CN101820966A

CN101820966A - 分子的压力提高的提取和分配

Info

Publication number: CN101820966A
Application number: CN200880100441A
Authority: CN
Inventors: A·拉扎雷维; V·格罗斯
Original assignee: Pressure Biosciences Inc
Current assignee: Pressure Biosciences Inc
Priority date: 2007-06-04
Filing date: 2008-06-02
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2028-06-02
Also published as: JP5587770B2; WO2008151136A1; TW200906847A; CA2689145A1; AU2008259821B2; JP2010530295A; CN106267902B; US20080300386A1; TWI683821B; EP2155351A1; EP2155351B1; TW201741329A; TWI598359B; CN106267902A; AU2008259821A1; CN101820966B; US9458190B2; EP2155351A4

Abstract

公开了从多种组分中提取感兴趣的组分的方法。

Description

分子的压力提高的提取和分配

相关申请的交叉参考

本申请要求2007年6月4日提交的美国序列号60/933209和2007年9月17日提交的美国序列号60/972971的优先权。前述申请的内容在此通过参考全文引入。

背景技术

目前的提取方法常常针对某一组分子具有特异性，以排除和损失其他组的分子。通常待分析的样品受限于尺寸，且一类分子的提取将消耗样品或使得不能

从样品中提取额外组的分子。基于分子在不同溶剂内的不同溶解度，已使用液液分配方法，从复杂混合物中提取分子实体(entity)。然而，当针对液液分配使用互不混溶或部分混溶的溶剂时，溶剂之间的交换仅仅在溶剂界面处发生，而溶剂本体不发生相互作用而彼此保持隔离。因此，在溶剂之间分子的分配要求剧烈的机械摇动，以便在溶剂之间维持大的液液表面的界面面积。典型地在分液漏斗内进行溶剂的摇动，且采用存在于漏斗内的过量气体进行，以通过摇动加速乳化。可对提取的分子进行空气氧化或者在其他情况下通过存在气相进行，例如在洗涤剂存在下形成泡沫，从而使得常规的液液提取工艺不方便、低效或不可能。

发明概述

本发明的公开内容尤其提供提取方法，通过使用互不混溶的提取溶剂(例如液相或溶剂相)的混合物，该方法允许从样品(例如混合物或多种组分)中提取一种实体(例如一种组分)或多组分子实体(例如多种组分)，其中所述混合物可拥有对各组样品衍生的组分完全不同的亲和性。该方法可用于例如液液提取、凝胶-液体提取、悬浮液-液体提取。在一些实施方案中，可在提取方法中使用压力(例如压力循环)。在一些实施方案中，存在非均相共沸混合物，并且在例如含有一种或更多种提取溶剂和样品的提取腔室内，通过施加增加的压力(例如液体静力压)到样品上，改变溶剂的相互共沸溶解度。通过降低胶束尺寸或者破坏它们，高压可直接影响胶束(参见，例如Ennaceur andSanderson，Langmuir 21：552-561(2005))。例如，与非循环地施加压力相比，从环境压力到高压，然后降低压力(例如返回到环境压力)的压力循环(例如液体静力压)可更加有效地破坏细胞和组织(参见，例如美国专利Nos.6274726、6120985、6270723和6696019)。

此处所使用的术语“提取(extraction，extracting)”是指在一相(例如多个液相中的一相)内，相对于其他组分(例如，污染物)，提高一种组分(例如感兴趣的组分)。在一些实施方案中，提取不是完全提取，而是部分提取，从而相对于另一组分，提高一种组分的相对量(例如感兴趣的组分)，且相对于所述其他组分(例如污染物)，没有完全除去和/或分离一种组分(例如，约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％的一种组分与其他组分相分离)。在一些实施方案中，完全从其他组分中提取一种组分(例如与其他组分完全分离)。

在一些方面中，可使用压力循环，破坏或降低在例如从膜、细胞、组织和复杂基体中提取分子实体的过程中形成的胶束和/或乳液数量，尤其当使用表面活性剂或洗涤剂辅助疏水实体在含水提取溶剂内增溶时。反复施加压力(例如液体静力压)可导致胶束和乳液的破坏，并基于其物理化学性能，分配样品衍生的分子到单独的液相内。

此外，本发明的公开内容描述了尤其溶剂(例如一种或更多种溶剂)提高样品衍生的分子实体分配的用途，该溶剂在环境压力(例如氯仿在水中以0.815％w∶w可溶，己烷在水中仅仅以0.001％w∶w可溶)和室温(例如约25℃)下具有差的相互溶解度。高压可改变溶剂的相互溶解度。通过选择合适的溶剂，溶剂量和压力水平，可临时混合互不混溶的溶剂和待提取的样品，这将导致形成亚稳态混合物，其中所得可溶的溶剂拥有可变的性能，例如溶解样品组分的能力。当分配部分解离的化合物时，根据它们各自的物理化学性能，例如分布系数、logP或分布系数logD，这种亚稳态体系的解压(例如快速解压)将导致混合物分离成不同的部分并在溶剂之间分配分子实体(参见，例如Paternoste等人，Biophys.J.69：2476-2488(1995)和其内引证的参考文献)。在一些实施方案中，在提取过程中，通过使用数种溶剂，可大大地降低或避免使用洗涤剂。

此外，本发明的公开内容描述了三元和更高的溶剂混合物的用途，其中与其他情况下采用任何一种互不混溶的液相，例如水和油相比，采用两亲溶剂(例如溶剂)助长两种或更多种互不混溶的溶剂在较大的程度上混溶。存在两亲溶剂进一步提高增加的压力(例如高压)的能力，以改变在彼此内溶剂的相互溶解度，并且当降低压力到较低水平时，加速被提取的样品(例如混合物)中各组分分配到不同相内。两亲溶剂可与水相(通过氢键键合)以及与油和类脂通过疏水相互作用形成稳定的缔合。因此，在一些实施方案中，通过压力循环促进在两亲溶剂内多组分样品的溶解将导致亲脂和亲水化合物相分离成两个或更多个液相，随后可机械分离所述液相。

在一个方面中，本发明的公开内容的特征在于从多种组分中提取感兴趣的组分的方法。该方法包括：

提供含有多种组分和至少一个液相(例如多个液相，例如至少两个液相)(例如，形成互不混溶的液相)的样品(例如混合物)，其中样品(例如混合物)在第一液体静力压下；

将样品(例如混合物)暴露于第二液体静力压下，其中第二液体静力压大于第一液体静力压，从而导致形成额外的液相；

从第二液体静力压降低压力，从而从多种组分中提取感兴趣的组分(例如在液相之一内，增加感兴趣的组分的百分数(或比例))。

在一些实施方案中，多种组分包括各种疏水度的组分。

在一些实施方案中，多种组分包括(例如提供)多个液相的相。

在一些实施方案中，在完成提取的过程中或当时，液相形成固相。

在一些实施方案中，多种组分中的一种组分可溶于多个液相中的一个液相内。

在一些实施方案中，多种组分中的一种组分不可溶于多个液相中的一个液相内。

在一些实施方案中，多种组分包括胶体。此处所使用的胶体或胶态分散体是非均相的混合物，它肉眼看起来是均匀的溶液。非均相混合物是其中一种溶液为一相的两相混合物。在胶体中，分散相由均匀地分布在连续相当中的微小颗粒或液滴制成。胶体的实例包括乳、霜、气溶胶(例如，雾、烟雾(smog)、烟)、沥青、油墨、油漆、胶水和海泡石(sea foam)。

在一些实施方案中，多种组分包括乳液。此处所使用的乳液是一类胶体。乳液是两种互不混溶的物质的混合物。一种物质(分散相)分散在另一种物质(连续相)内。乳液的实例包括黄油、人造黄油、浓咖啡、蛋黄酱、照相底片的光敏侧、金属加工的切割流体、油漆、油墨、润滑剂、局部药剂、洗剂、化妆品制剂等。在黄油和人造黄油中，连续液相包围水滴(油包水乳液)。

在一些实施方案中，至少两个液相在第一液体静力压下不混溶。

在一些实施方案中，至少两个液相在第二液体静力压下混溶(例如完全混溶)。

在一些实施方案中，至少两个液相在第一液体静力压下不可溶。

在一些实施方案中，至少两个液相在第一液体静力压下至少部分可溶。

在一些实施方案中，至少两个液相在第二液体静力压下至少部分可溶。

在一些实施方案中，至少两个液相在第二液体静力压下完全可溶。

在一些实施方案中，降低第二液体静力压到第三液体静力压，所述第三液体静力压等于第一液体静力压。在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于第四压力下，其中第四压力大于第一、第二或第三压力。

在一些实施方案中，降低第二液体静力压到第三液体静力压，所述第三液体静力压大于第一液体静力压。在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于第四压力下，其中第四压力大于第一、第二或第三压力。

在一些实施方案中，降低第二液体静力压到第三液体静力压，其中所述第三液体静力压小于第一液体静力压。在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于第四压力下，其中第四压力大于第一、第二或第三压力。

在一些实施方案中，从第二液体静力压降低压力导致至少两个液相分离成单独的相且感兴趣的组分分配到至少两个液相之一内。

在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于第三压力和第四压力下其中第四压力大于第一、第二或第三压力。

在一些实施方案中，样品(例如混合物)含有含试剂的辅助容器。在一些实施方案中，暴露于第二、第三或第四液体静力压下将引起辅助容器释放其内容物，从而引入该试剂到样品(例如混合物)内。

在一些实施方案中，多种组分不含感兴趣的组分，例如基本上不含感兴趣的组分的液相内分配。

在一些实施方案中，该方法进一步包括从液相中分离/纯化感兴趣的组分。

在一些实施方案中，液相以馏分(fractions)形式分离。

在一些实施方案中，感兴趣的提取组分直接与下游工艺(例如分析方法，例如HPLC或LC/MS)相容。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是蛋白质(例如膜结合的蛋白质，跨膜蛋白质、I型或II型膜蛋白质、受体、酶、脂蛋白、糖蛋白)。在一些实施方案中，在提取过程(或通过完成)提取中，改变蛋白质的结构。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是多糖(例如，肝素或肝素衍生的多糖)、多酚(例如，单宁、苯基丹参素(phenylpropanoid)(例如，木质素、类黄酮))、维生素、毒素、污染物、类脂(例如磷脂(例如磷脂酰胆碱(PtdCho)))、磷脂酰乙醇胺(PtdEtm)、磷脂酰肌醇(PtdIns)、磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、糖脂、类甾醇(例如，雌激素、黄体酮、雄激素、睾酮、蜕皮甾族化合物，例如蜕皮甾酮，皮质甾类，例如糖皮质激素和盐皮质激素，促蛋白合成类固醇、胆甾醇、植物甾醇、油菜素甾醇类、麦角固醇)、膜(细胞膜、细胞器膜、类脂双层)、在细菌包涵体内存在的组分、抗原(例如来自细菌)、病毒(例如用于疫苗生产)、药物试剂，例如小分子、代谢产物(例如小分子代谢产物)、药物(例如药学药物)、药物代谢产物、染料、食品成分、纳米颗粒配方、类脂筏(lipid raft)和淀粉样蛋白斑(amyloid plaque)、微管、细胞溶质或特定的细胞类型。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是核酸(DNA(核DNA、线粒体DNA))、RNA(mRNA、tRNA或rRNA)。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是病毒(例如，HIV、HPV、肝炎A、B、C、D、E、F或G，巨细胞病毒、EB病毒、黄热病(yellow fever)等等)，或细菌(例如，革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、共生细菌、致病菌)。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是杀虫剂(例如，杀细菌剂、杀真菌剂、除草剂、杀昆虫剂(例如杀卵剂、杀幼虫剂或杀成虫剂))、杀螨剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀啮齿动物剂或杀病毒剂。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是疏水的。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是亲水的。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是兼性的/两亲的。

在一些实施方案中，从多种组分中提取感兴趣的多种组分。在一些实施方案中，感兴趣的多种组分含有核酸和蛋白质。

在一些实施方案中，多种组分包括细胞(例如原核细胞或真核细胞)、细胞器(例如，线粒体、细胞核、高尔基体、叶绿体、内质网、液泡、顶体、中心粒、纤毛、乙醛酸循环体、氢化酶体、溶酶体、黑色体、纺锤剩体、肌原纤维、核仁、桶孔覆垫(parenthesome)、过氧化物酶体、核糖体、微粒体、囊泡)、膜、生物样品(组织样品(脂肪组织、肝脏、肾脏、皮肤、胰脏、腹部、肠、结肠、乳腺、卵巢、子宫、前列腺、骨骼、腱、软骨、头发、指甲、牙齿、心脏、肺、皮肤、活检等))、血液、尿液、乳汁、精液、唾液、粘液、其他体液和固体、细胞集合体(例如，血液、精液、粘液、组织活检)。

在一些实施方案中，多种组分是生物来源的。在一些实施方案中，生物来源的多种组分来自于动物(例如哺乳动物(例如人类或家养动物))、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫、禽类物种、真菌、细菌、病毒或植物。在一些实施方案中，生物来源的多种组分来自于远古样品，例如化石(例如化石动物、化石植物、化石骨骼、化石牙齿、化石粪便等)。

在一些实施方案中，多种组分包括乳液(例如胶乳油漆、润滑剂等)。

在一些实施方案中，多种组分是合成/人造的(例如油墨、润滑剂、胶乳油漆、霜、洗剂、燃料、液体推进剂、弹性体)。

在一些实施方案中，多种组分暴露于压力循环下，其中第一、第二和第三液体静力压是压力循环的一部分。

在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于反复的压力循环下。

在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于约1-约1000个压力循环下。

在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于第三液体静力压下，其中第三液体静力压小于第一液体静力压。

在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于第三液体静力压下，其中第三液体静力压等于第一液体静力压。

在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于第三液体静力压下，其中第三液体静力压大于第一液体静力压。

在一些实施方案中，第一液体静力压为约1.33×10^-7MPa-约1000MPa。

在一些实施方案中，第一液体静力压为约0.1MPa-约1000MPa。

在一些实施方案中，第二液体静力压为最多约1000MPa。

在一些实施方案中，第二液体静力压为约100kPa-约1000MPa。

在一些实施方案中，第二液体静力压为约133kPa-约1000MPa。

在一些实施方案中，第一和第二液体静力压之间的压差为约10kPa-1GPa。

在一些实施方案中，在约-40℃-约+100℃(例如，-2℃、25℃、70℃)的温度下进行该方法。

在一些实施方案中，压力为液压或气动压力。

在一些实施方案中，多个液相包括共沸混合物。

在一些实施方案中，多个液相包括在各种特定比例下的各种液体的混合物。

在一些实施方案中，多个液相是两相。

在一些实施方案中，多个液相是三相。

在一些实施方案中，多个液相包括含水溶剂(例如水或缓冲化合物和/或盐的水溶液，例如磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液/盐水、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPPES缓冲液、碳酸氢铵等)。

在一些实施方案中，多个液相包括有机溶剂(含碳溶剂)(例如，乙酸、丙酮、乙腈、异丙醇、叔丁醇、二氯甲烷或甲醇)。

在一些实施方案中，多个液相包括无机非水溶剂，所述溶剂是除了水以外的溶剂，它也不是有机溶剂(例如液氨、液体二氧化硫、磺酰氯氟、磷酰氯、四氧化二氮、三氯化锑、五氟化硼、氟化氢、纯硫酸和另一无机酸)。

在一些实施方案中，多个液相包括氯仿、四氯乙烯、甲醇、异丙醇、乙醇、另一醇(例如氟化醇(例如，1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)、2，2，2-三氟乙醇(TFE)、2-氟乙醇、2，2，3，3-四氟丙-1-醇、1，3-二氟丙-2-醇))、水或脂族烃(己烷、庚烷)、乙腈、甲酸、三氟乙酸、甘油、类脂(例如甘油三酯、磷脂、鞘脂、糖脂、油)、氟烃、其他卤代烃、洗涤剂的溶液、缓冲液、离液剂盐和/或其混合物。

在一些实施方案中，多个液相包括质子溶剂(例如，水、甲醇、乙醇、甲酸、氟化氢或氨)。

在一些实施方案中，多个液相包括非质子溶剂(例如二甲亚砜、二甲基甲酰胺、六甲基磷三酰胺或其混合物)。在一些实施方案中，例如在进一步加工感兴趣的组分之前，从感兴趣的提取组分中除去溶剂。

在一些实施方案中，通过蒸发(例如，在环境温度(例如约20-约23.5℃))或在升高的温度下(例如，高于环境温度的温度，例如约27℃，约30℃，约32℃，约35℃，或约37℃或更大)，除去溶剂。

在一些实施方案中，通过沉淀感兴趣的组分(例如通过添加水)，和例如除去溶剂上清液并用选择的溶剂替换它，从而除去该溶剂。

在一些实施方案中，可使用优化的盐浓度，选择沉淀所需的感兴趣的组分并保留非所需的组分在上清液内反之亦然。例如，可使用这一方法，耗尽高丰度的蛋白质物种的复杂样品(例如，血清白蛋白、免疫球蛋白等)并富集生物重要的低丰度蛋白质。

在一些实施方案中，多种组分提供一个液相或多个液相。

在一些实施方案中，液相是类脂、有机溶剂、含水缓冲液、乳液或固体颗粒的悬浮液。

在一些实施方案中，在液体静力压下由固相形成液相(例如，一个或更多个液相是熔融温度高于提取工艺温度(例如低于0℃)的组分(例如冰))。一旦加压样品(例如，混合物)到预定的液体静力压水平，则发生相转变，和熔融温度高于提取工艺温度的组分(例如，冰)熔融，从而变为液相。

在一些实施方案中，在液体静力压下，例如在液体静力压下，由液相形成固相。

在一些实施方案中，在低渗盐浓度下进行该方法。

在一些实施方案中，在高渗盐浓度下进行该方法。

在一些实施方案中，在等渗盐浓度下进行该方法。

在一些实施方案中，改变盐浓度，选择沉淀感兴趣的组分和/或维持污染物在溶液内。

在一些实施方案中，改变盐浓度，选择沉淀污染物和/或维持感兴趣的组分在溶液内。

在一些实施方案中，样品(例如混合物)包括洗涤剂(例如SDS)。

在一些实施方案中，样品(例如混合物)不含或基本上不含洗涤剂。

在一些实施方案中，样品(例如混合物)包括矿物油、

在一些实施方案中，样品(例如混合物)包括缓冲液(例如磷酸盐缓冲溶液(PBS))。

在一些实施方案中，从生物膜中提取蛋白质。

在一些实施方案中，从类脂相中提取蛋白质。

此处所述的方法的实例如下所述。使用此处所述的方法，可从脂肪组织、大脑、神经、黄油、霜等等中提取蛋白质、核酸或类脂。可从固体颗粒，例如药物或化妆品配方(药膏、洗剂、霜、香波、调节剂、纳米颗粒药物配方等)的乳液或悬浮液中提取成分。可从片剂、胶囊或软明胶胶囊形式的药物配方中提取成分。可从多相组合物，例如固体颗粒的乳液或悬浮液(例如油墨、油漆、清漆、润滑剂、燃料、化学合成用原料等)、脂质体悬浮液、膜小泡等等中提取成分。可从植物材料中提取油、萜烯类和/或亲脂化合物。可从植物(例如，药用植物)中提取各种化合物(例如，生物碱、类黄酮、异黄酮、原花色素、花色甘)。可从食品制剂中提取食品香料成分(例如辣椒碱)。可从植物油或动物脂肪中提取类脂可溶的维生素(例如生育酚、类胡萝卜素、番茄红素等)。可从皮肤和皮下组织中提取局部药物配方成分。

在一些实施方案中，从油漆中提取组分(例如染料)。

在一些实施方案中，从土壤中提取组分。

在一些实施方案中，从固体颗粒的悬浮液中提取组分。

在一些实施方案中，多种组分包括乳液。

在一些实施方案中，多种组分包括类脂或一种或多种组分在类脂或类脂混合物内的溶液。

在一些实施方案中，多种组分进一步包括蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、糖脂、类甾醇、维生素、药物物质或药物代谢产物。在一些实施方案中，多种组分包括细胞或单细胞有机物。

在一些实施方案中，该方法分配多种组分到多个液相中，该方法包括：

提供样品(例如，混合物)，其中该样品(例如，混合物)包括多种组分和多个液相，其中多个液相在环境压力下具有差的相互溶解度，和分级分离多个液相；

将样品(例如，混合物)暴露于增加的压力下，其中增加的压力将增加多个液相的相互溶解度，从而混合相互溶解度差的多个液相，并导致形成亚稳态的混合物；和

降低样品(例如，混合物)的压力，从而降低液相的溶解度并引起多个液相分离成各馏分并导致各组分在多个液相当中分配。

在一些实施方案中，多个液相在环境温度下具有差的相互溶解度。

在一些实施方案中，公开内容提供从多种组分中提取感兴趣的组分的方法。该方法包括：

提供含多种组分和多个液相的样品(例如，混合物)，其中样品(例如，混合物)在第一液体静力压下；

将样品(例如，混合物)暴露于第二液体静力压下，其中第二液体静力压大于第一液体静力压，和在多个液相内的至少两个液相变得部分混溶，从而导致形成混合液相，所述混合液相具有改变的性能并导致至少一种组分溶解；和

将样品(例如，混合物)暴露于第三液体静力压下，其中第三液体静力压低于第二液体静力压和其中将样品(例如，混合物)暴露于第三液体静力压下(例如，从第一到第二到第三压力的过渡压力下)导致从多种组分中分离感兴趣的组分，从而从多种组分中提取感兴趣的组分(例如，在液相之一内增加感兴趣的组分的百分数(或比例))。

在一些方面中，公开方法的特征在于从脂肪组织或具有高类脂含量的另一样品中提取感兴趣的蛋白质。该方法包括：

提供含多种组分和包含高含量的类脂(例如脂肪或大脑组织)，和至少一个液相(或多种液体)(例如，形成互不混溶的液相)的样品(例如，混合物)，其中样品(例如，混合物)在第一液体静力压下；

将样品(例如，混合物)暴露于第二液体静力压下，其中第二液体静力压大于第一液体静力压，从而导致液相在彼此内完全或部分溶解，于是导致感兴趣的蛋白质溶解。该方法可进一步包括：

从第二液体静力压降低压力，于是导致形成额外的一个或更多个液相，于是在液相之间分配多种组分，其中感兴趣的蛋白质被分配到液相内。

在一些实施方案中，含有多种组分的所得液相以馏分形式分离。

在一些实施方案中，液相包括溶剂。

在一些实施方案中，可直接分析含感兴趣的蛋白质的所得液相(例如有机相)，或者可除去溶剂以供进一步加工含感兴趣的蛋白质的液相。

在一些实施方案中，可(例如，在环境温度(例如约20-约23.5℃)或在升高的温度下(例如，高于环境温度的温度，例如约27℃，约30℃，约32℃，约35℃，或约37℃或更大))，通过蒸发除去溶剂。

在一些实施方案中，可通过沉淀感兴趣的蛋白质，除去溶剂上清液并用选择的溶剂替换它，从而除去该溶剂。

在一些实施方案中，可使用优化的盐浓度，以选择沉淀所需的感兴趣的蛋白质并保留非所需的蛋白质在上清液内，反之亦然。例如，可使用这一方法，耗尽高丰度的蛋白质物种的复杂样品(例如，血清白蛋白、免疫球蛋白等)并富集生物重要的低丰度蛋白质。

此处所述的方法的其他特征包括：

在一些实施方案中，公开内容提供蛋白质的提取方法，其中使用循环压力，加速样品溶解。样品可含有蛋白质和/或类脂，例如甘油三酯、磷脂、糖脂、鞘脂等，或其他疏水化合物，例如脂肪酸、脂族烃等。

在一些实施方案中，样品可含有一种或更多种蛋白质。

在一些实施方案中，样品可含有一种或更多种类脂。

在一些实施方案中，样品可含有或者可以是一片脂肪组织。

在一些实施方案中，样品可含有或者可以是大脑组织。

在一些实施方案中，样品可含有或者可以是乳液、悬浮液或胶体。

在一些实施方案中，样品可含有或者可以是乳汁、乳产品、树汁等。

在一些实施方案中，样品可含有或者可以是油漆、工业润滑剂、化妆品，例如霜或洗剂。

在一些实施方案中，通过循环压力加速溶解。

在一些实施方案中，通过机械均化，加速溶解。

在一些实施方案中，通过超声细胞破裂，加速溶解。

在一些实施方案中，通过搅拌、混合、冲击玻璃、陶瓷或金属珠粒、粉碎或共混，加速溶解。

在一些实施方案中，液相含有或者是HFIP、TFE、PFOA、三氯乙醇、三氟乙酸或其他卤代的醇或酸。

在一些实施方案中，液相含有或者是其他有机溶剂(例如，此处所述的有机溶剂)。

在一些实施方案中，液相含有或者是水或含水缓冲液(例如与有机溶剂混合的含水缓冲液)。

在一些实施方案中，液相含有或者是此处所述的数种溶剂的混合物。

在一些实施方案中，通过静态培育(例如，温度范围-20到+50℃)，进行分配。

在一些实施方案中，通过离心(例如，相对离心力：范围为1xg(例如没有旋转)-40,000xg)，加速分配。

在一些实施方案中，若样品衍生的疏水材料不足以形成一层的话，则通过添加疏水液体试剂(例如，油、类脂、矿物油、脂族烃等或其混合物)到样品中，加速分配，以加速相分离。

在一些实施方案中，通过以上所述的方法的任何结合，进行分配。

在一些实施方案中，发生样品溶解，但没有观察到分配(例如，存在太少的类脂)。

在一些实施方案中，在样品溶解之后，形成至少一个液相。

在一些实施方案中，通过移液、滗析、吸收等，物理分离液相。

在一些实施方案中，使用柱色谱法(吸附实例)，分离液相。

在一些实施方案中，在分离液相后，稀释样品(极性相)以诱导沉淀。

在一些实施方案中，没有分离液相，而是稀释样品诱导沉淀。

在另一方面中，公开内容的特征在于从多种组分中提取感兴趣组分(例如蛋白质)的方法。该方法牵涉将多种组分暴露于溶剂，例如1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)、TFE、PFOA、三氯乙醇、三氟乙酸或其他卤代的醇或酸下。暴露于溶剂下可从多种组分中提取感兴趣的组分。该方法还可包括机械步骤(例如，均化步骤)，例如加速提取。作为另一实例，与包括机械步骤不同，该方法可包括将样品暴露于变化的压力下(例如有或无压力循环)。

在一些实施方案中，该方法包括：

提供含多种组分和至少一个液相(例如多个液相)的样品(例如，混合物)，其中液相含有溶剂(例如，HFIP、TFE、PFOA、三氯乙醇、三氟乙酸或其他卤代的醇或酸)；和

在样品(例如混合物)上进行至少一个加工步骤，于是产生至少两个液相，并进而从多种组分中提取感兴趣的组分。

在一些实施方案中，加工步骤包括温度、微波辐射或机械加工中的一种或更多种。

在一些实施方案中，机械加工步骤包括均化(例如物理均化，例如玻璃球搅拌器、超声、转子-定子均化器、Dounce均化器、Potter-均化器)、涡流、超声、移液、剪切(例如注射器剪切)、粉碎(例如研钵和杵子粉碎)、摇动、混合、共混、捶打等等中的一种或更多种。在一些实施方案中，机械加工步骤包括质量传递步骤(例如，剧烈混合、机械摇动或捶打)。

在一些实施方案中，该方法包括同时(协同)或交替施加压力(例如压力循环)和另一类型的加工，例如温度、微波辐射或机械加工(例如，一类(或更多类)的机械加工，单独或与压力或另一类型的加工结合)等。

在一些实施方案中，该方法包括同时(协同)或交替施加两类(或更多类)加工，例如温度、微波辐射或机械加工(例如，两类(或更多类)的机械加工，单独或与压力或另一类型的加工结合)等。

在一些实施方案中，在完成提取之中或当时，液相形成固相。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是蛋白质。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是蛋白质组。

在一些实施方案中，多种组分包括疏水性变化的组分。

在一些实施方案中，多种组分包括(例如提供)多个液相中的一相。

在一些实施方案中，多个液相包括共沸混合物。

在一些实施方案中，多个液相是两相。

在一些实施方案中，多个液相是三相。

在一些实施方案中，样品(例如混合物)包括洗涤剂(例如SDS)。

在一些实施方案中，样品(例如混合物)包括矿物油。

在一些实施方案中，从生物膜中提取蛋白质。

在一些实施方案中，从类脂相中提取蛋白质。

在一些实施方案中，多种组分包括胶体。此处所使用的胶体或胶态分散体是肉眼看起来是均匀溶液的非均相混合物。非均相混合物是两相的混合物，其中一种溶液为一相。在胶体中，分散相由均匀地分布在连续相内的微细颗粒或液滴制成。胶体的实例包括牛奶、霜、气溶胶(例如雾、烟雾、烟)、沥青、油墨、油漆、胶水和海泡石。

在一些实施方案中，多种组分包括乳液。此处所使用的乳液是一类胶体。乳液是两种互不混溶的物质的混合物。一种物质(分散相)分散在另一种(连续相)内。乳液的实例包括黄油和人造黄油、浓咖啡、蛋黄酱、照相底片的光敏侧、金属加工的切割流体、油漆、油墨、润滑剂、局部药剂、洗剂、化妆品制剂等。在黄油和人造黄油中，连续液相包围水滴(油包水乳液)。

在一些实施方案中，多种组分被分配到不含感兴趣组分，例如基本上不含感兴趣组分的液相内。

在一些实施方案中，液相以馏分形式分离。

在一些实施方案中，提取的感兴趣的组分直接与下游工艺(例如分析方法，例如HPLC或LC/MS)相容。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是蛋白质(膜结合蛋白质、跨膜蛋白质、I型或I I型膜蛋白质、受体、酶、脂蛋白、糖蛋白)。在一些实施方案中，在提取过程(或通过完成)提取中，改变蛋白质的结构。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是多糖(例如，肝素或肝素衍生的多糖)、多酚(例如，单宁、苯基丹参素(例如，木质素、类黄酮))、维生素、毒素、污染物、类脂(例如磷脂(例如磷脂酰胆碱(PtdCho)))、磷脂酰乙醇胺(PtdEtm)、磷脂酰肌醇(PtdIns)、磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、糖脂、类甾醇(例如，雌激素、黄体酮、雄激素、睾酮、蜕皮甾族化合物，例如蜕皮甾酮，皮质甾类，例如糖皮质激素和盐皮质激素，促蛋白合成类固醇、胆甾醇、植物甾醇、油菜素甾醇类、麦角固醇)、膜(细胞膜、细胞器膜、类脂双层)、在细菌包涵体内存在的组分、抗原(例如来自细菌)、病毒(例如用于疫苗生产)、药物试剂，例如小分子、代谢产物(例如小分子代谢产物)、药物(例如药学药物)、药物代谢产物、染料、食品成分、纳米颗粒配方、类脂筏和淀粉样蛋白斑(amyloid plaque)、微管、细胞溶质或特定的细胞类型。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是病毒(例如，HIV、HPV、肝炎A、B、C、D、E、F或G，巨细胞病毒、EB病毒、黄热病等等)，或细菌(例如，革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、共生细菌、致病菌)。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是疏水的。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是亲水的。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是兼性的/两亲的。

在一些实施方案中，多种组分包括细胞(例如原核细胞或真核细胞)、细胞器(例如，线粒体、细胞核、高尔基体、叶绿体、内质网、液泡、顶体、中心粒、纤毛、乙醛酸循环体、氢化酶体、溶酶体、黑色体、纺锤剩体、肌原纤维、核仁、桶孔覆垫、过氧化物酶体、核糖体、微粒体、囊泡)、膜、生物样品(组织样品(脂肪组织、肝脏、肾脏、皮肤、胰脏、腹部、肠、结肠、乳腺、卵巢、子宫、前列腺、骨骼、腱、软骨、头发、指甲、牙齿、心脏、肺、皮肤、活检等))、血液、尿液、乳汁、精液、唾液、粘液、其他体液和固体、细胞集合体(例如，血液、精液、粘液、组织活检)。

在一些实施方案中，从固体颗粒的悬浮液中提取组分。

在一些实施方案中，多种组分包括乳剂。

在一些实施方案中，多种组分包括类脂，或在类脂或类脂混合物内的一种或多种组分的溶液。

在一些实施方案中，在例如进一步加工感兴趣的组分之前，从提取的感兴趣的组分中除去溶剂。

在一些实施方案中，通过沉淀感兴趣的组分，和例如除去溶剂上清液并用选择的溶剂替换它，从而除去该溶剂。

在一些实施方案中，在低渗盐浓度下进行该方法。

在一些实施方案中，在高渗盐浓度下进行该方法。

在一些实施方案中，在等渗盐浓度下进行该方法。

在一些实施方案中，使用柱色谱法(吸收的一个实例)，分离液相。

在一些方面中，可使用加工来破坏或改变在例如从膜、细胞、组织和复杂基体中提取分子实体的过程中形成的胶束和/或乳液，尤其当使用表面活性剂或洗涤剂辅助疏水实体在含水提取溶剂内增溶时。采用加工(例如反复采用加工(例如机械加工))可导致破坏胶束和乳液，并基于其物理化学性能，导致样品衍生的分子分配到单独的液相内。

在一些实施方案中，该方法包括同时(协同)或交替施加压力(例如压力循环)和另一类型的加工，例如温度、微波辐射或机械加工等。

此外，公开内容使用溶剂(例如一种或更多种溶剂)提高样品衍生的分子实体在溶剂当中的分配的用途，和该溶剂在环境压力(例如氯仿在水中以0.815％w∶w可溶，己烷在水中仅仅以0.001％w∶w可溶)和室温(例如约25℃)下具有差的相互溶解度。机械加工可改变溶剂的相互溶解度。通过选择合适的溶剂，溶剂量和机械加工量(例如持续时间和/或力)，可临时混合互不混溶的溶剂和待提取的样品，这将导致形成亚稳态混合物，其中所得可溶的溶剂拥有可变的性能，例如溶解样品组分的能力。当分配部分溶解的化合物时，终止或减少这种亚稳态体系的机械加工将导致混合物分离成不同的馏分，并且根据它们各自的物理化学性能，例如分布系数、logP或分布系数logD，在溶剂之间分配分子实体(参见，例如Paternoste等人，Biophys.J.69：2476-2488(1995)和其内引证的参考文献)。在一些实施方案中，在提取过程中，通过使用数种溶剂，可大大地降低或避免使用洗涤剂。

此外，本发明的公开内容描述了三元和更高的溶剂混合物的用途，其中与其他情况下采用任何一种互不混溶的液相，例如水和油相比，采用两亲溶剂(例如溶剂)助长两种或更多种互不混溶的溶剂在较大的程度上混溶。存在两亲溶剂进一步提高机械加工的能力，以改变在彼此内溶剂的相互溶解度，并且当减少或终止机械加工时，加速待提取的样品(例如混合物)中各组分分配到不同相内。两亲溶剂可与水相(通过氢键键合)以及与油和类脂通过疏水相互作用形成稳定的缔合。因此，在一些实施方案中，通过机械加工促进在两亲溶剂内多组分样品的溶解将导致亲脂和亲水化合物相分离成两个或更多个液相，随后可机械分离所述液相。

在一个方面中，本发明公开的方法的特征在于从多种组分中提取感兴趣的组分的方法。该方法包括：

提供含有多种组分和至少一个液相(例如多个液相)(例如，形成互不混溶的液相)的样品(例如混合物)；

在样品(例如混合物)上进行第一加工步骤，导致形成悬浮液、淤浆、乳液、胶束或额外的液相；

减少或终止加工步骤，从而从多种组分中提取感兴趣的组分(例如增加感兴趣的组分在液相之一内的百分数(或比例))。

在一些实施方案中，机械加工步骤包括均化(例如物理均化，例如玻璃球搅拌器、超声、转子-定子均化器、Dounce均化器、Potter-均化器)、涡流、超声、移液、剪切(例如注射器剪切)、粉碎(例如研钵和杵子粉碎)、摇动、混合、共混、捶打等等中的一种或更多种。在一些实施方案中，机械加工步骤包括质量传递步骤(例如，剧烈混合、机械摇动或捶打)。在一些实施方案中，机械加工步骤包括质量传递步骤(例如，剧烈混合、机械摇动或捶打)。

在样品(例如混合物)上进行第一机械加工步骤，导致形成悬浮液、淤浆、乳液、胶束或额外的液相；

降低(减少)或终止机械加工步骤，从而从多种组分中提取感兴趣的组分(例如增加感兴趣的组分在液相之一内的百分数(或比例))。

在一些实施方案中，该方法包括同时(协同)或交替施加机械加工步骤和压力(例如压力循环)或另一类型的加工，例如温度、微波辐射或机械加工等。

在一些实施方案中，多种组分包括疏水性变化的组分。

在一些实施方案中，在完成提取过程中或者当时，液相形成固相。

在一些实施方案中，多种组分包括胶体。此处所使用的胶体或胶态分散体是非均相的混合物，它肉眼看起来是均匀的溶液。非均相混合物是其中一种溶液为一相的两相混合物。在胶体中，分散相由均匀地分布在连续相当中的微小颗粒或液滴制成。胶体的实例包括乳、霜、气溶胶(例如，雾、烟雾、烟)、沥青、油墨、油漆、胶水和海泡石。

在一些实施方案中，在第一机械加工步骤之前，至少两个液相不混溶。

在一些实施方案中，在进行机械加工步骤之后，至少两个液相混溶(例如完全混溶)。

在一些实施方案中，在机械加工之前，至少两个液相不可溶。

在一些实施方案中，在进行第一机械加工步骤之后，至少两个液相部分可溶。

在一些实施方案中，在进行第一机械加工步骤之后，至少两个液相完全可溶。

在一些实施方案中，终止第一机械加工步骤。在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于第二机械加工步骤下，其中第二机械加工步骤具有与第一机械加工步骤相同类型的机械加工，或者具有不同类型的机械加工步骤。

在一些实施方案中，进行第二机械加工步骤，且它具有与第一机械加工步骤相同类型的机械加工，或者具有不同类型的机械加工步骤。在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于第三机械加工步骤下，所述第三机械加工步骤具有与第一或第二机械加工步骤相同类型的机械加工，或者具有与第一或第二机械加工步骤不同类型的机械加工步骤。

在一些实施方案中，减少或终止机械加工步骤将导致至少两个液相分离成单独的相，和感兴趣的组分被分配到至少两个液相之一内。

在一些实施方案中，样品(例如混合物)包括含试剂的辅助容器。在一些实施方案中，暴露于第一、第二或第三机械加工步骤下将引起辅助容器释放其内容物，从而引入该试剂到样品(例如混合物)内。

在一些实施方案中，以馏分形式分离液相。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是疏水的。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是亲水的。

在一些实施方案中，感兴趣的组分是兼性的/两亲的。

在一些实施方案中，在多种组分上进行机械加工步骤一次以上。

在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于反复的机械加工步骤下。

在一些实施方案中，将样品(例如混合物)暴露于约1-约1000个机械加工步骤下。

在一些实施方案中，进行相同类型的机械加工步骤。

在一些实施方案中，进行不同类型的机械加工步骤。例如，可进行一种或更多种下述的一个或更多个步骤：均化(例如物理均化，例如玻璃球搅拌器、超声、转子-定子均化器、Dounce均化器、Potter-均化器)、涡流、超声、移液、剪切(例如注射器剪切)、粉碎(例如研钵和杵子粉碎)、摇动、混合、共混和捶打。

在一些实施方案中，多个液相包括共沸混合物。

在一些实施方案中，多个液相是两相。

在一些实施方案中，多个液相是三相。

在一些实施方案中，多个液相包括氯仿、四氯乙烯、甲醇、异丙醇、乙醇、另一醇(例如氟化醇(例如，1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HF I P)、2，2，2-三氟乙醇(TFE)、2-氟乙醇、2，2，3，3-四氟丙-1-醇、1，3-二氟丙-2-醇))、水或脂族烃(己烷、庚烷)、乙腈、甲酸、三氟乙酸、甘油、类脂(例如甘油三酯、磷脂、鞘脂、糖脂)、氟烃、其他烃、洗涤剂的溶液、缓冲液、离液剂盐和/或其混合物。

在一些实施方案中，多个液相包括非质子溶剂(例如二甲亚砜、二甲基甲酰胺、六甲基磷三酰胺或其混合物)。

在一些实施方案中，例如在进一步加工感兴趣的组分之前，从感兴趣的提取组分中除去溶剂。

在一些实施方案中，可使用优化的盐浓度来选择沉淀所需的感兴趣的组分并保留非所需的组分在上清液内，反之亦然。例如，可使用这一方法，耗尽高丰度的蛋白质物种的复杂样品(例如，血清白蛋白、免疫球蛋白等)并富集生物重要的低丰度蛋白质。

在一些实施方案中，多种组分提供一个液相或多个液相。在一些实施方案中，液相是类脂、有机溶剂、含水缓冲液、乳液或固体颗粒的悬浮液。在一些实施方案中，当机械加工时，由固相形成液相(例如，一个或更多个液相是熔点高于提取工艺温度(例如低于0℃)的组分(例如，冰)。一旦在样品(例如混合物)上进行机械加工步骤，则发生相转变和熔融温度高于提取工艺温度的组分(例如，冰)熔融，从而变为液相。

在一些实施方案中，在低渗盐浓度下进行该方法。

在一些实施方案中，在高渗盐浓度下进行该方法。

在一些实施方案中，在等渗盐浓度下进行该方法。

在一些实施方案中，样品(例如混合物)包括洗涤剂(例如SDS)。

在一些实施方案中，样品(例如混合物)包括矿物油、

在一些实施方案中，从生物膜中提取蛋白质。

在一些实施方案中，从类脂相中提取蛋白质。

在一些实施方案中，从油漆中提取染料。

在一些实施方案中，从土壤中提取组分。

在一些实施方案中，从固体颗粒的悬浮液中提取组分。

在一些实施方案中，多种组分包括乳液。

在一些实施方案中，该方法在多个液相当中分配多种组分，该方法包括：

提供样品(例如混合物)，其中样品(例如混合物)包括多种组分和多个液相，其中分级分离多个液相；

在样品(例如混合物)上进行第一机械加工步骤，其中该机械加工将增加多个液相相互的溶解度，于是混合相互溶解度差的多个液相并导致形成亚稳态混合物；和

在样品(例如混合物)上进行第一机械加工步骤，于是降低液相的溶解度并引起多个液相分离成多个部分，并导致在多个液相当中分配组分。

在一些实施方案中，公开内容提供从多种组分提取感兴趣的组分的方法。该方法包括：

提供含多种组分和多个液相的样品(例如混合物)，其中该样品(例如混合物)；

在样品(例如混合物)上进行第二机械加工步骤，其中第二机械加工步骤是与第一机械加工步骤不同类型的机械加工，和在多个液相内的至少两个液相变得部分混溶，从而导致形成具有变化的性能的混合液相，并导致至少一种组分溶解；和

在样品(例如混合物)上进行第三机械加工步骤，其中第三机械加工步骤是与第一或第二机械加工步骤不同类型的机械加工，和其中在样品(例如混合物)上进行第三机械加工步骤导致感兴趣的组分与多种组分相分离，从而从多种组分中提取感兴趣的组分。

在一些实施方案中，液相包括溶剂。

在一些实施方案中，可直接分析含有感兴趣的蛋白质的所得液相(例如有机相)或者可除去溶剂以供进一步加工含感兴趣的蛋白质的液相。

在一些实施方案中，通过沉淀感兴趣的蛋白质，除去溶剂上清液并用选择的溶剂替换它，从而除去该溶剂。

在一些实施方案中，可使用优化的盐浓度，选择沉淀所需的感兴趣的蛋白质并保留非所需的蛋白质在上清液内，反之亦然。例如，可使用这一方法，耗尽高丰度的蛋白质物种的复杂样品(例如，血清白蛋白、免疫球蛋白等)并富集生物重要的低丰度蛋白质。

此处所述的方法的其他特征包括：

在一些实施方案中，公开内容提供蛋白质的提取方法，其中使用循环压力，加速样品溶解。样品可含有蛋白质和/或类脂，例如甘油三酯、磷脂、糖脂、鞘脂等或其他疏水化合物，例如脂肪酸、脂族烃等。

在一些实施方案中，样品可含有一种或更多种蛋白质。

在一些实施方案中，样品可含有一种或更多种类脂。

在一些实施方案中，样品可含有或者是一片脂肪组织。

在一些实施方案中，样品可含有或者是大脑组织。

在一些实施方案中，样品可含有或者是乳液、悬浮液或胶体。

在一些实施方案中，样品可含有或者是乳汁、乳产品、树汁等。

在一些实施方案中，通过机械加工，例如机械均化、超声细胞干扰、搅拌、混合、冲击玻璃、陶瓷或金属珠粒、粉碎或共混，加速溶解。

在一些实施方案中，若样品衍生的疏水材料不足以形成一层的话，则通过添加疏水液相(例如，油、类脂、矿物油、脂族烃等或其混合物)到样品中，加速分配，以加速相分离。

在一些实施方案中，在样品溶解之后，形成至少一个液相。

在一些实施方案中，使用柱色谱法(吸附实例)，分离液相。

术语“混溶”或“混溶度”是指液体在所有比例下混合，形成均匀溶液的性能。水和乙醇例如在所有比例下混溶。据说若在任何比例下，它们没有形成溶液，则是“互不混溶”或“不混溶”的。

术语“可溶”或“溶解度”是指一种物质在另一种内溶解的能力。据说若一种物质不能在另一种物质内溶解，例如至少约90％(wt)，约92％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或约100％的物质不可溶(不能溶解)，则该物质是“不溶”或“不可溶”或“可溶性差”。据说，若一种物质在另一种物质内能溶解，例如至少约90％(wt)，约92％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或约100％可溶，则该物质是“完全可溶”的。若一种物质在一定程度上能在另一种物质内溶解，例如至少约10％(wt)，约15％，约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或一直到约90％的物质可溶，则该物质是“部分可溶”的。

固体具有确定的体积和形状。

液体具有确定的体积，但能改变其形状，例如通过流动来改变其形状。

气体不具有确定的体积或形状。

此处引证的所有专利、专利申请和参考文献在此通过参考全文引入。在冲突的情况下，参考本申请。

在附图和下述说明中列出了本发明的一个或更多个实施方案的细节。根据说明书和附图，和根据权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。

附图说明

图1A和1B是阐述压力循环的示意图。

图2是可用于分配各组分和溶剂的装置的示意图。

图3是阐述通过压力循环介导的液液分配的示意图。

图4是显示在此处所述的方法中，作为细胞数量的函数的DNA回收率的线性图表。

详细说明

样品，例如复杂生物样品中各种组分的提取和随后分析对于药物研发、诊断和生物药物与环境研究来说是重要的。

许多分析方法使用待分析的分子实体的溶液，然而，许多样品(例如，大多数生物样品)以各种互不混溶的化合物，例如类脂、蛋白质、核酸、小分子实体等等的胶体、凝胶、高度组织化和/或划区化(compartmentalized)混合物形式存在。这种复杂体系典型地含有拥有宽泛的各种物理化学性能，例如在特定溶剂内的溶解度或混溶度、疏水性、静电荷、大小和结构的分子实体。一些分子实体(例如，细胞质、液泡、细胞器)被类脂屏障，例如生物膜包围，而其他(例如，膜蛋白质、类脂筏)包埋在类脂内。

分子实体的物理化学性能的多样性常常导致一些组的分子实体在给定提取溶剂内的回收不充分。例如，含水提取缓冲液可回收细胞质中的一些成分，例如可溶蛋白质和小分子，同时留下疏水膜蛋白质和类脂。

本发明的公开内容提供提取方法，在一些情况下，从例如细胞和组织之类的资源中溶解分子实体。提取以化学试剂的选择为基础。可影响提取的因素包括一种或更多种：溶剂的选择、缓冲液的选择、多相混合物(例如互不混溶的试剂(例如，液体、气体或固体))的选择、反应温度，和洗涤剂的选择。在一些实施方案中，该试剂与压力循环(例如液体静力压)结合使用。可影响提取的因素也可包括一种或更多种：最大压力、最小压力、压力循环的次数和压力循环的长度。在一些实施方案中，该试剂与机械加工结合使用。可影响提取的因素也可包括一种或更多种：所使用的机械加工的类型、机械加工的持续时间、所采用的机械加工的长度等等。

此处所述的方法的特征包括：

-较少或者不使用表面活性剂或洗涤剂提取；

-直接与下游分析应用，例如液相色谱、电泳和质谱相容；

-疏水蛋白质的较高的回收产量(和/或较好质量的产量)；

-从含高含量类脂的样品，例如脂肪或大脑组织，或者富含生物膜的样品中更加完全地提取疏水分子；

-单一步骤提取大于一组分子实体(例如蛋白质、类脂、核酸和小分子代谢产物；杀虫剂和药物滥用，药物制剂；纳米颗粒配方；食品成分等)；

-样品处理和分级分离的方便规格(format)；

-允许人们从通过常规方法不可能提取的样品中提取分析物的替代分级分离技术；

-允许人们确定常规方法是否无法从样品中提取一些分析物的替代分级分离技术；

-氟化醇和/或其他两亲溶剂或其结合物，允许单一的提取试剂产生类脂提取物和极性提取物作为两个不同的馏分；

-压力循环有助于组织均化和清洁分离各馏分；和

-该方法可加速对胶束形成的控制-并提供产生或改性具有所需特征的胶体、纳米颗粒、乳液的工序。

压力

可使用液体静力压(例如压力循环)改变溶剂在混合物(例如共沸混合物、溶液、悬浮液或多相混合物)内的相互溶解度或混溶度；控制分子在胶束、乳液、凝胶或胶体内的排列；和/或控制多相混合物中一种或更多种组分在另一组分或溶剂内的溶解。压力变化可导致各组分的相互溶解度变化，和体系的解压可引起混合物分解成多相，从而基于物理化学性能，将各分子分离成的单独的相。

可使用液体静力压，通过在一种溶剂内溶解组分，混合第一溶剂和另一种溶剂，从而当第一溶剂在大气压下时，导致形成互不混溶的多相混合物，以便制备胶体或纳米材料。也可使用压力，控制胶束在多相体系或乳液内的大小，以改变其物理性能或稳定性。

可例如以液压或气动压力形式施加压力。

压力循环是将样品暴露于大于一种压力下，在每一压力下一段时间，例如升高压力和降低压力，例如是从第一压力变化为第二压力，然后从第二压力下降到第三压力的总和。此外，可进行第二压力循环，例如从第三压力到第四压力到第五压力，等等。可反复这一工艺。例如，压力循环可由将样品(例如暴露于压力循环下的混合物，例如含感兴趣的组分的混合物)暴露于第一压力下第一时间段，和将样品暴露于第二压力下第二时间段，然后将混合物暴露于第三压力下第三时间段。然而，对样品可暴露于其下的压力次数没有限制，并在每一压力下花费的时间段不必相同。在图1A和1B中提供了压力循环的实例。如图1B所示，将样品暴露于第一压力下一个时间段(t₁)。然后将该样品暴露于第二压力下一个时间段(t₂)。然后将该样品暴露于第三压力下一个时间段(t₃)。可将样品暴露于各种压力下各种时间段(t_n)。这些暴露于每一压力下每一时间段的总和是压力循环。在一些实施方案中，将样品暴露于比第一或第二压力大的压力下一定时间段(在图1B中以t_n-1形式示出)。暴露于这一压力下可例如引入试剂到待暴露于压力循环下的混合物或腔室内(例如含有待暴露于压力循环下的混合物的腔室)，这通过含这种试剂的辅助容器破裂来实现。

所使用的最大压力可以是约100MPa-约1,000MPa，例如约100MPa-约900MPa，约200MPa-约800MPa，约300MPa-约700MPa，约400MPa-约600MPa，约100MPa-约350MPa，约250MPA-约500MPa。例如，最大压力可以是约15-约35kpsi(35kpsi＝235mPa)，或约80kpsi(537MPa)，或约30kpsi，或约240MPa。

所使用的最小压力可以是约133Pa-约200MPa，例如约150Pa-约150MPa，约200Pa-约100MPa，约350Pa-约75MPa，约500Pa-约50MPa，750Pa-约35MPa，约1MPa-约25MPa，约1kPa-约1MPa，约25kPa-约250kPa，约50kPa-约500kPa，约100kPa-约300kPa，约250kPa-约750kPa，约1MPa-约100MPa，约25MPa-约200MPa，约50MPa-约100MPa，约100MPa-约200MPa，约135Pa-约500Pa，约150kPa，约100MPa。在一些实施方案中，所使用的最小压力是海平面处的大气压，例如约100kPa(e.g.，0.1MPa)，例如，101.3kPa。

在一些实施方案中，所选的最大和最小压力以提供最小或最大压差值为基础。例如，最大和最大压力差不大于200MPa。作为另一实例，最小和最大压差不小于100kPa。

所使用的压力循环的次数(例如，升高和随后降低压力的次数，例如压力从第一数值变化到第二数值到第三数值(例如低于第二值)的次数)也是影响提取的困素。例如，压力循环次数的范围可以是约1个循环-约1000个循环，例如约5个循环-约800个循环，约10个循环-约500个循环，约20个循环-约250个循环，约30个循环-约150个循环，约50个循环-约100个循环，约100-约300个循环，约200-约400个循环，约50-约150个循环，约5-约35个循环，约10-约25个循环。在一些实施方案中，压力从第一压力循环到第二压力(例如高于第一压力)到第三压力(例如低于第二压力；第三压力可以与第一压力不相同)等等。在这些实施方案中，包括所有三个(或更多个)压力作为循环的一部分。

压力循环的长度(在该循环中花费的时间的总量，即在第一压力上花费的时间量加上在第二压力下花费的时间量，加上在任何额外的压力(例如第三压力、第四压力等等)下花费的时间量)也是重要的。例如，循环的长度可以是约5秒-约60分钟，例如，约10秒，约20秒，约30秒，约45秒，约60秒，约2分钟，约3分钟，约4分钟，约5分钟，约6分钟，约7分钟，约8分钟，约9分钟，约10分钟，约11分钟，约12分钟，约15分钟，约20分钟，约25分钟，约30分钟，约35分钟，约40分钟，约45分钟，约50分钟，约55分钟，约60分钟。在许多实施方案中，在第一和第二压力下的时间长度相同。例如在20秒的循环内，混合物在第一压力下10秒，和在第二压力下10秒。

在给定压力水平(例如在第一或第二或第三压力下)下花费的时间长度可以是例如约5秒-约30分钟，e.g.，约10秒，约20秒，约30秒，约45秒，约60秒，约2分钟，约3分钟，约4分钟，约5分钟约6分钟，约7分钟，约8分钟，约9分钟，约10分钟，约11分钟，约12分钟，约15分钟，约20分钟，约25分钟，约30分钟。在许多实施方案中，在第一和第二压力下的时间长度相同。例如在20秒的循环内，混合物在第一压力下10秒，和在第二压力下10秒。

可基于溶剂的性能和多种组分中组合物的性能，需要优化在特定压力水平下的暴露。因此，在一个压力下花费的时间长度可能需要长于在其他压力下花费的时间。在一些实施方案中，混合物在每一压力下可以具有不同的时间量。例如，混合物可在第一压力下10秒和在第二压力下30秒。

压力循环的进一步实例如下所述：

在海平面处的大气压(101.3kPa)下开始，接着100MPa保持5秒和在海平面处的大气压(101.3kPa)下保持30秒，20个循环；

在海平面处的大气压(101.3kPa)下开始，接着240MPa保持20秒和在海平面处的大气压(101.3kPa)下保持20秒，50个循环；和

在100MPa下开始，接着413MPa下保持10秒，接着200MPa下保持10秒，接着100MPa下保持10秒，重复该顺序超过10个循环。

在循环内牵涉三个压力的一些实施方案中，压力循环的长度为在第一、第二和第三循环下花费的时间总量。

压力循环参数的实例包括：在35kpsi下5个1分钟的循环，其中压力保持在241MPa下30秒，接着在约101.3kPa(大气压)下30秒；其中在每一循环内，在100MPa下保持5秒和大气压(101.3KPa)下保持30秒的20个循环；其中压力在500MPa下保持10秒，接着在200MPa下20秒的步骤，然后接着在100MPa下30秒，从而导致每一压力循环1分钟的30个循环。

加工步骤

可例如与此处所述的溶剂结合和/或与压力变化结合，使用加工(例如机械加工)，以改变样品在混合物(例如，共沸混合物、溶液、悬浮液或多相混合物)内组分和/或溶剂的溶解度或混溶性；控制分子在胶束、乳液、凝胶或胶体内的排列；和/或控制多相混合物中的一种或更多种组分在另一组分或溶剂内的溶解。在机械加工体系中的组分之后，可分离成多相，从而基于物理化学性能，在单独的相内分配分子。

可例如与此处所述的溶剂结合和/或与压力变化结合，使用加工(例如机械加工)，通过在一种溶剂内溶解组分，和/或混合第一溶剂与另一溶剂，制备悬浮液、淤浆、乳液、胶束、额外的液相、胶体或纳米材料，从而导致形成互不混溶的多相混合物。

加工的实例包括温度、微波辐射和机械加工。

机械加工的实例包括均化(例如物理均化，例如玻璃球搅拌器、超声、转子-定子均化器、Dounce均化器、Potter-均化器)、涡流、超声、移液、剪切(例如注射器剪切)、粉碎(例如研钵和杵子粉碎)、摇动、混合、共混、捶打。机械加工可包括质量传递步骤(例如，剧烈混合、机械摇动或捶打)。

可控制和/或调节加工(例如机械加工)。变量包括：加工的持续时间，反复加工步骤的次数，加工步骤的强度(例如施加到样品上的力)，进行加工时的温度，等等。

可与此处提供的方法一起使用一类或更多类加工(例如机械加工)。此外，可在此处提供的方法中，结合一类或更多类加工(例如机械加工)与压力循环。

温度

提取方法进行时的温度也可影响该工艺。温度可增加样品(例如生物膜)的无序度，并有助于提取感兴趣的分子实体(例如组分)。

例如，可在约-40℃-+100℃，例如约20℃-约70℃，约0℃-约50℃，4℃-约37℃，约10℃-约30℃，约15℃-约25℃，约20℃，约23℃，约25℃，约70℃或约-2℃下进行提取方法。

可通过溶剂和样品组分的性能影响在该方法中使用的温度的选择。可通过以1℃递增式地改变(增加或降低)温度，从而优化温度。可例如通过循环水浴，调节进行该方法时的温度。

也可进行提取方法，以便温度和压力在每一循环内变化，因为温度变化将进一步改变溶剂和样品组分的相互溶解度，即可协同使用温度和压力。例如，在该循环内的第一压力下，样品(混合物)在第一温度下；在该循环的第二压力下，样品(混合物)在第二温度下。在一些实施方案中，第一温度高于第二温度。在其他实施方案中，第二温度高于第一温度。

也可进行提取方法，以便温度随加工(例如机械加工)而变化，因为温度变化将进一步改变溶剂和样品组分的相互溶解度，即可协同使用温度和机械加工。例如，在加工(例如机械加工)之前，样品(混合物)在第一温度下；在加工(例如机械加工)过程中，样品(混合物)在第二温度下。在一些实施方案中，第一温度高于第二温度。在其他实施方案中，第二温度高于第一温度。

液体

可在此处提供的提取方法中的液相中使用各种液体。例如，可使用溶剂、洗涤剂、缓冲液、离液剂(例如离液剂盐)及其混合物。

溶剂

可在此处所述的提取方法中使用各种溶剂。例如，溶剂可以是含水、有机溶剂或类脂。溶剂体系可形成多相混合物(例如互不混溶的试剂)，例如该体系可以是两相或三相。

在优选的实施方案中，使用至少两个溶剂相(例如液相)，且至少两个溶剂相在压力循环的压力之一下不混溶(例如溶剂相在第一压力下不混溶)。然而，当压力循环时，两个溶剂相在其他压力下(例如在第二压力下，其中第二压力大于第一压力)至少部分混溶(和在一些情况下，部分可溶)。当返回到第一压力(或过渡到比第二压力低的第三压力)时，部分相互混溶度丧失且溶剂相分离。在一些实施方案中，取决于所使用的溶剂相的选择，溶剂相在第二压力下可完全混溶(和在一些情况下，完全可溶)。

在其他优选的实施方案中，使用至少两个溶剂相(例如液相)，且在加工(例如机械加工)之前，至少两个溶剂相不混溶(例如溶剂相不混溶)。然而，当加工(例如机械加工)时，两个溶剂相至少部分混溶(和在一些情况下，部分可溶)。一旦终止(或减少)加工(例如机械加工)，部分相互混溶性丧失，溶剂相分离。在一些实施方案中，取决于所使用的溶剂相的选择，溶剂相在加工(例如机械加工)时可完全混溶(和在一些情况下，完全可溶)。

溶剂的实例包括乙酸、丙酮、乙腈、苯、1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、叔丁醇、四氯化碳、氯苯、氯仿、环己烷、1，2-二氯乙烷、二乙醚、二甘醇、二甘醇二甲醚(二乙二醇二甲醚)、1，2-二甲氧基乙烷(聚乙烯醚类(glyme)，DME)，二甲醚、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二恶烷、乙醇、乙酸乙酯、乙二醇、甘油、庚烷、六甲基磷酰胺(HMPAA)、六甲基磷三酰胺(HMPT)、己烷、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)、二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、硝基甲烷、戊烷、石油醚(石油英)、1-丙醇、2-丙醇、吡啶、四氢呋喃(THF)、甲苯、三乙胺、水、重水(D₂O)、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯及其混合物。

溶剂也可分类为质子或非质子溶剂。质子溶剂的实例包括水、甲醇、乙醇、甲酸、氟化氢和氨水。非质子溶剂的实例包括二甲亚砜、二甲基甲酰胺、六甲基磷三酰胺及其混合物。

也可使用此处所述的任何溶剂的混合物。

可用于实践本发明方法的溶剂的非限定性实例包括氯仿、四氯乙烯、甲醇、异丙醇、乙醇、水、脂族烃(例如己烷、庚烷)、乙腈、甲酸、三氟乙酸、甘油、类脂(例如例如来自样品本身，例如来自生物膜(例如类脂膜；类脂双层的)甘油三酯、磷脂、鞘脂、糖脂)，或水溶液(例如来自于样品本身，例如来自于生物膜或细胞质的液体组分)、氟烃、其他烃、二甲亚砜(DMSO)、氟化醇(例如两亲氟化醇)(例如，1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)、2，2，2-三氟乙醇(TFE)、2-氟乙醇、2，2，3，3-四氟丙-1-醇、1，3-二氟丙-2-醇、全氟辛醇)、其他醇，及其混合物。在一些实施方案中，样品(例如组分源)提供(例如充当)溶剂。在一些情况下，来自样品的这一溶剂构成提取体系中液相之一。例如，在膜蛋白质的提取中，在合适的条件下，类脂双层在提取方法中充当溶剂和充当液相。(例如，膜蛋白质溶解在类脂双层内)。

可优化溶剂的浓度。浓度的实例包括：约0.2M HFIP；约0.05MHFIP；约0.38M-约0.57M HFIP；约60％HFIP；约75％HFIP；约95％HFIP；约100％HFIP；约1％-约5％甲酸。可由各种其他溶剂(例如乙腈)或缓冲液(例如磷酸盐缓冲的溶液(PBS))构成溶剂。可在此处所述的方法中使用溶剂本身，构成一相。或者，溶剂(例如此处列出的溶剂)可以是与另一组分(例如液体，例如另一溶剂)一起构成一个溶剂相的溶剂。例如，含0.1％甲酸的50％乙腈可构成溶剂相，正如此处的实施例中所述。

单一溶剂相可包括溶剂的结合物。例如，溶剂相可以是比值为2∶5∶2或4∶4∶1(w∶w∶w)的氯仿∶甲醇∶水；或者比值为1∶1(w∶w)的甲醇∶氯仿。作为另一实例，含0.1％甲酸的50％乙腈可用作溶剂相。

溶剂可包括共沸混合物，或当溶剂相暴露于增加的(例如第二)压力下时，可形成共沸混合物。由于主要在蒸馏应用中研究溶剂混合物的共沸性能，因为所得共沸混合物的沸腾温度不同于其成分溶剂的沸点，因此通过显示出变化的溶解度和溶解其他化合物的能力，共沸混合物起到不同溶剂的作用。液体静力压将改变共沸溶剂混合物的性能，因为它将改变单独的溶剂的性能。可存在于溶剂相内的共沸混合物或者当暴露于第二压力下时可形成共沸混合物的实例包括95.5％乙醇和4.5％水(w∶w)；20.2％氯化氢和79.8％水(w∶w)；1.2％水和98.8％二乙醚(w∶w)；20％丙酮和80％氯仿(w∶w)；30％丙酮、47％氯仿和23％甲醇(w∶w∶w)。

在一些实施方案中，将一种或更多种溶剂加入到样品(例如用于提取的组分源)中，这将导致形成两个或更多个液相。例如，添加溶剂，例如两亲物，例如HFIP到含一个或更多个亲水和/或极性组分和一种或更多种类脂的样品中将导致形成含一种或更多种亲水和/或极性组分和一种或更多种类脂的稳定混合物(例如当暴露于增加的压力水平下时或者当加工(例如机械加工)时)。当压力下降或者终止(或减少)加工(例如机械加工)时，一种或更多种亲水和/或极性相(例如HFIP)和一种或更多种类脂分离成两个或更多个液相，例如进而导致各组分分离成亲水和/或极性相或液相，例如导致感兴趣的组分分离。在一些优选的实施方案中，将一种溶剂加入到样品(例如用于提取的组分源)中，这将导致形成两个或更多个液相，例如样本提供溶剂(例如液相)。例如，添加溶剂，例如两亲物，例如HFIP到含水和类脂的样品中将导致形成具有水和类脂的稳定混合物(例如当暴露于增加的压力水平下时或者当加工(例如机械加工)时)。当压力下降或者终止(或减少)加工(例如机械加工)时，水(例如和HFIP)和类脂分离成两个或更多个液相，例如进而导致各组分分离到水和类脂相内，例如导致感兴趣的组分分离。

在一些实施方案中，可需要除去有机溶剂(例如挥发性有机溶剂)(例如，HFIP)。例如可通过蒸发，除去挥发性有机溶剂。在一些实施方案中，可通过沉淀感兴趣的组分，实现挥发性有机溶剂的除去。随后，可从所得粒料中分离残留溶剂。可通过添加合适的组分，例如水溶液，从溶剂，例如HFIP中实现沉淀。可通过样品浓度、温度、pH、时间、压力和其他溶质，例如盐、离液剂、洗涤剂或其他组分的添加，来改进沉淀效率。

缓冲液

可在此处所述的提取方法中使用各种缓冲液。例如，可在该方法的溶剂相中使用PBS。可使用宽泛的各种缓冲液，维持提取溶剂的所需pH并维持所需组分在特定溶剂内的溶解度和与随后的分析方法的相容性。这种缓冲液的实例包括HEPES、TRIS、MES、碳酸氢铵、乙酸铵、甲酸、三氟乙酸、乙酸等。

可使用盐的各种浓度，控制在细胞材料的选择提取过程中的渗透压。例如，可在来自哺乳动物细胞的各种组分的提取中使用0.9％氯化钠。在压力循环应用中，渗透压可与加工(例如机械加工)或者与液体静力压协同起作用。例如，在提取溶液中的低渗浓度可导致细胞溶胀且可与加工(例如机械加工)或者与压力循环处理协同起作用，以破坏细胞的原生质膜。相反，可在一定的压力循环(或加工(例如机械加工))条件下，使用高渗盐浓度，保护细胞避免破坏，如果希望这一结果的话。例如，对于哺乳动物的细胞来说，低于约0.9％的氯化钠浓度是低渗的，和高于约0.9％的浓度为高渗的。

洗涤剂和离液剂

可将洗涤剂或离液剂(例如离液盐)加入到溶剂相中，以辅助感兴趣的分子实体(例如组分)的提取。在一些实施方案中，所使用的洗涤剂或离液剂的用量可以小于已知分配技术，例如不使用此处所述的溶剂或以机械摇动为基础的技术(例如在不存在此处所述的溶剂的情况下)所使用的用量。在一些实施方案中，当在此处所述的方法中使用洗涤剂时，在提取过程中没有形成泡沫。

可使用的洗涤剂的实例包括阴离子洗涤剂(例如SDS、胆酸盐、脱氧胆酸盐)；阳离子洗涤剂(例如，C16TAB)；两性洗涤剂(例如LysoPC、CHAPS、兼性离子(Zwittergent)3-14)；和非离子洗涤剂(例如，辛基糖苷、洋地黄皂苷、C12E8、Lubrol、Triton X-100、NonidetP-40、Tween 80)。数种两亲有机溶剂，例如氟化醇(HFIP、TFE、全氟辛醇等)常常被视为具有洗涤剂功能。可单独或结合使用这种溶剂作为其他溶剂和缓冲液体系，例如此处所述的溶剂和缓冲液体系的添加剂。

所使用的洗涤剂的浓度可以是例如约0.001％-约10％，例如约0.1％-约2％，例如约0.5％-约4％，例如约1％-约2％。

在一些实施方案中，液相(例如结合的液相)不含或基本上不含洗涤剂。

也可使用离液剂。这种试剂的实例包括脲、氯化胍鎓盐(guanidinium chloride)、异硫氰酸胍鎓盐和盐酸胍。所使用的浓度可以是约约0.1M-约8M。离液剂的实例包括例如在美国专利No.7,064,192和美国公布申请Nos.2006-0188970、2004-0038333、2003-0083475和2002-0137157中所述的那些。

液体内的其他组分

此处所述的液相可任选地含有额外的试剂。例如，酶抑制剂，例如一种或更多种蛋白酶抑制剂(例如，丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶和氨基肽酶)(例如，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(AEBSF))、胃蛋白酶抑制剂A、E-64、抑胺肽酶、亮肽素和抑肽酶)、DNAse抑制剂(例如，金精三羧酸)、RNAse抑制剂(例如，二乙基焦碳酸酯(DEPC)、三氟乙酸铈(CsTFA)、重组胎盘RNAse抑制剂、SUPERASE′IN^TM、ANTI-Rnase或RNASECURE^TM(Ambion)、SCRIPTGU ARD^TM(EpicentreBiotechnologies)、DEPC)、金属螯合剂(例如，DTPA、EDTA、EGTA、NTA、去铁胺)等等可加入到液相，例如稳定感兴趣的组分，例如待提取的组分中。

作为另一实例，可在液相内包括矿物油。添加矿物油到样品中可改进带的尖锐度和强度。例如，如实施例中所述，例如通过改进相分离，增加样品内矿物油的用量可以是有益的，以便在离心过程中，有效地分配样品内的内源类脂到油层内。

盐

高浓度的盐可影响一些蛋白质的沉淀程度。例如，高的盐浓度可干扰或加速蛋白质的沉淀。典型地，当沉淀时，内源样品衍生的盐不足以引起任何显著的影响。在许多情况下，可添加外源盐改进总的蛋白质沉淀。另外，可使用优化的盐浓度，选择沉淀所需的蛋白质并保留非所需的蛋白质在上清液内，反之亦然。例如，可使用这一方法耗尽高丰度的蛋白质物种的复杂样品(例如，血清白蛋白、免疫球蛋白等)并富集生物重要的低丰度蛋白质。

高盐浓度是指基于溶液的总重量，大于约1wt％的盐浓度。例如，基于溶液的总重量，盐浓度为至少约5％；或至少约10wt％。

高盐溶液的实例包括：氯化钠饱和的溶液(在25℃下35.9g/100ml)；在水中硫酸铵饱和的溶液(在0℃下70.6g/100ml或在100℃下103.8g/100ml)；4M异硫氰酸胍鎓盐。

低盐浓度是指基于溶液的总重量，小于约1wt％的盐浓度。

辅助容器

在此处所述的提取方法的一些实施方案中，辅助容器(例如胶囊、安瓿)可存在于将暴露于此处所述的提取方法(例如，含压力循环和/或加工(例如，机械加工)的方法)下的混合物内。辅助容器的内容物可包括在施加足以引起辅助容器释放其内容物(例如破裂)的一定水平的压力或加工(例如机械加工)过程中，将引入到主要容器内的一种试剂或多种试剂。在一些实施方案中，可由冷冻成分(例如水)制备辅助容器。例如，在这些实施方案中，压力或加工(例如机械加工)将使辅助容器熔化，例如并引起它释放其内容物。冷冻的辅助容器可以是惰性并用于包含活性成分，或者冷冻的辅助容器本身可以是活性成分(例如，和该压力可使为活性成分的容器熔融，并进而引起容器释放其内容物)。

在施加压力或加工(例如机械加工)过程中引入的试剂可充当辅助(或三元等)液相，以加速样品组分的分配。或者，这一试剂可充当已有液相的添加剂。可在提取方法中使用试剂，例如增加感兴趣的组分的分配，增加感兴趣的组分的溶解度，增加污染物(例如不感兴趣的组分)例如在不含感兴趣的组分的相内的分配，改变提取溶剂的性能，例如pH、渗透压等。这些试剂的实例包括有机溶剂、两亲溶剂；离液剂盐或洗涤剂的溶液，洗涤剂溶液(十二烷基硫酸钠、[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基])-1-丙磺酸盐、(CHAPS)、Tween-80)、有机溶剂(例如，己烷、庚烷、甲醇、乙醇、乙腈、甲基叔丁基醚(MTBE)、正丙醇、异丙醇、异戊烷、辛烷、癸烷、环己烷、二甲苯、苯、二苯乙烯(tolyene)等或其混合物)，两亲试剂(例如HFIP、TFE)、盐，例如氯化钠、乙酸锂、碳酸氢铵、乙酸铵等；酸或碱，例如三氟乙酸、甲酸、乙酸、氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化锂等。

例如当压力循环到一定的压力水平时，可例如从相同或不同的辅助容器中引入一种或更多种这样的试剂。例如，可设计辅助容器，在一定的压力水平下或其上释放其内容物(例如破裂、泄漏、溶解或熔融)。在一些实施方案中，可使用大于一个辅助容器。例如，可设计一个辅助容器，在一个压力下释放其内容物，同时可设计第二辅助容器，在第二压力下释放其内容物，等等。按照这一方式，可将不同的试剂(或单独剂量的相同试剂)在控制的时间处(例如，在一定次数的压力循环之后)引入到混合物内。不限制辅助容器的形状或设计。此处所使用的术语“辅助容器”是指其内容物包括一种试剂且防止该试剂引入到在该辅助容器内包含的混合物或液相内，直到升高压力或加工(例如机械加工)到引起辅助容器释放其内容物的水平时的形式(例如密封形式)。没有限制制备辅助容器的材料。例如，辅助容器可由明胶材料、纤维素聚合物、玻璃、聚合物(SAN、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、其他聚合物等)制备。通过辅助容器材料的硬度和在该辅助容器内样品与其他可压缩材料(例如气体、空气、氮气、二氧化碳、氧气、惰性气体：氦气、氩气、氙气等)的含量，和/或通过容器的组成，来定义辅助容器将破裂时的压力或加工(例如机械加工)。例如，辅助容器将在其抗压缩性低于辅助容器内容物的可压缩性时的压力水平下释放其内容物(例如断裂、泄漏或熔融)。辅助容器也可例如由无定形或结晶化合物制备，所述化合物的熔点高于在大气压下样品的加工温度。采用高压将使辅助容器材料熔融。或者，整个辅助容器可由加入到液体试剂内的混合物，例如固体冰、固体类脂、烷属烃等制备。这一材料在压力下变为液体且可参与样品组分的分配。当混合物的压力解除时，它可以或者可以没有再次固化。若这一组分确实固化且若它含有在压力下分配到其内的起始混合物的数种成分，则可通过从混合物中简单除去固化材料，从该混合物中分离出各组分。

额外的步骤

可单独或结合一种或更多种额外的步骤/方法进行此处所述的提取方法，分离感兴趣的组分。可在此处所述的提取方法之前或之后进行额外的步骤。例如，可与此处提供的提取方法一起进行离心(例如梯度离心或超声离心)(例如，在此处所述的提取方法中使用的相同容器内离心)、沉淀(例如，一种或更多种样品组分沉淀)、免疫沉淀(例如除去污染物)、渗透(例如细胞，例如使用洗涤剂)，使用低渗缓冲条件破坏原生质膜或包围细胞器的其他膜，富集特定组织、细胞或有机物类型、膜部分等；根据其在细胞或组织内的位置或者根据其物理化学性能(例如静电荷、疏水性、在特定溶剂内的溶解度、分子结构或结合亲和力等)，以改进感兴趣的组分的分离或纯化。

用于提取的组分源

若感兴趣的组分具有与样品内其他组分不同的物理化学性能(例如静电荷，或在溶剂或溶剂体系内的溶解度)的话，可使用此处所述的提取方法，从含有至少两种组分的样品中提取感兴趣的组分。

组分可从中提取的来源的实例包括生物和合成(例如人造)来源。生物来源的实例包括哺乳动物(例如人类或家养动物)、真菌、细菌、病毒和植物源。这种来源的实例包括细胞、细胞器(例如，线粒体、细胞核、高尔基体、叶绿体、内质网、液泡、顶体、中心粒、纤毛、乙醛酸循环体、氢化酶体、溶酶体、黑色体、纺锤剩体、肌原纤维、核仁、桶孔覆垫、过氧化物酶体、核糖体、微粒体、囊泡)、膜(例如类脂膜，例如类脂双层)、生物样品(组织样品(脂肪组织、肝脏、肾脏、皮肤、胰脏、腹部、肠、结肠、乳腺、卵巢、子宫、前列腺、骨骼、腱、软骨、头发、指甲、牙齿、心脏、肺、皮肤、神经、活检等))、血液、尿液、乳汁、精液、唾液、粘液、其他体液和固体)、细胞集合体(例如，血液、精液、粘液、组织活检)、远古样品(例如化石(例如化石动物、化石植物、化石骨骼、化石牙齿、化石粪便等))。其他来源的实例包括黄油、霜、药物或化妆品配方(药膏、洗剂、霜、香波、调节剂、纳米颗粒药物配方等)，片剂、胶囊或软明胶胶囊形式的药物配方，多相组合物，例如固体颗粒的乳液或悬浮液(例如油墨、油漆(例如胶乳油漆)、清漆、润滑剂、燃料、化学合成用原料等)、脂质体悬浮液、膜小泡、液体推进剂、燃料、弹性体、聚合物、油墨配方；水包油乳液和其他溶剂(例如工业润滑剂)、土壤(例如土壤样品的悬浮液)、矿物等等。

提取的组分

可通过此处所述的方法提取的组分(例如分子实体)的实例包括蛋白质(例如膜结合的蛋白质，跨膜蛋白质、I型或II型膜蛋白质、受体、酶、脂蛋白、糖蛋白)，多糖(例如，肝素或肝素衍生的多糖、淀粉、胰岛素等)、蛋白多糖(例如胶原、甲壳素、胞壁质等)、多酚(例如，单宁、苯基丹参素(例如，木质素、类黄酮))、维生素、毒素、污染物、类脂(例如磷脂(例如磷脂酰胆碱(PtdCho)))、磷脂酰乙醇胺(PtdEtm)、磷脂酰肌醇(PtdIns)、磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、糖脂、类甾醇(例如，雌激素、黄体酮、雄激素、睾酮、蜕皮甾族化合物，例如蜕皮甾酮，皮质甾类，例如糖皮质激素和盐皮质激素，促蛋白合成类固醇、胆甾醇、植物甾醇、油菜素甾醇类、麦角固醇)、膜(细胞膜、细胞器膜、类脂双层)、核酸(DNA(核DNA、线粒体DNA))、RNA(mRNA、tRNA、rRNA、mtRNA、microRNA)、病毒(例如，HIV、HPV、肝炎A、B、C、D、E、F或G，巨细胞病毒、EB病毒、黄热病等等)，细菌(例如，革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、共生细菌、致病菌)，在细菌细胞内或在其他微生物或其他细胞类型内存在的组分(例如，由细菌、酵母或哺乳动物细胞产生的重组蛋白质)，在包涵体包含的重组蛋白质，细菌DNA或RNA，抗原(例如，来自细菌或哺乳动物细胞或病毒)、病毒(例如用于疫苗生产)、药物试剂，例如小分子、代谢产物(例如小分子代谢产物)，杀虫剂(例如，杀细菌剂、杀真菌剂、除草剂、杀昆虫剂(例如杀卵剂、杀幼虫剂或杀成虫剂))、杀螨剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀啮齿动物剂或杀病毒剂，药物(例如药学药物)、药物代谢产物、染料、食品成分、纳米颗粒配方、类脂筏和淀粉样蛋白斑(amyloidplaque)、微管、细胞溶质、油、萜烯类和其他亲脂化合物(例如来自植物材料)、来自植物(例如药用植物的)各种化合物(例如，生物碱、类黄酮、异黄酮、原花色素、花色甘)，食品香料成分(例如辣椒碱)(例如来自食品制剂)、类脂可溶的微生物(例如生育酚、类胡萝卜素、番茄红素等)(例如来自植物油或动物脂肪)，局部药物配方成分(例如来自皮肤和皮下组织)，特定的细胞类型，聚合物，弹性体，润滑剂，颜料，增塑剂等等。大大地简化了例如从富含类脂的脂肪组织中提取膜蛋白质或者从肝脏微粒体部分中提取酶，例如细胞色素P450，并获得较高产量的所需蛋白质。

细胞类型的实例包括囊胚细胞、鸡蛋、胚胎干细胞、上皮细胞、红细胞、成纤维细胞、肝细胞、白细胞、成肌细胞、肌管、神经元、卵母细胞、成骨细胞、破骨细胞、精子、T-细胞、合子(动物或植物)、糊粉粒、厚角组织、内皮层、胚乳、表皮、叶肉、分生组织细胞、栅栏组织、薄壁组织、韧皮部筛管、花粉生殖、花粉营养、厚壁组织、管胞、木质部容器。还包括各类角质化上皮细胞、湿气分层阻挡(wetstratified barrier)上皮细胞、外分泌上皮细胞、激素分泌细胞、肠、外分泌腺和泌尿生殖道细胞、新陈代谢和储存细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、上皮细胞内膜闭合的体内腔室、具有推进功能的纤毛细胞、胞外基质分泌细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、感觉换能器细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、生殖细胞、保育细胞。

提取组分的分析

可通过本领域已知的各种方法分析提取的组分。例如，使用此处所述的方法纯化的感兴趣的组分(例如，含感兴趣的组分的一相)可与下游工艺(例如分析方法)相容(例如对与洗涤剂不相容的工艺相容)，和/或可直接在这一工艺中使用。

例如，二维凝胶电泳；一维凝胶电泳、蛋白印迹法、ELISA、蛋白质或肽物质的指纹法(例如使用MALDI-TOF/TOF)、多向电泳(例如溶液相等电聚焦，接着二维凝胶电泳浓缩的pI部分)、质谱(MALDI-MS、LC-MS/MS、MALDI-TOF MS或LC-ESI-MS/MS)、PCR、RT-PCR和微型阵列、薄层色谱法、液相色谱(例如HPLC)、气相色谱、GC/MS、电子显微摄影、荧光显微摄影、和表面分析方法。在一些实施方案中，分离的分子或其络合物可在功能分析，例如酶活性分析、体外代谢产物分析等或对其进行随后的分级分离或提取步骤中使用。

从提取方法中获得的含感兴趣的组分的相可以不要求进一步纯化且可与一些分析方法，例如HPLC和/或LC/MS、GC和/或GC/MS直接相容(例如，由于不存在洗涤剂，溶剂挥发，和在没有事先除去溶剂的情况下，将所得提取物直接注入到HPLC柱上)。直接采用样品可最小化感兴趣的组分的潜在损失，这种损失是由于降解或样品操作导致的。

器件

可在许多器件中进行此处所述的提取方法，但不限于使用特定的器件。例如，可使用便于或加速样品(混合物)的液液分配的器件。图2提供了一次性使用的样品容器以供使用溶剂溶解和分配样品组分的实例。通过穿孔的盘(裂解(lysis)盘)隔开两个腔室。这一盘可靠近于液相边界的预期位置布置。当溶剂边界越过盘时，该盘产生涡流，从而导致溶剂与样品材料的改进混合和多种溶剂彼此的改进混合。这将有助于在压力循环过程中混合两种液体。在循环过程中，由于加压导致的质量传递将引起液体界面越过盘。液体静力压将改变溶剂在彼此内的循环溶解度。当在交替的液体静力压(例如压力循环)下混合溶剂时，可实现样品粒状物材料较好的溶解。如图3所示，可如下所述，发生通过压力循环介导的液液分配：

1.将不混溶的溶剂a和b放置在具有含多种组分的固体样品的样品容器内。

2.液体静力压P2将引起液体和固体样品压缩。当溶剂边界越过穿孔的盘时，发生溶剂的快速混合。

3.在液体静力压下培育将改变溶剂的相互溶解度，从而导致形成兼有溶剂a和b的性能的第三亚稳定的溶剂c。在这一阶段可发生样品的溶解。

4.将体系解压到较低压力P 3将引起混合物膨胀并分离溶剂a和b，且溶质在溶剂a和b之间根据其分布系数logP或分布系数logD分配(对于部分解离的溶质来说)。

5.该体系在压力P1下返回到其起始平衡。在这一阶段，可反复该循环，继续溶解和分配工艺。

在这一实例中，穿孔盘(裂解盘)在某一位置内。使器件更加易于实践此处所述的方法，目前的可以对器件进行的改进包括：穿孔盘的可变位置；使用多个盘；当压力达到辅助容器释放其内容物(例如破裂)的水平时，在压力下将引入待插入到样品管(例如隔室顶部或底部)内的含试剂(例如此处所述的试剂)的辅助容器。

具体实施方案

实施例1：从植物组织中提取类脂、蛋白质和小分子

从植物组织中提取分子实体。将植物组织放置在含两种溶剂的溶剂体系内。溶剂A是50％含水乙腈和0.1％甲酸；溶剂B是氯仿。以两个单独的相形式存在这两种溶剂。在挠性容器内密封该混合物。采用20个循环，其中在每一压力循环下10秒，处理该混合物。压力从大气压(海平面下101.3kPa)循环到240MPa。一旦完成循环，则溶剂被分配到两个单独的相内，并在这两种溶剂之间分配来自植物组织的分子实体。大多数亲水成分保留在顶部溶剂部分内，所述顶部溶剂部分主要由水、甲酸和小于50％w/w乙腈组成。底部部分主要由氯仿和残留的乙腈组成，它含有疏水分子实体。可对这两部分进行适合于检测和量化各化合物的分析方法。

实施例2：从脂肪组织中提取类脂和蛋白质

使用100mg组织样品，在纯的1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)内进行从脂肪组织中提取类脂和蛋白质。HFIP是两亲溶剂，它与水和与样品内存在的类脂形成稳定的均匀混合物。在通过压力循环提取样品之后，所得溶液变得不混溶，且当返回到大气压下时，分离成单独的相。尽管高压维持所得相的部分混溶性，以提高样品组分在它们之间的分配，但压力降低充当加速相分离的重要因素。随后(例如采用移液管)除去类脂部分，然后直接通过HPLC，分析HFIP/水部分，或者将其蒸发，浓缩蛋白质和核酸。或者，通过用过量水、含水缓冲液，或盐和/或其他试剂的水溶液稀释，从有机溶剂中沉淀出蛋白质。在用于HPLC的常规试剂中或者在缓冲液(洗涤剂基，例如9M脲/4％CHAPS；或例如2％SDS)内重构蛋白质部分，以提供与所选的凝胶分离方法(例如一维或二维凝胶电泳)的相容性。

实施例3：比较从脂肪组织中提取蛋白质的技术

图2所示的器件用于通过压力循环从脂肪组织中提取蛋白质。比较以下三种提取试剂：

1.Tris Buffered Saline(TBS)，没有洗涤剂

2.9M脲+4％CHAPS

3.HFIP，一种两亲氟化醇

在TBS中加工的样品显示出对脂肪组织最小的破坏且蛋白质的提取保持最小。

由于高含量(最多70wt％)的类脂将洗涤剂螯合到胶束内，因此在脲/CHAPS内加工的样品没有很好地溶解且含有仍然与类脂物质缔合的疏水蛋白质。在HFIP中提取的样品不含可视的残留脂肪组织(它看起来是白色油脂状残渣)。确实，在条件3中，脂肪和溶剂分离成亲水相(底部)和疏水相(顶部)。两亲溶剂能一样好地溶解极性和非极性组分，同时压力循环加速提取过程。当解压时，所得提取物分离成两个或更多个相。

实施例4：从猪脂肪组织中提取类脂、蛋白质和小分子

使用数种溶剂，进行压力循环介导的提取方法的比较。被比较的溶剂是：HFIP+0.1％TFA、Tris Buffer+0.9％NaCl和2％含水SDS。使用在1.4ml每一溶剂内的100mg组织。将每一样品置于相同的压力循环条件下：在每一循环过程中，240MPa 20秒，和大气压20秒，共30个循环。在用这三种溶剂首先提取之后，通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色，分析所得亲水相。每一样品进行两次试验。与2％含水SDS(数据未示出)相比，通过HFIP+0.1％TFA溶剂提取大约多2倍的蛋白质。Tris Buffer+0.9％NaCl提取最小量的蛋白质。

在残留的类脂碎屑上采用相同的各种溶剂，进行第二次提取。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色，分析所得提取物。用HFIP+0.1％TFA溶剂提取的样本回收最小残留的蛋白质，从而证明与所测试的其他溶剂(数据未示出)相比，在第一次提取中，在这一条件下提取到较大量的蛋白质。

实施例5：从脂肪组织中提取蛋白质：比较HFIP与洗涤剂

进行实验，采用下述压力循环：在每一循环过程中，240MPa20秒和大气压20秒，共30个循环，比较HFIP和9M脲/4％CHAPS试剂从鼠脂肪组织中提取蛋白质的效果。与脲/CHAPS试剂相比，采用HFIP提取多2或3倍的蛋白质。表1中示出了结果。

表1：基于提取溶剂的蛋白质产量

		平均mg/ml	STDEV
		平均mg/ml	STDEV	HFIP	第1组	4.48	0.36
	第2组	5.87	0.54	HFIP	第1组	4.48	0.36
	第2组	5.87	0.54
9M脲4％CHAPS	第1组	2.22	0.23
9M脲4％CHAPS	第1组	2.22	0.23		第2组	2.37	0.16

实施例6：大鼠大脑蛋白质提取-二元和三元溶剂结合物

进行实验，从大鼠大脑中提取蛋白质。大脑组织不含足够的内源类脂以引起相分离。添加辅助的疏水溶剂，以“补偿”内源类脂的缺乏并加速相分离。

所有样品采用压力循环-20秒加压，20秒减压共30个循环，35,000psi作为高压和大气压作为低压加工。每个实验条件是用50mg组织，包括5微升蛋白酶抑制剂。添加试剂到最终1.4ml的体积。

所测试的条件是：HFIP；己烷；矿物油；HFIP/己烷1∶2；和HFIP/己烷1∶1。

在单独用HFIP提取的样品中没有观察到相分离。当使用HFIP：己烷；HFIP/矿物油和HFIP/己烷/矿物油时，观察到相分离。

添加挥发性较大的试剂(己烷)将急剧加速通过蒸发除去溶剂的速度。

这些实验提供用洗涤剂提取和用溶剂提取的比较。SDS无法抽出(pull out)所有蛋白质的原因可能主要是化学计量-没有存在足够的SDS溶解所有脂肪，结果典型地进行冗长的机械均化，以回收包埋在脂肪小球内的所有的蛋白质分子。这一方法通常产生许多泡沫、渣滓和乳液，其中蛋白质的损失是必然的。依赖于洗涤剂溶解脂肪的试剂将留下完整的脂肪块。相反，与溶剂，例如HFIP结合的压力循环将导致脂肪组织完全溶解且没有形成泡沫或渣滓。

实施例7：通过压力循环和高分辨率的串联质谱，使用不含洗涤剂的蛋白质提取，进行脂肪组织的蛋白质组分析

脂肪组织的蛋白质组分析对于研究2型糖尿病、肥胖、癌症和许多其他任何疾病是高度有价值的。然而，在高类脂含量的组织上采用的常规的蛋白质增溶方法倾向于产生高度变化的结果，特别是对来自线粒体、ER、原生质膜和脂肪滴的大部分疏水蛋白质来说。丰富的样品衍生的类脂倾向于将洗涤剂螯合到胶束内，从而干扰蛋白质的提取。

这些实验研究针对与常规的均化和溶解技术相比，不含洗涤剂的细胞、胶束和膜片段的破坏和从小鼠脂肪组织样品中回收蛋白质的增加的效率来说，使用交替的液体静力压(压力循环技术或PCT)和各种有机溶剂。通过SDE-PAGE、2D-电泳、纳米流动的HPLC和高分辨率的高质量精度的串联质谱，分析所得蛋白质提取物。

开发了新型压力循环辅助的液液提取和分级分离方法，以实现组织的几乎完全溶解和类脂与蛋白质分级分离成不同的液相。除了通过该新型的压力循环方法得到的总体较高的蛋白质回收率以外，在脂肪组织的压力循环提取物中鉴定出数种新型的蛋白质物种。还显示了在使用常规方法获得的提取物内不存在的许多蛋白质。数种基因不同的模型小鼠家族的分析表明在蛋白质的表达中的数种趋势，所述蛋白质的表达可与疾病的进展有关或者充当蛋白质药物靶标。已获得由分级分离得到的类脂部分并收集以供将来的类脂性能研究。

通过压力循环技术(PCT)制备样品

这一研究的目标是开发从脂肪组织中可靠且可再现地提取蛋白质的方法，使得将来能进行鼠疾病模型的蛋白质组研究。使用来自野生类型(WT)和肥胖(ObOb+/+)动物的白色脂肪组织样品(腹部脂肪垫)。制备大致相等等分试样(100±15mg)的来自数种单独动物的脂肪组织。在专门的单独的一次性使用的1.4ml容器(图2)内，在室温下，使用在

NEP-3229(Pressure BioSciences，Inc.，WestBridgewater，MA)中生成的交替的液体静力压20个循环，同时进行样品均化和分级分离。每一循环由在35,000psi下20秒，接着在大气压下20秒组成。在每一情况下，将蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)加入到提取试剂中。在压力循环处理之后，从中取出样品试管，并简单地离心，以加速液相的完全分离。除非另有说明，采用凝胶负载的移液管尖端，除去来自每一试管的顶部液层，并储存以供随后分析类脂部分。在SpeedVac离心浓缩器(ThermoFisher Scientific)内使每一极性部分去溶剂化到约5-10微升，并在2xLaemmli SDS-PAGE缓冲液(4％SDS)中或者在2D样品缓冲液(9M脲，4％CHAPS)中重构，以提供与所需的下游分析方法的相容性。

脂肪组织：类脂/蛋白质分级分离方法。在单一的一次性容器内，使用交替的液体静力压，同时均化样品并加速样品化合物在不混溶的液相之间分配。在具有0.2ml矿物油的1.2ml HFIP内，进行提取。所得提取物直接与LC-MS/MS应用和蛋白质的电泳分离相容。

直接在两个连续的步骤中进行在2D样品缓冲液内的对照提取，取出50微升等分试样的每一提取物，以供蛋白质分析和SDS-PAGE分析，然后结合来自第一次和第二次的提取物，减压，使用TBP/丙烯酰胺烷化，并在Amicon ULTRA-4超滤装置(Millipore Corporation，Danvers，MA)内浓缩到起始样品体积。

电泳，图象分析和凝胶内消化

在4-12％的聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行SDS PAGE。采用样品，水合固定pH梯度的长条pH3-10 6小时，接着在10,000V下，等电聚焦(IEF)100,000V-h。所有预制的电泳供应和Criterion垂直凝胶电泳体系获自Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，而IsoelectrIQ2一体化的IEF仪器获自Proteome Systems，Woburn，MA。采用胶态考马斯亮蓝(Proteome Systems)或

Ruby(Bio-Rad Laboratories)染色凝胶，扫描，并采用PDQuest软件分析，以测定统计学上显著不同提取的蛋白质。使用常规的凝胶内消化方案，切除(excise)并加工选择的凝胶斑点或带。序列等级(grade)改性的猪胰蛋白酶(Promega)用于消化。

通过纳米-LC FTICR串联质谱鉴定蛋白质

将蛋白质的消化物(5-10微升)注射到C18固相提取截留柱(300mm i.d.x5mm，Dionex，CA)和75mm i.d.x15cm纳米-LC反相自填装熔凝硅石柱(固定相：Magic C 18AQ，3μm，100A(MichromBioresources，MA)；柱子：PicoFrit，15mm i.d.上，牵引尖端通过10个端口的Valco阀门。使用在0.1％FA内线性梯度的乙腈，进行肽的分离，并通过纳米电喷射，将洗脱液引入到LTQ FTICR质谱仪(Thermo Fisher Scientific)内。在SORCERER^TM(Sage-N)搜索引擎(search engine)上，使用SEQUEST对数法和GPMDB软件，进行数据分析。对结合的“正向”和“反向”FASTA DB进行研究。通过调节估计的假阳性蛋白质鉴定率(FPPrR)至≤1％，设定蛋白质鉴定数据的可靠度和灵敏度之间的平衡。基于Xcorr清洗双份肽的匹配物，以消除由同系蛋白质和同种型引起的冗余性。在没有添加冗余性到DTASelect和Protein Prophet输出的蛋白质IDs列表的情况下，列出具有最高分数的蛋白质目录的类似蛋白质。

结果与讨论

通过常规方法，在采用细胞破坏和分级分离的一系列过程中，进行使用有机溶剂和两亲氟化醇的从膜制剂中除去类脂的实验。我们开发了基于液液提取的不含洗涤剂的组织溶解和分级分离技术，它通过交替液体静力压来加强，所述交替的液体静力压将通过在互不混溶的液体之间的界面处临时产生亚稳态的“混杂”溶剂，加速分析物的分配。压力循环仪器产生液体静力压循环，所述液体静力压循环临时改变互不混溶的溶剂的相互溶解度，从而导致在液相之间更加有效地分配样品成分。在传统的提取中，高(例如最多70wt％)的类脂含量将洗涤剂螯合到胶束内，从而留下与类脂物质缔合的疏水蛋白质。

从脂肪组织中不含洗涤剂地提取蛋白质。一旦解压，则适当选择的液相分离，从而根据其在相应溶剂内的分布系数携带各自的分析物。

进行不同提取试剂的比较。通过Bradford分析测定，来量化蛋白质回收率。每一提取物的最终体积为1.4ml。

已发现，非极性和两亲有机溶剂二者的数种结合物与含水缓冲液一起加速液液分配。新的方法提供与下游分离方法，例如电泳、色谱法和质谱法的直接相容性。采用各种溶剂体系证明蛋白质提取效率的显著差别。采用I EF样品缓冲液(9M脲，4％CHAPS)，从脂肪组织样品中进行两次连续的蛋白质提取，并提供在首次提取之后，蛋白质残留在脂肪物质内的证据。

使用压力循环，同时进行脂肪组织的破坏、通过己烷脱类脂和在2xLaemmli样品缓冲液(4％SDS)内提取。尽管溶剂，例如己烷和苄醇允许组织脱类脂并同时通过含水缓冲液提取，但数种极性溶剂，例如异丙醇允许通过其在逐步提取方法中的疏水性来分级分离蛋白质。

添加两亲溶剂，即HFIP到一些溶剂组合物中将导致几乎完全的组织溶解和相分离。从100mg正常鼠类的白色脂肪组织块中提取蛋白质。比较常规的2D样品提取缓冲液和通过在含六氟异丙醇的溶剂体系内的压力循环，随后除去类脂部分和溶剂并在2D电泳内重构样品缓冲液的组织溶解方法。CHAPS基2D电泳缓冲液主要提取血浆蛋白质，而溶剂基提取物则含有脂肪组织中几乎完全的蛋白质补体(complement)。表2中提供了实施例。

表2：通过常规方法提取的样品内常常不能完全呈现的脂肪特异的蛋白质perilipin

蛋白质ID 电荷_肽序列 nsp adj prob

类脂滴缔合的蛋白质perilipin[Mus 3_ILHLTPAQAVSSTK 1

musculus]

gi|26279005|gb|AAN77870.1| 2_EVTALPNPR 1

gi|26327331|dbj|BAC27409.1| 3_IASELKTISTR 0.85

gi|28316726|ref|NP_783571.1| 2_LASGGADLALGSIEK 1

gi|42559472|sp|Q8CGN5|PLIN_MOUSE 2_ILHLTPAQVSSTK 1

可能分数：1.00 2_VSTLANTLSR 0.95

序列覆盖率：28.11％ 2_ETAEYAANTR 0.83

独特的肽匹配值：7

已发现数种蛋白质在使用常规提取方法获得的脂肪组织的蛋白质组曲线内大部分不能完全呈现。这些蛋白质的详细分析及其翻译后改性可提供对调节脂肪酸代谢产物的关键信息和防止II型糖尿病和肥胖发生率的可能方式。例如，进行鼠的FABP aP2的数种同种型之一的代表性光谱解释。可通过可能拥有调节作用的翻译后改性，解释aP2基因产品的多样性。

实施例8：从HFIP中回收蛋白质；通过蒸发对比用蒸馏水沉淀，除去溶剂

压力辅助的提取和分配极性与非极性样品成分导致形成至少一个液相，一种样品的溶液。在一些情况下，形成多个液相。这些相可通过合适的技术物理分离。通过许多可能的方法-柱色谱，其中包括HPLC；凝胶电泳，例如SDS-PAGE或2D-凝胶电泳等，对所得单独的相进行分析。

在这一实施例中，感兴趣的样品成分是蛋白质。而且，该蛋白质溶解在有机溶剂内。在一些情况下，溶剂是含卤素的有机溶剂，例如氯化醇、氯化酸、氟化醇、氟化酸等，或其混合物。数种含卤素的有机溶剂可充当洗涤剂，因为它们可引起蛋白质结构变化。在数个实施例中，在有机溶剂内蛋白质的结构可不同于在水溶液内的蛋白质结构。可通过添加试剂，例如水溶液，改变在有机溶剂内蛋白质的溶解度。正如这一实施例所述，可能需要蛋白质或其他溶质在有机溶剂内的浓度高于某一阈值，以诱导有效沉淀。

实施例8a.

通过压力循环，在1ml HFIP内加工250mg牛脂肪组织。压力循环条件如下所述：在35kPa下20秒，接着在大气压下20秒共20个循环。在压力循环步骤中使用PULSE管。

在压力循环之后，在11,000g下离心样品，以便加速相分离成类脂部分和蛋白质部分。回收下面的部分(含有蛋白质)并分成相同大小的等分试样。在离心真空浓缩器(SpeedVac，Thermo Scientific，Waltham，MA)内，蒸发等分试样之一至干。通过添加蒸馏水(3倍样品体积)，沉淀双份等分试样，在冰上骤冷10分钟，并通过在11,000g下离心15分钟，回收粒料。将上清液(水/HFIP混合物)转移到清洁的管道内并如上所述蒸发，以测定在沉淀过程中是否损失蛋白质。

在SDS-PAGE样品缓冲液内重构所有样品并在凝胶上试验。用考马斯蓝染色所得凝胶，比较通过两种方法回收的蛋白质(数据未示出)。凝胶结果表明在这些条件下，相对于蒸发样品，蛋白质带的图案和强度与沉淀样品相当。另外，凝胶分析证明在沉淀之后，在水/HFIP上清液内不存在可检测的蛋白质，从而证明在样品沉淀过程中，不存在可检测的蛋白质损失。

实施例8b.当如上加工牛脂肪组织，但组织质量与HFIP体积之比从250mg/ml下降到约40mg/ml(相当于在1.3ml HFIP内通过压力循环加工的50mg牛脂肪组织)时，沉淀反应没有有效地回收溶解的蛋白质，且观察到许多样品保留在水/HFIP部分内。

实施例8c.当如上加工牛脂肪组织，但通过降低HFIP的体积，使组织质量与HFIP体积之比从约40mg/ml增加到125或167mg/ml(这些比值相当于在0.3-0.4ml HFIP内50mg组织)时，沉淀反应的效率恢复。在沉淀的粒料中回收样品，并在水/HFIP部分内没有损失可检测的蛋白质。为了置换PULSE Tube内的额外体积，添加矿物油到反应中，引起最终总的反应体积为最多1.3-1.4ml。额外的矿物油对压力循环提取或沉淀反应没有显著的正或负影响。

实施例8d.采用牛脂肪组织，进行类似实验，以检验不同的脂肪组织∶HFIP之比(质量∶体积)。通过改变矿物油的体积，调节该比值。结果表明在较高的脂肪组织∶HFIP比值，例如～160mg/ml下，沉淀效率得到改进。

实施例9：通过压力循环，矿物油对蛋白质提取的影响

实施例9a.添加矿物油到压力循环反应中可有利地改进相分离，而与样品从溶剂中通过干燥提取还是通过蒸发提取无关。另外，在通过沉淀方法回收蛋白质之前，若不打算回收类脂部分的话(参见例如实施例10)，可以不要求除去类脂相。

通过压力循环，在HFIP/矿物油(0ml油/1.3ml HFIP；0.1ml油/1.2ml HFIP；或0.5ml油/0.8ml HFIP)的三种不同的结合物内加工50mg猪的脂肪组织。在压力循环(在35kpsi下20秒，接着在大气压下20秒，总计20个循环)之后，在11,000g下离心样品，以便加速相分离成类脂部分和蛋白质部分。将来自每一样品(含蛋白质)的下面的部分转移到新鲜的试管内，并在离心真空浓缩器(SpeedVac，ThermoScientific，Waltham，MA)内，蒸发至干。在SDS-PAGE样品缓冲液内重构所有样品并在凝胶上试验。用考马斯蓝染色所得凝胶，比较蛋白质回收率和带的尖锐度(数据未示出)。凝胶结果表明在这些条件下，添加矿物油到样品中确实有助于带尖锐度和强度的某种改进。从0.1增加矿物油的用量到0.5ml/样品不具有有害的影响，且实际上可以是有益的，因为在含0.5ml矿物油的样品内的带是所测试的三种样品中最强烈的。总之，添加油不是有害的，且对于相分离和提取效率来说可以是有益的。

实施例9b.在通常不发生相分离的样品，例如大脑组织中，添加矿物油到压力循环反应中可以有利地加速相分离。在HFIP/矿物油(0ml油/1.1ml HFIP；0.1ml油/1.0ml HFIP；或0.5ml油/0.6ml HFIP)的三种不同的结合物内提取120-130mg老鼠的大脑组织，并通过压力循环，在35kpsi下20秒，接着在大气压下20秒，总计20个循环加工。通过干燥和通过沉淀加工双份样品。凝胶结果表明添加矿物油和随后干燥样品显著地改进带的尖锐度。在没有添加矿物油的情况下，在样品内存在的内源脂肪没有有效地除去并在SDS-PAGE凝胶上导致形成显著干扰带分离的胶束。当矿物油加入到反应(0.1或0.5ml)中时，在离心过程中，改进的相分离允许有效地分配内源类脂到油层内。结果凝胶电泳结果急剧改进。添加矿物油到随后沉淀的样品中还导致一些改进，但甚至在没有添加油的情况下，沉淀的样品也显示出比干燥样品好的带分离。

实施例10：替代的溶剂提取方法：与使用矿物油获得的那些结果相当

在一些情况下，通过从干燥方案转变为沉淀方案，将实现与添加矿物油相同的优势。在HFIP/矿物油(0ml油/1.1ml HFIP；0.1ml油/1.0ml HFIP)的两种不同的结合物内提取120-130mg大鼠大脑组织，并通过压力循环，在35kpsi下20秒，接着在大气压下20秒，总计20个循环加工。在压力循环之后，在11,000g下离心样品，以便改进相分离，并通过添加蒸馏水(3倍样品体积)，在冰上骤冷10分钟回收下面的部分(含蛋白质)和沉淀，并通过在11000g下离心15分钟，回收粒料。在SDS-PAGE样品缓冲液内重构所有样品并在凝胶上试验。用考马斯蓝染色所得凝胶，比较蛋白质回收率和带的尖锐度。凝胶结果表明在这些条件下，添加矿物油不具有明显的缺点。这可能是由于在这些沉淀条件下，内源类脂没有与蛋白质一起沉淀，因此在电泳过程中没有存在于样品内。

实施例11：外源盐的效果

可添加外源盐，改进总的蛋白质沉淀。另外，可使用优化的盐浓度，以选择沉淀所需的蛋白质，并在上清液内保留非所需的蛋白质。将四种纯化的蛋白质-牛血清白蛋白(Fraction V)(BSA)、碳酸酐酶、鸡蛋白色溶菌酶和人类γ-球蛋白(所有均获自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)溶解在HFIP中到20mg/ml的最终浓度。采用3倍过量体积的dH₂O，沉淀单独的蛋白质或1∶1∶1∶1的所有四种蛋白质的混合物，在冰上沉淀20分钟，和在10,000g下离心15分钟。在SDS-PAGE样品缓冲液内重构粒料。同样回收上清液，在SpeedVac内干燥，并在SDS-PAGE样品缓冲液内再悬浮。所有所得样品在凝胶上试验。采用胶态考马斯蓝，染色所得凝胶。

采用蒸馏水沉淀蛋白质的效率是蛋白质特异的。尽管BSA和碳酸酐酶有效地沉淀并在粒料中回收，但溶菌酶和γ-球蛋白主要保留在上清液内。

而且，通过dH₂O选择沉淀一些蛋白质，分级分离了相同蛋白质的混合物，同时其他保留在溶液内。然而，添加25mg/ml NaCl溶液替代dH₂O将改进单独用水无法沉淀的蛋白质的沉淀。可采用这一方法分级分离复杂蛋白质混合物。

实施例12：从生物样品中同时分离和分级分离蛋白质、核酸和类脂的不含洗涤剂的样品制备技术

这一方法利用通过交替液体静力压(Pressure CyclingTechnology，or PCT)导致的细胞破坏和溶解并分配不同组分子到单独部分内的试剂体系的协同结合。PCT辅助的液液提取使用高的液体静力压，以改变各种化合物的溶剂化能和溶解度。在大气压下互不混溶的数种液体在高压下相互作用，其方式使得相界面对在溶剂相之间分配分子存在较小的阻挡。结果，在全部体积的容器内，而不是仅仅在界面处发生分配。蛋白质和类脂在压力下增溶并通过两亲有机溶剂，例如氟化醇，例如六氟异丙醇(HFIP)维持在溶液内。新的PCT/HFIP提取方法提供从珍贵或独特的样品，例如人类或野生动物的活体组织或难以复制的样品，例如小的细胞菌落，例如早期干细胞培养物中有效同时提取蛋白质、类脂和核酸。这一方法的另一优点是更加精确的分析不均匀的样品。由于不需要分裂(splitting)样品以供分离蛋白质、类脂和核酸分析，因此避免了因样品内各组分分布不均匀导致的假象。通过PCT破坏样品和在HFIP内提取的结合依赖于样品组分非酶和不含洗涤剂的溶解与分配，以便从许多类型的样品中有效且容易地提取类脂、蛋白质、RNA和DNA且不需要多个复制品，不方便且耗时的组织均化方法或强度大的后提取清洁步骤。因此，该新方法可辅助进行独特体系的生物学研究，其中蛋白质表达的转录曲线，翻译后蛋白质改性物和组织类脂组合物的分析以前认为是不实际的，因为可获得的材料量有限，或者其中单独的样品之间的变量太大，以致于无法提供复制品之间的精确比较。

该新方法不仅对小和珍贵的样品有利，而且对于其中期望纯化多种组分的单一便利方法的较大样品是有利的。由于对于大样品来说，PCT/HFIP方案容易规模化，因此，它相对于其他目前可获得的方法来说具有许多优点。可使用样品与溶剂之比高达250-300mg/ml，和可能地在一些情况下更高的HFIP。当随后的纯化步骤牵涉沉淀反应时，较高的样品与溶剂之比是重要的，因为在更加稀释的溶液中有效性较低。在PCT/HFIP提取样品中的大多数蛋白质和类脂之后，可在相对小体积的试剂内集中核酸富集的部分以供随后的RNA或DNA纯化。对于含有很少RNA和DNA的大样品(例如，土壤、酸奶、皮肤等)来说，这将提供有效得多的提取方法。

在两亲溶剂，例如HFIP内通过液体静力压提取导致快速的细胞破坏，类脂溶解和蛋白质溶解与变性。在解压之后，核酸没有保留在溶液内并可从样品提取之后从不溶部分中回收。另外，由于存在有利于提取更加亲脂的蛋白质的独特条件，因此通过凝胶内的胰蛋白酶消化和LC-MS/MS。已鉴定通过该新方法独特地提取的数种蛋白质物种。可在没有清洁和分离步骤，例如色谱或酶消化的情况下，使用MALDI-TOF质谱，对通过这一新方法提取的类脂进行直接分析。

实施例12a.在HFIP(PCT/HFIP)内压力介导的提取之后，检验单独的馏分

对于RNA和蛋白质的分布分析来说，用PBS洗涤～4×10⁷PC12细胞一次，悬浮在0.9ml HFIP内并转移到PULSE管道内。添加矿物油(0.5ml)，使最终体积为1.4ml。施加20个压力循环到每一样品上。每一压力循环由在35,000psi下20秒，接着在大气压下20秒共20个循环组成。在PCT之后，整个样品均匀地分到蛋白质和RNA复制样品的2个试管内，并在～12,000g下离心15分钟，以分离各相。在离心之后，除去非极性的顶部相。将界面层转移到清洁的试管中，简单地离心，并抽吸任何溶剂携带物。将溶剂相转移到清洁的试管中并在SpeedVac上干燥，以除去溶剂。简单地离心粒料，加速残留溶剂的抽吸。对于通过SDS-PAGE检验蛋白质来说，将粒料、界面和干燥的溶剂部分溶解在具有50mM DTT的1ml Laemmli样品缓冲液内。对于RNA分离来说，添加1ml

试剂到每一部分中，并遵照从细胞中提取RNA的标准

方案。

对于DNA分布分析来说，如上所述采用1.0ml HFIP和250微升矿物油，提取200mg冷冻的小鼠肝脏。如上所述将样品分成相同的双份，并分离各相。根据制造者关于从细胞中提取DNA的教导，使用Qiagen

Blood和Tissue试剂盒，从一份复制(one replicate)的粒料、界面和干燥的溶剂部分中提取DNA。

通过琼脂凝胶电泳，比较从三个部分中回收的RNA和DNA的回收率。通过SDS-PAGE，分离来自所有三个部分的蛋白质。从可溶相中回收大多数蛋白质，通过Qubit分析量化的核酸回收率证明该粒料和界面一起占RNA和DNA二者的～90％。

通过PCT/HFIP，提取牛脂肪组织，并分离成三个部分。随后再提取类脂部分和不可溶的部分，以测定是否可回收任何额外的蛋白质。通过SDS-PAGE检验再提取的样品，并证明尽管可从固体残渣中回收小量额外的蛋白质，但从类脂相中没有回收到可检测的蛋白质。对于从类脂相中再提取蛋白质来说，通过PCT，在1.05ml不含矿物油的HFIP中加工350mg牛脂肪组织。在提取和离心之后，除去溶剂相，将类脂相转移到清洁的试管中，并汇集(pool)粒料和界面。然后用新鲜的HFIP再提取粒料/界面部分和类脂部分，并在12,000g下离心10分钟。通过真空蒸发除去溶剂，和将所得样品溶解在Laemmli样品缓冲液内并进行SDS-PAGE。

上述实验证明下述：1)在类脂层内不存在可检测的可提取的蛋白质。2)极性溶剂相含有样品蛋白质的大部分，和仅仅痕量的RNA与DNA。3)粒料和界面二者均含有RNA和DNA，且粒料含有～70％回收的核酸和界面含有～20％(其余～10％可在蒸发之后从溶剂相中回收)。

实施例12b.大多数从组织中简单且有效地提取基因组DNA的方法依赖于强烈的酶消化蛋白质，以释放完整的DNA。我们证明在通过PCT，用HFIP从细胞或组织中提取DNA之后，可加工核酸部分以供DNA分离，并可回收高产量的完整基因组DNA。在从培养的哺乳动物细胞样品中提取蛋白质之后，使用

试剂盒(Qiagen)，加工固体部分以供分离DNA，并与直接采用

试剂盒提取的细胞的对照等分试样进行回收率的比较。这一方法通常不与完整的组织蛋白质的回收相容，因为该方案要求强烈的蛋白酶K消化，以获得最大的DNA产量。

通过压力循环，在HFIP内加工同样等分的培养哺乳动物细胞以供提取蛋白质和DNA。使用(型号NEP3229或NEP2320.)，施加20个压力循环到每一样品上。每一压力循环由在高压(35,000psi)20秒，接着在低压(大气压)下20秒组成。干燥蛋白质提取物，在IEF缓冲液内溶解，并进行2D PAGE。然后加工含大多数样品DNA和RNA的粒料和任何固体界面层，以供核酸提取。采用Qubit Fluorometer(Invitrogen)，使用量化DNA的QUANT-IT^TM dsDNA BR分析试剂盒，测量核酸的回收率。

结果证明，可通过许多可获得的试剂，容易地从固相中提取DNA，且也不需要费力的样品均化。另外，由于大多数蛋白质已经从核酸部分中提取，因此在提取过程中DNA降解的可能性非常低。

如上所述加工冷冻的小鼠肝脏(23mg/样品)。在离心之后，干燥蛋白质相，并进行SDS-PAGE。使用

试剂盒，从固相中提取DNA。在根据制造者的说明，采用

分离DNA之前，用蛋白酶K消化对照组织。

表3：肝脏组织和细胞培养物中回收DNA

细胞破坏和蛋白质提取的PCT/HFIP方法与DNA纯化的

试剂盒的结合导致从细胞中非常良好地同时回收DNA和蛋白质。另外，相同顺序的方案成功地应用到从肝脏组织提取蛋白质和DNA上。通过1D或2D PAGE分析蛋白质提取物，并证明从PCT/HFIP提取物中回收宽范围的蛋白质。使用结合的方法从细胞培养物中回收DNA与采用蛋白酶K消化的DNEASY对照相当，而从组织样品中回收的DNA是从对照中获得的约30％(表3)。

实施例12c.通过PCT/HFIP提取DNA与宽泛范围的样品尺寸相容

通过离心，对PC12细胞造粒，悬浮在生理缓冲液中并计数。通过PCT，在0.5-1.0ml HFIP中提取等分的1×10⁴-5×10⁵个细胞(通过添加矿物油，将每一样品的最终体积调节到1.4ml)。在35kpsi下20个循环(在高压下20秒，在大气压下20秒)之后，将样品转移到离心管内并在～12,000g下旋转，分离各相并对含DNA的不溶部分造粒。使用

试剂盒(Qiagen)，从粒料中回收DNA。图4示出了作为细胞数量的函数的DNA回收率。结果证明甚至从少至10,000个细胞的样品中通过PCT/HFIP回收DNA也是有效的。

实施例12d.比较同时提取RNA和蛋白质的PCT/HFIP方法和其他可商购的方法。

使用PCT/HFIP、获自Invitrogen的Reagent、获自Qiagen的ALLPREP^TM RNA/Protein试剂盒和获自Ambion的PARIS^TM试剂盒，加工PC 12细胞(10⁶个细胞/样品)。

对于PCT/HFIP提取来说，使用

(型号NEP3229或NEP2320)，施加20个压力循环。每一压力循环由在高压(35,000psi)下20秒，接着在低压(大气压)下20秒组成。在HFIP内PCT提取之后，干燥含蛋白质的溶剂相，在样品缓冲液内溶解并进行SDS-PAGE分析。回收粒料和固体界面层，并通过添加0.5ml

和通过标准方案提取，来加工以供RNA提取。根据制造者的说明，加工其他三种样品。通过SDS-PAGE，分离来自每一样品的蛋白质提取物的等分试样。每一RNA样品的最终体积为100微升。在凝胶上进行每一RNA样品的等分试验，以证明RNA没有降解。在琼脂凝胶上存在突出的28S和18S核蛋白体RNA带证明通过所有四种方法提取的RNA没有降解。通过QUANT-IT^TM RNA分析试剂盒，测量总的RNA回收率。(它是主要针对RNA提取而设计的优化试剂)得到优良的RNA回收率，但从有机相中提取蛋白质和清洁的多步方案缓慢，要求两个沉淀步骤，三个30分钟在95％乙醇内300mM盐酸胍中洗涤和在乙醇内最后20分钟的洗涤，以便从

试剂中除去苯酚和染料。这一强烈的清洁可导致体外蛋白质改性中的亚化学计量(N-termini，Lys)，这种亚化学计量可能潜在地干扰下游蛋白质翻译后改性的定量分析。尽管其他三种试剂盒容易使用，但从Ambion PARIS^TM试剂盒中回收RNA总是低于任何其他试剂(表4)。这可能是由于下述事实：在样品裂解之后，仅仅一半裂解物用于RNA提取，而另一半则备用于蛋白质。另外，由于在该工序最后，蛋白质提取物仍然在含有盐和洗涤剂的细胞破坏缓冲液内，因此可要求额外的蛋白质清洁步骤，例如渗析或过滤。使用Qiagen试剂盒的RNA回收类似于采用

和PCTV/HFIP获得的那些，但由于柱的结合能力低，因此样品(10⁶PC12细胞)必须分离到2个柱上，从而增加工作量和每一样品的成本。此外，由于从RNA中分离蛋白质部分所使用的ALLPREP^TM旋转柱的性质，因此许多蛋白质与结合的RNA部分一起保留且不存在于回收的蛋白质部分内。另外，由于通过ALLPREP^TM方案收集的蛋白质部分含有RNA稳定缓冲液，该缓冲液与SDS-PAGE不相容，因此在可导致潜在损失的SDS-PAGE分析之前，必须用丙酮沉淀蛋白质。

表4：总的RNA和蛋白质回收同时用的四种试剂的比较

实施例12e.为了证实使用新方法回收的RNA部分不仅完整(这通过在凝胶上存在28S和18S RNA来表示)，而且含有完整的mRNA并与RT-PCR相容，使用β-Actin引物，对以上所述的四种RNA样品进行实时的RT-PCR扩增。与所测试的三种标准方法相比，通过PCT/HFIP从PC12细胞中提取的RNA非常有利，从而表明该样品在预期浓度下含有可扩增的mRNA(表5)。

表5：RT-RT-PCR量化。比较同时回收RNA和蛋白质的四种试剂

实施例12f.为了表征PCT介导的液液提取方法脱类脂和增溶某些疏水蛋白质的能力(所述蛋白质典型地在标准的蛋白质组样品中是不能完全呈现的)，我们比较了使用两种不同的提取缓冲液提取小鼠的白色脂肪组织，接着2D-PAGE分离，凝胶内消化和通过LC-MS/MS分析。在类似的条件下，通过压力循环，使用或者PCT/HFIP溶剂体系或者洗涤剂基提取缓冲液(7M脲，2M硫脲，4％CHAPS)，加工老鼠腹部脂肪的双份样品。

在4-12％聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行SDS-PAGE。对于2D-PAGE分离来说，使用通过三丁基膦/丙烯酰胺同时还原和烷化。采用样品，水合固定的pH Gradient长条pH 3-106小时，接着在10,000V下经100,000V-h的IEF。所有预制的电泳供应和Criterion垂直凝胶电泳体系获自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA)，而IsoelectriIQ²一体化的IEF仪器获自Proteome Systems(Woburn，MA)。用胶态CBB或

Ruby染色凝胶，扫描，并用PDQuest软件分析，以测定统计学上显著不同的提取蛋白质。使用常规的凝胶内消化方案²⁶，切除并加工所选凝胶斑点。序列等级改性的猪胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)用于消化。

使用C₁₈固相提取截留柱(300μm i.d.x5mm，Dionex，CA)和100μm i.d.x 12cm nano-LC反相自包装熔凝硅石柱(PicoFrit，8μm i.d.的牵引尖端(New Objective，Inc.，Woburn MA)，固定相：Magic Cl 8AQ，3μm，

(Michrom Bioresources，Auburn，CA)，使用在0.1％甲酸内线性梯度的乙腈，分离蛋白质消化物(5-10微升)。通过纳米电喷射，将洗脱液引入到LTQ Orbitrap或LCQ DecaXP Plus质谱仪(Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)内。在SORCERER^TM(Sage-N Research，San Jose，CA)研究工具(searchengine)上，使用SEQUEST-SORCERER^TM算法，进行数据分析。对连环的“正向”和“反向”FASTA数据库进行研究。使用Protein Prophetand Peptide Prophet平台，过滤鉴定结果并使之有效。通过调节估计的假阳性蛋白质鉴定率至≤1％，设定蛋白质鉴定数据的可靠度和灵敏度之间的平衡。

通过PCT/HFIP提取的小鼠脂肪组织的2D凝胶上鉴定数种蛋白质，其在用洗涤剂提取的样品中不存在或者显著较少。这些包括铁蛋白轻链，载脂蛋白A1、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、perilipin(类脂滴缔合的蛋白质)、α烯醇化酶和碳酸酐酶。

实施例12g.直接施加由压力循环介导的HFIP提取衍生的类脂部分与在正电离模型中使用DHN基体的MALDI-TOF分析相容。

使用以上所述的具有矿物油的HFIP，从大鼠大脑组织中提取类脂。在没有添加矿物油的情况下，通过PCT/HFIP提取牛的心包脂肪。对来自这两种组织的类脂相进行MALDI-TOF分析。

通过PCT/HFIP提取的类脂部分不要求进一步的清洁方法，例如色谱法、额外的提取步骤或酶消化，相反可直接使用它以供通过MALDI-TOF质谱法分析。如前所述通过MALDI-TOF进行类脂相中磷脂和甘油三酯的分析(profiling)，并进行下述改性：在液滴沉积到MALDI目标上之后，在2微升0.5M 50％乙腈/水内的2，5-二羟基苯甲酸(DHB)基体溶液的液滴上直接点上类脂相部分的等分试样(0.5微升)的斑点。这一样品施加方法防止液滴在MALDI目标的多个斑点位置上铺开，这种铺开是由于非常低的粘度和类脂溶液在有机溶剂内的表面张力所致。另外，在结晶的基体混合物上施加两亲溶剂导致形成相对均匀的基体/样品斑点。在正电离模式下，在ABI 4700 Proteomics Analyzer(Applied Biosystems，Foster City，CA)上收集数据。

结果表明通过该新方法提取的类脂代表宽泛范围的类脂类型，且具有勿需额外的纯化步骤，直接分析的足够的纯度。从两种不同的组织中获得组织特异的类脂光谱。在大鼠大脑提取物中，大脑样品的磷脂特征是显而易见的，但不存在于牛的脂肪组织中的类脂组合物内。

实施例12h.为了进一步阐述PCT/HFIP提取方法的实用性，从5种不同的大鼠组织中进行蛋白质、RNA和DNA的顺序提取。

每一样品使用1.0ml HFIP和150-200微升矿物油，加工快速冷冻的大鼠组织(264mg肾脏，330mg腹部脂肪垫，310mg肝脏，264mg大脑，200mg心肌)。使用

(型号NEP3229或NEP2320.)，将20个压力循环施加到每一样品上。每一压力循环由高压(35,000psi)下20秒，接着在低压(大气压)下20秒组成。在PCT和离心之后，为了SDS-PAGE，制备每一蛋白质部分的10％的等分试样。汇集来自每一样品的粒料和界面部分，溶解在0.5mL

内，彻底涡旋，并根据标准

方案加工以供从细胞中提取RNA和DNA。

通过SDS-PAGE分离的含蛋白质的部分揭露出在每一样品内组织特异的蛋白质图案。琼脂凝胶电泳证明RNA完整，这通过28S和18S核糖体RNA的存在表明。使用方案，从固相中分离RNA和DNA，我们证明在通过PCT/HFIP提取蛋白质之后，可分离基因组DNA和完整的全部RNA二者(表6)。

结果证明，PCT/HFIP介导的组织破坏和提取便于从各种组织中有效地回收蛋白质、完整的RNA和基因组DNA。

表6：从细胞和组织中回收RNA和DNA

组织	RNA回收量/mg组织或10⁶个细胞	DNA回收量/mg组织或10⁶个细胞
组织	RNA回收量/mg组织或10⁶个细胞	DNA回收量/mg组织或10⁶个细胞	大鼠肝脏	2.40μg	34.5ng(140ng*)
大鼠肾脏	0.70μg	35.5ng	大鼠肝脏	2.40μg	34.5ng(140ng*)
大鼠肾脏	0.70μg	35.5ng	大鼠脂肪	0.02μg	0.67ng
大鼠大脑	0.55μg	37.08ng	大鼠脂肪	0.02μg	0.67ng
大鼠大脑	0.55μg	37.08ng	大鼠心肌	0.34μg	12.80ng
PC12细胞	11.90μg	10.70μg*	大鼠心肌	0.34μg	12.80ng

PCT/HFIP蛋白质提取通常紧跟着使用试剂(或其中用*表示处是指

试剂盒)，分离RNA和DNA。

描述了本发明的许多实施方案。尽管如此，要理解可在没有脱离本发明的精神和范围的情况下作出各种改性。

Claims

1.从多种组分中提取感兴趣的组分的方法，该方法包括：

提供含多种组分和至少两个液相的混合物，其中多种组分包括感兴趣的组分，和其中混合物在第一液体静力压下；

将混合物暴露于第二液体静力压下，其中第二液体静力压大于第一液体静力压，从而导致形成额外的液相；

从第二液体静力压中降低压力，从而从多种组分中提取感兴趣的组分。

2.权利要求1的方法，其中多种组分包括各种疏水性的组分。

3.权利要求1的方法，其中多种组分构成至少两个液相中的一相。

4.权利要求1的方法，其中多种组分中的一种组分可溶于至少两个液相中的一个液相内。

5.权利要求1的方法，其中感兴趣的组分是蛋白质。

6.权利要求5的方法，其中在提取过程中或之后，蛋白质的结构变化。

7.权利要求1的方法，其中至少两个液相在第一液体静力压下不可混溶。

8.权利要求1的方法，其中至少两个液相在第二液体静力压下可混溶。

9.权利要求1的方法，其中至少两个液相在第一液体静力压下不可溶。

10.权利要求1的方法，其中至少两个液相在第二液体静力压下部分可溶。

11.权利要求1的方法，其中至少两个液相在第二液体静力压下完全可溶。

12.权利要求1的方法，其中降低第二液体静力压到第三液体静力压，所述第三液体静力压等于第一液体静力压。

13.权利要求12的方法，其中将混合物暴露于第四压力下，其中第四压力大于第一、第二或第三压力。

14.权利要求1的方法，其中降低第二液体静力压到第三液体静力压，其中第三压力大于第一液体静力压。

15.权利要求14的方法，其中将混合物暴露于第四压力下，其中第四压力大于第一、第二或第三压力。

16.权利要求1的方法，其中降低第二液体静力压到第三液体静力压，其中第三压力小于第一液体静力压。

17.权利要求16的方法，其中将混合物暴露于第四压力下，其中第四压力大于第一、第二或第三压力。

18.权利要求1的方法，其中从第二液体静力压降低压力将导致至少两个液相分离成单独的相，和其中感兴趣的组分被分配到至少两个液相之一内。

19.权利要求1的方法，其中将混合物暴露于第一、第二、第三或第四压力下，其中第四压力大于第一、第二或第三压力。

20.权利要求19的方法，其中混合物包括含试剂的辅助容器，和暴露于第四液体静力压下将引起辅助容器释放其内容物，从而将该试剂引入到混合物内。

21.权利要求1的方法，其中多种组分被分配到基本上不含感兴趣组分的液相内。

22.权利要求1的方法，进一步包括从液相中分离感兴趣的组分。

23.权利要求1的方法，其中所提取的感兴趣的组分直接可与下游工艺相容。

24.权利要求1的方法，其中多种组分包括胶体。

25.权利要求24的方法，其中多种组分包括乳液。

26.权利要求1的方法，其中感兴趣的组分是多糖、多酚、维生素、毒素、污染物、类脂、糖脂、类甾醇、膜、在细菌包涵体内存在的组分，抗原、病毒、药物试剂、代谢产物、药物、药物代谢产物、染料、食品成分、纳米颗粒配方、类脂筏和淀粉样蛋白斑、微管、细胞溶质或特定的细胞类型。

27.权利要求1的方法，其中感兴趣的组分是核酸。

28.权利要求1的方法，其中感兴趣的组分是病毒或细菌。

29.权利要求1的方法，其中感兴趣的组分是杀虫剂。

30.权利要求1的方法，其中感兴趣的组分是疏水的。

31.权利要求1的方法，其中感兴趣的组分是亲水的。

32.权利要求1的方法，其中感兴趣的组分是两亲的。

33.权利要求1的方法，其中从多种组分中提取感兴趣的多种组分。

34.权利要求33的方法，其中感兴趣的多种组分包括核酸和蛋白质。

35.权利要求1的方法，其中多种组分包括细胞、细胞器、膜或生物样品。

36.权利要求1的方法，其中多种组分是生物来源的。

37.权利要求36的方法，其中生物来源的多种组分来自动物、真菌、细菌、病毒或植物。

38.权利要求1的方法，其中多种组分包括乳液。

39.权利要求1的方法，其中多种组分是合成的。

40.权利要求1的方法，其中降低第二压力到第三压力，和其中将多种组分暴露于压力循环下，其中第一、第二、第三液体静力压构成该压力循环。

41.权利要求40的方法，其中将混合物暴露于反复的压力循环下。

42.权利要求41的方法，其中将混合物暴露于约1-约1000个压力循环下。

43.权利要求42的方法，其中第三液体静力压小于第一液体静力压。

44.权利要求43的方法，其中第三液体静力压等于第一液体静力压。

45.权利要求44的方法，其中第三液体静力压大于第一液体静力压。

46.权利要求1的方法，其中第一液体静力压为约0.1MPa-约1000MPa。

47.权利要求1的方法，其中第二液体静力压为最多约1000MPa。

48.权利要求1的方法，其中第二液体静力压为约100kPa-约1000MPa。

49.权利要求1的方法，其中第一和第二液体静力压之差为约10kPa-1GPa。

50.权利要求1的方法，其中在约-40℃-约+100℃的温度下进行该方法。

51.权利要求1的方法，其中压力是液压或气动压力。

52.权利要求1的方法，其中多个液相包括共沸混合物。

53.权利要求1的方法，其中多个液相包括各种液体在各种特定比例下的混合物。

54.权利要求1的方法，其中多个液相是两相。

55.权利要求1的方法，其中多个液相是三相。

56.权利要求1的方法，其中多个液相包括含水溶剂。

57.权利要求1的方法，其中多个液相包括有机溶剂。

58.权利要求1的方法，其中多个液相包括氯仿、四氯乙烯、醇、水、脂族烃、乙腈、甲酸、三氟乙酸、甘油、类脂、卤代烃、洗涤剂、缓冲液、离液剂盐或其混合物。

59.权利要求1的方法，其中多种组分提供液相或多种液相。

60.权利要求59的方法，其中液相是类脂、有机溶剂、含水缓冲液、乳液或固体颗粒的悬浮液。

61.权利要求59的方法，其中在液体静力压下，由固相形成液相。

62.权利要求1的方法，其中在低渗盐浓度下进行该方法。

63.权利要求1的方法，其中在高渗盐浓度下进行该方法。

64.权利要求1的方法，其中在等渗盐浓度下进行该方法。

65.权利要求1的方法，其中混合物包括洗涤剂。

66.权利要求1的方法，其中混合物包括缓冲液。

67.权利要求1的方法，其中从生物膜中提取蛋白质。

68.权利要求1的方法，其中从类脂相中提取蛋白质。

69.权利要求1的方法，其中从油漆中提取组分。

70.权利要求1的方法，其中从土壤中提取组分。

71.权利要求1的方法，其中从固体颗粒的悬浮液中提取组分。

72.权利要求1的方法，其中多种组分包括乳液。

73.权利要求1的方法，其中多种组分包括类脂或一种或多种组分在类脂或类脂混合物内的溶液。

74.权利要求73的方法，其中多种组分进一步包括蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、糖脂、类甾醇、维生素、药物物质或药物代谢产物。

75.权利要求74的方法，其中多种组分包括细胞或单一细胞的有机物。

76.权利要求1的方法，其中至少两个液相在第一压力下具有差的相互溶解度，并分级分离至少两个液相；

其中将混合物暴露于第二压力下将增加至少两个液相的相互溶解度，从而混合相互溶解度差的至少两个液相，并导致形成亚稳态的混合物；和

从第二压力降低压力，从而降低至少两个液相的溶解度并引起多个液相分离成多个部分并导致各组分在多个液相当中分配。

77.在多个液相当中分配多种组分的方法，该方法包括：

提供一种混合物，其中该混合物包括多种组分和多个液相，其中多个液相在环境压力下具有差的相互溶解度，并分级多个液相；

将该混合物暴露于增加的压力下，其中增加的压力将增加多个液相的相互溶解度，从而混合相互溶解度差的多个液相，并导致形成亚稳态的混合物；和

降低混合物的压力，从而降低液相的溶解度并引起多个液相分离成各部分并导致各组分在多个液相当中的分配。

78.权利要求77的方法，其中多个液相在环境压力下具有差的相互溶解度。

79.从多种组分中提取感兴趣的组分的方法，该方法包括：

提供含多种组分和至少两个液相的混合物，其中多种组分包括感兴趣的组分；

将混合物暴露于溶剂下，其中该溶剂将提取感兴趣的组分，从而在多种组分中提取感兴趣的组分。

80.权利要求79的方法，其中溶剂包括1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)。

81.权利要求79的方法，其中该方法进一步包括将混合物暴露于改变的压力下。

82.权利要求79的方法，其中该方法进一步包括将混合物暴露于机械加工步骤下。

83.权利要求82的方法，其中机械加工步骤包括均化、涡流、超声、移液、剪切、粉碎、摇动、混合、共混、捶打或其结合。