の圧力を用いて該管腔から収集チャンバー中に該脂肪組織の一 部分を取り出す工程。 ２．シリンジを用いて、前記管腔に前記周囲圧力以下の選択的に制御されたレ ベルの圧力を手動で付与し、そして前記収集チャンバーを規定する工程をさらに 包含する、請求項１に記載の方法。 ３．前記脂肪組織の一部分を、前記シリンジからそしてフィルター部材を通じ て放出する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。 ４．前記フィルター部材を構成し、複数のフィルター開孔部を規定する工程を さらに包含する、請求項３に記載の方法。 ５．前記複数のフィルター開孔部のそれぞれを実質的に1.0mmのサイズで提供 する工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。 ６．前記脂肪組織の一部分を前記フィルター部材から第２のシリンジに受け入 れる工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。 ７．前記カニューレの前記遠位先端部に隣接し、そしてその回りに周辺方向に 間隔をおいて配置される、複数の実質的に類似する開孔部を提供する工程をさら に包含する、請求項１に記載の方法。 ８．前記カニューレを、前記遠位先端部に隣接する３つの実質的に類似の開孔 部を有して構成する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。 ９．前記開孔部を、その幅の約３倍の長さに細長いように構成する工程をさら に包含する、請求項１に記載の方法。 １０．脂肪組織中の結合組織のマトリックスから生存内皮細胞の増加した集団 を遊離させるように脂肪組織を迅速および容易にホモゲナイズする方法であって 、該方法は以下の工程を包含する： 微小血管内皮細胞を含み、そして結合組織マトリックスを有する脂肪組織の試 料を提供し、該脂肪組織を可変容量の収集容器に配置し、該収集容器に開口部を 規定する入口ポートを提供する工程； 複数のフィルター開孔部を規定するフィルター部材を該入口ポートに隣接して 配置しそして実質的に該入口ポートの該開口部を横に切開し、該フィルター開孔 部のそれぞれに少なくとも１つの組織切断縁部表面を提供する工程；および 該収集容器内の脂肪組織の該試料に圧力を付与し、該入口ポートの該開口部、 および該少なくとも１つの組織切断縁部表面を利用して該内皮細胞を遊離させる ように結合組織マトリックスを破壊する該複数のフィルター開孔部を通じて該組 織を放出する工程。 １１．前記フィルター部材から可変容量の受け入れ容器中に前記脂肪組織の一 部分を受け入れる工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。 １２．シリンジアセンブリを用いて前記圧力を前記脂肪組織に付与しそして前 記収集容器および前記受け入れ容器を規定する工程をさらに包含する、請求項１ １に記載の方法。 １３．前記フィルター開孔部のそれぞれを、実質的に約0.2mmと約３mmとの間 のサイズで提供する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。 １４．前記複数の開孔部のそれぞれを、実質的に1.0mmのサイズで提供する工 程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。 １５．脂肪組織中の生存内皮細胞の増加した集団を保存するように脂肪組織を 収集する方法であって、該方法は以下の工程を包含する： 結合組織マトリックスを有しそして微小血管内皮細胞を含む所定濃度の脂肪組 織の位置を患者の体内で定める工程； 細長い管状のカニューレを該濃度の脂肪組織に向ける工程であって、該カニュ ーレは遠位貫通先端部および対向する近位端部、該カニューレ中を伸びる管腔、 および該遠位先端部に隣接する該カニューレ上を該管腔から外側に広がる開孔部 を有し、該開孔部が該カニューレの長さに沿った方向に細長く、そして該開孔部 の対向する遠位端部および近位端部、および該開孔部の対向する側面縁部のそれ ぞれが組織切断縁部表面を有し、該カニューレの近位端部で該管腔を可変容量容 器と液体導通関係で配置する工程； 該濃度の脂肪組織の一部分を、選択的に制御された周囲圧力以下の圧力を付与 することにより、該開孔部を通じそして該管腔中に吸引する工程； 該脂肪組織の該一部分を、該開孔部の該切断縁部表面が該結合組織マトリック スを破壊するように該カニューレを相対的に移動することにより、患者の体との 結合から分離する工程；および 該脂肪組織の該分離された一部分を、該管腔を通じてそして該可変容量容器中 に、該付与された周囲圧力以下の圧力を用いて吸い上げる工程。 １６．シリンジを用いて手動で前記選択的に制御されたレベルの周囲圧力以下 の圧力を前記管腔に付与し、そして前記可変容量チャンバーを規定する工程をさ らに包含する、請求項１５に記載の方法。 １７．前記吸い上げられた脂肪組織を、前記シリンジからそして複数のフィル ター開孔部を規定するフィルター部材を通じて放出する工程をさらに包含する、 請求項１６に記載の方法。 １８．前記フィルター開孔部のそれぞれを、実質的に約0.2mmと約３mmとの間 のサイズで提供する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。 １９．前記カニューレの前記遠位先端部に隣接し、そしてそのまわりに周辺方 向に間隔をおいて配置される複数の実質的に類似の開孔部を提供する工程をさら に包含する、請求項１５に記載の方法。 ２０．前記遠位先端部に隣接する３つの実質的に類似の開孔部で前記カニュー レを構成する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。