JP2010530295A - 圧力で向上させた、分子の抽出および分配 - Google Patents
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Abstract
Description
・界面活性剤または洗剤を使用しない、または使用量の少ない抽出法
・液体クロマトグラフィ、電気泳動、質量分析など、後続の分析法にそのまま使用できる
・疎水性タンパク質の回収量が多い(および/または回収物が高品質である)
・脂質含量の高い試料、例えば、脂肪または脳組織、あるいは、生体膜内に濃縮された試料から、疎水性分子をより完全に抽出する
・2種類以上の分子実体(例えば、タンパク質、脂質、核酸、および小分子代謝産物;農薬および乱用薬物、医薬品;ナノ粒子配合物;食品成分など)を1回の工程で抽出
・試料の取り扱いおよび分画に便利な形
・従来の方法では抽出不可能な試料から分析物を抽出できる、もう一つの分画技術
・従来の方法では試料から特定の分析物が抽出されていないかどうかを確認できる、もう一つの分画技術
・フッ素化アルコール類、および/または、他の両親媒性溶媒、あるいはこれらを組み合わせたもので、脂質抽出物と極性抽出物とを2つの別々の画分として生成する、1つの抽出試薬ができる
・圧力循環により、組織の均質化と、画分の明瞭な分離が促進される
・この方法により、ミセル生成を制御し易くし、また、所望の特性を備えたコロイド、ナノ粒子、エマルションを作り出し、あるいは所望の特性を持つものに変えることができる。
静水圧(例えば、圧力循環)を用いることにより、混合物(例えば、共沸混合物、溶液、懸濁液、または多相混合物)中の溶媒の相互溶解性または混和性を変えることができる;ミセル、エマルション、ゲル、またはコロイド中の分子の配置を制御することができる;および/または、多相混合物の1つ以上の成分の、他の成分または溶媒への溶解を制御することができる。圧力を変えることで、成分の相互溶解性が変わり、系を減圧すると混合物が複数の相に分かれ、物理化学的性質に基づいて分子を個々の相に分けることができる。
例えば、本件に記載の溶媒と組み合わせ、および/または、圧力変化と組み合わせ、処理(機械的処理など)を使用して、混合物(例えば、共沸混合物、溶液、懸濁液、または多相混合物)中の試料成分および/または溶媒の溶解性または混和性を変えることができる;ミセル、エマルション、ゲル、またはコロイド中の分子の配置を制御することができる;および/または、多相混合物の1つ以上の成分の、他の成分または溶媒への溶解を制御することができる。機械的処理の後、系の成分を複数の相に分け、物理化学的性質に基づいて分子を個々の相に分配することができる。
抽出法を行う温度もプロセスに影響する。温度は、試料(例えば、生体膜)の無秩序性を増し、着目する分子実体(例えば、成分)の抽出を促進することができる。
本件に提示の抽出法の液相には、様々な液体が使用できる。例えば、溶媒、洗剤、緩衝液、カオトロピック剤(例えば、カオトロピック塩)、およびこれらの混合物が使用可能である。
本件に記載の抽出法では、様々な溶媒が使用できる。例えば、溶媒は、水性溶媒、有機溶媒、または脂質とすることができる。溶媒系は、多相混合物(例えば、非混和性試薬の)とすることができ、例えば、この系は、二相性または三相性であっても良い。
本件に記載の抽出法と共に、様々な緩衝剤を用いることができる。例えば、本方法の溶媒相にPBSを用いることができる。様々な緩衝剤を用いて、抽出溶媒を所望のpHに保ち、また、特定の溶媒中における所望成分の溶解性や、後続の分析法との適合性を保つことができる。このような緩衝剤の例としては、HEPES、TRIS、MES、重炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸、トリフルオロ酢酸、酢酸などが挙げられる。
洗剤またはカオトロピック剤(例えば、カオトロピック塩)を溶媒相に加えて、着目分子実体(例えば、成分)の抽出を助けることができる。いくつかの実施の形態において、使用する洗剤またはカオトロピック剤の量を、本件に記載の溶媒を使用しない方法や、機械的震盪(例えば、本件に記載の溶媒を用いずに)による方法などの、公知の分配法で用いられる量より少なくすることができる。いくつかの実施の形態において、本件に記載の方法で洗剤を用いても、抽出の際に泡が生じない。
本件に記載の液相には、必要に応じて更に試薬を加えて良い。例えば、酵素阻害薬、例えば、プロテアーゼ阻害薬(例えば、セリン、システイン、およびアスパラギン酸プロテアーゼ類、およびアミノペプチダーゼ類の阻害薬)(例えば、4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSF)、ペプスタチンA、E−64、ベスタチン、ロイペプチン(leupeptin)、およびアプロチニン)、DNAse阻害薬(例えば、アウリントリカルボン酸)、RNAse阻害薬(例えば、ジエチルピロカルボナート(DEPC)、セシウムトリフルオロ酢酸(CsTFA)、組み換え胎盤RNAse阻害薬、SUPERASE・IN(商標)、ANTI−RNAseまたはRNASECURE(商標)(Ambion製)、SCRIPTGUARD(商標)(Epicentre Biotechnologies製)、DEPC)、金属キレート剤(例えば、DTPA、EDTA、EGTA、NTA、デスフェラール)などの1つ以上を、例えば、着目成分、例えば、抽出される成分を安定化させるため、液相に加えることができる。
高濃度の塩は、特定のタンパク質の沈殿の程度に影響を与えることができる。例えば、高塩濃度は、タンパク質の沈殿を妨げ、または促進することができる。一般に、内在する試料由来の塩は、沈殿に十分な影響を与えるには不足している。多くの例で、外から塩を加えて全タンパク質沈殿を改善することができる。更に、最適塩濃度を用いて、所望のタンパク質を選択的に沈殿させ、不要なタンパク質を上澄み中に留めておくことができる。またその逆も可能である。例えば、このような方法を用いて、非常に豊富なタンパク質種から成る複合試料(例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン類など)を精製し、存在量の少ない生物学的に重要なタンパク質を濃縮することができる。
本件に記載の抽出法の一部の実施の形態において、本件に記載の抽出法(例えば、圧力サイクルおよび/または処理(機械的処理など)を含む方法)を行う混合物中に、2次容器(例えば、カプセル、アンプル)が存在していても良い。2次容器の中身としては、2次容器からその中身を放出(例えば、破裂)させるに足りる、ある程度の圧力または処理(機械的処理など)を加えると主容器に導入される、試薬または複数の試薬類を入れることができる。いくつかの実施の形態において、2次容器を、凍らせた成分(例えば、水)から作っても良い。例えば、このような実施の形態では、圧力または処理(機械的処理など)によって2次容器が溶け、例えば、その中身が放出される。凍らせた2次容器は、不活性で、活性成分を加えるために用いられるものでも、あるいは凍らせた2次容器自体が活性成分であっても良い(例えば、圧力によって活性成分である容器が溶け、またはこれによって容器の中身が放出される)。
本件に記載の抽出の方法は、単独で、あるいは、着目成分を単離するための1つ以上の追加のステップ/方法と組み合わせて行うことができる。1つまたは複数の追加ステップは、本件に記載の抽出法の前または後に行うことができる。本件に記載の抽出法と共に、例えば、遠心分離(例えば、勾配遠心分離または超遠心分離)(例えば、本件に記載の抽出法が行われているのと同じ容器中での遠心分離)、沈殿(例えば、1つ以上の試料成分の沈殿)、免疫沈降(例えば、汚染物質を除くため)、易透化(例えば、洗剤を用いた、例えば、細胞の)、低張緩衝条件を用いた、原形質膜またはオルガネラを囲むその他の膜の破壊、特定の組織、細胞または生物の種類、膜画分などの濃縮;試料成分の、細胞または組織中におけるその局在性に従った、あるいは、その物理化学的性質(例えば、静電電荷、疎水性、特定の溶媒での溶解性、分子配座、結合親和力など)に従った分画を行って、着目成分の単離または精製を改善することができる。
着目成分が、試料中の1つまたは複数の他の成分と異なる物理化学的性質(例えば、静電電荷、あるいは溶媒または溶媒系での溶解性)を持っているならば、本件に記載の抽出法を用いて、少なくとも2つの成分を含む試料から着目成分を抽出することができる。
本件に記載の方法で抽出可能な成分(例えば、分子実体)の例としては、タンパク質(例えば、膜結合タンパク質、膜貫通タンパク質、I型またはII型膜タンパク質、受容体、酵素、リポタンパク質、糖タンパク質)、多糖(例えば、ヘパリンまたはヘパリン由来多糖、澱粉、イヌリンなど)、プロテオグリカン(例えば、コラーゲン、キチン、ムレインなど)、ポリフェノール(例えば、タンニン、フェニルプロパノイド(例えば、リグニン、フラボノイド))、ビタミン、毒素、汚染物質、脂質(例えば、リン脂質類(例えば、ホスファチジルコリン(PtdCho)、ホスファチジルエタノールアミン(PtdEtn)、ホスファチジルイノシトール(PtdIns)、ホスファチジルセリン(PtdSer))、糖脂質類、ステロイド類(例えば、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン、テストステロン、エクジステロンなどのエクジステロイド類、グルココルチコイド類やミネラルコルチコイド類などのコルチコステロイド類、タンパク同化ステロイド類、コレステロール、植物ステロール類、ブラシノステロイド類、エルゴステロール類)、膜(細胞膜、オルガネラ膜、脂質二重層)、核酸(DNA(核DNA、ミトコンドリアDNA)、RNA(mRNA、tRNA、rRNA、mtRNA、ミクロRNA))、ウイルス(例えば、HIV、HPV、肝炎ウイルス(A、B、C、D、E、F、またはG型)、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、黄熱病など)、細菌(例えば、グラム陽性またはグラム陰性菌、相利共生菌、病原菌)、細菌細胞中、あるいは他の微生物または他の細胞型の細胞中に存在する成分(例えば、細菌、酵母、または哺乳類細胞によって組み換え生産されたタンパク質)、封入体、細菌DNA、またはRNA中に含まれる組み換えタンパク質、抗原(例えば、細菌、真菌、または哺乳類細胞からの、あるいはウイルスからの)、ウイルス(例えば、ワクチン生産のための)、小分子などの薬学試剤、代謝産物(例えば、小分子代謝産物)、農薬(例えば、殺菌剤、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤(例えば、殺卵剤、幼虫駆除剤、または成虫駆除剤)、殺ダニ剤、軟体動物駆除剤、殺線虫剤、殺鼠剤、殺ウイルス剤)、薬物(例えば、医薬)、薬物代謝産物、染料、食品成分、ナノ粒子配合物、脂質ラフト、アミロイド斑、微小管、細胞質ゾル、油類、テルペン類、および他の親油性化合物(例えば、植物材料からの)、植物(例えば、薬用植物)からの様々な化合物(例えば、アルカロイド類、フラボノイド類、イソフラボン類、プロアントシアニジン類、アントシアニン類)、食品香料成分(例えば、カプサイシン)(例えば、食品からの)、脂溶性ビタミン類(例えば、トコフェロール類、カロテノイド類、リコピンなど)(例えば、植物油または動物性脂肪からの)、局所製剤成分(例えば、皮膚および下層組織からの)、特定の細胞型、ポリマ、エラストマ、潤滑剤、顔料、可塑剤などが挙げられる。例えば、脂質に富む脂肪組織からの膜タンパク質の抽出、あるいは、肝ミクロソーム画分からのシトクロムP450などの酵素の抽出は、非常に簡単となり、所望のタンパク質が高収量で得られる。
抽出した成分は、当該技術で公知の様々な方法で分析可能である。例えば、本件に記載の方法を用いて精製した着目成分(例えば、着目成分を含む相)は、後続プロセス(例えば、分析法)で使用可能(例えば、洗剤を用いては行えないプロセスに適合する)であり、および/または、このようなプロセスにそのまま使用できる。
本件に記載の抽出法は、多くのデバイス中で行うことができ、特定のデバイスの使用に限定されない。例えば、試料(混合物)の液液分配ができる、または促進するデバイスが使用可能である。図2に、溶媒を用いて試料成分を溶解および分配するための、使い捨て試料容器の例を示す。2つのコンパートメントは穴開きディスク(溶解ディスク)で仕切られている。このディスクは、液相境界の予想位置の近くに置くことができる。溶媒境界がこれを横切るとき、ディスクによって乱流が生じ、溶媒と試料材料とが、また複数の溶媒が互いに良く混ぜ合わされる。これにより、圧力循環の際の2つの液体の混合が促進される。循環の際の加圧による物質移動によって、液体界面がディスクを通過する。静水圧は、溶媒の相互溶解性を変える。交互に変化する静水圧(例えば、圧力循環)をかけて溶媒を混合すると、試料の微粒子物質を更に溶解させることができる。図3に示すように、圧力循環を介した液液分配は、次のように行われる。
1.非混和性溶媒aおよびbを、複数の成分を含む固体試料と共に、試料容器に加える。
2.静水圧P2で、液体と固体試料とを圧縮する。溶媒境界が穴開きディスクを通過するにつれ、溶媒の急激な混合が起こる。
3.静水圧下に置くことで溶媒の相互溶解性を変え、溶媒aとbの組み合わせた性質を持つ、第3の準安定溶媒cを生成させる。この段階で試料を溶解させることができる。
4.系を低い圧力P3に減圧して混合物を膨張させ、溶媒aとbを分け、その分配係数(logP)または分布係数(logD)(部分的に解離した溶質について)に従って、溶媒aとbの間で溶質を分配させる。
5.系を、元の平衡状態(圧力P1)に戻す。この段階からサイクルを繰り返し、溶解および分配プロセスを続ける。
[植物組織からの脂質、タンパク質、および小分子の抽出]
植物組織から分子実体を抽出した。2つの溶媒を含む溶媒系に植物組織を入れた。溶媒Aは、50%含水アセトニトリルおよび0.1%ギ酸であり、溶媒Bは、クロロホルムであった。2つの溶媒は2相に分離していた。混合物をフレキシブルコンテナ中に密閉した。混合物に、10秒間で20サイクル、圧力循環をかけて処理した。圧力循環は、大気圧(海面位で101.3kPa)から240MPaであった。循環を終えると、溶媒は2つの個々の相に分かれ、植物組織からの分子実体は2つの溶媒間で分配した。親水性成分の大部分は、主に水とギ酸と50%(w/w)以下のアセトニトリルから成る、上部溶媒画分中に残っていた。主にクロロホルムと残りのアセトニトリルから成る下部画分は、疎水性分子実体を含んでいた。いずれの画分も、それぞれの化合物の検出および定量に適した分析法にかけることができる。
[脂肪組織からの脂質およびタンパク質の抽出]
脂肪組織からの脂質およびタンパク質の抽出は、100mgの組織試料を、純粋な、1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)に加えて行った。HFIPは両親媒性溶媒であり、水と、試料中に存在する脂質との、安定な均一の混合物を生成する。圧力循環によって試料を抽出した後、生成した溶液は非混和性となり、大気圧に戻すと個別の相に分かれた。高い圧力は、生成する相の部分的な混和性を保ち、それらの間での試料成分の分配を高めるが、圧力の低下は、相分離を促す重要な要素として働く。続いて、脂質画分を除き(例えば、ピペットで)、次にHFIP/水画分をそのままHPLCで分析し、または蒸発させてタンパク質と核酸を濃縮する。あるいは、過剰の水、水性緩衝液、あるいは塩および/または他の試薬の水溶液を加えて、有機溶媒からタンパク質を析出させる。タンパク質画分をHPLC用の一般的な試薬または緩衝液(洗剤を用いたもの、例えば、9M尿素/4%CHAPS、あるいは、例えば、2%SDS)中で再構成し、最適なゲル分離法(例えば、一次元または二次元ゲル電気泳動)に適したものとする。
[脂肪組織からのタンパク質抽出法の比較]
圧力循環によって脂肪組織からタンパク質を抽出するため、図2に示すデバイスを用いた。次の3つの抽出試薬を比較した。
1.Tris緩衝生理食塩水(TBS)、洗剤なし
2.9M尿素+4%CHAPS
3.HFIP(両親媒性フッ素化アルコール)
[ブタ脂肪組織からの、脂質、タンパク質、小分子の抽出]
いくつかの溶媒を用いて、圧力循環媒介抽出の比較を行った。比較した溶媒は、HFIP+0.1%TFA、Tris緩衝液+0.9%NaCl、および2%SDS水溶液であった。それぞれの溶媒1.4mlに入れた100mgの組織を用いた。それぞれの試料を同じ圧力循環条件(各サイクルの間、240MPaで20秒間と、大気圧で20秒間とを、30サイクル)にかけた。3つの溶媒による1回目の抽出の後、得られた親水性相を、SDS−PAGEと、クマシーブルー染色で分析した。それぞれの試料は2連で行った。2%SDS水溶液(データは提示せず)に比べ、HFIP+0.1%TFA溶媒では約2倍のタンパク質が抽出された。Tris緩衝液+0.9%NaClによるタンパク質の抽出量が最も少なかった。
[脂肪組織からのタンパク質の抽出:HFIPと洗剤との比較]
HFIPと、9M尿素/4%CHAPS試薬との効果を比較するため、実験を行い、圧力循環(各サイクルの間、240MPaで20秒間と、大気圧で20秒間とを、30サイクル)を用いて、マウス脂肪組織からタンパク質を抽出した。HFIPで、尿素/CHAPS試薬を用いたものの2から3倍のタンパク質が抽出された。結果を表1に示す。
[ラット脳タンパク質の抽出:二元および三元の溶媒の組み合わせ]
ラットの脳からタンパク質を抽出する実験を行った。脳組織は相分離を起こすのに十分な内在性脂質を含んでいない。内在性脂質の不足を“補償”して相分離を促すため、二次的な疎水性溶媒を加えた。
[圧力循環による無洗剤タンパク質抽出と、高分解能タンデム型質量分析とを使用する、脂肪組織のプロテオーム分析]
脂肪組織のプロテオーム分析は、2型糖尿病、肥満、癌、その他ヒトの病気の多くの研究にとって非常に重要である。しかし、高脂質含量の組織に従来のタンパク質可溶化法を行うと、特に、ミトコンドリア、ER、原形質膜、および脂質液滴からの重要な疎水性タンパク質に関して、ばらつきの大きな結果を生じる。大量の試料由来脂質が洗剤をミセル中に閉じ込めて、タンパク質の抽出を妨げる。
本研究の目的は、脂肪組織からの信頼性と再現性のあるタンパク質抽出法を開発し、将来のマウス疾患モデルのプロテオーム研究を可能にすることであった。野生型(WT)の肥満した(ObOb+/+)動物からの白色脂肪組織試料(腹部脂肪体)を使用した。何匹かの動物からそれぞれ、ほぼ等量(100±15mg)の脂肪組織を採取した。試料をそれぞれ特製の1.4mlの使い捨て容器(図2)に入れ、BAROCYCLER(登録商標)NEP−3229(マサチューセッツ州ウエストブリッジウォータ、Pressure BioSciences, Inc.製)で発生させた交互静水圧、20サイクルを室温でかけて、均質化と分画とを同時に行った。各サイクルは、35,000psiで20秒間と、次に、大気圧で20秒間とから成る。プロテアーゼ阻害薬カクテル(ミズーリ州セントルイス、Sigma-Aldrich製)を、各容器中の抽出試薬に加えた。圧力循環処理の後、試料管をBAROCYCLER(登録商標)から取り出し、短時間遠心し、液相を完全に分離させた。別記のない限り、ゲル担持ピペットチップを用いてそれぞれの管から上部液体層を取り、後の脂質画分の分析のため保存した。それぞれの極性画分をSpeedVac遠心濃縮器(ThermoFisher Scientific製)中で脱溶媒和して約5〜10μlとし、2×Laemmli SDS−PAGE緩衝液(4%SDS)、または2D試料緩衝液(9M尿素、4%CHAPS)のいずれかで再構成して、所望とする後続の分析法に適合させた。
交互静水圧を用いて、1つの使い捨て容器中で、試料の均質化と、試料化合物の非混和性液相間での分配の促進とを同時に行った。抽出は、0.2mlの鉱油を加えた1.2mlのHFIP中で行った。生成した抽出物は、そのままLC−MS/MS法やタンパク質の電気泳動分離に使用できた。
SDS−PAGEは、4〜12%のポリアクリルアミド勾配ゲル上で行った。固定化したpH勾配ストリップ(pH3〜10)を試料で6時間水和した後、1万Vで10万V・時間、等電点電気泳動(IEF)を行った。全ての成形済電気泳動供給品およびCriterion垂直ゲル電気泳動装置は、カリフォルニア州ハーキュリーズ、Bio-Rad Laboratories製でありIsoelectrIQ2一体化IEF装置は、マサチューセッツ州ウォバーン、Proteome Systems製であった。ゲルを、コロイド状クマシーブリリアントブルー(Proteome Systems製)またはSYPRO(登録商標)ルビー(Bio-Rad Laboratories製)で染め、スキャンし、PDQuestソフトウェアで解析して、統計的有意差を持つ抽出のタンパク質を求めた。選択したゲルスポットまたはバンドを切り取り、通常のゲル内消化プロトコルを用いて処理した。消化のため、シークエンシンググレードの変性ブタトリプシン(Promega製)を用いた。
タンパク質消化物(5〜10μl)を、C18固相抽出捕集カラム(内径300mm×5mm、カリフォルニア州、Dionex製)、および内径75mm×15cmのナノLC逆相自己充填フューズドシリカカラム(固定相:Magic C18AQ、3μm、100オングストローム(マサチューセッツ州、Michrom Bioresources製);カラム:PicoFrit、内径15mm、10ポートのValco弁を通してチップを引く)上に注入した。0.1%FA中アセトニトリルの直線勾配を用いてペプチド分離を行い、ナノエレクトロスプレにより、溶離液をLTQ FTICR質量分析計(Thermo Fisher Scientific製)に導入した。データ解析は、SEQUESTアルゴリズムおよびGPMDBソフトウェアを用い、SORCERER(商標)(Sage-N製)サーチエンジン上で行った。結合させた“forward”および“reverse”FASTA DBに対して検索を行った。推定誤検出タンパク質同定率(estimated false positive protein identification rate:FPPrR)を≦1%に調整して、タンパク質同定データの信頼性と感度のバランスを保った。Xcorrに基づいて重複するペプチドの一方を除き、相同タンパク質とそのイソ型によって生じる冗長性を除いた。DTASelectおよびProtein Prophetから出力されたタンパク質ID表に冗長性を加えることなく、スコアの最も高いタンパク質入力値と共に、同様のタンパク質をリストした。
有機溶媒と両親媒性フッ素化アルコール類とを用いた、膜標本から脂質を除去するための実験を、従来法による細胞破壊および分画に続けて行った。我々は、非混和性液体の界面で一時的に準安定“混成”溶媒を作り出すことで分析物の分配を促進する、交互静水圧によって改善された、無洗剤液液抽出に基づく組織溶解および分画技術を開発した。圧力循環機器装置は、静水圧のサイクルを発生し、これが一時的に非混和性溶媒の相互溶解性を変えて、試料成分を液相間でより効率的に分配させる。従来の抽出では、脂質含量が高い(例えば、最大70質量%まで)と、洗剤はミセル中に閉じ込められ、疎水性タンパク質が脂質塊に付着したままとなってしまう。
[HFIPからのタンパク質の回収:蒸発による溶媒除去と、蒸留水を用いた沈殿による溶媒除去との比較]
極性および無極性試料成分の、圧力支援抽出および分配では、少なくとも1つの液相、試料溶液が生成する。いくつかの事例では、多数の液相が生成する。この相は適当な手法で物理的に分けられる。生成した個々の相を、多くの可能な方法、HPLCなどのカラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動(例えば、SDS−PAGEまたは2Dゲル電気泳動)などで分析する。
250mgのウシ脂肪組織を、1mlのHFIP中で圧力循環により処理した。圧力循環条件は次のとおりであった。35kpsiで20秒間、次に大気圧で20秒間を、20サイクル。圧力循環ステップでは、PULSE管を用いた。
組織質量のHFIP体積に対する比を、250mg/mlから約40mg/mlに小さくして(1.3mlのHFIP中で圧力循環により処理される、50mgのウシ脂肪組織に相当する)、ウシ脂肪組織を前述のように処理すると、沈殿反応で、溶解したタンパク質が効率良く回収されず、試料の大部分が水/HFIP画分中に残っていることが認められた。
HFIPの量を減らし、組織質量のHFIP体積に対する比を、約40mg/mlから、125または167mg/mlに大きくして(この比は、0.3〜0.4mlのHFIP中、50mgの組織に相当する)、ウシ脂肪組織を前述のように処理すると、沈殿反応の効率は回復した。試料は、沈殿したペレット中に回収され、水/HFIP画分中に失われる検出可能なタンパク質はなかった。PULSE管中の余分な体積を置換するため、反応物に鉱油を加え、最終的な全反応物体積を1.3〜1.4mlまでとした。余分な鉱油は、圧力循環抽出または沈殿反応に対して、良くも悪くも目立つ効果はなかった。
ウシ脂肪組織を用いて同様の実験を行い、異なる脂肪組織:HFIP比(質量:体積)を調べた。この比は、鉱油の量を変えて調節した。その結果、高い脂肪組織:HFIP比、例えば、約160mg/mlで、沈殿効率が向上することがわかった。
[圧力循環によるタンパク質抽出に対する鉱油の効果]
(実施例9a)
圧力循環反応への鉱油の添加は、試料を溶媒から乾固して抽出するか、沈殿によって抽出するかに拘わらず、相分離を向上させるため有利である。更に、脂質画分の回収を目的としない場合(例えば、実施例10参照)、沈殿法でタンパク質を回収する前に、脂質相を除去する必要がなくなる。
圧力循環反応への鉱油の添加は、脳組織などの、通常では相に分かれない試料の相分離を促すことから、有益といえる。120〜130mgのラット脳組織を、配合の異なる3つのHFIP/鉱油(0mlの油/1.1mlのHFIP;0.1mlの油/1.0mlのHFIP;または0.5mlの油/0.6mlのHFIP)中で抽出し、圧力循環(35kpsiで20秒間、大気圧で20秒間を、20サイクル)で処理した。2つの試料を、乾燥法と沈殿法で処理した。ゲルの結果は、鉱油を加えた後、試料を乾燥させると、バンドの鮮鋭度が著しく向上することを示した。鉱油を加えないと、試料中にある内在性脂肪が効率良く除去されず、SDS−PAGEゲル上のバンド分離に著しく影響するミセルが発生する。反応物に鉱油を加える(0.1または0.5mlのいずれか)と相分離が良くなり、遠心分離の際に、内在性脂質が油層へ効率良く分配される。結果として、ゲル電気泳動の結果が劇的に改善される。後に沈殿させる試料に鉱油を加えても多少の改善が見られるが、油を添加しなくとも、沈殿させた試料は乾燥させた試料よりも良好なバンド分離を示した。
[別の溶媒除去法:鉱油を用いて得られた結果と匹敵するもの]
一部の状況においては、乾燥プロトコルを沈殿プロトコルに切り替えることで、鉱油の添加と同様の効果が得られることがある。120〜130mgのラット脳組織を、配合の異なる2つのHFIP/鉱油(0mlの油/1.1mlのHFIP;0.1mlの油/1.0mlのHFIP)中で抽出し、圧力循環(35kpsiで20秒間、大気圧で20秒間を、20サイクル)で処理した。圧力循環後、相分離を良くするため、試料を11,000×gで遠心し、下部画分(タンパク質を含む)を回収して、蒸留水(試料体積の3倍)を加えて沈殿させ、氷上で10分間冷却し、11,000×gで15分間遠心してペレットを回収した。試料をSDS−PAGE試料緩衝液で再構成し、ゲル上で泳動させた。得られたゲルをクマシーブルーで染め、タンパク質の回収量とバンド鮮鋭度を比較した。ゲルの結果は、このような条件下において、油の添加による有意な不都合がないことを示した。このような沈殿条件下では、内在性脂質はタンパク質と共に沈殿せず、このため電気泳動の際の試料中には存在しないと考えられる。
[外因性の塩類の影響]
外因性の塩類を加えて、全タンパク質沈殿量を上げることができる。更に、最適塩濃度を用いて、所望のタンパク質を選択的に沈殿させ、不要なタンパク質を上澄み中に留めておくことができる。4種類の精製したタンパク質(ウシ血清アルブミン(画分V)(BSA)、炭酸脱水酵素、ニワトリ卵白リゾチーム、およびヒトγグロブリン(全て、ミズーリ州セントルイス、Sigma-Aldrichより入手))をHFIPに溶解し、20mg/mlの最終濃度とした。それぞれのタンパク質、または4種類全てのタンパク質の1:1:1:1混合物を、3倍量のdH2Oで沈殿させ、氷上で20分間沈殿させ(precipitated)、10,000×gで15分間遠心した。ペレットをSDS−PAGE試料緩衝液で再構成した。上澄みも回収し、SpeedVac中で乾燥し、SDS−PAGE試料緩衝液中に再懸濁させた。得られた全ての試料をゲル上で泳動させた。得られたゲルをコロイド状クマシーブルーで染めた。
[生体試料からの、タンパク質、核酸、および脂質を同時に単離および分別するための、無洗剤試料調製技術]
この方法は、交互静水圧による細胞破壊(圧力循環技術、またはPCT)と、異なる種類の分子を溶解し、個々の画分に分配する試薬系との、相乗的な組み合わせを活用するものである。PCTで促進した液液抽出では、高静水圧を用いて様々な化合物の溶媒和エネルギーと溶解性とを変える。大気圧では非混和性のいくつかの液体が高圧下で影響し合い、溶媒相の間で分子が分配する際に相境界があまり障壁とならなくなる。この結果、界面だけでなく、容器の体積全体で分配が起こる。タンパク質と脂質は圧力下で可溶化し、フッ素化アルコール類、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)などの両親媒性有機溶媒によって溶液中に保たれる。この新たなPCT/HFIP抽出法で、ヒトまたは野生動物の生検組織などの貴重または希有な試料や、小細胞集団様の初期幹細胞培養物などの複製の困難な試料からの、タンパク質、脂質、および核酸の効率的な同時抽出が行える。この方法のもう一つの長所は、不均一な試料をより正確に分析できることである。タンパク質、脂質、および核酸分析用にそれぞれ試料を分ける必要がないため、試料中の成分の不均一な分布による人為的影響が排除できる。PCTによる試料破壊とHFIPでの抽出の組み合わせによって、酵素や洗剤を用いずに試料成分を溶解および分配し、多数の試料、不便で時間のかかる組織均質化法、または徹底的な抽出後クリーンアップを必要することなく、様々な種類の試料から効率的かつ容易に、脂質、タンパク質、RNA、およびDNAが抽出できる。つまり、この新たな方法は、使用できる材料の量が限られているために、転写プロフィールとタンパク質発現との相関、翻訳後タンパク質修飾および組織脂質組成物の分析が、以前は実行不可能と考えられていた、あるいは、試料(replicates)間の精密な比較を行うには個々の試料間のばらつきが大きすぎる、特異的な生物学的研究体系の実現に役立つと考えられる。
[HFIP(PCT/HFIP)中での圧力媒介抽出後の各画分の分析]
RNAおよびタンパク質分散分析のため、約4×107個のPC12細胞を、PBSで1度洗い、0.9mlのHFIP中に懸濁させて、PULSE管へ移した。鉱油(0.5ml)を加えて、最終容量を1.4mlとした。各試料に圧力サイクルを20回かけた。各圧力サイクルは、35,000psiで20秒間、次に、大気圧で20秒間であった。PCT後、試料全体を、タンパク質用とRNA用の試料として均等に2つの管に分け、約12,000×gで15分間遠心して相を分けた。遠心後、無極性の上相の層を除いた。界面層を清浄な管に移し、短時間遠心して、溶媒の残りを吸引して除いた。溶媒相を清浄な管に移し、SpeedVac上で乾燥して溶媒を除いた。ペレットを短時間遠心して残留溶媒の吸引を促した。SDS−PAGEでタンパク質を可視化するため、ペレットと、界面と、乾燥した溶媒画分とを、50mM DTTを加えた1mlのLaemmli試料緩衝液に溶解した。RNAを単離するため、1mlのTRIZOL(登録商標)試薬を各画分に加えた後、細胞からRNAを抽出するための標準TRIZOL(登録商標)プロトコルを行った。
組織からゲノムDNAを抽出するための簡単で効果的な方法の多くは、タンパク質の十分な酵素消化により、無傷の(intact)DNAを放出するものである。我々は、HFIPとPCTにより、細胞または組織からタンパク質を抽出した後、核酸画分をDNA単離のために処理することができ、無傷のゲノムDNAを高収量で回収できることを示した。培養哺乳類細胞の試料からタンパク質を抽出した後、DNAを単離するため、DNEASY(登録商標)キット(Qiagen製)を用いて固体画分を処理し、DNEASY(登録商標)キットを用いて直接抽出した対照細胞と回収量を比較した。このプロトコルで最大のDNA収量を得るには、十分なプロテイナーゼK消化が必要なため、この方法は通常、無傷の組織タンパク質の回収には適さない。
[PCT/HFIPによるDNA抽出は、広範囲の試料量に適応可能]
PC12細胞を、遠心分離によりペレットとし、生理学的緩衝液中に懸濁させてカウントした。1×104〜5×105細胞の試料を、0.5〜1.0mlのHFIP(各試料の最終容量を、鉱油を加えて1.4mlに調節した)中、PCTで抽出した。35kpsiで20サイクル処理(高圧で20秒間、大気圧で20秒間)した後、試料を遠沈管に移し、約12,000×gで遠心して、相とペレット(DNAを含む不溶画分)とを分けた。DNEASY(登録商標)キット(Qiagen製)を用いてペレットからDNAを回収し、細胞数に応じたDNA回収量を、図4に示した。この結果から、PCT/HFIPによるDNA回収は、わずか1万細胞程の試料からでも有効であることが確認された。
[RNAとタンパク質との同時抽出のための、他の市販の方法と、PCT/HFIP法との比較]
PCT/HFIP、TRIZOL(登録商標)試薬(Invitrogen製)、ALLPREP(商標)RNA/タンパク質キット(Qiagen製)、およびPARIS(商標)キット(Ambion製)を用いて、PC12細胞(106細胞/試料)を処理した。
新たな方法を用いて回収したRNA画分が、ゲル上の28Sおよび18S RNAの存在によって示されたように、無傷であるだけでなく、無傷のmRNAも含み、またRT−PCRに適合することを確認するため、前述の4種のRNA試料を、βアクチンプライマを用いる、リアルタイム−RT−PCR増幅にかけた。PCT/HFIPでPC12細胞から抽出したRNA抽出物は、試験した3種の標準法と非常に良く一致し、試料が、予想濃度の増幅可能なmRNAを含んでいることを示している(表5)。
標準的なプロテオーム試料中では通常少なく見積もられる、いくつかの疎水性タンパク質を、PCT媒介液液抽出法が脱脂および可溶化する能力を示すため、2つの異なる抽出緩衝液を使用してネズミの白色脂肪組織を抽出し、次に2D−PAGE分離、ゲル内消化、LC−MS/MSによる分析を行って比較した。ネズミの腹部脂肪の2つの試料を、PCT/HFIP溶媒系、または洗剤を用いた抽出緩衝液(7M尿素、2Mチオ尿素、4%CHAPS)のいずれかを用い、同じ圧力循環条件下で処理した。
[圧力循環媒介HFIP抽出より得られた脂質画分の直接利用は、陽イオン化モードでDHBマトリックスを使用するMALDI−TOF分析に適合]
ラット脳組織から、前述のように、鉱油を加えたHFIPを使用し、PCTで脂質を抽出した。ウシ心膜脂肪は、鉱油を加えずに、PCT/HFIPで抽出した。2つの組織からの脂質相をMALDI−TOF分析にかけた。
PCT/HFIP抽出法の有用性を更に示すため、5つの異なるラット組織から、タンパク質、RNA、およびDNAの逐次抽出を行った。
Claims (83)
- 複数の成分から着目成分を抽出する方法であって、
前記方法は、
複数の成分と少なくとも2つの液相とを含む混合物を調製する工程であって、前記複数成分は着目成分を含み、前記混合物は第1の静水圧にある工程と、
前記混合物に第2の静水圧をかける工程であって、前記第2静水圧は前記第1静水圧より大きく、これにより更なる液相が生じる工程と、
前記第2静水圧から圧力を下げることにより、前記着目成分を前記複数成分から抽出する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、様々な疎水性を備えた成分を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、少なくとも2つの液相の1つの相を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分の1つの成分は、前記の少なくとも2つの液相の1つの液相に可溶であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記着目成分はタンパク質であることを特徴とする方法。
- 請求項5に記載の方法であって、前記タンパク質の立体配座は、抽出の間、または抽出後に変化することを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記の少なくとも2つの液相は、前記第1静水圧において混和しないことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記の少なくとも2つの液相は、前記第2静水圧において混和することを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記の少なくとも2つの液相は、前記第1静水圧において可溶でないことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記の少なくとも2つの液相は、前記第2静水圧において部分的に可溶であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記の少なくとも2つの液相は、前記第2静水圧において完全に可溶であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第2静水圧は、前記第1静水圧に等しい、第3の静水圧に下げられることを特徴とする方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記混合物には、第4の圧力がかけられ、前記第4圧力は、前記第1、第2、または第3圧力より大きいことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第2静水圧は、第3の静水圧に下げられ、前記第3圧力は、前記第1静水圧より大きいことを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記混合物には、第4の圧力がかけられ、前記第4圧力は、前記第1、第2、または第3圧力より大きいことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第2静水圧は、第3の静水圧に下げられ、前記第3圧力は、前記第1静水圧より小さいことを特徴とする方法。
- 請求項16に記載の方法であって、前記混合物には、第4の圧力がかけられ、前記第4圧力は、前記第1、第2、または第3圧力より大きいことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第2静水圧から圧力を下げると、少なくとも2つの液相は個々の相に分かれ、前記着目成分は、前記の少なくとも2つの液相の一方に分配されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記混合物には、第1、第2、第3、または第4圧力がかけられ、前記第4圧力は、前記第1、第2、または第3圧力より大きいことを特徴とする方法。
- 請求項19に記載の方法であって、前記混合物は、試薬を含む2次容器を含み、前記第4静水圧をかけて前記2次容器の内身を放出させ、これにより前記試薬を前記混合物に加えることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、前記着目成分を殆ど含まない液相に分配されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記着目成分を前記液相から単離する工程を更に含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記の抽出された着目成分は、後続プロセスにそのまま使用できることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、コロイドを含むことを特徴とする方法。
- 請求項24に記載の方法であって、前記複数成分は、エマルションを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記着目成分は、多糖、ポリフェノール、ビタミン、毒素、汚染物質、脂質、糖脂質、ステロイド、膜、細菌封入体中に存在する成分、抗原、ウイルス、薬学試剤、代謝産物、薬物、薬物代謝産物、染料、食品成分、ナノ粒子配合物、脂質ラフト、アミロイド斑、微小管、細胞質ゾル、または特定の細胞型であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記着目成分は、核酸であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記着目成分は、ウイルスまたは細菌であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記着目成分は、農薬であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記着目成分は、疎水性であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記着目成分は、親水性であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記着目成分は、両親媒性であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、複数の着目成分は、複数の成分から抽出されることを特徴とする方法。
- 請求項33に記載の方法であって、前記の複数の着目成分は、核酸およびタンパク質を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、細胞、オルガネラ、膜、または生体試料を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、生体起源のものであることを特徴とする方法。
- 請求項36に記載の方法であって、生体起源の前記複数成分は、動物、真菌、細菌、ウイルス、または植物から得たものであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、エマルションを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、合成物であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第2圧力は、第3の圧力に下げられ、前記複数成分は、圧力サイクルに曝され、前記第1、第2、および第3静水圧は、圧力サイクルを構成することを特徴とする方法。
- 請求項40に記載の方法であって、前記混合物は、繰り返される圧力サイクルに曝されることを特徴とする方法。
- 請求項41に記載の方法であって、前記混合物は、約1から約1000回の圧力サイクルに曝されることを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法であって、前記第3静水圧は、前記第1静水圧より小さいことを特徴とする方法。
- 請求項43に記載の方法であって、前記第3静水圧は、前記第1静水圧に等しいことを特徴とする方法。
- 請求項44に記載の方法であって、前記第3静水圧は、前記第1静水圧より大きいことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第1静水圧は、約0.1MPaから約1,000MPaであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第2静水圧は、最大約1,000MPaまでであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第2静水圧は、約100kPaから約1,000MPaであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第1静水圧と前記第2静水圧との圧力差は、約10kPaから1GPaであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記方法は、約−40℃から約+100℃の温度で行われることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記圧力は、液圧または空気圧であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数液相は、共沸混合物を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数液相は、様々な特定の割合の様々な液体から成る混合物を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数液相は、二相性であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数液相は、三相性であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数液相は、水性溶媒を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数液相は、有機溶媒を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数液相は、クロロホルム、テトラクロロエチレン、アルコール、水、脂肪族炭化水素、アセトニトリル、ギ酸、トリフルオロ酢酸、グリセロール、脂質、ハロカーボン、洗浄剤、緩衝液、カオトロピック塩、またはこれらの混合物を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、1つの液相または複数の液相を生成することを特徴とする方法。
- 請求項59に記載の方法であって、前記液相は、脂質、有機溶媒、水性緩衝液、エマルション、または固体粒子懸濁液であることを特徴とする方法。
- 請求項59に記載の方法であって、前記液相は、静水圧下で固相から生成することを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記方法は、低張塩濃度で行われることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記方法は、高張塩濃度で行われることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記方法は、高張塩濃度で行われることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記混合物は、洗剤を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記混合物は、緩衝剤を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、タンパク質は、生体膜から抽出されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、タンパク質は、脂質相から抽出されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、成分は、塗料から抽出されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、成分は、土から抽出されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、成分は、固体粒子の懸濁液から抽出されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、エマルションを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記複数成分は、脂質、あるいは、脂質または脂質混合物に1つまたは複数の成分を加えた溶液を含むことを特徴とする方法。
- 請求項73に記載の方法であって、前記複数成分は、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、糖脂質、ステロイド、ビタミン、薬物、または薬物代謝産物を更に含むことを特徴とする方法。
- 請求項74に記載の方法であって、前記複数成分は、細胞または単細胞生物を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記の少なくとも2つの液相は、前記第1圧力において相互溶解性に乏しく、前記の少なくとも2つの液相は分画されており、
前記混合物に前記第2圧力をかけて、前記の少なくとも2つの液相の相互溶解性を高めることにより、相互溶解性に乏しい前記の少なくとも2つの液相を混合して、準安定混合物を生成し、
前記第2圧力から圧力を下げることにより、前記の少なくとも2つの液相の溶解性を下げ、前記複数液相を画分に分かれさせて、前記複数液相の間で前記成分を分配させることを特徴とする方法。 - 複数の液相の間で複数の成分を分配させる方法であって、
前記方法は、
混合物を調製する工程であって、前記混合物は、複数の成分と複数の液相とを含み、前記複数液相は、周囲圧力において相互溶解性に乏しく、前記複数液相は分画されている工程と、
前記混合物に高めた圧力をかける工程であって、前記の高めた圧力が、前記複数液相の相互溶解性を高めることにより、相互溶解性に乏しい前記複数液相を混合して、準安定混合物を生成する工程と、
前記混合物の圧力を下げることにより、前記液相の溶解性を下げ、前記複数液相を画分に分かれさせて、前記複数液相の間で前記成分を分配させる工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項77に記載の方法であって、前記複数液相は、周囲温度において相互溶解性に乏しいことを特徴とする方法。
- 複数の成分から着目成分を抽出する方法であって、
前記方法は、
複数の成分と少なくとも2つの液相とを含む混合物を調製する工程であって、前記複数成分は着目成分を含む工程と、
前記混合物を溶媒に曝す工程であって、前記溶媒が着目成分を抽出することにより、前記着目成分が前記複数成分から抽出される工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項79に記載の方法であって、前記溶媒は、1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)を含むことを特徴とする方法。
- 請求項79に記載の方法であって、前記方法は、前記混合物を圧力変化に曝す工程を更に含むことを特徴とする方法。
- 請求項79に記載の方法であって、前記方法は、前記混合物を機械的処理ステップにかける工程を更に含むことを特徴とする方法。
- 請求項82に記載の方法であって、前記機械的処理ステップは、ホモジナイズ、ボルテックス処理、超音波処理、ピペット処理、剪断、粉砕、震盪、混和、混合、ハンマリング、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする方法。
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