CN113151578A - 区分不同象草品种的dna条形码标准检测基因及其应用 - Google Patents

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CN113151578A CN202110654405.7A CN202110654405A CN113151578A CN 113151578 A CN113151578 A CN 113151578A CN 202110654405 A CN202110654405 A CN 202110654405A CN 113151578 A CN113151578 A CN 113151578A
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因及其应用，本发明的DNA条形码标准检测基因能快速的对不同象草品种及其杂交种进行区分、鉴定，该方法的准确性高、操作过程简洁、用时短的特点，特别是，采用本发明可准确地鉴别不同象草品种及其杂交种，可应用于象草品种的鉴定及品种保护，这对于象草种质资源的科学保护具有重要意义以便高效、快速、准确的鉴定不同象草品种及其杂交种。相比传统的通过形态鉴定法，本发明的方法能在实验室条件下较短时间内很好的完成，可大大提高效率。具有很好的推广价值。

Description

区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因及其应用
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因及其应用。
【背景技术】
象草(Cenchrus purpureus)因大象爱采食而得名，是禾本科、黍族多年生大型草本植物，原产于非洲。象草因其具有生物量大、生长快速、适应性强等特点，被用作重要的饲草作物在全世界热带及亚热带被广泛种植，此外，由于象草在生物能方面的优势也使其成为潜在的能源草。目前国内主要栽培象草品包括：桂闽引象草、矮象草、紫象草、热研4号象草、桂牧1号象草、巨菌草；其中，热研4号象草、桂牧1号象草为杂交种，象草品种及其杂交种形态极为相似。此外，象草的繁殖方式主要为无性繁殖，已茎段作为繁殖材料，象草品种及其杂交种的茎段形态也极为相似。从现有的形态学研究看，还缺乏直观、明显的差异可区分不同象草品种及其杂交种的方法。
为此，有必要对不同品种的象草基因进行研究，从分子水平上快速区分不同象草品种，达到简单、高效、准确区分不同象草品种的目的。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因及其应用，该应用技术能快速、准确的对不同象草品种进行区分，特别是对象草的杂交种进行有效区分。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因，所述DNA条形码标准检测基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示。
进一步的，所述不同象草品种为5个，分别为：桂闽引象草、矮象草、紫象草、巨菌草和杂交种象草；所述桂闽引象草(简写：CpGMY)(拉丁名：C.purpureus cv.GuiMinYin)对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述矮象草(简写：CpMott)(拉丁名：C.purpureus cv.Mott)对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述紫象草(简写：CpPurple)(拉丁名：C.purpureus cv.Purple)对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述巨菌草(简写：CpJujun)(拉丁名：C.giganteumz.x.lin tentative name)对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述杂交种象草的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步的，上述的杂交种象草为热研4号象草和/或桂牧1号象草；其中，热研4号象草(简写：CpReyan4)为(C.purpureus×C.americanus cv.)的杂交种；桂牧1号象草(简写：CpGuimu1)为(Cenchrus purpureus cv.Mott)×(C.americanus×C.purpureus)cv.的杂交种。
本发明还包括所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因在象草分类中的应用。
本发明还包括一种应用所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因区分不同象草品种的方法，所述方法为：提取待测象草品种基因组DNA；以提取的基因组DNA为模板，以CpITSf和CpITSr为引物进行PCR扩增，获得PCR产物，对PCR产物进行测序；
当核酸序列如SEQ ID NO.1所示，第527位碱基为G、第537位碱基为C、同时第569位碱基为G时，该象草品种为桂闽引象草；
当核酸序列如SEQ ID NO.2所示，第292位碱基为A和/或第527位碱基为A、同时第537位碱基为C、同时569位碱基为A时，该象草品种为矮象草；
当核酸序列如SEQ ID NO.3所示，第527位碱基为A、同时第537位碱基为C、同时569位碱基为G时，该象草品种为紫色象草；
当核酸序列如SEQ ID NO.4所示，第527位碱基为A、同时第537位碱基为T、同时569位碱基为G时，该象草品种为巨菌草；
当核酸序列如SEQ ID NO.5所示，第414位碱基为G时，该象草品种为杂交种象草；
所述引物CpITSf如序列表SEQ ID NO.6所示；所述引物CpITSr如序列表SEQ IDNO.7所示。
本发明还包括一种应用所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因区分象草杂交种的方法，提取待测象草品种的基因组DNA；以提取的基因组DNA为模板，以CpITSf和CpITSr为引物进行PCR扩增，获得PCR产物，对PCR产物进行测序；当核酸序列如SEQ ID NO.5所示，第414位碱基为G时，该象草品种为杂交种；所述引物CpITSf如序列表SEQ ID NO.6所示；所述引物CpITSr如序列表SEQ ID NO.7所示。
本发明还包括一种区分不同象草品种的鉴定方法，提取待鉴定的象草材料的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用CpITSf和CpITSr为引物进行PCR扩增获得未知象草的PCR产物并测序，然后将未知象草测序后的PCR产物序列和权利要求1或2所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因序列一起聚类建树，未知象草的PCR产物序列被聚类到哪个种，则未知象草即为该种；所述引物CpITSf如序列表SEQ ID NO.6所示；所述引物CpITSr如序列表SEQ ID NO.7所示。
本发明还包括一种获取所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因的方法，该方法为：
(1)通过不同的生物学特性初步鉴定桂闽引象草、矮象草、紫象草、巨菌草、热研4号象草和/或桂牧1号象草；
(2)提取幼苗的DNA；
(3)将幼苗的DNA通过引物CpITSf和CpITSr进行PCR扩增和测序；
(4)对测序结果进行比对、编辑、质量核查、检测特异SNP位点，序列建树；
(5)对标准分类对应序列的确认得到相应的DNA条形码标准检测基因如序列表SEQID NO.1-SEQ ID NO.5所示；
(6)用已知明显分类的象草品种进行准确性验证。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明的DNA条形码标准检测基因能快速的对不同象草品种(桂闽引象草、矮象草、紫象草、巨菌草)及其杂交种(热研4号和/或桂牧1号)进行区分、鉴定，具有操作过程简洁、用时短，准确率高的特点，经检验，该方法的准确率达到100％。相比传统的通过形态鉴定法，可大大提高效率。该方法能在实验室条件下较短时间内很好的完成，具有很好的推广价值，有助于快速有效的区分不同象草种质资源。
2、采用本发明的标准检测基因和方法可准确地鉴别不同象草品种及其杂交种，除上述优点外，本发明还找出了杂交象草：热研4号象草和桂牧1号象草区别于其他非杂交象草的特异性SNP，利用该位点能快速建立引物区分杂交象草和非杂交象草，为象草后期的种质鉴定提供良好的参考。
【附图说明】
图1基于不同象草品种及其杂交种标准分类对应序列构建的聚类图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因，所述DNA条形码标准检测基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示。
本实施例的DNA条形码标准检测基因获得方法为：
(1)通过不同的生物学特性初步鉴定桂闽引象草、矮象草、紫象草、巨菌草和杂交种象草；
(2)象草种子发芽：分别取4个不同象草品种(桂闽引象草、矮象草、紫象草和巨菌草)和2个象草杂交种种子(热研4号象草和/或桂牧1号象草)20粒，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，将培养皿置于24℃培养箱中(白天16h，黑夜8h)培养14天，并定期更换滤纸；
(3)幼苗DNA的提取：使用SDS法提取，将幼苗擦净水整株放在1.5ml离心管中，放入钢珠充分震荡；加入600μl DNA buffer混合均匀，65℃水浴10min，期间震荡1-2次；放至常温，加195μl l5mol的醋酸钾(PH＝6.0)，冰上放置5min；加600μl氯仿异戊醇(24:1)，混合均匀；室温，12000rpm离心10min，吸取360μl上清液至新1.5ml离心管；加54μl 3mol醋酸钠和360μl的异丙醇，混合均匀，室温放置10min；室温，12000rpm离心10min，弃上清液并倒置1.5ml离心管，除去残留液体；加500μl75％的乙醇，将沉淀弹起；室温，12000rpm离心5min，倒去乙醇；放入超净工作台晾干，放置5min，待乙醇挥发完全后，加20μl超纯水溶解；溶解后，轻弹管壁，将DNA混合均匀，再瞬时离心，-20℃保存待用提取待测象草品种基因组DNA；
(4)以提取的基因组DNA为模板，以CpITSf和CpITSr为引物进行PCR扩增，其中，PCR的总反应体系为25μl：2×Reaction Mix 12.25μl，Golden DNA Polymerase 0.25μl，正反向引物各2.5μl,ddH2O 5μl，DNA模板2.5μl；PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。获得PCR产物，挑选琼脂糖电泳效果好的、明亮的、无杂带的样本PCR产物，送样测序，均使用正向基因进行DNA扩增；
(5)序列比对、编辑、质量核查、建树获得上述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5序列：使用软件vectorNTI对所测序列进行比对编辑，删去头尾较乱的碱基序列，然后用DNAMAN对编辑后的序列进行质量核查，通过多重序列比对检查测序结果，最后利用MEGA7构建聚类图，该图如图1所示；图中：CpGMY为桂闽引象草、CpMott为矮象草、CpPurple为紫色象草、CpJujun为巨菌草、CpReyan4为热研4号象草、CpGuimu1为桂牧1号象草。
实施例2：
上述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5的标准检测基因可以区分如下6个品种的象草品种：桂闽引象草、矮象草、紫象草、巨菌草和杂交种象草：
其中桂闽引象草对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
矮象草对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
紫色象草对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.3所示；
巨菌草对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.4所示；
杂交种桂牧1号和热研4号的DNA条形码标准检测基因一致，对应的核酸序列如SEQID NO.5所示。
实施例3：
基于上述基因序列的高度保守性和稳定性，上述DNA条形码标准检测基因可用于区分上述6个不同象草品种。
利用上述DNA条形码标准检测基因区分不同象草品种的方法为：
(1)象草种子发芽：分别取未知象草品种的种子，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，将培养皿置于24℃培养箱中(白天16h，黑夜8h)培养14天，并定期更换滤纸；
(2)幼苗DNA的提取：使用SDS法提取，将幼苗擦净水整株放在1.5ml离心管中，放入钢珠充分震荡；加入600μl DNA buffer混合均匀，65℃水浴10min，期间震荡1-2次；放至常温，加195μl l5mol的醋酸钾(PH＝6.0)，冰上放置5min；加600μl氯仿异戊醇(24:1)，混合均匀；室温，12000rpm离心10min，吸取360μl上清液至新1.5ml离心管；加54μl 3mol醋酸钠和360μl的异丙醇，混合均匀，室温放置10min；室温，12000rpm离心10min，弃上清液并倒置1.5ml离心管，除去残留液体；加500μl75％的乙醇，将沉淀弹起；室温，12000rpm离心5min，倒去乙醇；放入超净工作台晾干，放置5min，待乙醇挥发完全后，加20μl超纯水溶解；溶解后，轻弹管壁，将DNA混合均匀，再瞬时离心，-20℃保存待用提取待测象草品种基因组DNA；
(3)以提取的基因组DNA为模板，以CpITSf和CpITSr为引物进行PCR扩增，其中，PCR的总反应体系为25μl：2×Reaction Mix 12.25μl，Golden DNA Polymerase 0.25μl，正反向引物各2.5μl,ddH2O 5μl，DNA模板2.5μl；PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。获得PCR产物，对PCR产物进行测序；
(4)当核酸序列如SEQ ID NO.1所示，第527位碱基为G、第537位碱基为C、同时第569位碱基为G时，该象草品种为桂闽引象草；
(5)当核酸序列如SEQ ID NO.2所示，第292位碱基为A和/或第527位碱基为A、同时第537位碱基为C、同时569位碱基为A时，该象草品种为矮象草；
(6)当核酸序列如SEQ ID NO.3所示，第527位碱基为A、同时第537位碱基为C、同时569位碱基为G时，该象草品种为紫色象草；
(7)当核酸序列如SEQ ID NO.4所示，第527位碱基为A、同时第537位碱基为T、同时569位碱基为G时，该象草品种为巨菌草；
(8)当核酸序列如SEQ ID NO.5所示，第414位碱基为G时，该象草品种为杂交种象草；
上述步骤(3)中的引物CpITSf如序列表SEQ ID NO.6所示；所述引物CpITSr如序列表SEQ ID NO.7所示。
实施例4：
经过对本申请DNA条形码标准检测基因序列的分析得知，杂交种：热研4号象草和/或桂牧1号象草的ITS扩增产物中，其序列的第414位碱基为G时，该象草品种为杂交种，为此，可以通过如下方法进行鉴定象草是否为杂交种：
(1)按照实施例3的步骤(1)-(2)提取待测象草品种的基因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，以CpITSf和CpITSr为引物按照实施例3的步骤(3)进行PCR扩增，获得PCR产物，对PCR产物进行测序；当测序得到的核酸序列如SEQ ID NO.5所示，第414位碱基为G时，该象草品种为杂交种：热研4号象草和/或桂牧1号。
在后期的研究中，还可通过该特异性位点：SEQ ID NO.5序列的第414位碱基为G来设计特异性引物进行扩增，能快速的将杂交种和非杂交种区分出来。
实施例5：
本实施例采用聚类分析的方法，对象草品种进行快速区分，该方法相对于实施例3的方法而言，更简便、快速，准确率更高，具体方法如下：
(1)按照实施例3的步骤(1)-步骤(3)获取未知象草品种的PCR产物并进行测序；
(2)然后将未知象草测序后的PCR产物序列和序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5不同象草品种的DNA条形码标准检测基因序列一起聚类建树，未知象草的PCR产物序列被聚类到哪个同种标准分类对应序列中，则未知象草即为该种。
此外，任意抽调出一组标准分类对应序列，其余序列聚类建树，结果剩下序列中的标准分类对应序列聚在一起，如此重复抽调出不同的标准分类对应序列，聚类建树的结果一致。
由此说明，采用聚类方法进行分辨，能快速的对未知象草品种进行区分，该方法简单、高效、快速、准确。
综上所述，本申请的DNA条形码标准检测基因能快速的对桂闽引象草、矮象草、紫象草、巨菌草和杂交种象草进行区分；采用本发明提供的鉴定方法，可直接对不同象草品种及其杂交种进行区分、鉴定，该方法的准确性高、操作过程简洁、用时短，准确率高。该方法能在实验室条件下较短时间内很好的完成，具有很好的推广价值，有助于快速有效的区分不同象草种质资源。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> 象草(Cenchrus purpureus)
<400> 1
cattgtcgtg acccttaaac aaaacagacc gtgaacatgt cacccatgcc gctcgggctt 60
ctgctcgggc taggcctcga ccttctttta gagggaaggg gtcgcaaaag aacccacggc 120
gccgaaggcg tcaaggaaca cttatattgc cttgcccggg gttgtggtcg gcctgccgaa 180
cgcacctcgt gcagcgatgc tatcttaatc cacacgactc tcggcaacgg atatctcggc 240
tctcgcatcg atgaagaacg tagcaaaatg cgatacctgg tgtgaattgc agaatcccgc 300
gaaccatcga gtttttgaac gcaagttgcg cccgaggcct tctggctgag ggcacgtctg 360
cctgggcgtc acgccaaaag acactcccaa cccatccgtg gggaaggatg tggtgtttgg 420
ctccccgtgc cgtaaggtgg ggtgggccga agttggggcc gccggcgtaa catgccgagc 480
accgcacgtg gtgggcgaca tacagttgtt ctcggtgcag tgtctcggct agtagtcggc 540
gtgttggcct aaatgaccca tgacgaccgt agcgctttgt cgctcggacc gcgaccccag 600
gtcagacggg actacccgct gagtttaagc atataaataa gcgga 645
<210> 2
<211> 645
<212> DNA
<213> 象草(Cenchrus purpureus)
<400> 2
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<212> DNA
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gtcagacggg actacccgct gagtttaagc atataaataa gcgga 645
<210> 5
<211> 645
<212> DNA
<213> 象草(Cenchrus purpureus)
<400> 5
cattgtcgtg acccttaaac aaaacagacc gtgaacatgt cacccatgcc gctcgggctt 60
ctgctcgggc taggcctcga ccttctttta gagggaaggg gtcgcaaaag aacccacggc 120
gccgaaggcg tcaaggaaca cttatattgc cttgcccggg gttgtggtcg gcctgccgaa 180
cgcacctcgt gcagcgatgc tatcttaatc cacacgactc tcggcaacgg atatctcggc 240
tctcgcatcg atgaagaacg tagcaaaatg cgatacctgg tgtgaattgc agaatcccgc 300
gaaccatcga gtttttgaac gcaagttgcg cccgaggcct tctggctgag ggcacgtctg 360
cctgggcgtc acgccaaaag acactcccaa cccatccgtg gggaaggatg tggggtttgg 420
ctccccgtgc cgtaaggtgg ggtgggccga agttggggcc gccggcgtaa catgccgagc 480
accgcacgtg gtgggcgaca tacagttgtt ctcggtgcag tgtctcagct agtagttggc 540
gtgttggcct aaatgaccca tgacgaccgt agcgctttgt cgctcggacc gcgaccccag 600
gtcagacggg actacccgct gagtttaagc atataaataa gcgga 645
<210> 6
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaagkaraa gtcgtaacaa gg 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
rgtttctttt cctccgctta 20

Claims (6)

1.区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因，其特征在于，所述DNA条形码标准检测基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因，其特征在于，所述不同象草品种为5个，分别为：桂闽引象草、矮象草、紫象草、巨菌草和杂交种象草；所述桂闽引象草对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述矮象草对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述紫象草对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述巨菌草对应的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述杂交种象草的DNA条形码标准检测基因核酸序列如SEQ IDNO.5所示。
3.如权利要求1或2所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因在象草分类中的应用。
4.一种应用如权利要求1或2所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因区分不同象草品种的方法，其特征在于，所述方法为：提取待测象草品种基因组DNA；以提取的基因组DNA为模板，以CpITSf和CpITSr为引物进行PCR扩增，获得PCR产物，对PCR产物进行测序；
当核酸序列如SEQ ID NO.1所示，第527位碱基为G、第537位碱基为C、同时第569位碱基为G时，该象草品种为桂闽引象草；
当核酸序列如SEQ ID NO.2所示，第292位碱基为A和/或第527位碱基为A、同时第537位碱基为C、同时569位碱基为A时，该象草品种为矮象草；
当核酸序列如SEQ ID NO.3所示，第527位碱基为A、同时第537位碱基为C、同时569位碱基为G时，该象草品种为紫象草；
当核酸序列如SEQ ID NO.4所示，第527位碱基为A、同时第537位碱基为T、同时569位碱基为G时，该象草品种为巨菌草；
当核酸序列如SEQ ID NO.5所示，第414位碱基为G时，该象草品种为杂交种象草；
所述引物CpITSf如序列表SEQ ID NO.6所示；所述引物CpITSr如序列表SEQ ID NO.7所示。
5.一种应用如权利要求1或2所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因区分象草杂交种的方法，其特征在于，提取待测象草品种的基因组DNA；以提取的基因组DNA为模板，以CpITSf和CpITSr为引物进行PCR扩增，获得PCR产物，对PCR产物进行测序；当核酸序列如SEQ ID NO.5所示，第414位碱基为G时，该象草品种为杂交种；所述引物CpITSf如序列表SEQ ID NO.6所示；所述引物CpITSr如序列表SEQ ID NO.7所示。
6.一种区分不同象草品种的鉴定方法，其特征在于，提取待鉴定的象草材料的基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用CpITSf和CpITSr为引物进行PCR扩增获得未知象草的PCR产物并测序，然后将未知象草测序后的PCR产物序列和权利要求1或2所述区分不同象草品种的DNA条形码标准检测基因序列一起聚类建树，未知象草的PCR产物序列被聚类到哪个种，则未知象草即为该种；所述引物CpITSf如序列表SEQ ID NO.6所示；所述引物CpITSr如序列表SEQ ID NO.7所示。
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