CN110172497B - 一种结核分枝杆菌dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，包括步骤：获取结核分枝杆菌，对所述结核分枝杆菌进行灭活处理，得到已灭活的结核分枝杆菌；对所述已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，得到结核分枝杆菌分散液；对所述结核分枝杆菌分散液进行破壁处理，得到破壁产物；对所述破壁产物，先采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提，然后采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提，得到抽提产物；采用异丙醇和糖原对所述抽提产物进行沉淀处理，得到结核分枝杆菌DNA。本发明提取方法，提取质量高，提取方法易于操作，适合在普通生物实验室中进行。

Description

一种结核分枝杆菌DNA的提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌DNA的提取方法。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺结核为最多见，结核病至今仍为重要的传染病。因此，对结核分枝杆菌的及时、高效、特异性的检测成为预防、治疗结核分枝杆菌引起病症的有效手段。虽然目前对结核分枝杆菌的生物学特性、致病机制、耐药机制、诊断方法、抗结核药物的研制等方面都取得了一定的成就，但是结核病仍然是影响人类健康流行性最广，病死率最高的感染性疾病之一，寻求快速、准确的诊断方法一直是结核病学首要研究的领域。随着分子生物学的发展，对结核分支杆菌的DNA研究给结核病的诊断带来了新的希望，结核分支杆菌的DNA检测具有高敏感、高特异和快速性等优点。

目前，结核分枝杆菌基因组DNA的制备是应用PCR技术检测结核分枝杆菌核酸和进行全基因组测序的关键。结核分枝杆菌基因组DNA制备有两个难点：一是结核分枝杆菌的细胞壁坚韧，裂解困难，若菌株分散不充分，进一步增加了结核分枝杆菌菌壁裂解，从而影响基因组核酸的释放；二是抽提和沉淀方法直接影响基因组DNA的纯度和浓度。常见的结核分枝杆菌的提取方法有CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)抽提法和酚氯仿抽提法、Triton法，SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)法及胰酶法，其中，CTAB抽提法和酚氯仿抽提法是提取实验中最常用两种方法。

但是，一方面，由于结核分枝杆菌细胞壁坚韧，其培养物聚集程度高，常规的移液器吹打或震荡的方式不易分散菌株，往往导致细胞壁暴露不彻底，不利于溶菌酶的充分作用，从而影响结核分枝杆菌基因组DNA的提取效率。另一方面，为避免DNA断裂，目前结核分枝杆菌基因组DNA抽提方式往往采用单一的提取方式，抽提效果并不稳定，沉淀效率比较低，对少量样本的沉淀效果不佳，致使肉眼无法直接观察到白色基因组DNA沉淀，从而增加了实验人员的操作难度，降低了提取效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，旨在解决现有结核分枝杆菌DNA提取方法对聚集程度高的细胞分散程度差，抽提效果不稳定，沉淀效率低，尤其是对少量样品的沉淀效果不佳等技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

获取结核分枝杆菌，对所述结核分枝杆菌进行灭活处理，得到已灭活的结核分枝杆菌；

对所述已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，得到结核分枝杆菌分散液；

对所述结核分枝杆菌分散液进行破壁处理，得到破壁产物；

对所述破壁产物，先采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提，然后采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提，得到抽提产物；

采用异丙醇和糖原对所述抽提产物进行沉淀处理，得到结核分枝杆菌DNA。

优选地，所述灭活处理的步骤包括：将所述结核分枝杆菌置于TE缓冲液中，在75～85℃的条件下，处理30～60分钟；和/或，

所述涡旋振荡分散处理的步骤包括：将所述已灭活的结核分枝杆菌置于缓冲溶液中，在添加有玻璃珠的情况下，涡旋振荡分散2～5分钟，得到涡旋振荡分散产物。

优选地，所述超声分散处理的步骤包括：对所述涡旋振荡分散产物进行间歇式超声处理2分钟～3分钟，得到所述结核分枝杆菌分散液；其中，所述间歇式超声处理的超声处理时长为2～10秒，暂停时长2～10秒。

优选地，所述破壁处理的步骤包括：获取溶菌酶，将所述溶菌酶添加到所述结核分枝杆菌分散液中，混合均匀后，在35℃～38℃的条件下水浴消化2小时～24小时，得到所述破壁产物。

优选地，所述溶菌酶的浓度为50～60mg/ml，添加量为所述结核分枝杆菌分散液体积的3.5％～4.5％；和/或，

所述水浴消化处理的步骤包括：每隔20～30分钟进行一次颠倒混合处理。

优选地，所述采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提的步骤包括：

获取十二烷基硫酸钠溶液和蛋白酶K溶液，将所述十二烷基硫酸钠溶液和所述蛋白酶K溶液添加到所述破壁产物中，轻柔混匀后，添加NaCl溶液和预热后的所述CTAB/NaCl溶液，再次轻柔混合均匀后，在60℃～70℃水浴条件下处理8～15分钟，得到第一次抽提产物。

优选地，所述采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提的步骤包括：获取与所述第一次抽提产物等体积的所述酚、氯仿和异戊醇混合液添加到所述第一次抽提产物中，混合均匀后，离心处理得到的上清液即为所述抽提产物。

优选地，所述十二烷基硫酸钠溶液中十二烷基硫酸钠的含量为10％，所述十二烷基硫酸钠溶液的添加量为所述破壁产物体积的14％～15％；和/或，

所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/ml，添加量为所述破壁产物体积的2％～3％；和/或，

所述CTAB/NaCl溶液为10％CTAB/0.7mol/LNacl，添加量为所述破壁产物体积的18％～19％；和/或，

所述酚、氯仿和异戊醇的混合液中酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1。

优选地，所述沉淀处理的步骤包括：

获取异丙醇和糖原溶液，将所述异丙醇添加到所述抽提产物中，混合均匀后，添加所述糖原溶液，再次混合均匀后，于低于-20℃条件下，低温处理2～3小时，得到低温处理产物；

将所述低温处理产物离心处理后，得到的沉淀物采用乙醇离心洗涤处理2～3次，得到的白色沉淀即为所述结核分枝杆菌DNA。

优选地，所述异丙醇的添加量为所述抽提产物体积的55％～65％；和/或，

所述糖原溶液的浓度为20mg/ml，添加量为所述抽提产物体积的0.6％～0.7％；和/或，

所述结核分枝杆菌DNA在使用时，挥发去除其中的乙醇溶剂后，采用缓冲溶液溶解所述结核分枝杆菌DNA。

本发明提供的结核分枝杆菌DNA的提取方法，为提供结核分枝杆菌DNA的提取效率，一方面，针对结核分枝杆菌细胞壁坚韧，其培养物聚集程度高，不易分散，从而影响结核分枝杆菌基因组DNA的提取效率的问题，对已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，通过两次分阶段的分散处理使结核分枝杆菌菌株充分分散，使细胞壁彻底暴露，利于后续细胞破壁处理过程有效裂解细胞壁，提高DNA提取效率；另一方面，对破壁产物，先后采用CTAB/NaCl(十六烷基三甲基溴化铵/氯化钠)溶液和酚、氯仿和异戊醇的混合液进行两次抽提，充分确保了对结核分枝杆菌DNA的充分提取和对蛋白等杂质的充分去除，有效增加DNA提取浓度和纯度，并且抽提过程中不会对DNA本身造成影响，确保了DNA的完整性；再一方面，对抽提产物采用异丙醇和糖原共沉淀，提高了对抽提产物的沉淀效果，即使对少量样本的提取，也能有效沉淀提取的DNA，使肉眼可直接观察到白色DNA沉淀，减轻实验人员的操作难度，提高提取效率。本发明提供的结核分枝杆菌DNA的提取方法，可成功提取高质量的结核分枝杆菌全基因组DNA，可应用于结核分枝杆菌全基因组测序及基因分型研究，且该提取方法易于操作，适合在普通生物实验室中进行。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

本发明实施例提供了一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

S10.获取结核分枝杆菌，对所述结核分枝杆菌进行灭活处理，得到已灭活的结核分枝杆菌；

S20.对所述已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，得到结核分枝杆菌分散液；

S30.对所述结核分枝杆菌分散液进行破壁处理，得到破壁产物；

S40.对所述破壁产物，先采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提，然后采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提，得到抽提产物；

S50.采用异丙醇和糖原对所述抽提产物进行沉淀处理，得到结核分枝杆菌DNA。

本发明实施例提供的结核分枝杆菌DNA的提取方法，为提供结核分枝杆菌DNA的提取效率，一方面，针对结核分枝杆菌细胞壁坚韧，其培养物聚集程度高，不易分散，从而影响结核分枝杆菌基因组DNA的提取效率的问题，对已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，通过两次分阶段的分散处理使结核分枝杆菌菌株充分分散，使细胞壁彻底暴露，利于后续细胞破壁处理过程有效裂解细胞壁，提高DNA提取效率；另一方面，对破壁产物，先后采用CTAB/NaCl(十六烷基三甲基溴化铵/氯化钠)溶液和酚、氯仿和异戊醇的混合液进行两次抽提，充分确保了对结核分枝杆菌DNA的充分抽提和对蛋白等杂质的充分去除，有效增加DNA提取浓度和纯度，并且抽提过程中不会对DNA本身造成影响，确保了DNA的完整性；再一方面，对抽提产物采用异丙醇和糖原共沉淀，提高了对抽提产物的沉淀效果，即使对少量样本的抽提，也能有效沉淀抽提的DNA，使肉眼可直接观察到白色DNA沉淀，减轻实验人员的操作难度，提高提取效率。本发明实施例提供的结核分枝杆菌DNA的提取方法，可成功提取高质量的结核分枝杆菌全基因组DNA，可应用于结核分枝杆菌全基因组测序及基因分型研究，且该提取方法易于操作，适合在普通生物实验室中进行。

具体地，上述步骤S10中，获取结核分枝杆菌，对所述结核分枝杆菌进行灭活处理，得到已灭活的结核分枝杆菌。本发明实施例首先对结核分枝杆菌进行灭活处理，使菌株失去活性，以便后续对菌株DNA的抽提处理。

作为优选实施例，所述灭活处理的步骤包括：将所述结核分枝杆菌置于TE缓冲液中，在75～85℃的条件下，处理30～60分钟。本发明实施例采用热灭活的方式，对结核分枝杆菌在75～85℃的条件下，灭活处理30～60分钟，即可实现对结核分枝杆菌灭活的目的。

具体地，上述步骤S20中，对所述已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，得到结核分枝杆菌分散液。本发明实施例对灭活后的结核分枝杆菌先后进行涡旋振荡分散处理和超声分散处理，通过两次分散处理，使结核分枝杆菌菌株充分分散，细胞壁彻底暴露，以利于后续裂解细胞壁，使DNA充分释放，提高提取效率。

作为优选实施例，所述涡旋振荡分散处理的步骤包括：将所述已灭活的结核分枝杆菌置于在缓冲溶液中，在添加有玻璃珠的情况下，涡旋振荡分散2～5分钟，得到涡旋振荡分散产物。本发明实施例通过涡旋振荡处理，在涡旋振荡分散过程中，通过玻璃珠的撞击摩擦使聚集的结核分枝杆菌菌株分散，得到涡旋振荡分散产物。

在一些实施例中，将已灭活的结合分枝杆菌置于由Tris和EDTA配制而成TE缓冲溶液中，添加3～4颗玻璃珠，充分涡旋振荡2～3分钟，使菌株分散，得到涡旋振荡分散产物。

在一些实施例中，所述灭活处理的步骤包括：将所述结核分枝杆菌置于TE缓冲液中，在75～85℃的条件下，处理30～60分钟；所述涡旋振荡分散处理的步骤包括：将所述已灭活的结核分枝杆菌置于TE缓冲溶液中，在添加有3～4颗玻璃珠的情况下，涡旋振荡分散2～5分钟，得到涡旋振荡分散产物。

作为优选实施例，所述超声分散处理的步骤包括：对所述涡旋振荡分散产物进行间歇式超声处理2分钟～3分钟，得到所述结核分枝杆菌分散液；其中，所述间歇式超声处理的超声处理时长为2～10秒，暂停时长2～10秒。本发明实施例通过2～3分钟的间歇式超声处理，对涡旋振荡产物进一步进行分散处理，确保结核分枝杆菌菌株充分分散，使细胞壁得到彻底暴露，有利于后续对细胞壁的裂解，释放DNA，从而提高对DNA提取效率。本发明实施例超声处理为间歇式超声处理，即超声2～10秒，停止2～10秒，以此间歇超声处理2～3分钟，既有效确保了对结核分枝杆菌的分散效果，又避免了因超声产热，对超声仪器设备的影响。本发明实施例对超声处理的超声功率不做具体限定，只要能实现上述进一步分散效果且对DNA无破坏作用即可，在一些实施例中，超声处理的功率可以是200～600W。

在一些实施例中，所述超声分散处理的步骤包括：将所述涡旋振荡分散产物，超声5秒，暂停5秒，以此间歇超声处理1分钟偶后；暂停10秒；然后再次以超声5秒，暂停5秒的间歇方式，超声处理1分钟，即得到结核分枝杆菌分散液。

具体地，上述步骤S30中，对所述结核分枝杆菌分散液进行破壁处理，得到破壁产物。本发明实施例通过对结核分枝杆菌分散液进行破壁处理，裂解细胞壁，使DNA释放。

作为优选实施例，所述破壁处理的步骤包括：获取溶菌酶，将所述溶菌酶添加到所述结核分枝杆菌分散液中，混合均匀后，在35℃～38℃的条件下水浴消化2小时～24小时，得到所述破壁产物。本发明实施例采用溶菌酶，在35℃～38℃的条件下水浴消化2小时～24小时，溶菌酶通过破坏结核分枝杆菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，释放DNA。另外，本发明实施例采用的溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，因此，该溶菌酶不但对结核分枝杆菌细胞壁有优异的裂解效果，还具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，能有效提高破壁产物的纯度。

作为优选实施例，所述溶菌酶的浓度为50～60mg/ml，添加量为所述结核分枝杆菌分散液体积的3.5％～4.5％。在浓度为50～60mg/ml，添加量为所述结核分枝杆菌分散液体积的3.5％～4.5％的情况下，溶菌酶对结核分枝杆菌分散液有最佳的裂解破壁效果和抑菌消炎效果。

在一些实施例中，将浓度为50～60mg/ml，添加量为所述结核分枝杆菌分散液体积的3.5％～4.5％的溶菌酶，添加到所述结核分枝杆菌分散液中，混合均匀后，在35℃～38℃的条件下水浴消化2小时～24小时，水浴消化过程中每隔20～30分钟进行一次颠倒混合处理，使反应体系中溶菌酶与结核分枝杆菌充分接触，更有利于溶菌酶对细胞壁的裂解破壁处理，得到充分裂解后的破壁产物。

具体地，上述步骤S40中，对所述破壁产物，先采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提，然后采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提，得到抽提产物。本发明实施例对破壁产物先后采用CTAB/NaCl溶液和酚、氯仿和异戊醇的混合液进行抽提处理，通过两次抽提，充分确保了对结核分枝杆菌DNA的充分提取，更好的去除蛋白等杂质，有效增加DNA提取浓度和纯度，提高DNA提取效率。另外，本发明实施例通过先采用CTAB/NaCl溶液，后采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行抽提处理的分阶段处理方法，使抽提过程中不会对DNA本身造成影响，确保了DNA的完整性。

作为优选实施例，所述采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提的步骤包括：获取十二烷基硫酸钠溶液和蛋白酶K溶液，将所述十二烷基硫酸钠溶液和所述蛋白酶K溶液添加到所述破壁产物中，轻柔混匀后，添加NaCl溶液和预热溶解后的所述CTAB/NaCl溶液，再次轻柔混合均匀后，在60℃～70℃水浴条件下处理8～15分钟，得到第一次抽提产物。本发明实施例，首先，通过将所述十二烷基硫酸钠溶液和所述蛋白酶K溶液添加到所述破壁产物中，轻柔混匀(避免剧烈振荡导致DNA断裂降解)后，消化分解蛋白质，酶解与核酸结合的组蛋白，除去杂质，使DNA游离在溶液中，以便后续对结核分枝杆菌DNA的抽提，收集DNA。然后，添加NaCl溶液和预热后的所述CTAB/NaCl溶液，再次轻柔混合均匀(避免剧烈振荡导致DNA断裂降解)后，在60℃～70℃水浴条件下处理8～15分钟，从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖，在高离子强度的溶液中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质，得到第一次抽提产物。另外，本发明实施例通过预热CTAB/NaCl溶液，不但使CTAB/NaCl溶液充分溶解，而且预热后的CTAB/NaCl溶液可以提高其释放结核分枝杆菌DNA的效率，也缩短了抽提时间。在一些实施例中，将CTAB/NaCl溶液预热65℃后添加到破壁产物中进行抽提处理。

作为优选实施例，所述十二烷基硫酸钠溶液(SDS)中十二烷基硫酸钠的含量为10％，所述十二烷基硫酸钠溶液的添加量为所述破壁产物体积的14％～15％。本发明实施例10％的SDS溶液通过将10g SDS溶于ddH₂O，定容至100ml，然后高压灭菌制得。该浓度和添加量的SDS溶液与蛋白酶K溶液一起，对破壁产物中蛋白质、与核酸结合的组蛋白等杂质有最佳的酶解分散作用。

作为优选实施例，所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/ml，添加量为所述破壁产物体积的2％～3％。本发明实施例浓度为20mg/ml，添加量为所述破壁产物体积的2％～3％的蛋白酶K溶液与SDS一起，对破壁产物中蛋白质、与核酸结合的组蛋白等杂质有最佳的酶解分散作用。

作为优选实施例，所述CTAB/NaCl溶液为10％CTAB/0.7mol/LNacl，添加量为所述破壁产物体积的18％～19％。本发明实施例10％CTAB/0.7mol/LNacl，添加量为所述破壁产物体积的18％～19％的CTAB/NaCl溶液，为CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物提供了离子强度环境，有利于对蛋白，多糖，酚类等杂质的去除，对DNA有最佳的抽提效果。

在一些实施例中，将浓度为10％，添加量为所述破壁产物体积的14％～15％的SDS和浓度为20mg/ml，添加量为所述破壁产物体积的2％～3％的蛋白酶K溶液添加到所述破壁产物中，轻柔混匀后，添加所述破壁产物体积的18％～19％的NaCl溶液；然后，取所述破壁产物体积的18％～19％得10％CTAB/0.7mol/LNaCl，于65℃预热溶解后的所述CTAB/NaCl溶液，再次轻柔混合均匀后，在60℃～70℃水浴条件下处理8～15分钟，得到第一次抽提产物。

作为优选实施例，所述采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提的步骤包括：获取与所述第一次抽提产物等体积的所述酚、氯仿和异戊醇混合液添加到所述第一次抽提产物中，混合均匀后，离心处理得到的上清液即为所述抽提产物。本发明实施例采用酚、氯仿和异戊醇的混合液对第一次抽提产物进行第二次抽提，进一步确保对结核分枝杆菌中DNA的充分提取。具体地，酚、氯仿和异戊醇的混合液中，酚能够使蛋白质变性，同时抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)的降解作用，由于蛋白分子表面含有很多极性基团与酚相似相溶，而DNA溶于水相，从而使得蛋白质和DNA分离；酚易溶于氯仿中，酚微溶于水，抽提完之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，本发明混合液中氯仿一方面，加速有机相与液相分层，使有机相和无机相迅速分离，并去除核酸溶液中的迹量酚，通过氯仿把水相里残留的酚抽提掉，另一方面，氯仿作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制DNase活性。另外，混合液中异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中由于震荡等原因产生的泡沫，降低表面张力，从而减少气泡产生；同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

作为优选实施例，所述酚、氯仿和异戊醇的混合液中酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1。本发明实施例混合液中酚与氯仿是非极性分子，而第一次抽提产物中水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。而异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中由于震荡等原因产生的泡沫，降低表面张力，从而减少气泡产生；同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。所以在抽提过程中，采用酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1的混合溶液，该特定比例量的混合液，各组分之间的协同配合作用最佳，对DNA的抽提分离，抑泡等协同配合作用最佳，此时对DNA的抽提分离效果最好。

在一些实施例中，将浓度为10％，添加量为所述破壁产物体积的14％～15％的SDS和浓度为20mg/ml，添加量为所述破壁产物体积的2％～3％的蛋白酶K溶液添加到所述破壁产物中，轻柔混匀后，添加所述破壁产物体积的18％～19％的NaCl溶液；取所述破壁产物体积的18％～19％得10％CTAB/0.7mol/LNaCl，于65℃预热溶解后的所述CTAB/NaCl溶液，再次轻柔混合均匀后，在60℃～70℃水浴条件下处理8～15分钟，得到第一次抽提产物。然后，将与第一次抽提产物等体积的酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1的混合液，添加到所述第一次抽提产物中，混合均匀后，离心处理得到的上清液即为所述抽提产物。

具体地，上述步骤S50中，采用异丙醇和糖原对所述抽提产物进行沉淀处理，得到结核分枝杆菌DNA。本发明实施例采用异丙醇和糖原对抽提产物共沉淀，提高了对抽提产物的沉淀效果，即使对少量样本的提取抽提，也能有效沉淀抽提的DNA，使肉眼可直接观察到白色DNA沉淀，减轻实验人员的操作难度，提高提取效率。

作为优选实施例，所述沉淀处理的步骤包括：获取异丙醇和糖原溶液，将所述异丙醇添加到所述抽提产物中，混合均匀后，添加所述糖原溶液，再次混合均匀后，于低于-20℃条件下，低温处理2～3小时，得到低温处理产物；将所述低温处理产物离心处理后，得到的沉淀物采用乙醇离心洗涤处理2～3次，得到的白色沉淀即为所述结核分枝杆菌DNA。本发明实施例先通过对抽提产物添加异丙醇混合均匀后，再添加糖原溶液，再次混合均匀，其中，异丙醇比较疏水，能很好地沉淀核酸，即使低浓度核酸也能实现较好的沉淀效果；糖原不含脱氧核糖核酸酶(Dnase)和核糖核酸酶(Rnase)，与异丙醇一起作为辅助沉淀剂沉淀下来的核酸更适合于后续的PCR、RT-PCR以及内切酶等核酸酶反应。另外，得到的沉淀物采用乙醇离心洗涤处理2～3次，一方面乙醇能增加盐的溶解度，去除一些盐离子杂质，另一方面，乙醇容易挥发，对下游DNA的应用试验影响较小。

作为优选实施例，所述异丙醇的添加量为所述抽提产物体积的55％～65％。本发明实施例添加量为所述抽提产物体积的55％～65％的异丙醇，对抽提产物有较好的沉淀效果。

作为优选实施例，所述糖原溶液的浓度为20mg/ml，添加量为所述抽提产物体积的0.6％～0.7％，本发明实施例浓度为20mg/ml，添加量为所述提取抽提产物体积的0.6％～0.7％的糖原与异丙醇有最佳的配合共沉作用。

在一些实施例中，获取添加量为所述抽提产物体积的55％～65％的异丙醇和浓度为20mg/ml，添加量为所述抽提产物体积的0.6％～0.7％的糖原溶液，将所述异丙醇添加到所述抽提产物中，混合均匀后，添加所述糖原溶液，再次混合均匀后，于低于-20℃条件下，低温处理2～3小时，得到低温处理产物；将所述低温处理产物离心处理后，去除上清液得到的沉淀物，采用75％乙醇离心洗涤处理2～3次，得到的白色沉淀即为所述结核分枝杆菌DNA。

作为优选实施例，所述结核分枝杆菌DNA在使用时，挥发去除其中的乙醇溶剂后，采用缓冲溶液溶解所述结核分枝杆菌DNA。具体地，挥发去除结核分枝杆菌DNA中的乙醇溶剂后，溶解在TE缓冲溶液中，在室温或4℃过夜，使DNA充分溶解，即可使用。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例结核分枝杆菌DNA的抽提方法的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。

实施例1

一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，包括以下步骤：

(1)从L-J(Loewenstein-Jensen)固体培养基上刮取结核分枝杆菌菌落，放入加有500ul的TE缓冲液中，80℃水浴，30分钟即可杀灭细菌,得到已灭活的结核分枝杆菌。

(2)对所述已灭活的结核分枝杆菌，进行涡旋振荡分散处理：①确保1.5ml的EP管中灭活菌株与1×TE的总量为500ul，不足时加1×TE补足。②加入3－4粒玻璃珠于EP管，充分涡旋振荡2-3分钟，使细菌分散。③根据涡旋后EP管中的菌量，可适当加入1×TE进行稀释，得到涡旋振荡分散产物。

(3)对所述涡旋振荡分散产物进行超声分散：①将EP管中的菌液进行吹打混匀，防止菌株沉淀。②吸取450ul的菌液转移至超声分散管中。(注意枪头上残留的菌液)③超声条件：超声5S，暂停5S，总时长60S。④重复③一次(共2次，2分钟)。⑤超声结束，将超声管壁上的菌液尽量甩下来，将所有菌液转移至新的1.5ml离心管中，得到所述结核分枝杆菌分散液。

(4)对所述结核分枝杆菌分散液进行破壁处理：加入20ul的50mg/ml溶菌酶，涡旋混匀，37℃水浴消化2小时，得到破壁产物。(每20-30min颠倒混匀)

(5)对所述破壁产物，先采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提：①加入70ul的10％SDS和10ul的20mg/ml蛋白酶K，轻柔的颠倒混匀，勿剧烈振荡，65℃水浴10min。②加入100ul的5mol/L的NaCl溶液。③加入100ul的10％CTAB/NaCl溶液(需65℃预热)，轻柔的颠倒混匀，65℃水浴10min，得到第一次抽提产物。

(6)对所述第一次抽提产物采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提：加入与第一次抽提产物等体积(约700ul)的酚：氯仿：异戊醇，颠倒数次充分混匀，13500g离心10min，用200ul的枪头小心吸取上清(不要吸到中间的白色沉淀)至新的1.5ml离心管中。(上清约600ul左右)，得到抽提产物；

(7)采用异丙醇和糖原对所述抽提产物进行沉淀处理：①在抽提产物中加入0.6体积(约420ul)的异丙醇，颠倒混匀。②加入4ul20mg/ml糖原，颠倒混匀，-20℃冰箱2小时，16000g离心30min。③用枪头吸去上清，注意不要碰到白色沉淀。④加入250ul的75％酒精，上下颠倒数次，使酒精将管壁都润洗到。13500g离心1min，弃去上清，得到白色沉淀即为结核分枝杆菌DNA。

进一步的，为了验证本发明实施例结核分枝杆菌DNA提取方法的进步性，本发明实施例进行了对比试验：

采用本发明实施例1的结核分枝杆菌DNA提取方法和现有常规方法(CTAB抽提法)，在相同条件下同时提取10份结核分枝杆菌培养物，提取后采用微量分光光度计进行浓度测定，结果如下表1所示：

表1

由上述测试结果可见，采用本发明实施例1结核分枝杆菌DNA的提取方法提取的DNA浓度显著高于采用常规提取方法提取的DNA浓度；并且，OD值(260/280)也高于常规方法的OD值，说明通过本发明实施例结核分枝杆菌DNA的提取方法提取的DNA纯度更高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

获取结核分枝杆菌，对所述结核分枝杆菌进行灭活处理，得到已灭活的结核分枝杆菌；

对所述已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，得到结核分枝杆菌分散液；

对所述结核分枝杆菌分散液进行破壁处理，得到破壁产物；

对所述破壁产物，先采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提，然后采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提，得到抽提产物；其中，进行所述第一次抽提的步骤包括：获取十二烷基硫酸钠溶液和蛋白酶K溶液，将所述十二烷基硫酸钠溶液和所述蛋白酶K溶液添加到所述破壁产物中，轻柔混匀后，添加NaCl溶液和预热后的所述CTAB/NaCl溶液，再次轻柔混合均匀后，在60℃～70℃水浴条件下处理8～15分钟，得到第一次抽提产物；进行所述第二次抽提的步骤包括：获取与所述第一次抽提产物等体积的所述酚、氯仿和异戊醇混合液添加到所述第一次抽提产物中，混合均匀后，离心处理得到的上清液即为所述抽提产物；其中，所述十二烷基硫酸钠溶液中十二烷基硫酸钠的含量为10％，所述十二烷基硫酸钠溶液的添加量为所述破壁产物体积的14％～15％；所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/ml，添加量为所述破壁产物体积的2％～3％；所述CTAB/NaCl溶液为10％CTAB/0.7mol/LNacl，添加量为所述破壁产物体积的18％～19％；所述酚、氯仿和异戊醇的混合液中酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1；

采用异丙醇和糖原对所述抽提产物进行沉淀处理，得到结核分枝杆菌DNA；其中，所述沉淀处理的步骤包括：获取异丙醇和糖原溶液，将所述异丙醇添加到所述抽提产物中，混合均匀后，添加所述糖原溶液，再次混合均匀后，于低于-20℃条件下，低温处理2～3小时，得到低温处理产物；将所述低温处理产物离心处理后，得到的沉淀物采用乙醇离心洗涤处理2～3次，得到的白色沉淀即为所述结核分枝杆菌DNA；其中，所述异丙醇的添加量为所述抽提产物体积的55％～65％；所述糖原溶液的浓度为20mg/ml，添加量为所述抽提产物体积的0.6％～0.7％；所述结核分枝杆菌DNA在使用时，挥发去除其中的乙醇溶剂后，采用缓冲溶液溶解所述结核分枝杆菌DNA。

2.如权利要求1所述的结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述灭活处理的步骤包括：将所述结核分枝杆菌置于TE缓冲液中，在75～85℃的条件下，处理30～60分钟；和/或，

所述涡旋振荡分散处理的步骤包括：将所述已灭活的结核分枝杆菌置于缓冲溶液中，在添加有玻璃珠的情况下，涡旋振荡分散2～5分钟，得到涡旋振荡分散产物。

3.如权利要求2所述的结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述超声分散处理的步骤包括：对所述涡旋振荡分散产物进行间歇式超声处理2分钟～3分钟，得到所述结核分枝杆菌分散液；其中，所述间歇式超声处理的超声处理时长为2～10秒，暂停时长2～10秒。

4.如权利要求1～3任意一项所述的结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述破壁处理的步骤包括：获取溶菌酶，将所述溶菌酶添加到所述结核分枝杆菌分散液中，混合均匀后，在35℃～38℃的条件下水浴消化2小时～24小时，得到所述破壁产物。

5.如权利要求4所述的结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述溶菌酶的浓度为50～60mg/ml，添加量为所述结核分枝杆菌分散液体积的3.5％～4.5％；和/或，

所述水浴消化处理的步骤包括：每隔20～30分钟进行一次颠倒混合处理。