CN113278608B

CN113278608B - 一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂

Info

Publication number: CN113278608B
Application number: CN202110520013.1A
Authority: CN
Inventors: 徐小寅; 张文彬; 郝梦雅
Original assignee: Hangzhou Xinjing Biological Reagent Development Co ltd
Current assignee: Hangzhou Xinjing Biological Reagent Development Co ltd
Priority date: 2021-05-13
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-05-13
Also published as: CN113278608A

Abstract

本发明公开了一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂，由以下体积分数的组分组成：卤代烃或液态烃类20％～60％、酯类溶剂20％～50％、醇类溶剂20％～50％；密度大于1g/cm3，熔点小于0℃，沸点大于150℃，20℃下在水中的溶解度小于1.5g/100ml。本发明还提供所述氯仿替代试剂在核酸提取过程中，代替氯仿进行萃取有机相，使有机相和水相分层，分离出核酸水相的应用。氯仿替代试剂能完全替代氯仿在核酸提取中的作用，提取的核酸浓度和使用氯仿时相当，且没有氯仿的有毒、易挥发、受管制等各种缺陷。

Description

一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂

技术领域

本发明涉及一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂，具体涉及一种在核酸提取过程中，使有机相和水相分层，分离出核酸的氯仿替代试剂。

背景技术

酚氯仿抽提核酸是最经典的核酸提取技术，《分子克隆实验指南.精编版》中仍在大量使用酚氯仿抽提技术。苯酚由于类似苯而呈现出非极性分子的特点，使用酚抽提核酸时，其作用是先使蛋白质变性，再由于蛋白分子表面含有很多非极性基团(含有苯环的氨基酸)，根据相似相溶的原理，蛋白分子会溶解于苯酚相中，而核酸则由于亲水的特性溶于水相。但是苯酚由于含有一个羟基，使得苯酚又具有一部分极性分子的特性，能微溶于水。所以在用酚抽提核酸的过程中，必须加入与苯酚亲和力非常强的氯仿，以加速有机相与水相的分层，并以此去除核酸溶液中残留的苯酚。

氯仿是一种无色透明液体，有特殊气味，味甜，高折光，不燃，质重，易挥发的试剂。氯仿纯品对光敏感，遇光照会与空气中的氧作用，逐渐分解而生成剧毒的光气(碳酰氯)和氯化氢。对人体有毒害作用，主要作用于中枢神经系统，且被世界卫生组织国际癌症研究机构列入2B类致癌物清单中，因此《分子克隆实验指南.精编版》679页，附录4明确指出使用氯仿时要戴合适的手套和安全眼镜并始终在化学通风橱里进行。此外，根据《危险化学品安全管理条例》、《易制毒化学品管理条例》，氯仿受公安部门管制。虽然氯仿有上述的严重缺陷，但由于其在核酸提取中不可替代的作用，依旧沿用至今。特别是经典的Trizol试剂法提取RNA，必须使用氯仿，而Trizol试剂至今在RNA提取市场上依然占有非常大的比重。

市场上各家公司的Trizol试剂或相关产品都会要求用户自行准备氯仿，由于氯仿是易制毒化学试剂而受到管制，购买及使用程序非常不便，且有毒有害，使用时对设备和环境要求较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于核酸提取中分离核酸时必须使用的氯仿替代试剂，该试剂可替代氯仿在核酸提取中的作用，萃取苯酚等非极分子，使有机相和水相分层，分离出核酸溶液，并且该试剂不具有氯仿的缺陷，无毒或低毒，不易挥发，无需在通风橱操作，使用不受管制。

本发明采用的技术方案是：

一种用于核酸提取分离的氯仿替代试剂，所述替代试剂由以下体积分数的组分组成：卤代烃或液态烃类20％～60％、酯类溶剂20％～50％、醇类溶剂20％～50％；密度大于1g/cm³，熔点小于0℃，沸点大于150℃，20℃下在水中的溶解度小于1.5g/100ml。

进一步，所述卤代烃或液态烃类为四氯乙烯、四氯乙烷、五氯乙烷、四溴乙烷、1,2-二氯丙烷、1,3-二氯丙烷、三氯丙烷、四氯丙烷、苯、二甲苯或辛烷，更优选为卤代烃即四氯乙烯、四氯乙烷、五氯乙烷、1,2-二氯丙烷、1,3-二氯丙烷、三氯丙烷或四氯丙烷，最优选为四氯乙烯、四氯丙烷或五氯乙烷。

进一步，所述酯类溶剂为乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸丙酯、丙酸异丙酯、丁酸丙酯、正丁酸异丙酯、戊酸丙酯、异戊酸丙酯、己酸丙酯、己酸异丙酯、庚酸丙酯、辛酸丙酯、辛酸异丙酯、辛酸异丙酯、癸酸正丙酯、癸酸异丙酯、乳酸正丙酯、棕榈酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、丙酸丁酯、丙酸异丁酯、丁酸丁酯、丁酸异丁酯、异丁酸异丁酯、戊酸丁酯、戊酸异丁酯、异戊酸异丁酯、庚酸丁酯、庚酸异丁酯、辛酸正丁酯、辛酸异丁酯、乙酸异戊酯、戊酸戊酯、乙酸乙酰乙酯、2-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、4-乙酰基丁酸乙酯；邻氨基苯甲酸甲酯、磷酸三(2-氯乙基)酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯、壬酸烯丙酯、对甲苯磺酸正丁酯、癸二酸二乙酯、癸二酸二异丙酯、癸二酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二丁酯，优选为乙酸乙酰乙酯、磷酸三(2-氯乙基)酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯或邻苯二甲酸二丁酯，更优选为乙酸乙酰乙酯、正硅酸丙酯或邻苯二甲酸二丁酯。

进一步，所述的醇类溶剂为C4～C12的脂肪醇，进一步，所述醇类溶剂为丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、己醇、庚醇、辛醇、异辛醇、壬醇、异壬醇、癸醇或异癸醇，优选为正戊醇、异戊醇、己醇、庚醇、辛醇或异辛醇，更优选为异戊醇、己醇或辛醇。

更进一步，本发明所述的氯仿替代试剂优选为以下三种配方之一，所述配方中的组分均为体积分数：

配方1：正硅酸丙酯30％，四氯乙烯50％，辛醇20％；

配方2：乙酸乙酰乙酯20％，四氯丙烷50％，异戊醇30％；

配方3：邻苯二甲酸二丁酯50％，五氯乙烷30％，己醇20％。

本发明的氯仿替代试剂的要求是在常温下为液态的试剂，且满足以下条件：

1.分子结构属于非极性分子，与苯酚有非常好的相溶性且不溶于水，其范围包括酯类，卤代烃、醇类等。

2.要求该化学试剂沸点越高越好，低挥发性，在室温条件下可以长时间维持液态。

3.要求该化学试剂密度最好大于或接近1g/cm³，萃取苯酚后，有机相应处于下相。

4.该化学试剂要求具有无毒或低毒的特性。

5.与核酸的亲和性差，也不会与核酸产生化学反应。

由于同时具备上述5种条件的化学试剂并不存在，本发明采用的方法是将几种化学试剂调配到一起，组成一种缓冲体系，达到各项使用性能均优于氯仿的替代试剂。

本发明中，采用三组分的混合配制方式，氯仿替代试剂试剂由卤代烃或液态烷烃、酯类溶剂、醇类溶剂混配而成。这些组分的选择和调配都是基于本发明的技术目的而进行的。

由于本发明的密度要求大于1g/cm³，所以必须有卤代烃或烷烃作为组成成分，且优选密度大的卤代烃，用于调整缓冲溶液的密度，卤代烃的含量在20％-60％(体积比)范围。

本发明的酯类或者醇类优选低毒或无毒，沸点高且密度大的酯类或者醇类溶剂。

本发明还提供所述氯仿替代试剂在核酸提取过程中，代替氯仿进行萃取有机相，使有机相和水相分层，分离出核酸水相的应用。所述应用较常见的是在酚氯仿抽提核酸方法中代替氯仿萃取苯酚分离核酸，比如在《分子克隆指南.精编版》第7章方案7.1“用酸性苯酚-硫氰酸胍-氯仿从细胞和组织中抽提纯化RNA”，以及CTAB法从植物叶片提取DNA等方法。其他以替代氯仿在核酸提取中的萃取苯酚或其他有机物为目的的应用，也属于本发明的保护范围。

具体的应用方式包括且不限于在各类市场上商品化的RNA或DNA提取试剂或者试剂盒中，使用本发明提供的氯仿替代试剂来代替其中的氯仿，如Trizol试剂(invitrogen公司产品)、RNAiso Plus(Takara公司产品)、RNAsimple总RNA提取试剂盒(北京天根生化产品)、超纯总RNA提取试剂盒(杭州新景生物产品)、高多糖多酚植物总RNA试剂盒(杭州新景生物产品)、植物/真菌DNA试剂盒(杭州新景生物产品)等。

本发明配制成的氯仿替代试剂的商品名命名为“Buffer EX”，理化性质如下：

熔点：-30℃～-50℃

沸点：150～180℃

溶解度(水)：1～1.5g/100ml(20℃)

密度：1.1～1.2g/ml

外观:无色液体，不易挥发，具有特殊的气味。

可燃，遇明火、高热或接触氧化剂有发生燃烧的危险！

相应的，氯仿试剂的理化性质对比如下：

熔点：-63.5℃

沸点：61.3℃

溶解度(水)：0.74g/100ml(20℃)

密度：1.484g/ml

外观:无色液体，极易挥发，具有特殊的气味。

不可燃。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种能替代氯仿在核酸提取中使有机相和水相分层的试剂，氯仿替代试剂能完全替代氯仿在核酸提取中的作用，提取的核酸浓度和使用氯仿时的浓度相当，没有显著差异，且没有氯仿的有毒、易挥发、受管制等各种缺陷。

本发明提供的氯仿替代试剂不仅可以达到在核酸抽提过程中氯仿萃取苯酚的效果，而且较氯仿还有不易挥发，低毒，不属于易制毒试剂，不受公安部门管制的优点。

附图说明

图1实施例1用不同试剂萃取的小鼠肝脏组织中RNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图2实施例2用不同试剂萃取的小鼠肌肉组织中RNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图3实施例3用不同试剂萃取的马铃薯块茎RNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图4实施例4用不同试剂萃取的绿萝DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

配制配方1的氯仿替代试剂：

正硅酸丙酯30％，四氯乙烯50％，辛醇20％(体积分数)。

用Trizol试剂(invitrogen公司产品)提取100mg小鼠肝脏组织中RNA，对比使用Buffer EX(选用试剂配方1：正硅酸丙酯30％，四氯乙烯50％，辛醇20％，本发明的氯仿替代试剂的商品名)与氯仿提取RNA的效果对比，具体测试方法如下：

1.在研钵中加液氮，将约1g小鼠肝脏组织研磨至粉末状，用液氮预冷过的1.5ml离心管称取100mg研磨成粉末状的小鼠组织，共4管，每管加入1ml Trizol试剂。用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8～10次。

2.两管样本加入200μl BufferEX(试剂配方1)，另外两管样本加入200μl氯仿，盖上管盖，用力摇晃15秒，12000×g离心15分钟。

3.取4个RNase-free 1.5ml离心管，分别加入500μl异丙醇，将步骤2)中的各管样本的离心上清液转移到装有异丙醇的1.5ml离心管中。混合均匀，12000×g离心15分钟。

4.弃上清，加入1ml 75％乙醇，温和地翻转离心管4～6次，7,500×g离心5分钟。

5.弃上清，盖上管盖，低速离心数秒使管壁上的乙醇沉降到管底。用200μl吸头吸尽残留的乙醇，保留管底的白色RNA沉淀。室温静置5分钟干燥RNA。

6.加入50～100μl RNase-free水溶解RNA，并将RNA储存于-70℃备用。

7.获得的小鼠RNA经微量分光光度计测试，结果如下表1：

表1：

OD值对照表

8.获得的小鼠RNA经1％琼脂糖凝胶电泳后拍摄的电泳图如图1所示。

实验结果表明，用EX配方1来替代氯仿进行萃取步骤，提取得到的小鼠RNA样品浓度和使用氯仿萃取的样品没有显著差别，电泳图也验证了获得的RNA完整性较好，与微量分光光度计测得的浓度有对应关系，可以很好地替代氯仿。

实施例2

配制配方1的氯仿替代试剂：

正硅酸丙酯30％，四氯乙烯50％，辛醇20％(体积分数)。

用超纯总RNA提取试剂盒(杭州新景生物产品)提取小鼠肌肉组织中RNA，对比使用Buffer EX(选用试剂配方1：正硅酸丙酯30％，四氯乙烯50％，辛醇20％，本发明的氯仿替代试剂的商品名)与氯仿提取RNA的效果对比，具体测试方法如下：

1)收集约1g小鼠肌肉组织并转移到研钵中，加入液氮后将样本研磨至粉末状，再用液氮预冷的1.5ml离心管每管称取100mg研磨成粉末状的肌肉组织，共4管，每管加入1mlBuffer TL，旋涡振荡15秒混匀。

2)两管样本加入200μl Buffer EX(试剂配方1)，另外两管样本加入200μl氯仿，盖上管盖，用力摇晃15秒，12000×g离心15分钟。

3)吸取600μl上层水相转移到一个洁净的1.5ml离心管中，加入600μl 70％乙醇，勿弃吸头，直接用吸头吸注两次混匀，进入步骤4)的操作。

4)吸取600μl混合液转移到核酸纯化柱(核酸纯化柱置于2ml离心管中)中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。

5)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，将1.5ml离心管中剩余的液体全部倒入核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。

6)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μl Buffer WA，盖上管盖，12000rpm离心30秒。

7)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600μl Buffer WBR，盖上管盖，12000rpm离心30秒。

8)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。

9)弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个RNase-free的1.5ml离心管中，在纯化柱中加入50μl RNase-Free Water，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。

10)弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将RNA储存于-70℃备用。

11)获得的小鼠RNA经微量分光光度计测试，结果如下表2：

表2

序号	样品编号	Abs260	Abs280	Abs230	260/230	260/280	样品浓度	单位	样品类型
										1	EX	4.746	2.454	2.759	1.72	1.93	189.8280	ng/μl	RNA
2	EX	4.597	2.385	2.705	1.70	1.93	183.8755	ng/μl	RNA
										3	氯仿	4.481	2.330	2.755	1.63	1.92	179.2484	ng/μl	RNA
4	氯仿	4.594	2.368	2.767	1.66	1.94	183.7509	ng/μl	RNA

12)获得的小鼠RNA经1％琼脂糖凝胶电泳后拍摄的电泳图如图2所示。

实验结果表明，EX试剂配方2在超纯总RNA提取试剂盒中替代氯仿，所提取到的RNA样品浓度和氯仿没有显著差异，且RNA完整性较好。

实施例3

配制配方2的氯仿替代试剂：乙酸乙酰乙酯20％，四氯丙烷50％，异戊醇30％；

用高多糖多酚植物总RNA试剂盒(杭州新景生物产品)提取马铃薯块茎RNA，对比使用Buffer EX(选用试剂配方2：乙酸乙酰乙酯20％，四氯丙烷50％，异戊醇30％，本发明的氯仿替代试剂的商品名)与氯仿提取RNA的效果对比，具体测试方法如下：

1.在研钵中加入约2g马铃薯块茎和液氮，将组织研磨至粉末状，再用液氮预冷的1.5ml离心管每管称取200mg研磨成粉末状的组织，共4管。

2.每管加入600μl已加入β-巯基乙醇的BufferRCT，旋涡震荡直至组织全部溶解。

3.两管样本加入600μl Buffer EX(试剂配方2)，另外两管样本加入600μl氯仿，盖上管盖，用力摇晃15秒，12000×g离心15分钟。

4.小心吸取350μl上清，转入一个洁净的1.5ml管中。

5.在上清液中加入350μl BufferK并直接用吸头吸注6-8次混合均匀，将混合液全部转移到过滤柱中，盖上管盖，13000rpm离心1分钟。

6.弃过滤柱，向2ml离心管中的滤液中加入700μl 70％乙醇并直接用吸头吸注6-8次混合均匀，吸取700μl混合液加入到核酸纯化柱中，盖上管盖，13000rpm离心1分钟。

7.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，吸取剩余的混合液加入到核酸纯化柱中，13000rpm离心1分钟。

8.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μl BufferWA,盖上管盖，13000rpm离心1分钟。

9.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600μl Buffer WBR，盖上管盖，13000rpm离心1分钟。

10.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。

11.弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的RNase-free的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50-100μl RNase-Free Water，盖上管盖，室温静置1分钟，13000rpm离心1分钟。

12.弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将RNA储存于-80℃备用。

13.获得的马铃薯RNA经微量分光光度计测试，结果如下表3：

表3

序号	样品编号	Abs260	Abs280	Abs230	260/230	260/280	样品浓度	单位	样品类型
										1	EX	4.287	2.108	2.068	2.07	2.03	171.4847	ng/μl	RNA
2	EX	3.942	1.947	1.947	2.02	2.02	157.6804	ng/μl	RNA
										3	氯仿	3.970	1.948	1.943	2.04	2.04	158.7861	ng/μl	RNA
4	氯仿	3.789	1.869	1.838	2.06	2.03	151.5415	ng/μl	RNA

14.获得的马铃薯RNA经1％琼脂糖凝胶电泳后拍摄的电泳图如图3所示。

实验结果表明，EX试剂配方3在高多糖多酚植物总RNA试剂盒中替代氯仿，所提取到的RNA样品浓度和氯仿没有显著差异，且RNA完整性较好。

实施例4

配制配方3的氯仿替代试剂：邻苯二甲酸二丁酯50％，五氯乙烷30％，己醇20％。

用植物/真菌DNA试剂盒(杭州新景生物产品)提取绿萝DNA，对比使用Buffer EX(选用试剂配方3：邻苯二甲酸二丁酯50％，五氯乙烷30％，己醇20％，本发明的氯仿替代试剂的商品名)与氯仿提取DNA的效果对比，具体测试方法如下：

1.将2g新鲜的绿萝叶片剪碎，置于研钵或者匀浆器中，加入400μl65℃预热的BufferPD和10μlβ-巯基乙醇，用力研磨至匀浆状。

2.研磨充分后加入5ml 65℃预热的BufferPD继续研磨1分钟，使组织完全裂解。

3.每个2ml离心管收集800μl裂解产物，共4管。将离心管置65℃水浴30分钟。水浴期间每隔5～10分钟翻转离心管数次以帮助DNA的释放。

4.两管样本加入800μl Buffer EX(试剂配方3)，另外两管样本加入800μl氯仿，用力混合均匀，12000rpm，离心5分钟。

5.小心吸取上清，转入一个新的1.5ml管中(这时体积大概有600μl)。

6.在上清中加入等体积的Buffer GP，混合均匀。

7.吸取一半体积步骤6中的混合液(约600μl)加入到核酸纯化柱中(核酸纯化柱置于2ml离心管中)，盖上管盖，12000rpm离心30秒。

8.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，将步骤6中剩余的混合液全部加入到纯化柱中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。

9.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μl BufferWA，盖上管盖，12000rpm离心30秒。

10.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600μl BufferWB，盖上管盖，12000rpm离心30秒。

11.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，盖上管盖，14000rpm离心1分钟。

12.弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱中加入100～200μl 65℃预热的BufferTE，盖上管盖，室温静置2分钟，12000rpm离心1分钟。

13.弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将DNA储存于﹣20℃备用。

14.获得的绿萝DNA经微量分光光度计测试，结果如下表4：

表4

序号	样品编号	Abs260	Abs280	Abs230	260/230	260/280	样品浓度	单位	样品类型
										1	EX	1.778	0.983	0.776	2.29	1.81	88.8921	ng/μl	dDNA
2	EX	1.559	0.864	0.677	2.30	1.81	77.9614	ng/μl	dDNA
										3	氯仿	1.515	0.846	0.670	2.26	1.79	75.7257	ng/μl	dDNA
4	氯仿	1.678	0.934	0.766	2.19	1.80	83.9095	ng/μl	dDNA

15.获得的绿萝DNA经1％琼脂糖凝胶电泳后拍摄的电泳图如图4所示。

实验结果表明，EX试剂配方4在植物/真菌DNA试剂盒中替代氯仿，所提取到的DNA样品浓度和氯仿没有显著差异，且DNA完整性较好。

Claims

1.一种氯仿替代试剂，其特征在于所述氯仿替代试剂为以下三种配方之一，所述配方中的组分均为体积分数：

配方1：正硅酸丙酯30%，四氯乙烯 50%，辛醇20%;

配方2：乙酸乙酰乙酯20%，四氯丙烷50%，异戊醇30%;

配方3：邻苯二甲酸二丁酯50%，五氯乙烷30%，己醇20%；

所述氯仿替代试剂的理化性质如下：

熔点：-30℃~-50℃

沸点：150~180°C

在20℃下水中的溶解度为1 ~1.5 g/100ml；

密度：1.1~1.2g/ml

外观: 无色液体，不易挥发，具有特殊的气味。

2.如权利要求1所述的氯仿替代试剂在核酸提取中的应用，所述应用为在核酸提取过程中，代替氯仿进行萃取有机相，使有机相和水相分层，分离出核酸水相。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：在市场上商品化的RNA或DNA提取试剂或者试剂盒中，使用权利要求1所述的氯仿替代试剂来代替其中的氯仿。