ES2313919T3 - Metodo para determinar la eficacia de las amplificaciones de acido nucleico. - Google Patents
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Abstract
Método para determinar la eficacia de la amplificación de un ácido nucleico diana, en el que se determina la eficacia de amplificación del modo siguiente: a) preparar una serie de diluciones del ácido nucleico diana b) amplificar el ácido nucleico diana en condiciones de reacción definidas, midiendo la amplificación del ácido nucleico en tiempo real c) establecer un valor umbral definido d) determinar el número de ciclos para cada dilución, en el que se rebasa el valor umbral de señal e) determinar una función no lineal continuamente diferenciable del logaritmo del número de copias del ácido nucleico diana empleado para la amplificación como función del número de ciclos en el que se rebasa el valor umbral de señal y f) calcular la eficacia de amplificación E a partir de la función determinada en el paso e).
Description
Método para determinar la eficacia de las
amplificaciones de ácido nucleico.
La presente invención se refiere al ámbito de la
cuantificación de ácido nucleico mediante una PCR cuantitativa en
tiempo real.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos para la cuantificación de ácidos
nucleicos son importantes en muchas áreas de la biología molecular
y en particular en el diagnóstico molecular. A nivel de DNA se
emplean estos métodos por ejemplo para determinar el número de
copias de secuencias genéticas amplificadas en el genoma. Sin
embargo, los métodos para la cuantificación de ácidos nucleicos se
emplean especialmente en relación con la determinación de las
cantidades de mRNA, ya que este es un índice de la expresión del
correspondiente gen codificador.
Si se dispone de una cantidad suficiente de
material de muestra, los mRNA especiales pueden cuantificarse por
métodos convencionales, p.ej. el análisis Northern Blot o los
métodos de ensayo de protección de la RNAsa. Sin embargo, estos
métodos no tienen sensibilidad suficiente para el material de
muestra que está disponible solamente en cantidades pequeñas o para
genes que se expresan de forma muy débil.
La reacción llamada RT-PCR es un
método mucho más sensible. En este método se produce en primer lugar
un cDNA de hebra simple a partir del mRNA que se quiere analizar,
empleando una transcriptasa inversa. A continuación se genera un
producto de amplificación de DNA de doble hebra mediante la PCR.
Cabe distinguir entre las dos variantes
diferentes de este método:
\bullet en la llamada cuantificación relativa
se determina la relación de la expresión de un cierto RNA diana con
respecto a la cantidad de RNA de un gen llamado guardián
(housekeeping) que se supone que se expresa constitutivamente en
todas las células, con independencia de su correspondiente estado
fisiológico. El mRNA está presente, pues, aproximadamente en la
misma cantidad en todas las células.
La ventaja de esto es que las calidades
inicialmente diferentes de los diversos materiales de muestra y el
proceso de preparación del RNA no influyen en un resultado
particular. Sin embargo, con este método no es posible la
cuantificación absoluta.
\bullet Como alternativa se puede determinar
la cantidad absoluta de RNA empleado mediante ácidos nucleicos
estándar de un número de copias conocido y la amplificación de una
serie de diluciones correspondientes de este ácido nucleico
estándar. Hay dos alternativas:
Cuando se emplean patrones externos, el ácido
nucleico patrón y el diana se amplifican en reactores separados. En
este caso puede emplearse un patrón que tenga una secuencia idéntica
a la del ácido nucleico diana. Sin embargo pueden producirse
errores sistemáticos en este tipo de cuantificación si la
preparación de RNA que se pretende analizar contiene componentes
inhibidores que reduzcan la eficiencia de la posterior reacción
PCR. Estos errores pueden excluirse utilizando patrones internos, es
decir, amplificando el ácido nucleico patrón y el diana en un mismo
reactor. Sin embargo, un inconveniente de este método estriba en que
tienen que emplearse patrones que tengan secuencias diferentes a
las del ácido nucleico diana que se pretende analizar con el fin de
que se pueda distinguir entre la amplificación del ácido nucleico y
del diana. Esto a su vez puede conducir a un error sistemático en
la cuantificación, porque, cuando las secuencias son diferentes, no
pueden excluirse diferentes eficacias en la amplificación PCR.
Los productos de la PCR pueden cuantificarse por
dos métodos fundamentalmente diferentes:
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso la cantidad de producto PCR formado
no guarda relación con la cantidad del número inicial de copias ya
que la amplificación de ácidos nucleicos al final de la reacción ya
no es exponencial y, en lugar, se llega a la saturación. Por
consiguiente, diferentes números iniciales de copias presentan
cantidades idénticas de producto formado en la PCR. Por ello, en
este procedimiento se emplea normalmente el método PCR competitivo
o RT-PCR competitivo. En estos métodos se
coamplifica la secuencia diana específica junto con una serie de
diluciones de un patrón interno que tiene un número conocido de
copias. El número inicial de copias de la secuencia diana se
extrapola a partir de la mezcla que contiene una cantidad idéntica
de producto de PCR de secuencia patrón y de secuencia diana
(Zimmermann y Mannhalter, Bio-Techniques 21,
280-279, 1996).
Un inconveniente de este método es además que la
medición se realiza en la región de saturación de la reacción de
amplificación.
En este caso se hace el seguimiento de la
formación de productos de la PCR en cada ciclo de la PCR.
Normalmente se mide la amplificación en termocicladores que tienen
dispositivos adicionales para medir las señales de fluorescencia
durante la reacción de amplificación. Un ejemplo típico de ello es
el LightCycler de Roche Diagnostics (nº de cat. 2 0110468). Los
productos de amplificación se detectan por ejemplo mediante sondas
de hibridación marcadas fluorescentes que solamente emiten señales
de fluorescencia cuando están unidas al ácido nucleico diana o, en
ciertos casos, también mediante colorantes fluorescentes que se unen
al DNA de doble hebra. Se determina un umbral definido de señal
para todas las reacciones a analizar y se determina el número de
ciclos Cp requerido para alcanzar este valor umbral para el ácido
nucleico diana así como para los ácidos nucleicos de referencia,
como son los genes estándar y el guardián (housekeeping). Los
números absoluto y relativo de copias de la molécula diana pueden
determinarse sobre la base de los valores Cp obtenidos para el ácido
nucleico diana y el ácido nucleico de referencia (Gibson y col.,
Genome Research 6, 995-1001; Bieche y col.,
Cancer Research 59, 2759-2765, 1999; WO
97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714). Estos métodos se denominan
también PCR en tiempo real.
En resumen, en todos los métodos descritos para
la cuantificación de un ácido nucleico por PCR, el número de copias
formado durante la reacción de amplificación se relaciona siempre
con el número de copias formado de un ácido nucleico de referencia,
que es un gen estándar o un RNA de un gen guardián. En este contexto
se supone que la eficacia de la PCR es diferente en el ácido
nucleico diana y en el ácido nucleico de referencia.
Normalmente, una eficacia de la PCR de 2,00 se
supone que corresponde a doblar el número de copias en cada ciclo
PCR (boletín de usuario nº 2, ABI Prism 7700, PE Applied Biosystems,
1997).
Sin embargo se ha puesto de manifiesto que la
eficacia real de la PCR puede ser distinta de 2,00, ya que en ella
influyen varios factores, por ejemplo la unión de los cebadores, la
longitud del producto de la PCR, el contenido G/C y las estructuras
secundarias del ácido nucleico a amplificar y los inhibidores que
pueden estar presentes en la mezcla reaccionante como resultado de
la preparación de la muestra. Esto es particularmente importante
cuando se emplean ácidos nucleicos de referencia heterólogos, p.ej.
en la cuantificación relativa comparada con la expresión de los
genes guardianes. Además no se sabe si o en qué medida la
concentración inicial del ácido nucleico diana a detectar influye
significativamente en la eficacia de la reacción de
amplificación.
Bourinbaiar y col. (1996) describen métodos para
determinar la eficacia de la amplificación.
El objeto de la presente invención es, pues,
desarrollar un método para determinar la eficacia de las
amplificaciones de ácido nucleico del modo más exacto posible y su
utilización en métodos para la cuantificación más exacta posible de
ácidos nucleicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Este objeto se alcanza según la invención con un
método para determinar la eficacia de la amplificación de un ácido
nucleico diana en el que
a) se prepara una serie de diluciones del ácido
nucleico diana
b) se amplifica el ácido nucleico diana en
condiciones de reacción definidas y se mide la amplificación en
tiempo real
c) se establece un valor definido de umbral de
señal
d) para cada dilución se determina el número de
ciclos en el que se rebasa el valor umbral de señal,
e) se determina la eficacia de amplificación en
función de la cantidad original del ácido nucleico diana.
Por tanto, la eficacia de amplificación puede
determinarse generando una función continuamente diferenciable no
lineal del logaritmo del número de copias de ácido nucleico diana
empleado para la amplificación como función del número de ciclos en
los que se rebasa el valor umbral de señal y a partir de esta
función se calcula la eficacia de amplificación E como función de
la cantidad de ácido nucleico diana. En esta forma de ejecución, la
eficacia de amplificación E de una cierta cantidad de ácido nucleico
diana se determina con preferencia en forma de primera derivada
local negativa de la función continuamente diferenciable del paso
e).
Como alternativa puede determinarse también la
eficacia de amplificación determinando una función continuamente
diferenciable no lineal de los números de ciclos determinados como
función del logaritmo del número de copias de ácido nucleico diana
empleado para la amplificación y calculando la eficacia de
amplificación E a partir de la función determinada. En este caso,
la eficacia de amplificación E de una cierta cantidad de ácido
nucleico diana se determina con preferencia en forma de primera
derivada local recíproca de la función continuamente diferenciable
del
paso e).
paso e).
Han demostrado ser especialmente ventajosos los
métodos, en los que se determina la eficacia de amplificación como
función del logaritmo de la concentración del ácido nucleico diana o
viceversa, mediante un ajuste polinómico para determinar la función
continuamente diferenciable no lineal. Este puede ser un ajuste
polinómico de 3er, 4º, 5º, 6º o 7º grado o con preferencia un
ajuste de 4º grado.
Por consiguiente, los métodos según la invención
para la cuantificación de un ácido nucleico diana en una muestra
constan de los pasos siguientes:
a) Determinación según la invención de la
eficacia de amplificación del ácido nucleico diana en condiciones
definidas.
b) Amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra en las mismas condiciones de reacción.
c) Medición de la amplificación en tiempo
real.
d) Cuantificación de la cantidad original de
ácido nucleico diana en la muestra por corrección de la cantidad
original derivada del paso c) mediante la eficacia de amplificación
determinada.
Estos métodos pueden utilizarse para la
cuantificación relativa en comparación con la expresión de genes
guardianes y también para la cuantificación absoluta.
Según los métodos de la invención, la
cuantificación absoluta del ácido nucleico diana en una muestra
consta de los pasos siguientes:
a) Determinación según la invención de las
eficacias de amplificación del ácido nucleico diana y de un patrón
interno o externo en condiciones definidas de amplificación.
b) Amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra y del patrón interno o externo en las mismas
condiciones de reacción definidas.
c) Medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y patrón en tiempo real.
d) Cálculo del número original de copias en la
muestra por corrección del número de copias derivado del paso c)
mediante las eficacias de amplificación determinadas en el paso
a).
A diferencia de ello, los métodos de
cuantificación de un ácido nucleico diana en una muestra respecto a
un ácido nucleico de referencia constan de los pasos
siguientes.
a) Determinación según la invención de las
eficacias de amplificación del ácido nucleico diana y del ácido
nucleico de referencia en condiciones definidas de
amplificación.
b) Amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra así como del ácido nucleico de referencia
contenido en la muestra en las mismas condiciones definidas de
amplificación.
c) Medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y del ácido nucleico de referencia en tiempo
real.
d) Cálculo de la proporción original entre ácido
nucleico diana y ácido nucleico de referencia en la muestra por
corrección de la proporción derivada del paso c) mediante las
eficacias de amplificación determinadas en el paso
a).
a).
La invención se refiere además a todos los
métodos, en los que la determinación de las eficacias de
amplificación se emplea solo indirectamente para el resultado de la
cuantificación y en particular para aquel que depende de la
concentración inicial. En este sentido, la invención se refiere en
particular a un método para la cuantificación relativa de un ácido
nucleico diana con respecto a un ácido nucleico de referencia y
estandarizado con referencia a una muestra de calibrador, que
consta de los pasos siguientes:
a) Preparar una serie de diluciones común o de
dos series de diluciones separadas del ácido nucleico diana y del
ácido nucleico de referencia.
b) Amplificar las diversas diluciones de ácido
nucleico diana y ácido nucleico de referencia en condiciones de
reacción definidas, midiendo la amplificación del ácido nucleico en
tiempo real.
c) Establecer los valores definidos de umbral de
señal para el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de
referencia.
d) Determinar los números de ciclos Cp en los
que se rebasan los valores definidos de umbral de señal para el
ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia son en cada
dilución.
\newpage
e) Determinar una función continuamente
diferenciable del logaritmo de la cantidad de ácido nucleico diana
empleado en función de los valores Cp determinados en d) y
determinar una función continuamente diferenciable del logaritmo de
las cantidades de ácido nucleico de referencia empleado como función
de los valores Cp determinados.
f) Determinar los valores Cp del ácido nucleico
diana y del ácido nucleico de referencia en la muestra a analizar
así como en una muestra con calibrador.
g) Asignar los valores Cp medidos en el paso f)
a valores concretos de las funciones determinadas en el paso
e).
h) Determinar los cocientes de los valores de la
función del paso g) del ácido nucleico diana y del ácido nucleico
de referencia para la muestra para la muestra a analizar así como
para la muestra con calibrador.
i) Determinar la proporción de los cocientes de
h) como indicativo de la cantidad original de DNA diana contenido
en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
La importancia de la corrección de eficacia para
los métodos cuantitativos de amplificación de ácido nucleico se
ilustrará con un cálculo de error. En la tabla 1 se recoge un
cálculo teórico del error porcentual medio del número de copias
determinado en el caso de las eficacias de amplificación diferentes
de 2,00 en relación con el correspondiente número de ciclos.
El error se calcula con arreglo a la
fórmula:
error\
porcentual = (2^{n}/E^{n} - 1) x
100
en la que E es la eficacia de la
amplificación y n es el correspondiente número de ciclos, en el que
se determina el error
porcentual.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia de amplificación de una reacción PCR
puede determinarse por varios métodos.
Por ejemplo, en el caso de un seguimiento en
tiempo real de las reacciones PCR, esto puede lograrse determinando
la cantidad de ácido nucleico diana amplificado de cada ciclo de
amplificación y determinando la eficacia de la reacción de
amplificación a partir de los valores resultantes.
Como alternativa puede determinarse la eficacia
de la reacción de amplificación de una diana concreta en un modo de
PCR en tiempo real en condiciones definidas amplificando en primer
lugar varias diluciones del ácido nucleico diana y determinando el
número de ciclos para cada dilución en el que se rebasa el valor
umbral de señal previamente definido.
Después se determina la eficacia a partir de la
pendiente de la función del logaritmo del número de copias empleado
frente al número de ciclos determinado para el número
correspondiente de copias. La ventaja de este método estriba en que
no puede surgir un error sistemático de la determinación de la
eficacia de amplificación en una fase de la reacción PCR en la que
ya no hay una amplificación exponencial del ácido nucleico diana
(fase meseta).
Sin embargo, se ha puesto de manifiesto de forma
inesperada que, en ciertas circunstancias, la eficacia de
amplificación puede depender también de la cantidad original de
ácido nucleico diana. Se observa un cambio obvio en la eficacia de
amplificación en especial en concentraciones bajas de las
preparaciones experimentales correspondientes. Por consiguiente,
los métodos descritos anteriormente para determinar la eficacia no
dan lugar a funciones lineales, de modo que, en estos casos, la
determinación descrita de la pendiente de la línea de regresión
daría lugar por ejemplo a valores de eficacia de amplificación
determinadas que serían demasiados bajos, en especial cuando las
concentraciones de ácido nucleico diana son bajas.
Debido a la dependencia que tiene la eficacia de
amplificación de la concentración del ácido nucleico diana, no es
posible descartar un cambio en la eficacia de amplificación incluso
durante los primeros ciclos de una reacción de amplificación,
aunque esté todavía en fase exponencial. Pero, como este fenómeno no
puede analizarse directamente de modo experimental, debido a la
falta de sensibilidad de detección, a continuación se entenderá por
eficacia de amplificación dependiente de la concentración como la
eficacia de amplificación determinada mediante los ciclos ya
cumplidos antes del momento temporal correspondiente de
detección.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere, por tanto, a
métodos para la cuantificación, corregida en cuanto a eficacia, de
ácidos nucleicos, en los que se determina la eficacia de la
amplificación del modo siguiente:
a) preparar una serie de diluciones del ácido
nucleico diana
b) amplificar el ácido nucleico diana en
condiciones de reacción definidas, reivindicadas en la
reivindicación 1 y medir la amplificación del ácido nucleico en
tiempo real
c) establecer un valor definido de umbral de
señal
d) para cada dilución, determinar el número de
ciclos Cp en los que se rebasa el valor umbral de señal y
e) determinar la eficacia de amplificación como
función de la cantidad de ácido nucleico diana.
La eficacia de amplificación puede determinarse
en particular como función de la cantidad original de ácido
nucleico diana mediante
- una función continuamente diferenciable no
lineal del logaritmo del número de copias de ácido nucleico diana
empleado para la amplificación en función del número de copias en el
que se rebasa el valor umbral de señal o, como alternativa, una
función continuamente diferenciable no lineal del número de ciclos
determinado como función del logaritmo del número de copias de
ácido nucleico diana empleado en cada caso y
- calcular la eficacia de amplificación E a
partir de la función determinada. La eficacia de amplificación
correspondiente se determina según la invención en función de la
cantidad de ácido nucleico diana que se emplea en cada caso.
La función continua se determina por métodos
matemáticos y algoritmos apropiados. Por ejemplo, la función puede
describirse con un ajuste polinómico de grado superior. Para
calcular una función ha demostrado se apropiado un ajuste
polinómico de 3er, 4º, 5º, 6º o 7º grado, es preferido un ajuste
polinómico de 4º grado.
La eficacia que depende de las cantidades
buscadas puede determinarse derivando una función continuamente
diferenciable F(Cp) de los valores Cp en forma de función de
un logaritmo del número original de copias o viceversa.
La eficacia de amplificación puede determinarse
entonces con arreglo a la ecuación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que f'(Cp) es la derivada de
la función continua y G es el número base del logaritmo. Por tanto,
en esta forma de ejecución, la eficacia de amplificación E de una
cierta cantidad original de ácido nucleico diana se determina como
primera derivada local negativa de la función continuamente
diferenciable determinada
previamente.
Como alternativa, la eficacia de amplificación E
puede determinarse con arreglo a la ecuación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que conc es la cantidad
original del ácido nucleico, f'(log(conc)) es la derivada de
la función continua y G es el número base del logaritmo. Por tanto,
en esta forma de ejecución, la eficacia de amplificación E de una
cierta cantidad original de ácido nucleico diana se determina en
forma de primera derivada local negativa recíproca de la función
continuamente diferenciable determinada
previamente.
La cuantificación, corregida en cuanto a
eficacia, de ácidos nucleicos en forma de función de la cantidad de
ácido nucleico diana puede utilizarse en principio para los métodos
de cuantificación absoluta y también para los métodos de
cuantificación relativa. Además, tal corrección de eficacia es
también especialmente ventajosa en los métodos, en los que se
normaliza la cuantificación relativa sobre la base de la llamada
muestra con calibrador (ABI Prism 7700, Manual de aplicación,
Perkin Elmer) con el fin de eliminar la influencia de las
diferentes sensibilidades de detección de los ácidos nucleicos diana
y de referencia.
Si se pretende determinar la cantidad absoluta
de ácido nucleico diana a detectar en la muestra, el método para
cuantificar un ácido nucleico diana en una muestra según la
invención consiste en los pasos siguientes:
a) Determinar las eficacias de amplificación del
ácido nucleico diana y de un patrón interno o externo en función de
sus concentraciones iniciales respectivas en condiciones definidas
de amplificación.
b) Amplificar el ácido nucleico diana contenido
en la muestra y el patrón interno o externo en las mismas
condiciones de reacción definidas.
c) Medir la amplificación del ácido nucleico
diana y del patrón en tiempo real.
d) Calcula el número original de copias en la
muestra corrigiendo el número de copias derivado del paso c)
mediante las eficacias de amplificación determinadas en el paso
a).
Es una ventaja sustancial que las secuencias del
ácido nucleico diana y del ácido nucleico patrón sean idénticas.
Sin embargo, cuando se elige la secuencia del patrón interno, se
tendrá que tomar en consideración si el sistema de detección
disponible es capaz de distinguir entre el ácido nucleico patrón y
el ácido nucleico diana. Esto puede lograrse empleando sondas de
hibridación con diferentes marcadores para la detección del ácido
nucleico diana y del patrón interno. De modo ideal se emplean
oligonucleótidos para estas sondas de detección, que pueden
utilizarse para distinguir entre diferencias mínimas de secuencias,
por ejemplo mutaciones puntuales.
Una ventaja del uso de un patrón interno es que
los inhibidores presentes en la muestra también influyen en la
amplificación del patrón. Por lo tanto pueden minimizarse las
diferencias en las eficacias de amplificación.
A diferencia de ello, el uso de un patrón
externo tiene la ventaja de que las reacciones de amplificación del
ácido nucleico diana y patrón no pueden interferir entre sí en
sentido competitivo, en lo que respecta a su eficacia. Además, los
productos de amplificación del ácido nucleico patrón y diana pueden
detectarse en mezclas reaccionantes paralelas mediante el mismo
sistema de detección, por ejemplo con a misma sonda de hibridación.
Un inconveniente son las posibles diferencias en las eficacias de la
PCR debidas a los inhibidores existentes en la muestra. Sin
embargo, los errores de cuantificación causados por esto pueden
eliminar con una corrección de eficacia según la invención.
Un objeto de la presente invención en relación a
la cuantificación relativa es también un método para la
cuantificación de un ácido nucleico diana en una muestra con
respecto a un ácido nucleico de referencia, que consta de los pasos
siguientes:
a) Determinar las eficacias de amplificación del
ácido nucleico diana y del ácido nucleico de referencia en función
de sus respectivas concentraciones iniciales en condiciones
definidas de amplificación.
b) Amplificar el ácido nucleico diana contenido
en la muestra así como el ácido nucleico de referencia contenido en
la muestra en las mismas condiciones definidas de amplificación.
c) Medir la amplificación del ácido nucleico
diana y del ácido nucleico de referencia en tiempo real.
d) Calcular la proporción original de ácido
nucleico diana y ácido nucleico de referencia en la muestra por
corrección de la proporción derivada del paso c) mediante las
eficacias de amplificación determinadas en el paso a).
Tal método de la invención elimina por un lado
la influencia de los inhibidores, que puedan estar presentes en la
muestra examinada y, por otro lado, corrige los errores que pudieran
surgir como resultado de las diferentes eficacias de amplificación
del ácido nucleico diana y del ácido nucleico de referencia.
Un requisito esencial del método según la
invención para la cuantificación relativa es que la eficacia de
amplificación del ácido nucleico diana así como la eficacia de
amplificación del ácido nucleico de referencia se determinan como
función de la cantidad de ácido nucleico diana y de referencia que
están presentes originalmente. Las dos determinaciones se lleva a
cabo con preferencia por el método descrito antes determinando el
número de ciclos en el que se rebasa un cierto valor umbral de
señal.
En una forma preferida de ejecución de la
cuantificación relativa se divide la muestra en dos partes alícuotas
y se efectúa la medición en tiempo real de la amplificación del
ácido nucleico diana y del ácido nucleico de referencia en
reactores separados. De este modo se impide la interferencia entre
las reacciones de amplificación del ácido nucleico diana y del
ácido nucleico de referencia en lo que respecta a su eficacia, por
ejemplo por competición por los desoxinucleótidos o por la
polimerasa Taq. Además, el ácido nucleico diana y el ácido nucleico
de referencia pueden detectarse con los mismos sistemas de
detección, por ejemplo con el mismo colorante de fijación sobre
el
DNA.
DNA.
Como alternativa puede efectuarse la medición en
tiempo real de la amplificación del ácido nucleico diana y del
ácido nucleico de referencia de una muestra en un mismo reactor
empleando sondas de hibridación marcadas de modo diferente. Esto es
especialmente ventajoso cuando solamente se dispone de pequeñas
cantidades de material de muestras, porque de esta manera el número
de PCR reacciones requeridas se reduce a la mitad.
Los pasos de b) a d) se llevan a cabo con
ventaja en una mezcla paralela que contiene la llamada muestra con
calibrador.
La muestra con calibrador es una muestra que
contiene el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia
en una proporción definida, que es constante para cada medición. A
continuación se determina la proporción de los cocientes para la
muestra y la para muestra con calibrador como índice de la cantidad
original del ácido nucleico diana existente en la muestra. Esto
tiene la ventaja de que además se eliminan otros errores
sistemáticos debidos a las diferencias de sensibilidad de detección
del ácido nucleico diana y del ácido nucleico de referencia. Estos
errores sistemáticos pueden surgir por ejemplo como resultado de las
diferentes propiedades de hibridación de las sondas de hibridación
o, en el caso de las sondas con marcador fluorescente, de las
diferentes eficacias de excitación, rendimientos cuánticos o
eficacias de unión del colorante con la sonda. Por lo tanto, la
muestra a analizar y la muestra con calibrador deberán analizarse en
cada ensayo con los mismos agentes de detección, es decir, con el
mismo lote de sondas de hibridación provistas de marcador
fluorescente.
La invención se refiere en particular a aquellas
formas de ejecución de los métodos descritos para la cuantificación
de ácidos nucleicos corregida en cuanto a la eficacia, en los que se
detectan los productos de amplificación con sondas de hibridación
que se han marcado con un componente detectable de muchas maneras
diferentes.
Un requisito previo de la determinación
corregida en cuanto a eficacia de la cantidad original de un ácido
nucleico diana y para la determinación de las eficacias de
amplificación en sí consiste en fijar los valores de umbral de
señal y después determinar el número de ciclos de la correspondiente
reacción de amplificación para que se alcance un cierto valor
umbral de señal. El valor umbral de señal puede determinarse de
varias maneras según la técnica anterior:
Según la técnica anterior, el valor umbral de
señal puede ser por ejemplo una señal que corresponda a cierto
múltiplo de la varianza estadística de la señal de fondo (ABI Prism
7700, Manual de aplicación, Perkin Elmer).
Como alternativa, el número de ciclos en el que
se rebasa el valor umbral de señal puede determinarse con arreglo
al método llamado "punto de ajuste por encima del umbral"
método (Manual del usuario del LightCycler,
B59-B68, Roche Molecular Biochemicals, 1999).
En otra forma de ejecución, el valor umbral
puede determinarse en forma de valor relativo en lugar de valor
absoluto cuando, con independencia del valor absoluto de la señal,
el curso de la reacción de amplificación se determina como función
del número de ciclos y a continuación se calcula la enésima
derivada. En este caso, rebasar ciertos extremos puede definirse
como rebasar un cierto valor umbral de señal (solicitud de patente
EP-00106523.4). Por consiguiente, este método de
determinación del valor umbral es independiente de la intensidad
absoluta de la señal, por ejemplo de una señal de fluorescencia.
Esto es particularmente adecuado para aquellas
formas de ejecución, en las que el ácido nucleico diana y el ácido
nucleico de referencia se amplifican en un mismo reactor y se
detectan mediante marcadores fluorescentes diferentes. Han
demostrado ser especialmente indicados los métodos para la
cuantificación de los productos de la PCR, corregida en cuanto a
eficacia, en los que se determina el máximo de la segunda derivada
como medida del valor umbral de señal.
Las sondas de hibridación empleadas en el método
según la invención son normalmente ácidos nucleicos de hebra
simple, por ejemplo el DNA o RNA de hebra simple o derivados de los
mismos o, como alternativa, los PNA que se hibridan en la
temperatura de fusión de la reacción de amplificación con el ácido
nucleico diana. Estos oligonucleótidos tienen normalmente una
longitud de 20 a 100 nucleótidos.
El marcador puede introducirse en cualquier
grupo ribosa o fosfato del oligonucleótido dependiendo del formato
concreto de la detección. Son preferidos los marcadores del extremo
5' y 3' de la molécula del ácido nucleico.
El tipo de marcador tiene que poder detectarse
en el modo de tiempo real de la reacción de amplificación. Esto es
también posible en principio por ejemplo con marcadores que se
detectan por RMN (aunque no solamente estos).
Son especialmente preferidos los métodos, en los
que los ácidos nucleicos amplificados se detectan mediante por lo
menos una sonda de hibridación provista de marcador
fluorescente.
Son posibles muchos procedimientos de ensayo. A
continuación se describen tres formados de detección que han
demostrado ser especialmente indicados en relación con la presente
invención:
Para este formato de ensayo se emplean
simultáneamente 2 sondas de hibridación de hebra simple, que son
complementarias de sitios adyacentes de la misma hebra del ácido
nucleico diana amplificado. Las dos sondas están marcadas con
componentes fluorescentes diferentes. Cuando se excita con luz de
una longitud de onda adecuada, el primer componente transfiere la
energía absorbida al segundo componente según el principio de
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, de tal
manera que puede medirse la emisión de fluorescencia del segundo
componente cuando las dos sondas de hibridación se unen a
posiciones adyacentes de la molécula diana a detectar.
Como alternativa es posible emplear un cebador
provisto de marcador fluorescente y solamente una sonda
oligonucleótido con marcador (Bernard y col., Analytical
Biochemistry 235, pp. 1001-107, 1998).
Se marca una sonda de hibridación de hebra
simple con dos componentes. Cuando se excita el primer componente
con una luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida
se transfiere al segundo componente, también llamado atenuador
(quencher), con arreglo al principio de transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia. Durante el paso de fusión de la
reacción PCR, la sonda de hibridación se une al DNA diana y se
degrada por acción de exonucleasa 5'-3' ejercida
por la polimerasa Taq durante la siguiente fase de elongación. De
ello resulta que el componente fluorescente excitado y el atenuador
se separan espacialmente entre sí y de este modo puede medirse la
emisión de fluorescencia del primer componente.
Estas sondas de hibridación se marcan también
con un primer componente y un atenuador, los marcadores se colocan
con preferencia en los dos extremos de la sonda. Como resultado de
la estructura secundaria de la sonda, los dos componentes se hallan
en proximidad espacial en solución. Después de la hibridación con
los ácidos nucleicos diana, los dos componentes están separados
entre sí, de modo que después de la excitación con luz de una
longitud de onda adecuada puede medir la emisión de fluorescencia
del primer componente (Lizardi y col.,
US-5,118,801).
En las formas de ejecución descritas, en las que
solamente se amplifica el ácido nucleico diana o solamente el ácido
nucleico de referencia o un patrón externo en un reactor en cada
caso, el correspondiente producto de amplificación puede detectarse
también según la invención con un colorante que se una al DNA, que
emite la correspondiente señal de fluorescencia después de la
interacción con el ácido nucleico de doble hebra después de la
excitación con luz de una longitud de onda apropiada. Los colorantes
SybrGreen y SybrGold (Molecular Probes) han demostrado ser
especialmente indicados para esta aplicación. Como alternativa
pueden emplearse colorantes intercalados.
En una forma preferida de ejecución de
cuantificación absoluta de un ácido nucleico diana en una muestra,
el método según la invención consta de los pasos siguientes:
a) Determinar las eficacias de amplificación del
ácido nucleico diana y de un patrón interno o externo como función
de las correspondientes cantidades iniciales, en condiciones
definidas de amplificación.
b) Amplificar el ácido nucleico diana contenido
en la muestra y el patrón interno o externo, en las mismas
condiciones de reacción definidas.
c) Medir la amplificación del ácido nucleico
diana y del patrón en tiempo real.
d) Determinar un valor definido de umbral de
señal.
e) Determinar los números de ciclos, en los que
se rebasa en cada caso el valor umbral de señal durante la
amplificación del ácido nucleico diana y del patrón.
f) Determinar el número original de copias
N(T)_{0} del ácido nucleico diana en la muestra
según la fórmula
N(S)_{0} = la
cantidad original de patrón que se
emplea.
E(S) = la eficacia de amplificación del
patrón para un ciclo concreto n en el correspondiente punto temporal
de detección, promedio de los ciclos ya realizados
E(T) = la eficacia de amplificación de la
diana para un ciclo concreto n en el correspondiente punto temporal
de detección, promedio de los ciclos ya realizados
ns = el número de ciclos en los que se rebasa el
valor umbral de señal por amplificación del ácido nucleico patrón
y
nt = el número de ciclos en los que se rebasa el
valor umbral de señal por amplificación del ácido nucleico
diana.
En estas circunstancias, el cálculo de
N(T)_{0} arroja este resultado:
y
Dado que se ha establecido un valor umbral de
señal idéntico para el ácido nucleico diana y el patrón, esto se
aproxima a:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, el número original de copias de
ácido nucleico diana presentes en la muestra se calcula con arreglo
a la ecuación
En una forma de ejecución alternativa de la
cuantificación absoluta de un ácido nucleico diana en una muestra,
el método de la invención consta de los pasos siguientes:
a) Determinar las eficacias de amplificación del
ácido nucleico diana y de un patrón interno o externo como función
de las correspondientes cantidades iniciales, en condiciones
definidas de amplificación.
b) Amplificar el ácido nucleico diana contenido
en la muestra y el patrón interno o externo en las mismas
condiciones de reacción definidas.
c) Medir la amplificación del ácido nucleico
diana y del patrón en tiempo real.
d) Determinar un valor definido de umbral de
señal.
e) Determinar los números de ciclo, en los que
se rebasa en cada caso el valor umbral de señal durante la
amplificación del ácido nucleico diana y del patrón.
f) Determinar el número original de copias
N(T)_{0} del ácido nucleico diana en la muestra con
arreglo a la fórmula
N(S)_{0} = la
cantidad original de patrón que se
emplea
E(S_{n}) = la eficacia de amplificación
del patrón para un ciclo individual x
E(T_{n}) = la eficacia de amplificación
de la diana para un ciclo individual x
En este caso, las eficacias de amplificación del
ácido nucleico diana y del patrón interno se determinan con
preferencia del modo antes descrito, determinando un número de
ciclos, en el que se rebasa un cierto valor umbral de señal.
N(T)_{0} se calcula según la
invención del modo siguiente:
y
Dado que se ha establecido un valor umbral de
señal idéntico para el ácido nucleico diana y patrón, este se
aproxima a:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, el número original de copias de
ácido nucleico diana presentes en la muestra se calcula mediante la
ecuación
Un inconveniente de este método estriba en que
las eficacias de los primeros ciclos de cada reacción de
amplificación no pueden determinarse porque la cantidad de ácido
nucleico amplificado se sitúa todavía por debajo del límite de
detección de todos los sistemas de detección disponibles en la
técnica anterior.
Sin embargo, la eficacia de un ciclo temprano
puede aproximarse a la media geométrica \Pi de todas las
eficacias determinadas en los ciclos siguientes. Como alternativa,
la eficacia no determinable de un ciclo temprano puede equipararse
a la eficacia determinada para el primer ciclo, en el que sea ya
detectable el producto de la
amplificación.
amplificación.
Una forma especial de ejecución de la
cuantificación relativa según la invención es un método de
cuantificación de un ácido nucleico diana en una muestra con
respecto a un ácido nucleico de referencia que consta de los pasos
siguientes:
a) Determinar las eficacias de amplificación del
ácido nucleico diana y del ácido nucleico de referencia como
función de las correspondientes cantidades iniciales en condiciones
definidas de amplificación.
b) Amplificar el ácido nucleico diana contenido
en la muestra y el ácido nucleico de referencia contenido en la
muestra en las mismas condiciones definidas de amplificación.
c) Medir la amplificación del ácido nucleico
diana y del ácido nucleico de referencia en tiempo real.
d) Determinar un valor definido de umbral de
señal.
e) Determinar los números de ciclos, en los que
se rebasa en cada caso el valor umbral de señal durante la
amplificación del ácido nucleico diana y del ácido nucleico de
referencia.
f) Calcular la proporción original entre ácido
nucleico diana y ácido nucleico de referencia en la muestra según
la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
N(T)_{0} = la cantidad original
de ácido nucleico diana
N(R)_{0} = la cantidad original
de ácido nucleico de referencia
E(R) = la eficacia de amplificación del
ácido nucleico de referencia, promedio de los ciclos ya realizados,
en el correspondiente tiempo de detección de un cierto ciclo n
E(T) = la eficacia de amplificación del
ácido nucleico diana, promedio de los ciclos ya realizados, en el
correspondiente tiempo de detección de un cierto ciclo n
nr = el número de ciclos en los que se rebasa el
valor umbral de señal durante la amplificación del ácido nucleico
de referencia
nt = el número de ciclos en los que se rebasa el
valor umbral de señal durante la amplificación del ácido nucleico
diana.
En estas circunstancias, el cálculo de
N(T)_{0} arroja este resultado:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que se ha establecido valor umbral de señal
idéntico para el ácido nucleico diana y patrón, este se aproximada
a:
Por consiguiente, el número original de copias
de ácido nucleico diana presentes en la muestra se calcula con
arreglo a esta ecuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de ejecución alternativa de la
cuantificación relativa de un ácido nucleico diana en una muestra,
el método según la invención consta de los pasos siguientes:
a) Determinar las eficacias de amplificación del
ácido nucleico diana y del ácido nucleico de referencia como
función de las cantidades iniciales, en condiciones definidas de
amplificación.
b) Amplificar ácido nucleico diana contenido en
la muestra y el ácido nucleico de referencia contenido en la
muestra en las mismas condiciones definidas de amplificación.
c) Medir la amplificación del ácido nucleico
diana y del ácido nucleico de referencia en tiempo real.
d) Determinar un valor definido de umbral de
señal.
e) Determinar los números de ciclos, en los que
se rebasa en cada caso el valor umbral de señal durante la
amplificación del ácido nucleico diana y el ácido nucleico de
referencia.
f) Determinar la proporción original entre el
ácido nucleico diana y ácido nucleico de referencia en la muestra
según la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
N(T)_{0} = la cantidad original
de ácido nucleico diana presente en la muestra
N(R)_{0} = la cantidad original
de ácido nucleico de referencia presente en la muestra
E(R_{n}) = la eficacia de amplificación
del ácido nucleico de referencia en un ciclo individual x
E(T_{n}) = la eficacia de amplificación
del ácido nucleico diana en un ciclo individual x
La proporción del paso (f) se determina según la
invención del modo siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
en las que N(T)_{n}
= la cantidad de DNA diana en el valor umbral de señal y
N(R)_{n} = la cantidad de DNA de referencia en el
valor umbral de señal de (1) y (2). De ello se desprende
que:
De ello se desprende que:
Dado que se establece un valor umbral de señal
idéntico para el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de
referencia, se puede suponer que aproximadamente
En estas condiciones y partiendo de la ecuación
(4) para la proporción original entre ácido nucleico diana y ácido
nucleico de referencia, se llega a la ecuación:
De modo similar a la cuantificación absoluta, la
eficacia de un ciclo temprano no puede determinarse y se puede
suponer que será la media geométrica \Pi de todas las eficacias
determinadas en los ciclos posteriores. Como alternativa, la
eficacia de un ciclo temprano puede equipararse a la eficacia que se
determina para el primer ciclo en el que sea detectable el producto
de la amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, la aproximación
N(T)_{n} = N(R)_{n} solamente se
aplica cuando el ácido nucleico diana y ácido nucleico de
referencia se detectan con sensibilidades diferentes.
Debido a la detección de los productos de
amplificación en esta forma de ejecución, es ventajoso efectuar
adicionalmente los pasos b), c), e) y f) del método antes descrito
con una muestra con calibrador con el fin de eliminar los errores
sistemáticos y posteriormente determinar la proporción entre el
cociente determinado para la muestra y para la muestra con
calibrado como medida de la cantidad original de ácido nucleico
diana en la muestra.
Por lo tanto se mide según la invención una
muestra con calibrador en una mezcla reaccionante paralela y se
determina la proporción entre los cocientes
N(T)_{0}/N(R)_{0} para la muestra y
para la muestra con calibrador como medida de la cantidad original
de ácido nucleico diana en la muestra.
Esto resulta a continuación de la ecuación (4)
empleando los subíndices
_{A} para la muestra a analizar y
_{K} para la muestra con calibrador
Debido al hecho de que se ha definido un valor
umbral de señal idéntico para la muestra a analizar y para la
muestra con calibrador y que se emplean agentes idénticos para
detectar los amplicones diana y de referencia en la muestra y en la
muestra con calibrador, la proporción entre los cocientes
determinados para la muestra y la muestra con calibrador son los
siguientes:
Por consiguiente, la proporción entre los
cocientes de la muestra a analizar y la muestra con calibrado
es:
Por lo tanto puede obtenerse un valor relativo a
partir del número original de copias de ácido nucleico diana en la
muestra, en el que se han eliminado los errores sistemáticos debidos
a las diferentes eficacias de amplificación y debido a las
diferentes sensibilidades de detección. El único requisito para la
precisión del valor determinado es la hipótesis justificada de que,
en condiciones tampón absolutamente idénticas, las eficacias de
amplificación y de detección serán también idénticas en los
diversos reactores.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, la corrección de eficacia dependiente de
la concentración según la invención es también idónea para los
métodos de cuantificación, en los que no se determina directamente
la eficacia de amplificación, sino que se incorpora indirectamente
al resultado de la cuantificación.
Este puede ser el caso, por ejemplo, en método
de cuantificación relativa, en los que se normaliza el resultado
sobre la base de una muestra con calibrador con el fin de eliminar
la influencia de las diferentes sensibilidades de detección para el
ácido nucleico diana y de referencia.
Por consiguiente, la presente invención abarca
también métodos para la cuantificación relativa de un ácido
nucleico diana con respecto a un ácido nucleico de referencia y
normalizada sobre la base de una muestra con calibrado, que consta
de los pasos siguientes:
a) Preparar una serie de diluciones normales y
dos series de diluciones separadas del ácido nucleico diana y del
ácido nucleico de referencia.
b) Amplificar las diversas diluciones de ácido
nucleico diana y ácido nucleico de referencia en condiciones de
reacción definidas, midiendo la amplificación del ácido nucleico en
tiempo real.
c) Establecer valores umbral definidos de señal
para el ácido nucleico diana y ácido nucleico de referencia.
d) Determinar los números de ciclos Cp en los
que se rebasa los valores umbral de señal definidos del ácido
nucleico diana y del ácido nucleico de referencia para cada
dilución.
e) Determinare una función continuamente
diferenciable de los valores Cp determinados en d) como función del
logaritmo de las cantidades empleadas de ácido nucleico diana y
determinar una función continuamente diferenciable de los valores
Cp determinados como función del logaritmo de las cantidades
empleadas de ácido nucleico de referencia.
f) Determinar los valores Cp del ácido nucleico
diana y del ácido nucleico de referencia en la muestra a analizar
así como en la muestra con calibrador.
g) Asignar los valores Cp medidos en el paso f)
a ciertos valores de las funciones determinadas en el paso e).
h) Calcular los cocientes de los valores de
función de g) del ácido nucleico diana y del ácido nucleico de
referencia para la muestra a analizar y para el muestra con
calibrador.
i) Determinar la proporción entre los cocientes
de h) como medida de la cantidad del DNA diana que está
originalmente presente en la muestra.
Como alternativa puede utilizarse un método
según la invención para la cuantificación relativa del ácido
nucleico diana con respecto a un ácido nucleico de referencia y
normalizada sobre la base de una muestra con calibrador, que consta
de los pasos siguientes:
a) Preparar una serie normal de diluciones y dos
series separadas de diluciones de ácido nucleico diana y ácido
nucleico de referencia.
b) Amplificar las diversas diluciones de ácido
nucleico diana y ácido nucleico de referencia en condiciones de
reacción definidas, midiéndose la amplificación del ácido nucleico
en tiempo real.
c) Establecer valores umbral definidos de señal
para el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia.
d) Determinar los números de ciclos Cp, en los
que se rebasan los valores umbral de señal definidos para el ácido
nucleico diana y el ácido nucleico de referencia en cada
dilución.
e) Determinar una función continuamente
diferenciable del logaritmo de las cantidades empleadas de ácido
nucleico de referencia como función de los valores Cp determinados
en d) y determinar una función continuamente diferenciable del
logaritmo de las cantidades empleadas de ácido nucleico de
referencia como función de los Cp determinados.
f) Determinar de los valores Cp del ácido
nucleico diana y del ácido nucleico de referencia en la muestra a
analizar así como en la muestra con calibrador.
g) Asignar los valores Cp medidos en el paso f)
a ciertos valores de las funciones determinadas en el paso e).
h) Calcular los cocientes de los valores de las
funciones de g) del ácido nucleico diana y del ácido nucleico de
referencia de la muestra a analizar y de la muestra con
calibrador.
i) Determinar la proporción entre los cocientes
de h) como medida de la cantidad del DNA diana que está
originalmente presente en la muestra.
Según la invención, las funciones continuamente
diferenciables del paso e), que pueden ser lineales o no lineales,
se determinan mediante un ajuste polinómico, con preferencia de 3er,
4º, 5º, 5º o 7º grado.
La extensión, en la que dichas funciones
continuamente diferenciables son lineales o no lineales, dependerá
de las concentraciones iniciales del ácido nucleico diana y de
referencia en las series de diluciones. Si la concentración inicial
es baja, puede suponerse como probable que no habrá relación lineal
entre el logaritmo de la concentración correspondiente y los
valores Cp medidos para la concentración correspondiente. Aparte de
esto, la forma de dichas funciones dependerá de las condiciones
experimentales respectivas y de la correspondiente secuencia diana
y, por ello, estas funciones tienen que determinarse empíricamente y
no pueden derivarse sobre la base de consideraciones teóricas.
Los métodos descritos de normalización mediante
una muestra con calibrador pueden utilizarse también en particular
cuando las eficacias de amplificación cambian en relación con las
cantidades iniciales de ácido nucleico diana o ácido nucleico de
referencia que se quieren analizar. Como resultado de ello se toma
en consideración indirectamente la dependencia de las eficacias de
amplificación en los correspondientes números originales de copias
de ácido nucleico diana y ácido nucleico de referencia. Por lo
tanto, los métodos de cuantificación según la invención permiten
determinar con gran precisión las concentraciones iniciales incluso
pequeñas de ácido nucleico diana.
La validez de tal cuantificación deriva de las
consideraciones siguientes:
Las funciones se generan en los pasos de a) a e)
del método descrito sobre la base de los números de ciclos (valores
Cp) medidos para la serie de diluciones, que a continuación se
denominan curvas de calibrado. Las curvas de calibrado se calculan
a partir de los valores individuales medidos por métodos
matemáticos, por ejemplo mediante un ajuste polinómico. Si la
eficacia se mantiene constante para las diferentes concentraciones
iniciales de ácido nucleico diana, la curva de calibrado es una
función lineal.
En la figura 1 se representa esquemáticamente un
ejemplo de tales curvas de calibrado. El número de ciclos, en el
que se rebasa el valor umbral definido de señal se representa sobre
la abscisa de la gráfica. El logaritmo de una cierta concentración
relativa se representa sobre las ordenadas de la gráfica (el número
base del logaritmo puede elegirse al azar, con la condición de que
no cambie dentro de la reacción experimental). En este contexto se
entiende por concentración relativa una dimensión sin unidades, que
depende de la eficacia de detección, pero es proporcional a la
cantidad de ácido nucleico diana y de referencia, que se está
empleando actualmente.
(En el ejemplo de la figura 1, la eficacia de
amplificación del ácido nucleico de referencia permanece constante
para varias diluciones. Sin embargo, en comparación, la eficacia de
amplificación del ácido nucleico diana aumenta a concentraciones
bajas).
Los números de ciclos (valores Cp) del ácido
nucleico diana (Cp-Tar) y del ácido nucleico de
referencia (Cp-Ref), en los que se rebasan los
números umbral definidos de señal se determinan para la muestra a
analizar en los siguientes pasos f) y g) del método descrito. El
log de los valores de función (Rconc(Tar)) y log
(Rconc(Ref)) se asignan a los números de ciclos
Cp-Tar y Cp-Ref determinados para la
muestra sobre la base de las curvas de calibrado determinadas
previamente.
En caso de cuantificación relativa, es ventajoso
además eliminar la influencia de las diferentes eficacias de
detección para el ácido nucleico diana y ácido nucleico de
referencia. Esto puede lograrse mediante una muestra llamada de
calibrador. Por consiguiente, los valores Cp del ácido nucleico
diana y del ácido nucleico de referencia se determinan también para
la muestra con calibrador de igual manera que para la muestra a
analizar y se les asignan también los correspondientes valores de
función.
Sin embargo, a continuación se supone que la
eficacia de detección permanece constante durante el ensayo, es
decir, una concentración relativa determinada experimentalmente es
proporcional al número de copias del ácido nucleico diana y de
referencia que están actualmente presentes en la muestra en
cuestión. Por tanto, lo que se sigue se aplica en primer lugar a
cualquier muestra que contenga un calibrador:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las
que:
AConc(Tar) = el número actual de copias
de ácido nucleico diana presentes en una muestra
AConc(Ref) = el número actual de copias
de ácido nucleico de referencia presentes en una muestra
K_{Tar} = constante
K_{Ref} = constante
Rconc(Tar) = concentración relativa del
ácido nucleico diana (sin unidades)
Rconc(Ref) = concentración relativa del
ácido nucleico de referencia (sin unidades)
Las constantes K_{Tar} y K_{Ref} son
cantidades cuyos valores absolutos dependen de la correspondiente
eficacia de detección.
En otras palabras, en estas constantes se toman
en consideración factores como un diferente rendimiento cuántico de
los marcadores fluorescentes o una diferente cinética de hibridación
de las sondas de hibridación y, por tanto, normalmente no son
idénticas.
El siguiente cociente se forma con arreglo al
paso h) del método recién descrito:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a partir de (1) y (2), se desprende
que:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esta ecuación se aplica igualmente a la muestra
a analizar y a la muestra de calibrado, porque se emplea en ambas
muestras el mismo agente de detección.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según el paso i) del método recién descrito, la
proporción entre los dos cocientes determinados se determina del
modo siguiente:
Por consiguiente pueden eliminarse las
constantes que dependen de la correspondiente eficacia de
detección:
Se deduce que las proporciones entre las
concentraciones relativas determinadas de ácido nucleico diana y
las concentraciones normalizadas de ácido nucleico de referencia
sobre la fase de la proporción entre las concentraciones relativas
de ácido nucleico diana y las de ácido nucleico de referencia en el
calibrador son idénticas a las proporciones entre los números
absolutos de copias de ácido nucleico diana y de ácido nucleico de
referencia de las muestras individuales a analizar.
Por consiguiente, este método según la invención
es un método exacto para la cuantificación relativa de ácidos
nucleicos, en el que
- por un lado, se toman en consideración
diferentes eficacia de las reacciones PCR, sin tener que determinar
directamente la eficacia y
- por otro lado, se elimina la influencia de la
eficacia de detección, que dependen de varios factores no
controlables, gracias al uso de una muestra con calibrador.
La invención se ilustra con los ejemplos
siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se sintetizan los cDNA mediante una reacción de
transcriptasa inversa a partir de 3 RNA totales que son productos
comerciales (Clontech), aislados de la línea celular HeLa, tejido de
glándula suprarrenal y tejido cerebral en las condiciones
siguientes:
- 1 \mug de RNA total
- 1 x AMV tampón de reacción
- 5 mM MgCl_{2}
- 1 mM mezcla de desoxinucleótidos
- 0,0625 mM hexámeros aleatorios
- 50 unidades de RNasa
- 10 unidades de transcriptasa inversa de AMV
- hasta 20 \mul de H_{2}O
Se incuban todas las mezclas a 25ºC durante 10
minutos, a 42ºC durante 60 y a 95ºC durante 5 minutos para la
síntesis del cDNA. Después se enfrían a 4ºC.
A continuación se realiza la reacción de
amplificación, que se mide en tiempo real en formato FRET HybProbe
en un instrumento LightCycler (Roche Diagnostics GmbH). Cada mezcla
se amplifica en las condiciones siguientes:
- 1 x sondas de hibridación LC-fast start DNA-master (Roche Diagnostics GmbH)
- 3 mM MgCl_{2}
- 0,5 mM de cada cebador
- 0,2 \muM sonda de fluoresceína
- 0,2 \muM sonda LC-RED640
- hasta 20 \mul de H_{2}O
Para amplificar la secuencia CycA (ciclofilina
A) se emplean cebadores que tienen las SEQ. ID. NO: 1 y SEQ. ID.
NO: 2. Se detecta el producto CycA empleando una sonda marcada con
fluoresceína que tiene la SEQ. ID. NO: 3 y una sonda marcada con
LC-RED640 que tiene la SEQ. ID. NO: 4. Para
amplificar la secuencia del PBGD (porfobilinógeno) se emplean
cebadores que tienen las SEQ. ID. NO: 5 y SEQ. ID. NO: 6. Se detecta
el producto PBGD empleando una sonda marcada con fluoresceína que
tiene la SEQ. ID. NO: 7 y una sonda marcada con
LC-RED640-la SEQ. ID. NO: 8.
Se amplifica la preparación en el LightCycler en
las siguientes condiciones de PCR:
- desnaturalización: 95ºC 10 min
- amplificación: 45 x 95ºC 10 s y 20,0ºC/s
- 55ºC 10 s 20,0ºC/s
- 72ºC 15 s 3,0ºC/s
- enfriamiento: 40ºC 30 s
Después de cada incubación a 55ºC se efectúa la
medición de la fluorescencia con arreglo a las instrucciones del
fabricante. Se determina el valor umbral de señal (valor Cp) como
valor máximo de la 2ª derivada de la reacción de amplificación en
función del número de ciclos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se diluye el cDNA sintetizado a partir del RNA
total de HeLa en los pasos 1:5 (un total de 5 pasos de dilución)
con el fin de determinar las eficacias de amplificación de CycA y
PBGD. Se efectúa una determinación por triplicado del valor umbral
de señal (valor Cp) en el aparato LightCycler para cada paso de
dilución. Se lleva a cabo tanto para la CycA como para el PBGD.
Se generan dos funciones diferentes para
determinar los coeficientes de ajuste, en los que se determina el
número de ciclos Cp para cada concentración como función del
logaritmo decimal de la concentración de cDNA emplea-
da.
da.
Suponiendo eficacias idénticas para las diversas
concentraciones iniciales de un ácido nucleico, se determinan las
dos eficacias de amplificación correspondientes del ácido nucleico
diana y al ácido nucleico de referencia con arreglo a la
ecuación
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\vskip1.000000\baselineskip
En este caso se determina la
f'(log(conc)) como pendiente de la línea de regresión de las
funciones representadas en las figuras 2a y 2b. Por consiguiente,
se determina una eficacia E = 2,62 para el ácido nucleico diana
CycA y una eficacia E = 1,97 para el ácido nucleico de referencia
PBGD.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplean los mismos valores medidos para
generar las funciones del ácido nucleico diana y de referencia del
logaritmo de las concentraciones relativas determinadas frente a los
valores Cp medidos, calculando un ajuste polinómico de 4º grado.
Estas funciones se representan en las figura 3a (ácido nucleico
diana) y 3b (ácido nucleico de referencia).
Los parámetros de ajuste determinados para el
ácido nucleico diana (CycA) son:
- A (desviación, offset) = 11,3974946
- B (lineal) = -0,1
- C (cuadrat.) = -0,0721349
- D = 0,0044516
- E = -8,214E-05
Los parámetros de ajuste determinados para el
ácido nucleico de referencia son:
- A (desviación, offset) = 9,98347024
- B (lineal) = -0,29359011
- C = 0
- D = 0
- E = 0
Tal como se observa en las figuras y los
parámetros de ajuste determinados, esto da lugar a una función casi
lineal para el ácido nucleico de referencia. Por consiguiente, la
amplificación del ácido nucleico de referencia en el intervalo de
concentraciones medido se produce con una eficacia sustancialmente
constante.
A diferencia de ello se determina una función no
lineal con los valores Cp obtenidos para el ácido nucleico diana
CycA. Por consiguiente, la eficacia de la reacción de amplificación
en el intervalo de concentraciones medidas para el CycA es
significativamente dependiente del número original de copias
presentes en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
En las condiciones descritas en el ejemplo 1, la
proporción determinada de la cantidad original de CycA y PBGD
debería ser independiente de la correspondiente cantidad amplificada
de la muestra material empleada. Por lo tanto, la determinación de
la proporción entre varias cantidades de muestra RNA se emplea para
comprobar el efecto de la corrección de eficacia sobre la base de
los valores medidos que se obtienen.
\newpage
Las proporciones originales entre ácido nucleico
diana (CycA) y de referencia (PBGD) en RNA de glándulas
suprarrenales y RNA cerebral se determinan empleando tres pasos de
dilución, en cada caso de los cDNA (se realizan determinaciones por
duplicado de cada paso de dilución). El cociente de la proporción
entre las concentraciones relativas CycA y PBGD se determina a
partir de los datos medidos entre la muestra analizada y la muestra
con calibrador. Se emplea como calibrador el RNA total de las
células HeLa. Se efectúa esta determinación por un lado, con una
eficacia supuesta de amplificación de 2,00 para el CycA y PBGD, por
otro lado, mediante las funciones lineales y no lineales
determinadas en el ejemplo 2.
En la tabla 1 se recogen las proporciones
normalizadas con calibrador de ácido nucleico diana/ácido nucleico
de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se indica en la tabla 1, los valores
determinados para las dos muestras de RNA (tejidos de glándulas
suprarrenales y cerebro) después de la corrección de eficacia no
lineal de la invención tienen un coeficiente de variación aprox.
tres veces menor que los mismos valores sin la corrección de
eficacia y aprox. dos veces menor que los mismos valores después de
una corrección lineal de eficacia. También el porcentaje máximo de
error de las proporciones de diana normalizada con
calibrador/referencia en función de la concentración inicial se
reduce significativamente con la corrección no lineal de la eficacia
de la invención para los dos RNA diana, si se compara con la
corrección lineal de eficacia o si se compara con el método sin
corrección de eficacia. Estos resultados ponen de manifiesto que el
método de la invención es especialmente ventajoso en métodos, en
los que se lleva a cabo una normalización mediante calibradores.
\newpage
Figura
1
Representación esquemática de una función para
determinar el logaritmo de una concentración relativa frente a un
determinado número de ciclos.
Figura
2a
Determinación de la eficacia de amplificación de
CycA determinando una línea de regresión.
Figura
2b
Determinación de la eficacia de amplificación de
PBGD determinando una línea de regresión.
Figura
3a
Corrección de eficacia para la amplificación de
CycA mediante un ajuste polinómico de 4º grado.
Figura
3b
Corrección de eficacia para la amplificación de
PBGD mediante un ajuste polinómico de 4º grado.
<110> Roche Diagnostics GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para determinar la eficacia
de las amplificaciones de ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 544300EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 544300EP
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-09-01
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgcgtct cctttgag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagttgtcc acagtcagca atg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccatggag cgctttgggt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatggcaaga ccagcaagaa gatcac
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacacagcct actttccaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacccacg cgaatca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaacggcaat gcggctgcaa cg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaagaaaa cagcccaaag atga
\hfill24
Claims (13)
1. Método para determinar la eficacia de la
amplificación de un ácido nucleico diana, en el que se determina la
eficacia de amplificación del modo siguiente:
a) preparar una serie de diluciones del ácido
nucleico diana
b) amplificar el ácido nucleico diana en
condiciones de reacción definidas, midiendo la amplificación del
ácido nucleico en tiempo real
c) establecer un valor umbral definido
d) determinar el número de ciclos para cada
dilución, en el que se rebasa el valor umbral de señal
e) determinar una función no lineal
continuamente diferenciable del logaritmo del número de copias del
ácido nucleico diana empleado para la amplificación como función
del número de ciclos en el que se rebasa el valor umbral de señal
y
f) calcular la eficacia de amplificación E a
partir de la función determinada en el paso e).
2. Método para determinar la eficacia de la
amplificación de un ácido nucleico diana, en el que dicha eficacia
de amplificación se determina del modo siguiente:
a) preparar una serie de diluciones del ácido
nucleico diana
b) amplificar el ácido nucleico diana en
condiciones de reacción definidas, midiendo la amplificación del
ácido nucleico en tiempo real
c) establecer un valor umbral definido
d) determinar el número de ciclos para cada
dilución en el que se rebasa el valor umbral de señal
e) determinar una función no lineal
continuamente diferenciable del número de ciclos determinado en el
paso d) como función del logaritmo del número de copias de ácido
nucleico diana empleado para la amplificación y
f) calcular la eficacia de amplificación E a
partir de la función determinada en el paso e).
3. Método reivindicado en la reivindicación 1,
en el que se determina la eficacia de amplificación E de una cierta
cantidad de ácido nucleico diana como primera derivada local
negativa de la función continuamente diferenciable del paso e).
4. Método reivindicado en la reivindicación 2,
en el que se determina la eficacia de amplificación E de una cierta
cantidad original de ácido nucleico diana en forma de primera
derivada local recíproca de la función continuamente diferenciable
del paso e).
5. Método reivindicado en las reivindicaciones
1-4, en el que se determina una función no lineal
continuamente diferenciable del paso e) mediante un ajuste
polinómico con preferencia de 3er, 4º, 5º, 6º o 7º grado.
6. Método la cuantificación relativa de un ácido
nucleico diana en una muestra que consta de los pasos
siguientes:
a) determinar las eficacias de amplificación del
ácido nucleico diana y de un patrón interno o externo en
condiciones definidas de amplificación tal como se reivindica en las
reivindicaciones 1-5,
b) amplificar el ácido nucleico diana contenido
en la muestra y el patrón interno o externo en las mismas
condiciones de reacción definidas.
c) medir la amplificación del ácido nucleico
diana y del patrón en tiempo real.
d) calcular el número original de copias en la
muestra por corrección del número de copias derivado del paso c)
mediante las eficacias de amplificación determinada en el paso
a).
7. Método para la cuantificación de un ácido
nucleico diana en una muestra con respecto a un ácido nucleico de
referencia que consta de los pasos siguientes:
a) determinar las eficacias de amplificación del
ácido nucleico diana y del ácido nucleico de referencia en
condiciones definidas de amplificación tal como se reivindica en las
reivindicaciones 1-5
b) amplificar el ácido nucleico diana contenido
en la muestra y el ácido nucleico de referencia contenido en la
muestra en las mismas condiciones definidas de amplificación.
c) medir la amplificación del ácido nucleico
diana y del ácido nucleico de referencia en tiempo real.
d) calcular la proporción original entre ácido
nucleico diana y ácido nucleico de referencia en la muestra por
corrección de la proporción derivada del paso c) mediante las
eficacias de amplificación determinadas en el paso a).
8. Método para la cuantificación relativa de un
ácido nucleico diana con respecto a un ácido nucleico de referencia
y normalizada con una muestra provista de calibrado, que consta de
los pasos siguientes:
a) preparar una serie normal de diluciones o dos
series separadas de diluciones de ácido nucleico diana y ácido
nucleico de referencia
b) amplificar las diversas diluciones de ácido
nucleico diana y ácido nucleico de referencia en condiciones de
reacción definidas, midiendo la amplificación del ácido nucleico en
tiempo real
c) establecer valores umbral definidos de señal
para el ácido nucleico diana y ácido nucleico de referencia
d) determinar el número de ciclos Cp en los que
se rebasan en cada dilución los valores umbral de señal definidos
para el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia
e) determinar una función continuamente
diferenciable de los valores Cp determinados en d) como función del
logaritmo de las cantidades empleadas de ácido nucleico diana y
determinar una función continuamente diferenciable de los valores
Cp determinados como función del logaritmo de las cantidades
empleadas de ácido nucleico de referencia
f) determinar los valores Cp del ácido nucleico
diana y del ácido nucleico de referencia en la muestra a analizar
así como en la muestra con calibrador
g) asignar los valores Cp medidos en el paso f)
a valores concretos de las funciones determinados en el paso e)
h) calcular los cocientes de los valores de
función g) del ácido nucleico diana y ácido nucleico de referencia
para la muestra a analizar y para la muestra con calibrador
i) determinar la proporción entre los dos
cocientes de h) como medida de la cantidad original de ácido
nucleico diana contenida en la muestra.
9. Método para la cuantificación relativa de un
ácido nucleico diana con respecto a un ácido nucleico de referencia
y normalizada con una muestra con calibrador, que consta de los
pasos siguientes:
a) preparar una serie normal de diluciones o dos
series separadas de diluciones de ácido nucleico diana y ácido
nucleico de referencia
b) amplificar las diversas diluciones de ácido
nucleico diana y ácido nucleico de referencia en condiciones de
reacción definidas, midiendo la amplificación del ácido nucleico en
tiempo real.
c) establecer valores umbral de señal definidos
para el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia
d) determinar los números de ciclos Cp, en los
que se rebasan en cada dilución los valores umbral de señal
definidos para el ácido nucleico diana y para el ácido nucleico de
referencia
e) determinar una función continuamente
diferenciable del logaritmo de las cantidades empleadas de ácido
nucleico diana como función de los valores Cp determinados en d) y
determinar una función continuamente diferenciable del logaritmo de
las cantidades empleadas de ácido nucleico de referencia como
función de los valores Cp determinados
f) determinar los valores Cp del ácido nucleico
diana y del ácido nucleico de referencia en la muestra a analizar y
en la muestra con calibrador
g) asignar los valores Cp medidos en el paso f)
a valores concretos de las funciones determinadas en el paso e)
h) calcular los cocientes de los valores de la
función del apartado g) del ácido nucleico diana y del ácido
nucleico de referencia para la muestra a analizar y para la muestra
con calibrador
i) determinar la proporción entre los dos
cocientes de h) como medida de la cantidad original de ácido
nucleico diana contenido en la muestra.
10. Método reivindicado en las reivindicaciones
8-9, en la que las funciones continuamente
diferenciables del paso e) se determinan mediante un ajuste
polinómico, con preferencia de 3er, 4º, 5º, 6º o 7º grado.
11. Método reivindicado en las reivindicaciones
1-10, en el que se detectan los ácidos nucleicos
amplificados mediante por lo menos una sonda de hibridación con
marcador fluorescente.
12. Método reivindicado en la reivindicación 11,
en el que se detectan los ácidos nucleicos amplificados mediante
sondas de hibridación FRET, faros moleculares o sondas TaqMan.
13. Método reivindicado en las reivindicaciones
1-12, en el que se detectan los ácidos nucleicos
amplificados mediante un colorante que se une al DNA, con
preferencia el SybrGreen I.
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