CN103045586A - 适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括预处理、裂解、纯化、沉淀、洗涤、溶解，本发明方法操作安全、简便、高通量、成本低，对人体无伤害、无痛苦。提取的基因组DNA纯度高，含量高，片段在23kb以上，完全满足全基因组测序文库构建及一般分子生物学实验操作的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法。
背景技术
在分子生物学技术的研究中，关键在于DNA的提取。常规的分子生物学操作如PCR、酶切、杂交，对DNA的质量要求不高，一般分子生物学实验指导书上的常规方法如浓盐法、酸碱抽提法等即可满足其要求。
随着全基因组随机测序方法的成熟，计算机拼装算法的发展，基因组时代已经到来，从基因组学角度实现传统医学、保健等方面的转化，将有望使基于基因组测试的个体化诊疗、健康保健方案成为可能。目前基于基因组测序技术的遗传疾病诊断、个体化治疗、遗传天赋基因检测以及基因营养学检测等已开始为广大群众所接受。
全基因组测序对DNA的样品具有高纯度、大片段的要求，不同于一般PCR样品的要求。对于全基因组测序的基因组文库构建，DNA的需求量较大，长度至少大于23kb，而且质量要求较高，应尽量避免多糖、蛋白质的残留，否则影响库的构建及后续测序工作。因此，一次性获取高质高量的DNA就相当必要。
基因组DNA，传统上是从血液中提取的。这种采血的方法对被收集者造成伤害，带来痛苦，被绝大多数人所厌恶甚至拒绝；尤其是对婴幼儿而言，不恰当的取样方式往往无法满足提取测试的需要。从唾液等其它体液中获取基因组DNA是一种对人体无伤害、无痛苦的方法，它简便易行，廉价高效，避免了采血的不需要配备注射器、消毒用具，且比用棉拭子刮取口腔上皮细胞效果好，特别适用于婴幼儿基因组DNA的提取。中山大学陈嘉昌等人使用试剂盒方法提取唾液DNA，效果好但成本高；公安部物证中心周云彪等人发明的使用磁珠法进行唾液DNA分离提取，受限于磁珠等特殊物质的购买，不适宜于大范围的推广。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种操作安全、简便、高通量、成本低、提取的基因组DNA质量好的一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法。
本发明是一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)向0.5-1ml婴幼儿唾液样品中加入500ul提取缓冲溶液，反复吹打混匀后，8000×g离心5分钟，弃去上清，此步骤重复一次；
(2)向步骤(1)得到的沉淀中加入500ul裂解液，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置30分钟，期间来回颠倒离心管数次；
(3)向步骤(2)得到的混合液中，加入RNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；
(4)向步骤(3)得到的上清液中，加入等体积苯氛-氯仿混合溶液，充分混匀，混合液4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；
(5)向步骤(4)得到的上清液中加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；
(6)向步骤(5)得到的上清液中加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；
(7)向步骤(6)得到的上清液中加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.1倍的醋酸钠溶液，-20℃静置60分钟后，4℃，12000×g离心10分钟，弃上清；
(8)向步骤(7)得到的沉淀物中加入0.5mL70%乙醇清洗沉淀物，4℃，12000×g离心5分钟，弃上清，此步骤重复一次；
(9)步骤(8)得到的沉淀物自然风干，加入20μL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20℃保存待用。
优选的，所述的婴幼儿唾液样品为5岁以下儿童的唾液、泪液、鼻涕。
优选的，所述步骤(1)中所述的DNA提取缓冲溶液，溶剂为50mM的Tris-HClpH7.4，配方中各溶剂组分中浓度为：0.5mM的EDTA、50mM的NaCl；
优选的，所述步骤(2)中，所述的裂解液，溶剂为50mM Tri s-HCl pH7.4，配方中各溶质组分浓度为：50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1% Triton x-100，1% Sodium deoxycholate，0.1% SDS，蛋白酶K 20mg/mL。
优选的，所述步骤(3)中，所述的RNA酶的水溶液中，RNA酶的浓度为10mg/mL。
优选的，所述步骤(4)中，所述的苯酚-氯仿混合溶液中，苯酚和氯仿的体积比为1∶1。
优选的，所述步骤(5)中，所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1。
优选的，所述步骤(6)中，所述的苯氯仿-异戊醇混合溶液中，苯氯仿和异戊醇的体积比为1∶1。
优选的，所述步骤(7)中，所述的醋酸钠的水溶液中，醋酸钠的浓度为3mol/L。
本发明的有益技术效果在于：
(1)本发明方法操作安全、简便、高通量、成本低，对人体无伤害、无痛苦。
(2)本发明方法所述的DNA提取方法适用与婴幼儿的体液样本，提取的基因组DNA纯度高，含量高，片段在23kb以上，可以满足一般分子生物学操作及全基因组测序文库构建。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明是一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)向0.5-1ml婴幼儿唾液样品中加入500ul提取缓冲溶液，反复吹打混匀后，8000×g离心5分钟，弃去上清，此步骤重复一次，用于去除唾液中的杂质。
(2)向步骤(1)得到的沉淀中加入500ul裂解液，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置30分钟，期间来回颠倒离心管数次，用于裂解细胞膜等细胞大结构释放细胞内容物。
(3)向步骤(2)得到的混合液中，加入RNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min，用于消化降解细胞内的各类RNA。
(4)向步骤(3)得到的上清液中，加入等体积苯氛-氯仿混合溶液，充分混匀，混合液4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内，用于变性抽提溶液中的蛋白质。
(5)向步骤(4)得到的上清液中加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内，用于抽提溶液中蛋白质并带走液体内残余氛。
(6)向步骤(5)得到的上清液中加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内，用于将溶液内残余氛及氯仿抽提出。
(7)向步骤(6)得到的上清液中加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.1倍的醋酸钠溶液，-20℃静置60分钟后，4℃，12000×g离心10分钟，弃上清，用于将DNA沉淀分离出来。
(8)向步骤(7)得到的沉淀物中加入0.5mL70%乙醇清洗沉淀物，4℃，12000×g离心5分钟，弃上清，此步骤重复一次，用于将沉淀DNA中残余杂质及有机溶剂进一步去除。
(9)步骤(8)得到的沉淀物自然风干，加入20μL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20℃保存待用，用于将提取的DNA溶解并储存。
优选的，所述的婴幼儿唾液样品为5岁以下儿童的唾液、泪液、鼻涕。
优选的，所述步骤(1)中所述的DNA提取缓冲溶液，溶剂为50mM的Tris-HClpH7.4，配方中各溶剂组分中浓度为：0.5mM的EDTA、50mM的NaCl；
优选的，所述步骤(2)中，所述的裂解液，溶剂为50mM Tris-HCl pH7.4，配方中各溶质组分浓度为：50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton x-100，1% Sodium deoxycholate，0.1% SDS，蛋白酶K 20mg/mL。
优选的，所述步骤(3)中，所述的RNA酶的水溶液中，RNA酶的浓度为10mg/mL。
优选的，所述步骤(4)中，所述的苯酚-氯仿混合溶液中，苯酚和氯仿的体积比为1∶1。
优选的，所述步骤(5)中，所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1。
优选的，所述步骤(6)中，所述的苯氯仿-异戊醇混合溶液中，苯氯仿和异戊醇的体积比为1∶1。
优选的，所述步骤(7)中，所述的醋酸钠的水溶液中，醋酸钠的浓度为3mol/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向0.5-1ml婴幼儿唾液样品中加入500ul提取缓冲溶液，反复吹打混匀后，8000×g离心5分钟，弃去上清，此步骤重复一次；
(2)向步骤(1)得到的沉淀中加入500ul裂解液，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置30分钟，期间来回颠倒离心管数次；
(3)向步骤(2)得到的混合液中，加入RNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；
(4)向步骤(3)得到的上清液中，加入等体积苯氛-氯仿混合溶液，充分混匀，混合液4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；
(5)向步骤(4)得到的上清液中加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；
(6)向步骤(5)得到的上清液中加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；
(7)向步骤(6)得到的上清液中加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.1倍的醋酸钠溶液，-20℃静置60分钟后，4℃，12000×g离心10分钟，弃上清；
(8)向步骤(7)得到的沉淀物中加入0.5mL 70％乙醇清洗沉淀物，4℃，12000×g离心5分钟，弃上清，此步骤重复一次；
(9)步骤(8)得到的沉淀物自然风干，加入20μL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20℃保存待用。
2.根据权利要求1所述的一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的婴幼儿唾液样品为5岁以下儿童的唾液、泪液、鼻涕。
3.根据权利要求1所述的一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的DNA提取缓冲溶液， 溶剂为50mM的Tris-HCl pH7.4，配方中各溶剂组分中浓度为：0.5mM的EDTA、50mM的NaCl。
4.根据权利要求1所述的一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述的裂解液，溶剂为50mM Tris-HCl pH7.4，配方中各溶质组分浓度为：50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton x-100，1％Sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶K20mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述的RNA酶的水溶液中，RNA酶的浓度为10mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述的苯酚-氯仿混合溶液中，苯酚和氯仿的体积比为1∶1。
7.根据权利要求1所述的一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1。
8.根据权利要求1所述的一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述的苯氯仿-异戊醇混合溶液中，苯氯仿和异戊醇的体积比为1∶1。
9.根据权利要求1所述的一种适用于全基因组测序的婴幼儿唾液内基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(7)中，所述的醋酸钠的水溶液中，醋酸钠的浓度为3mol/L。
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