ES2291238T3 - Metodo para la cuantificacion de acidos nucleicos a tiempo real, de eficiencia corregida. - Google Patents
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Abstract
Método para la cuantificación de un ácido nucleico diana en una muestra, el cual comprende los siguientes pasos: a) determinación de la eficiencia de amplificación del ácido nucleico diana en condiciones definidas de amplificación, la cual comprende los siguientes pasos: a1) preparación de una serie de diluciones del ácido nucleico diana, a2) amplificación del ácido nucleico diana en condiciones definidas de reacción, midiéndose la amplificación del ácido nucleico a tiempo real, a3) determinación de un valor definido del umbral, a4) determinación del número de ciclos al cabo de los cuales se excede el valor del umbral de la señal, para cada dilución, a5) determinación de una función lineal logarítmica del número de copias del ácido nucleico diana empleadas para la amplificación como función del número de ciclos al cabo de los cuales se excede el valor del umbral de la señal y cálculo de la eficiencia de la amplificación E, de acuerdo con E = G -a ó determinación de una función lineal del número de ciclos determinados en el paso a4) como una función de un logaritmo del número de copias del ácido nucleico diana empleado para la amplificación y cálculo de la eficiencia de la amplificación E, de acuerdo con E = G -1/a , en donde a se determina como la primera derivada de la función determinada, y G es el número base del logaritmo. b) amplificación del ácido nucleico diana contenido en la muestra, en las mismas condiciones definidas de reacción. c) medición de la amplificación a tiempo real, d) cuantificación de la cantidad original de ácido nucleico diana en la muestra mediante la corrección de la cantidad original derivada del paso c) con ayuda de la eficiencia de la amplificación determinada.
Description
Método para la cuantificación de ácidos
nucleicos a tiempo real, de eficiencia corregida.
La presente invención se refiere al campo de la
cuantificación de ácidos nucleicos con ayuda de una PCR
cuantitativa, a tiempo real.
Los métodos para la cuantificación de ácidos
nucleicos son importantes en muchas áreas de la biología molecular
y en particular para diagnósticos moleculares. A nivel del ADN
dichos métodos se emplean por ejemplo para determinar el número de
copias de las secuencias de genes amplificadas en el genoma. Sin
embargo, los métodos para la cuantificación de ácidos nucleicos se
emplean especialmente en conexión con la determinación de las
cantidades de mARN dado que es habitualmente una medida para la
expresión del gen de codificación correspon-
diente.
diente.
Si se dispone de una cantidad suficiente de
material de muestra, los ARNm especiales pueden cuantificarse
mediante métodos convencionales tales como el análisis Northern Blot
ó los métodos de ensayo de protección de ARNasa. Sin embargo, estos
métodos no son lo bastante sensibles para el material de muestra que
está solo disponible en pequeñas cantidades o para genes que se
expresan muy débilmente.
El así llamado, método RT-PCR,
es un método mucho más sensible. En este método, se obtiene
primeramente un ADNc monocatenario a partir del ARNm que hay que
analizar, empleando una transcriptasa inversa. Subsiguientemente,
se genera un producto de amplificación de ADN de doble cadena con
ayuda de la PCR.
Se hace una distinción entre las dos diferentes
variantes de este método:
\bullet En la así llamada, cuantificación
relativa, el ratio de la expresión de un cierto ARN diana, se
determina en relación a la cantidad de ARN del así llamado, gen de
régimen interno ("housekeeping gene"), el cual se asume que
está constitutivamente expresado en todas las células
independientemente del respectivo status fisiológico. Por ello, el
ARNm está aproximadamente en la misma cantidad en todas las
células.
La ventaja de esto, es que diferentes
cualidades iniciales de varios materiales de muestra y el
procedimiento de preparación del ARN no tienen ninguna influencia
sobre el resultado particular. Sin embargo, una cuantificación
absoluta no es posible con este método.
\bullet Alternativamente, la cantidad absoluta
de ARN empleada puede determinarse con ayuda de ácidos nucleicos
estándar de un número conocido de copias y amplificación de una
serie de diluciones correspondientes de este ácido nucleico
estándar. Existen dos alternativas:
Cuando se emplean estándares externos, el ácido
nucleico estándar y el ácido nucleico diana se amplifican en
recipientes de reacción separados. En este caso, puede emplearse un
estándar con una secuencia idéntica al ácido nucleico diana. Sin
embargo, pueden tener lugar errores sistemáticos en este tipo de
cuantificación si la preparación de ARN que va a analizarse contiene
componentes inhibidores que perjudican la eficiencia de la reacción
PCR subsiguiente. Dichos errores pueden excluirse empleando
estándares internos, es decir, amplificando el estándar y el ácido
nucleico diana en un mismo recipiente de reacción. Sin embargo, un
inconveniente de este método es que los estándares tienen que
emplearse teniendo diferentes secuencias comparadas con las del
ácido nucleico diana que va a analizarse, con el fin de distinguir
entre la amplificación, del ácido nucleico estándar y el ácido
nucleico diana. Esto puede en cambio, conducir a un error
sistemático en la cuantificación, dado que no pueden excluirse
diferentes eficiencias de la amplificación mediante PCR cuando las
secuencias son diferentes.
Los productos de la PCR pueden cuantificarse por
dos caminos fundamentalmente diferentes:
a) Determinación del punto final de la cantidad
de producto de la PCR formado en la fase plana de la reacción de
amplificación.
En este caso, la cantidad de producto de la PCR
formado no es correlativo con la cantidad del número de copias
inicial puesto que la amplificación de los ácidos nucleicos al final
de la reacción ya no es por más tiempo exponencial y en su lugar se
alcanza una saturación. En consecuencia, diferentes números de
copias iniciales presentan idénticas cantidades de producto PCR
formado. Por lo tanto, el método PCR competitivo ó el
RT-PCR competitivo, se emplea habitualmente en este
procedimiento. En estos métodos, la secuencia diana específica se
coamplifica junto con una serie de diluciones de un estándar interno
de un número de copias conocido. El número de copias iniciales de
la secuencia diana se extrapola a partir de la mezcla que contiene
una cantidad idéntica de producto PCR de la secuencia estándar y
diana (Zimmermann and Mannhalter Bio-Techniques
21:280-279, 1996).
Un inconveniente de este método es también que
la medición tiene lugar en la región de saturación de la reacción
de amplificación.
b) Cuantificación cinética en tiempo real en la
fase exponencial de la PCR. En este caso, la formación de productos
PCR está monitorizada en cada ciclo de la PCR. La amplificación se
mide habitualmente en termocicladores los cuales tienen unos
dispositivos adicionales para la medición de las señales de
fluorescencia durante la reacción de amplificación. Un ejemplo
típico de éstos es el aparato Roche Diagnostics LightCycler
(catálogo nº 20110468). Los productos de la amplificación se
detectan por ejemplo mediante sondas de hibridación marcadas con
fluorescente, las cuales solamente emiten señales de fluorescencia
cuando están unidas al ácido nucleico diana o en ciertos casos
también mediante colorantes fluorescentes que se unen al ADN de
doble cadena. Se determina un umbral definido de la señal para
todas las reacciones que hay que analizar, y se determina el número
de ciclos C_{p} requeridos para alcanzar este valor umbral para el
ácido nucleico diana como también para los ácidos nucleicos de
referencia tales como el gen estándar o de régimen interno
("housekeeping gene"). El número absoluto o relativo de copias
de la molécula diana puede determinarse sobre la base de los valores
Cp obtenidos para el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de
referencia (Gibson et al., Genome Research
("Investigación del genoma"), 6:995-1001;
Bieche et al., Cancer Research ("Investigación del
cáncer"), 59:2759-2765, 1999; WO 97/46707; WO
97/46712; WO 97/46714).
En resumen, en todos los métodos descritos para
la cuantificación de un ácido nucleico mediante PCR, el número de
copias formadas durante la reacción de amplificación está siempre en
relación con el número de copias formada de un ácido nucleico de
referencia el cual es o bien un estándar o un ARN de un gen de
régimen interno ("housekeeping gene"). En esta conexión se
acepta que la eficiencia de la PCR del ácido nucleico diana y del de
referencia no son diferentes.
Habitualmente, una eficiencia de la PCR de 2,00
se acepta que corresponde a doblar el número de copias por ciclo de
la PCR (User Bulletin ("Boletín del usuario") nº 2ABI Prism
7700, PE Applied Biosystems ("Biosistemas aplicados"),
1997).
Sin embargo, se ha descubierto que la eficiencia
real de la PCR puede ser diferente de 2,00 dado que está
influenciada por varios factores tales como la unión con cebadores,
longitud del producto de la PCR, contenido G/C y estructuras
secundarias del ácido nucleido que hay que amplificar e inhibidores
que pueden estar presentes en la mezcla de reacción como resultado
de la preparación de la muestra. Esto es particularmente importante
cuando se emplean ácidos nucleicos de referencia, heterólogos, p.
ej., en la cuantificación relativa comparada con la expresión de
genes de régimen interno ("housekeeping genes").
En la literatura pueden encontrarse varios
métodos de cuantificación de ácidos nucleicos. Yang Bingzhi et
al (Analitical Biochemistry ("Bioquímica analítica"), 1993,
208, 1, 110-116) describe un método de
cuantificación relativa que emplea un control estándar interno, en
donde los resultados están corregidos respecto a los resultados
obtenidos para el control interno. La patente EP 959140 describe una
cuantificación de un ácido nucleico diana, en donde los valores
obtenidos están corregidos mediante la determinación de una llamada
"corrección de la amplificación". La patente WO 99/54510
describe la preparación de curvas estándar como un medio para la
normalización de los datos de expresión del gen de la PCR
cuantitativa.
El objeto de la presente invención ha sido por
lo tanto proporcionar métodos para la cuantificación de ácidos
nucleicos, los cuales solventan los inconvenientes de la técnica
antigua como se describe más arriba. El objeto de la presente
invención fue en particular proporcionar métodos para la
cuantificación de ácidos nucleicos en los cuales un ácido nucleico
diana se cuantifica independientemente de las eficacias de
amplificación del ácido nucleico diana y ácido nucleico de
referencia.
Este objetivo se logra de acuerdo con la
invención mediante un método para la cuantificación de un ácido
nucleico diana en una muestra, el cual método comprende los pasos
siguientes
a) determinación de la eficiencia de la
amplificación del ácido nucleico diana en condiciones definidas.
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra en las mismas condiciones de reacción.
c) medición de la amplificación en tiempo
real.
d) cuantificación de la cantidad original de
ácido nucleico diana en la muestra mediante corrección de la
cantidad original derivada del paso c) con ayuda de la eficiencia
de amplificación determinada.
De acuerdo con la invención, este método puede
emplearse para la cuantificación relativa comparada con la
expresión de genes de régimen interno ("housekeeping genes")
así como para la cuantificación absoluta.
Un primer aspecto de la invención se refiere por
lo tanto, a métodos para la cuantificación de un ácido nucleico
diana en una muestra, comparada con un ácido nucleico de referencia
que comprende los siguientes pasos:
a) determinación de las eficiencias de
amplificación del ácido nucleico diana y del ácido nucleico de
referencia en condiciones de amplificación definidas.
b) amplificación del ácido nucleico diana en la
muestra así como también del ácido nucleico de referencia contenido
en la muestra, en las mismas condiciones de amplificación
definidas.
c) medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y del ácido nucleico de referencia en tiempo
real.
d) cálculo del ratio original entre el ácido
nucleico diana y el ácido nucleico de referencia en la muestra
mediante la corrección del ratio derivado del paso c) con ayuda de
las eficiencias de amplificación determinadas en el paso a).
Un segundo aspecto de la presente invención, se
refiere al método para la cuantificación de un ácido nucleico diana
en una muestra que comprende los siguientes pasos:
a) determinación de las eficiencias de
amplificación del ácido nucleico diana y de un estándar interno o
externo, en condiciones de amplificación definidas.
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra así como también el estándar interno o
externo, en las mismas condiciones de reacción definidas.
c) medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y el ácido nucleico estándar en tiempo real.
d) cálculo del número original de copias en la
muestra mediante la corrección del número de copias derivado del
paso c) con ayuda de las eficiencias de amplificación determinadas
en el paso a).
En todos los métodos, las eficiencias de
amplificación están preferentemente determinadas mediante
a) preparación de una serie de diluciones del
ácido nucleico diana
b) amplificación del ácido nucleico diana en
condiciones definidas de reacción de acuerdo con A, midiéndose la
amplificación de los ácidos nucleicos en tiempo real.
c) ajuste de un valor definido del umbral de la
señal.
d) determinación del número de ciclos para cada
dilución, en la cual se ha excedido el valor del umbral de la
señal,
e) cálculo de la eficiencia de la amplificación
basada sobre el número de ciclos determinado.
El objeto de la invención se logra mediante un
método para la cuantificación de un ácido nucleico diana en una
muestra, el cual método comprende los siguientes pasos:
a) determinación de la eficiencia de
amplificación del ácido nucleico diana en las condiciones definidas,
la cual comprende los siguientes pasos:
- a1)
- preparación de una serie de diluciones del ácido nucleico diana,
- a2)
- amplificación del ácido nucleico diana en condiciones de reacción definidas, midiéndose la amplificación del ácido nucleico a tiempo real,
- a3)
- determinación de un valor definido del umbral,
- a4)
- determinación del número de ciclos al cabo de los cuales se excede el valor del umbral de la señal, en cada dilución,
- a5)
- determinación de una función lineal logarítmica del número de copias de ácido nucleico diana empleadas para la amplificación como función del número de ciclos al cabo de los cuales se excede el valor del umbral de la señal, y cálculo de la eficiencia de la amplificación E de acuerdo con E = G^{-a}
- ó
- determinación de una función lineal del número de ciclos determinado en el paso a4) como una función de un logaritmo del número de copias del ácido nucleico diana empleado para la amplificación, y cálculo de la eficiencia de la amplificación E, de acuerdo con E = G^{-1/a},
- en donde ^{a} se determina como la primera derivada de la función determinada, y G es el número base del logaritmo
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra, en las mismas condiciones de reacción,
c) medición de la amplificación a tiempo
real,
d) cuantificación de la cantidad original de
ácido nucleico diana en la muestra mediante la corrección de la
cantidad original derivada del paso c) con ayuda de la eficiencia
de la amplificación determinada.
La importancia de una corrección de la
eficiencia será ilustrada mediante un cálculo del error. La tabla 1
muestra un cálculo teórico del tanto por ciento de error medio del
número de copias determinado en el caso de que las eficiencias de
amplificación sean diferentes de 2,00 como una función del
respectivo número de ciclos. El error se calcula de acuerdo con la
fórmula
tanto \ por \
ciento \ de \ error = (2^{n}/E^{n}-1) \ x \
100
en la cual, E es la eficiencia de
la amplificación y n es el respectivo número de ciclos al cabo de
los cuales se determina el tanto por ciento de
error.
La eficiencia de la amplificación puede
determinarse mediante varios métodos, por ejemplo, determinando una
función con la cual la señal medida se determina en relación a la
amplificación del ácido nucleico diana como una función de la
duración del ciclo.
La eficiencia de la amplificación se determina
de preferencia mediante un método en el cual
a) se prepara una serie de diluciones de un
ácido nucleico diana
b) el ácido nucleico diana se amplifica en
condiciones de reacción definidas como se reivindica en la
reivindica-
ción 1
ción 1
y se mide la amplificación del ácido nucleico a
tiempo real
c) se ajusta un valor umbral definido para la
señal
d) se determina el número de ciclos C_{p} para
cada dilución, al cabo de los cuales es excedido el valor del
umbral de la señal
e) se determina una función lineal logarítmica
del número de copias de ácido nucleico diana empleadas para la
amplificación, como una función del número de ciclos al cabo de los
cuales es excedido el valor del umbral de la señal
f) la eficiencia de la amplificación E se
calcula de acuerdo con
E =
G^{-a}
en donde a se determina como la
primera derivada de la función determinada en el paso e) y G es el
número base del
logaritmo.
De una manera similar, puede determinarse
también la eficiencia de la amplificación mediante un método en el
cual
a) se prepara una serie de diluciones del ácido
nucleico diana
b) el ácido nucleico diana se amplifica en
condiciones de reacción definidas como se ha reivindicado en la
reivindicación 1 y la amplificación del ácido nucleico se mide a
tiempo real
c) se ajusta un valor definido del umbral de la
señal
d) se determina el número de ciclos C_{p} al
cabo de los cuales se excede el valor del umbral de la señal, para
cada dilución
e) se determina una función lineal del número
de ciclos determinados en el paso d), como una función del logaritmo
del número de copias del ácido nucleico diana empleado para la
amplificación
y
f) se calcula la eficiencia de la amplificación
E de acuerdo con
E =
G^{-1/a}
en donde a se determina como la
primera derivada de la función determinada en el paso
e),
y
G es el número base del logaritmo.
Los dos procedimientos preferidos tienen la
ventaja de que no puede tener lugar un error sistemático resultante
de la determinación de la eficiencia de la amplificación en una fase
de la reacción PCR en la cual ya no hay más amplificación
exponencial del ácido nucleico diana (fase plana).
Sin embargo, se ha descubierto inesperadamente
que en ciertas condiciones, la eficiencia de la amplificación puede
ser también dependiente de la cantidad original de ácido nucleico
diana o puede cambiar durante los primeros ciclos de una reacción
de amplificación que está todavía en la fase exponencial. Un objeto
de la invención es así también un método para la cuantificación de
la eficiencia corregida de los ácidos nucleicos en los cuales la
eficiencia de la amplificación se determina mediante
a) preparación de una serie de diluciones del
ácido nucleico diana
b) amplificación del ácido nucleico diana en
condiciones de reacción definidas como se ha reivindicado en la
reivindicación 1, y medición de la amplificación del ácido nucleico
a tiempo real
c) ajuste de un valor definido del valor del
umbral de la señal
d) determinación para cada dilución, del número
de ciclos C_{p} al cabo de los cuales se excede el valor del
umbral de la señal
e) determinación de la eficiencia de la
amplificación como una función de la cantidad de ácido nucleico
diana.
Esto puede lograrse por ejemplo, mediante
derivación de la función continuamente diferenciable
F(C_{p}) de los valores de C_{p} como una función del
número de copias del original o viceversa.
La función F(C_{p}) = log
(concentración del número de copias del original), puede por ejemplo
estandarizarse mediante algoritmos matemáticos tales como un ajuste
polinómico de alto grado. La eficiencia de la amplificación E puede
determinarse a continuación mediante la ecuación
E =
G^{-dF(Cp)/dCp}
en la cual dF/C_{p}) es la
derivada de la función contínua y G es el número base del logaritmo.
Un ajuste polinómico de 4º grado ha probado ser particularmente
adecuado dentro del sentido de la
invención.
La cuantificación de la eficiencia corregida de
los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención puede en principio
emplearse para métodos para la cuantificación absoluta así como para
métodos para la cuantificación relativa.
\newpage
Por lo tanto, un asunto objeto de la presente
invención en relación a la cuantificación relativa, es también un
método para la cuantificación de un ácido nucleico diana en una
muestra, relativa a un ácido nucleico de referencia, que comprende
los siguientes pasos:
a) determinación de las eficiencias de la
amplificación del ácido nucleico diana y del ácido nucleico de
referencia en condiciones definidas de amplificación.
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra así como del ácido nucleico de referencia
contenido en la muestra, en las misma condiciones definidas de
amplificación.
c) medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y del ácido nucleico de referencia, a tiempo
real.
d) cálculo del ratio original entre el ácido
nucleico diana y el ácido nucleico de referencia en la muestra,
corrigiendo el ratio derivado del paso c) con ayuda de las
eficiencias de amplificación determinadas en el paso a).
Dicho método de acuerdo con la invención,
elimina por una parte la influencia de los inhibidores que pueden
estar presentes en la muestra examinada, y por otro lado, corrige
errores que pueden tener lugar como resultado de diferentes
eficiencias de amplificación del ácido nucleico diana y del ácido
nucleico de referencia.
Los pasos b) a d) se efectúan ventajosamente en
una mezcla paralela que contiene una así llamada, muestra de
calibración. La muestra de calibración es una muestra que contiene
el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia en un
ratio definido constante para cada medición. Subsiguientemente se
determina el ratio de los cocientes determinados para la muestra y
para la muestra de calibración, como una medida para la cantidad
original de ácido nucleico diana en la muestra. Esto tiene la
ventaja de que se eliminan además, otros errores sistemáticos
debidos a diferencias en la sensibilidad de la detección del ácido
nucleico diana y el ácido nucleico de referencia. Estos errores
sistemáticos pueden ocurrir por ejemplo como resultado de
diferentes propiedades de hibridación de las sondas de hibridación
o, en el caso de sondas marcadas con fluorescencia, diferentes
eficiencias de la excitación, en cuanto a rendimientos o eficiencias
de copulación del colorante con la sonda. Por lo tanto, la muestra
debe ensayarse y la muestra de calibración debe ser analizada en
cada experimento con los mismos agentes de detección, es decir, con
el mismo lote de sondas de hibridación marcadas
fluorescentemente.
Una versión especial de cuantificación relativa
de acuerdo con la invención, es un método para la cuantificación de
un ácido nucleico diana en una muestra relativa a un ácido nucleico
de referencia que comprende los siguientes pasos:
a) determinación de las eficiencias de la
amplificación del ácido nucleido diana y del ácido nucleico de
referencia en condiciones definidas de amplificación
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra y del ácido nucleico de referencia contenido
en la muestra en las mismas condiciones definidas de
amplificación
c) medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y del ácido nucleico de referencia a tiempo real.
d) determinación de un valor definido del umbral
de la señal
e) determinación del número de ciclos al cabo de
los cuales el valor del umbral de la señal se ha excedido en cada
caso durante la amplificación del ácido nucleico diana y el ácido
nucleico de referencia.
f) cálculo del ratio original del ácido nucleico
diana y el ácido nucleico de referencia en la muestra, de acuerdo
con la fórmula
N(T)_{0}/N(R)_{0}
=
E(R)^{n(R)}/E(T)^{n(T)}
en
donde
- N(T)_{0}
- = cantidad original de ADN diana presente en la muestra
- N(R)_{0}
- = cantidad original de ADN de referencia presente en la muestra
- E(R)
- = eficiencia de la amplificación del ácido nucleico de referencia
- n(R)
- = número de ciclos del ácido nucleico de referencia medido en el paso e)
- E(T)
- = eficiencia de la amplificación del ácido nucleico diana
- n(T)
- = número de ciclos del ácido nucleico diana medido en el paso e)
\newpage
En esta versión es ventajoso efectuar los pasos
b), c), e) y f) con una muestra de calibración con el fin de
eliminar errores sistemáticos debidos a la detección de los
productos de amplificación y subsiguientemente se determinan los
ratios de los cocientes medidos para la muestra y para la muestra de
calibración, como una medida para la cantidad original del ácido
nucleico diana en la muestra.
El ratio obtenido en el paso f) se calcula de
acuerdo con la invención, como sigue:
(1)N(T)_{n} =
N(T)_{0} \ x \
E(T)^{n(T)}
(2)N(R)_{n} =
N(R)_{0} \ x \
E(R)^{n(R)}
en
donde
- N(T)_{n}
- = cantidad de ADN diana al valor del umbral de la señal, y
- N(R)_{n}
- = cantidad de ADN de referencia al valor del umbral de la señal.
De (1) y (2) se deduce que:
(3)\frac{N(T)_{n}}{N(R)_{n}}
= \frac{N(T)_{0} \ x \
E(T)^{n(T)}}{N(R)_{0} \ x \
E(R)^{n(R)}}
de lo cual se deduce
que:
(4)\frac{N(T)_{0}}{N(R)_{0}}
= \frac{N(T)_{n} \ x \
E(R)^{n(R)}}{N(R)_{n} \ x \
E(T)^{n(T)}}
Debido al hecho de que se ha ajustado un valor
para el umbral de la señal idéntico para el ácido nucleico diana y
el ácido nucleico de referencia, éste puede ser aproximadamente:
N(T)_{n} =
N(R)_{n}
Bajo esta condición, y partiendo de la ecuación
(4) para el ratio original del ácido nucleico diana y el ácido
nucleico de referencia, se llega a la ecuación:
(5)N(T)_{0}/N(R)_{0}
=
E(R)^{n(R)}/E(T)^{n(T)}
Sin embargo, esta aproximación asumida no es
aplicable cuando el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de
referencia son detectados con diferentes sensibilidades. De acuerdo
con la invención es por lo tanto particularmente ventajoso medir
una muestra de calibración en una reacción paralela y determinar el
ratio de los cocientes
N(T)_{0}/N(R)_{0} medidos para la
muestra y para la muestra de calibración como una medición para la
cantidad original de ácido nucleico diana en la muestra.
Esto da como resultado lo siguiente a partir de
la ecuación (4) empleando los índices
_{A} para la muestra que hay que analizar,
y
_{K} para la muestra de calibración
Debido al hecho de que se ha ajustado un valor
idéntico del umbral de la señal para la muestra que se va a
analizar y para la muestra de calibración y que se emplean idénticos
agentes para detectar la diana y los amplicones de referencia en la
muestra y en la muestra de calibración, el ratio del cociente
determinado para la muestra y para la muestra de calibración es
como sigue:
Por lo tanto el ratio de los cocientes de la
muestra a analizar y la muestra de calibración es:
En consecuencia, puede obtenerse un valor
relativo de esta manera para el número de copias del original del
ácido nucleico diana en la muestra en el cual se han eliminado
errores sistemáticos debido a diferentes eficiencias de
amplificación así como debido a diferentes sensibilidades de
detección. El único requisito para la exactitud del valor
determinado es la aceptación justificada de que bajo condiciones
absolutamente idénticas del tampón, las eficiencias de la
amplificación y detección son también idénticas en los varios
recipientes de reacción.
Un requisito para todos los métodos de acuerdo
con la invención para la cuantificación relativa es que se
determine la eficiencia de la amplificación del ácido nucleico
diana, así como la eficiencia de la amplificación del ácido
nucleico de referencia. Dichas dos determinaciones se prefiere
llevarlas a cabo mediante los métodos descritos más arriba por
determinación del número de ciclos al cabo de los cuales se excede
un cierto valor del umbral de la señal.
En una versión preferida de cuantificación
relativa, la muestra se divide en dos alícuotas y la medida a tiempo
real de la amplificación del ácido nucleico diana y el ácido
nucleico de referencia se efectúa en recipientes de reacción
separados. Esto evita la interferencia entre las reacciones de
amplificación del ácido nucleico diana y el ácido nucleico de
referencia con respecto a su eficiencia, por ejemplo mediante
competición para los desoxinucleótidos o Taq polimerasa. Además, el
ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia pueden
detectarse con los mismos sistemas de detección, por ejemplo con el
mismo colorante de unión al ADN.
Alternativamente, la medición a tiempo real de
la amplificación del ácido nucleico diana y el ácido nucleico de
referencia puede efectuarse en una muestra en el mismo recipiente de
reacción empleando sondas de hibridación diferentemente marcadas.
Esto es particularmente ventajoso cuando se dispone solamente de
pequeñas cantidades de material de muestra, debido a que el pequeño
número de reacciones PCR necesarias se reduce de esta manera, a la
mitad.
Si se pretende determinar la cantidad absoluta
de ácido nucleico diana que se encuentra en una muestra, entonces
el método para la cuantificación de un ácido nucleico diana en una
muestra comprende los siguientes pasos:
a) determinación de las eficiencias de
amplificación del ácido nucleico diana y de un estándar interno o
externo en condiciones definidas de amplificación.
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra así como del estándar interno o externo con
las mismas condiciones definidas de reacción.
c) medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y del estándar en tiempo real.
d) cálculo del número de copias del original en
la muestra, corrigiendo el número de copias derivado del paso c) con
ayuda de las eficiencias de la amplificación determinadas en el
paso a).
Las secuencias del ácido nucleico diana y el
ácido nucleico estándar son de manera ventajosa substancialmente
idénticas. Sin embargo, cuando se selecciona la secuencia de un
estándar interno debe tenerse en cuenta que el sistema de detección
disponible debería de ser capaz de distinguir entre el ácido
nucleico estándar y el ácido nucleico diana. Esto puede lograrse por
ejemplo, empleando sondas de hibridación con diferentes marcas para
la detección del ácido nucleico diana y el estándar interno. De
forma ideal, los oligonucleótidos se emplean para esto como sondas
de detección que pueden ser empleadas para distinguir entre mínimas
diferencias de las secuencias tales como mutaciones puntuales.
Una ventaja del empleo de un estándar interno es
que los inhibidores presentes en la muestra influencian también la
amplificación del estándar. Por lo tanto, las diferencias en las
eficiencias de la amplificación pueden ser minimizadas.
En cambio, el empleo de un estándar externo
tiene la ventaja de que las reacciones de amplificación del ácido
nucleico diana y del estándar no pueden interferir competitivamente
entre sí por lo que respecta a su eficiencia. Además, los productos
de amplificación del ácido nucleico estándar y diana pueden
detectarse en reacciones en paralelo con ayuda del mismo sistema de
detección, por ejemplo, con la misma sonda de hibridación. Una
desventaja son las posibles diferencias en las eficiencias de la PCR
debido a los inhibidores en la muestra. Sin embargo, los errores en
la cuantificación causados por esto, pueden eliminarse mediante el
método descrito a continuación:
En una versión preferida para la cuantificación
absoluta de un ácido nucleico diana en una muestra, el método de
acuerdo con la invención comprende los siguientes pasos:
a) determinación de las eficiencias de la
amplificación del ácido nucleico diana así como un estándar interno
o externo en condiciones de amplificación definidas.
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra así como del estándar interno o externo en
las mismas condiciones definidas de la amplificación
c) medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y estándar a tiempo real
d) ajuste de un valor definido para el umbral de
la señal
e) determinación del número de ciclos durante la
amplificación del ácido nucleico diana y estándar, a los cuales se
excede el valor del umbral de la señal
f) determinación del número de copias del
original N(T)_{0} del ácido nucleico diana en la
muestra de acuerdo con la fórmula
(8)N(T)_{0} =
N(S)_{0} *
E(S)^{n(S)}/E(T)^{n(T)}
en la
cual
- N(S_{0})
- = cantidad original del estándar empleado
- E(S)
- = eficiencia de la amplificación del estándar
- n(S)
- = número de ciclos del estándar medidos en el paso (e)
- E(T)
- = eficiencia de la amplificación del estándar
- n(T)
- = número de ciclos del ácido nucleico diana medido en el paso e).
En este caso de manera parecida a la
cuantificación relativa, las eficiencias de la amplificación del
ácido nucleico diana y del estándar interno, se determinan de
preferencia como se ha descrito en la determinación del número de
ciclos a los cuales se ha excedido un cierto valor del umbral de la
señal.
De acuerdo con la invención,
N(T)_{0} se calcula como sigue:
N(T)_{n} =
N(T)_{0} *
E(T)^{n(T)}
y
N(S)_{n} =
N(S)_{0} *
E(S)^{n(S)}
Puesto que se ha ajustado un valor idéntico para
el umbral de la señal idéntico para el ácido nucleico diana y
estándar, esto es aproximadamente
N(T)_{n} =
N(S)_{n}
Por lo tanto el número de copias del original
del ácido nucleico diana presentes en la muestra se calcula de
acuerdo con la ecuación
(8)N(T)_{0} =
N(S)_{0} *
E(S)^{n(S)}/E(T)^{n(T)}
La invención se refiere también en particular a
aquellas versiones de los métodos descritos para la cuantificación
corregida con la eficiencia, de los ácidos nucleicos en los cuales
los productos de la amplificación son detectados mediante sondas de
hibridación las cuales pueden estar marcadas con un componente
detectable de muchas diferentes maneras.
Un requisito previo para la determinación de la
eficiencia corregida de la cantidad original de un ácido nucleico
diana y para la determinación de las eficiencias de la amplificación
per se, es el de definir los valores del umbral de la señal
y subsiguientemente determinar el numero de ciclos de la respectiva
reacción de amplificación a los cuales se alcanza cierto valor del
umbral de la señal. El valor del umbral de la señal puede
determinarse de acuerdo con la técnica anterior de varias
maneras:
De acuerdo con la técnica anterior, el valor del
umbral de la señal puede por ejemplo ser una señal a la cual
corresponde un cierto múltiplo de la varianza estadística de la
señal de fondo (ABI Prism 7700 Application Manual, Perkin
Elmer).
Alternativamente, el número de ciclos a los
cuales el valor del umbral de la señal es excedido, puede
determinarse de acuerdo con el llamado método del "punto de
ajuste por encima del umbral" (LightCycler Operator's Manual,
B59-B68, Roche Molecular Biochemicals, 1999).
En otra versión, el valor del umbral puede
determinarse como un valor relativo en lugar de un valor absoluto,
cuando independientemente del valor absoluto de la señal, el curso
de la reacción de amplificación se determina como una función del
número de ciclos y subsiguientemente se calcula la derivada
n^{ava}. En este caso, el exceder ciertos límites puede definirse
como el exceder un cierto valor del umbral de la señal (solicitud
de la patente EP nº 0016523.4). Por lo tanto, este método de
determinación del valor del umbral es independiente de la fuerza
absoluta de la señal de por ejemplo una señal de fluorescencia. Así,
es particularmente adecuado para aquellas versiones en las cuales
el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia se
amplifican en el mismo recipiente de reacción y son detectados con
ayuda de diferentes marcas fluorescentes. Se han ensayado métodos
que son particularmente adecuados para la cuantificación de la
eficiencia corregida de productos de la PCR en los cuales se
determina el máximo de la segunda derivada como una medición del
valor del umbral de la señal.
Las sondas de hibridación empleadas para los
métodos de acuerdo con la invención son habitualmente ácidos
nucleicos monocatenarios tal como ADN ó ARN ó derivados de los
mismos o alternativamente APN que híbrida a la temperatura de
reasociación de la reacción de amplificación con el ácido nucleico
diana. Estos oligonucleótidos tienen habitualmente una longitud de
20 a 100 nucleótidos.
En función del formato de detección la marca
puede introducirse sobre un grupo ribosa o fosfato del
oligonucleótido. Se prefieren las marcas en el extremo 3' y 5' de
la molécula de ácido nucleico.
El tipo de marca debe ser detectable en la
modalidad a tiempo real de la reacción de amplificación. Esto es
por ejemplo en principio también posible (pero no solamente), con
ayuda de marcas que pueden ser detectadas por RMN.
Se prefieren particularmente los métodos en los
cuales los ácidos nucleicos amplificados se detectan con ayuda de
por lo menos una sonda de hibridación marcada fluorescente.
Muchos procedimientos de ensayo son posibles
para ello. Los siguientes tres formatos de detección han demostrado
ser particularmente adecuados en conexión con la presente
invención:
\vskip1.000000\baselineskip
Para este formato de ensayo, se emplean
simultáneamente 2 sondas de hibridación monocatenarias, las cuales
son complementarias a los sitios adyacentes de la misma cadena de
ácido nucleico diana amplificado. Ambas sondas están marcadas con
diferentes componentes fluorescentes. Cuando se excitan con luz de
la adecuada longitud de onda, un primer componente transfiere la
energía absorbida al segundo componente de acuerdo con el principio
de transferencia de la energía de resonancia de fluorescencia de
forma que puede medirse la emisión de fluorescencia del segundo
componente, cuando ambas sondas de hibridación se unen a las
posiciones adyacentes de la molécula diana que hay que detectar.
Alternativamente es posible emplear un cebador
marcado fluorescente y solamente una sonda de oligonucleótidos
marcada (Bernard et al., Analitical Biochemistry
("Bioquímica analítica") 235, p. 1001-107
(1998)).
\vskip1.000000\baselineskip
Se marca una sonda de hibridación monocatenaria
con dos componentes. Cuando se excita el primer componente con luz
de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida es
transferida al segundo componente, el así llamado, atenuador, de
acuerdo con el principio de transferencia de la energía de
resonancia de la fluorescencia. Durante el paso de reasociación de
la reacción PCR, la sonda de hibridación se une al ADN diana y se
degrada mediante la actividad 5'-3' exonucleasa de
la Taq polimerasa durante la subsiguiente fase de prolongación.
Como resultado, el componente fluorescente excitado y el extintor se
separan espacialmente entre sí y así puede medirse la emisión de
fluorescencia del primer componente.
\vskip1.000000\baselineskip
Estas sondas de hibridación están también
marcadas con un primer componente y con un atenuador, estando las
marcas localizadas de preferencia en ambos extremos de la sonda.
Como resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos
componentes están en una espacial proximidad en solución. Después de
la hibridación con el ácido nucleico diana, ambos componentes se
separan entre sí de manera que después de la excitación con luz de
una longitud de onda adecuada, puede medirse la emisión fluorescente
del primer componente (Lizardi et al., US
5.118.801).
5.118.801).
En las versiones descritas en las cuales
solamente se amplifica el ácido nucleico diana o solamente el ácido
nucleico de referencia o un estándar externo, en un recipiente de
reacción en cada caso, el producto de la amplificación respectiva
puede también detectarse de acuerdo con la invención mediante un
colorante de unión al ADN que emite una correspondiente señal de
fluorescencia después de la interacción con el ácido nucleico de
doble cadena después de la excitación con luz de una longitud de
onda adecuada. Los colorantes verde Sybr y oro Sybr (sondas
moleculares) han probado que son particularmente adecuados para esta
aplicación. Pueden emplearse alternativamente, colorantes
intercalados.
Un objeto de la invención son también kits que
contienen agentes apropiados para efectuar el método de acuerdo con
la invención. De acuerdo con la invención estos agentes están
presentes en el kit en varias composiciones. Un kit contiene de
preferencia reactivos tales como por ejemplo, una transcriptasa
inversa para la preparación del ADNc, una ADN polimerasa para la
reacción de amplificación, cebadores específicos para la reacción de
amplificación y opcionalmente también sondas de hibridación
específicas para detectar el producto de amplificación. Como
alternativa pueden estar presentes en el kit, polimerasas para una
reacción RT-PCR de un paso único. También es
posible que un kit de acuerdo con la invención contenga insertos de
envase o discos que contienen listas con eficiencias de
amplificación previamente determinadas para las condiciones de
amplificación definidas. Finalmente, la invención se refiere
también a un kit que adicionalmente contiene otros reactivos para la
síntesis y marcado de oligonucleótidos tales como los ésteres NHS
fluorescentes o CPGs marcados fluorescentes. Además, un kit de
acuerdo con la invención puede contener opcionalmente un ADN que
puede emplearse como estándar interno o
externo.
externo.
La invención se aclara además mediante los
siguientes ejemplos:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se aisló el ARN de la línea celular
HT-29 (ATCC) empleando un kit de restricción de ARN
de alta pureza (Roche Diagnostics GmbH). Después de la
determinación espectro-fotométrica semicuantitativa,
se ajustó la concentración de ARN a 100 ng/\mul en agua exenta de
ARN. A partir del mismo, se prepararon tres diluciones simples en
serie, con concentraciones de ARN de 10 ng, 1 ng y 100
pg/\mul.
Se preparó el ADNc total a partir de estas
diluciones mediante transcripción inversa bajo las siguientes
condiciones:
- 1 x
- tampón de transcripción inversa AMV
- 1 mM
- de cada desoxinucleósido trifosfato
- 0,0625 mM
- de hexámeros randomizados
- 10 u
- de transcriptasa inversa AMV
- 10 \mul
- de ARN
- Añadir 20 \mul
- de agua
Todas las mezclas se incubaron durante 10
minutos a 25ºC, 30 minutos a 42ºC y 5 minutos a 95ºC para la
síntesis del ADNc. Subsiguientemente, se enfriaron a 4ºC. Se empleó
una muestra conteniendo 10 ng/\mul de ARN HT29, como
calibrador.
Después se llevó a cabo la reacción de
amplificación, la cual se midió en tiempo real en el formato FRET
HybProbe con un aparato LightCycler (Roche Diagnostics GmbH). Cada
mezcla de reacción se amplificó con las siguientes condiciones:
- 1 x
- tampón para sondas de hibridación de ADN fast start
- 1 x
- mezcla de detección
- 2 \mul
- ADNc
- Añadir 20 \mul
- de agua
La mezcla de detección 1 x se componía de 0,5
\muM del cebador delantero y 0,5 \muM del cebador inverso, cada
uno de ellos con sondas de hibridación marcadas con 0,2 \muM de
fluoresceína y LC rojo 649, 4 mM de cloruro de magnesio y 0,005% de
Brij-35.
Los cebadores que contenían SEQ ID NO:1 y SEQ ID
NO:2 se emplearon para amplificar una secuencia CK20. El producto
CK20 se detectó empleando una sonda de fluoresceína que contenía SEQ
ID NO:3 y una sonda de hibridación con LC-rojo 640
que contenía SEQ ID NO:4. Los cebadores que contenían SEQ ID NO:5 y
6 se emplearon para detectar la secuencia PBGD. La PBGD se detectó
empleando una sonda de hibridación marcada con fluoresceína, que
contenía SEQ ID NO:7 y una sonda de hibridación marcada con
LC-rojo 640 que contenía SEQ ID NO:8.
Las mezclas de reacción fueron primero incubadas
durante 10 minutos a 95ºC en presencia de 5 mM de cloruro de
magnesio para la amplificación. La verdadera reacción de
amplificación se efectuó durante 50 ciclos, de acuerdo con el
siguiente esquema:
10 segundos a 95ºC
10 segundos a 60ºC
5 segundos a 72ºC
Después de cada incubación a 60ºC se efectuó una
medición de la fluorescencia de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Se determinó el valor del umbral de la señal (valor
C_{p}) como el máximo de la segunda derivada de la reacción de
amplificación como una función del número de ciclos.
Ejemplo
2
Se estableció una función para determinar la
eficiencia a la cual el número de ciclos C_{p} determinado para
la respectiva concentración, se había determinado como una función
del logaritmo decimal de la concentración de ARN empleada.
Se calculó una función lineal a partir de esta
función mediante análisis de regresión con ayuda del programa
LightCycler. Partiendo de esta función, se determinó la eficiencia
de acuerdo con la ecuación
eficiencia =
10^{-1/a}
en donde ^{a} es el gradiente
(primera derivada) de la línea de regresión
determinada.
Los resultados obtenidos para CK20 y PBGD están
indicados en la tabla 2. El resultado muestra que por una parte las
eficiencias son considerablemente distintas de 2,00 es decir, el
doble del ácido nucleico diana no toma parte en cada ciclo de la
PCR. Por otro lado, el resultado muestra que las eficiencias de la
amplificación del CK20 y PBGD difieren significativamente entre sí
en condiciones idénticas.
Ejemplo
3
En las condiciones descritas en el ejemplo 1, el
ratio determinado entre la cantidad original de CK20 y PBGD debería
ser independiente de la respectiva concentración amplificada del
material de muestra empleado. Por lo tanto la determinación del
ratio para varias cantidades de RNA de muestra, se empleó para
comprobar el efecto de una corrección eficiente sobre la base de
los valore medidos que se obtuvieron. En este caso, el ratio entre
CK20 y PBGD se determinó de acuerdo con la invención de acuerdo con
la ecuación (5). Por una parte, el ratio se determinó empleando las
eficiencias obtenidas del ejemplo 2 y por otro lado, con una
eficiencia de amplificación asumida de 2,00 para CK20 y para PGD.
Los resultados se muestran en la tabla 3:
Como puede verse a partir de la tabla, los
valores de la eficiencia corregida calculados para el ratio
N(T)_{0}/N(R)_{0}
tienen una desviación estándar significativamente menor para las diferentes cantidades de ARN de muestra que los valores sin corregir, y un coeficiente de variación de 6,1% comparado con 52,7%.
tienen una desviación estándar significativamente menor para las diferentes cantidades de ARN de muestra que los valores sin corregir, y un coeficiente de variación de 6,1% comparado con 52,7%.
Ejemplo
4
Análogamente a los ejemplos 1 y 2, se efectuaron
las reacciones de amplificación en presencia de 10 mM de cloruro de
magnesio. En este caso, se determinó una eficiencia de 1,491 para
CK20 y una eficiencia de 1,578 para PBGD. Además, se determinaron
los valores C_{p} de una muestra de calibración conteniendo una
cantidad desconocida de HT-29 ARN a 5 mM y 10 mM de
cloruro de magnesio. Los datos medidos se emplearon para determinar
los cocientes de los ratios entre CK20 y PBGD entre las muestras
analizadas en cada caso y el calibrador apropiado de acuerdo con la
ecuación (7). Esta determinación se efectuó por una parte con una
eficiencia asumida de 2 para la amplificación de CK20 y PBGD, así
como también por otra parte, con ayuda de las eficiencias de
amplificación determinadas experimentalmente. El resultado figura
en la tabla 4.
Como puede verse en la tabla 4, los valores de
la eficiencia corregidos tienen una desviación estándar menor
(0,10) así como un coeficiente de variación tres veces menor que los
valores T:R/C con una eficiencia de la PCR asumida de 2,00. Este
resultado muestra que una corrección de la eficiencia de acuerdo con
la invención es también ventajosa en cuantificaciones en las cuales
ha sido ya llevada a cabo una estandarización con ayuda de los
calibradores.
Ejemplo
5
Para esta finalidad, se preparó una serie de
diluciones decimales de un plásmido que contiene el gen PSA de
10^{9} a 10^{2} copias. Al mismo tiempo se preparó una segunda
serie decimal de diluciones con un plásmido que contenía el gen
para TNF (factor de necrosis tumoral) con un número de copias
desconocido del ADN del plásmido. A continuación las mezclas de
reacción PSA se amplificaron en un LightCycler (Roche Diagnostics)
en condiciones estándar empleando los cebadores que contenían las
SEQ ID NO: 9 y 10, y las mezclas de reacción TNF se amplificaron
empleando los cebadores que contenían las SEQ ID NO:11 y 12 (Roche
Diagnostics LightCycler Verde Sydr Mastermix, 5 mM concentración
final MgCl_{2}, 0,5 \muM concentración final de cada cebador).
La amplificación se midió en tiempo real empleando el agente de
unión a ADN, SybrGreen1 (Molecular Probes) ("Sondas
Moleculares") en condiciones estándar, en la cual la evaluación
se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante en
la modalidad de la derivada segunda.
El número de copias del original del plásmido
TNF se determinó de dos diferentes formas sobre la base de los
datos obtenidos.
Por un lado se generó una línea de calibración
basada sobre la amplificación de BSA, asumiendo la misma eficiencia
de amplificación para el PSA y el TNF.
Por otro lado, el número de copias del original
se determinó de acuerdo con la fórmula (8). De forma análoga al
ejemplo 2, la eficiencia de la amplificación para el PSA y TNF se
determinó mediante el cálculo de una línea de regresión de acuerdo
con la fórmula
E=
10^{-1/a}
en donde ^{a} significa el
aumento (1ª derivada) de la línea de regresión calculada. En este
caso, se determinó una eficiencia de amplificación de 2,03 para el
PSA y se determinó una eficiencia de amplificación de 2,13 para el
TNF.
Los resultados de los dos procedimientos de
cuantificación se muestran en la tabla 5. Una así llamada,
comprobación de la dilución, se efectuó como medición de la
exactitud de la determinación. Los valores de la comprobación de la
dilución encontrados se calculan a partir de los cocientes de los
números de copias medidos para la dilución respectiva y dos mezclas
de dilución que difieren entre sí por un factor de 10. De esta
forma, debería esperarse un valor de 10,00 como el valor ideal.
Como muestra el resultado de la comprobación de
la dilución de la tabla 5, la media de los resultados de los datos
de la eficiencia corregida da como resultado un valor de 10,16,
mientras que la media de los datos de la eficiencia sin corregir da
como resultado un valor de 8,96, el cual está considerablemente
alejado del valor ideal de 10,00. De ello se deduce que una
corrección de la eficiencia es también ventajoso para las versiones
en las cuales se efectúa una cuantificación absoluta de los ácidos
nucleicos con ayuda de la PCR.
<110> Roche Diagnostics GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la eficiencia corregida
de la cuantificación de ácidos nucleicos en tiempo real.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 539400 DE
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.1.
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcaagcagt ggtacgaaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggacacacc gagcattt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattacagaca aattgaagag ctgcg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcagatta aggatgctca actgc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggagccat gtctggtaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagggtacg aggctttcaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagtgatt cgcgtgggta cccg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagccagct tgctcgcata cagac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggagttct tgaccccaaa ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccagcgtcc agcacaca
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgccccaa tccctttatt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtttcgaag tggtggtctt g
\hfill21
Claims (12)
1. Método para la cuantificación de un ácido
nucleico diana en una muestra, el cual comprende los siguientes
pasos:
a) determinación de la eficiencia de
amplificación del ácido nucleico diana en condiciones definidas de
amplificación, la cual comprende los siguientes pasos:
- a1)
- preparación de una serie de diluciones del ácido nucleico diana,
- a2)
- amplificación del ácido nucleico diana en condiciones definidas de reacción, midiéndose la amplificación del ácido nucleico a tiempo real,
- a3)
- determinación de un valor definido del umbral,
- a4)
- determinación del número de ciclos al cabo de los cuales se excede el valor del umbral de la señal, para cada dilución,
- a5)
- determinación de una función lineal logarítmica del número de copias del ácido nucleico diana empleadas para la amplificación como función del número de ciclos al cabo de los cuales se excede el valor del umbral de la señal y cálculo de la eficiencia de la amplificación E, de acuerdo con E = G^{-a}
- ó
- determinación de una función lineal del número de ciclos determinados en el paso a4) como una función de un logaritmo del número de copias del ácido nucleico diana empleado para la amplificación y cálculo de la eficiencia de la amplificación E, de acuerdo con E = G^{-1/a},
- en donde ^{a} se determina como la primera derivada de la función determinada, y G es el número base del logaritmo.
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra, en las mismas condiciones definidas de
reacción.
c) medición de la amplificación a tiempo
real,
d) cuantificación de la cantidad original de
ácido nucleico diana en la muestra mediante la corrección de la
cantidad original derivada del paso c) con ayuda de la eficiencia de
la amplificación determinada.
2. Método para la cuantificación de un ácido
nucleico diana en una muestra, relativa a un ácido nucleico de
referencia, el cual comprende los siguientes pasos:
a) determinación de las eficiencias de
amplificación del ácido nucleico diana y del ácido nucleico de
referencia en condiciones definidas de amplificación,
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra así como del ácido nucleico de referencia
contenido en la muestra en las mismas condiciones definidas de
amplificación,
c) medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y del ácido nucleico de referencia a tiempo real,
d) determinación de un valor definido del umbral
de la señal,
e) determinación del número de ciclos al cabo de
los cuales el umbral de la señal ha sido excedido en cada caso
durante la amplificación del ácido nucleico diana y el ácido
nucleico de referencia,
f) cálculo del ratio original entre el ácido
nucleico diana y el ácido nucleico de referencia en la muestra, de
acuerdo con la fórmula siguiente
N(T)_{0}/N(R)_{0} =
E(R)^{n(R)}/E(T)^{n(T)}
en
donde
- N(T)_{0}
- = cantidad original de ADN diana presente en la muestra
- N(R)_{0}
- = cantidad original de ADN de referencia presente en la muestra
- E(R)
- = eficiencia de la amplificación del ácido nucleico de referencia
- n(R)
- = número de ciclos del ácido nucleico de referencia medido en el paso e)
- E(T)
- = eficiencia de la amplificación del ácido nucleico diana
- n(T)
- = número de ciclos del ácido nucleico diana medido en el paso e)
3. Método como se ha reivindicado en la
reivindicación 2, en donde los pasos b), c), e) y f) se efectúan
adicionalmente empleando una muestra de calibración y
subsiguientemente se determina el ratio de los cocientes para la
muestra y para la muestra de calibración se determina como una
medición para la cantidad original de ácido nucleico diana en la
muestra.
4. Método como se ha reivindicado en las
reivindicaciones 2-3, en donde la determinación de
la eficiencia de la amplificación del ácido nucleico diana y la
determinación de la eficiencia de la amplificación del ácido
nucleico de referencia, se efectúa de acuerdo con los pasos a1) a
a5) de la reivindicación 1.
5. Método como se ha reivindicado en las
reivindicaciones 2-4, en donde la medición a tiempo
real de la amplificación del ácido nucleico diana y el ácido
nucleico de referencia en una muestra se efectúa en recipientes de
reacción separados.
6. Método como se ha reivindicado en las
reivindicaciones 2-4, en donde la medición a tiempo
real de la amplificación del ácido nucleico diana y el ácido
nucleico de referencia en una muestra se efectúa en el mismo
recipiente de reacción empleando sondas de hibridación con
diferentes marcas.
7. Método para la cuantificación de un ácido
nucleico diana en una muestra, el cual comprende los siguientes
pasos:
a) determinación de las eficiencias de
amplificación del ácido nucleico diana y del estándar interno o
externo en condiciones definidas de amplificación,
b) amplificación del ácido nucleico diana
contenido en la muestra así como del estándar interno o externo en
las mismas condiciones definidas de amplificación,
c) medición de la amplificación del ácido
nucleico diana y del estándar, a tiempo real.
d) determinación de un valor definido del umbral
de la señal,
e) determinación del número de ciclos al cabo de
los cuales el valor del umbral de la señal ha sido excedido durante
la amplificación del ácido nucleico diana y del estándar,
f) determinación del número de copias original
N(T)_{0} del ácido nucleico diana en la muestra, de
acuerdo con la fórmula
N(T)_{0} =
N(S)_{0} *
E(S)^{n(S)}/E(T)^{n(T)}
en la
cual
- N(S)_{0}
- = cantidad original de estándar empleado
- E(S)
- = eficiencia de la amplificación del estándar
- n(S)
- = número de ciclos del estándar medido en el paso e)
- E(T)
- = eficiencia de la amplificación del ácido nucleico diana
- n(T)
- = número de ciclos del ácido nucleico diana medidos en el paso e).
8. Método como se ha reivindicado en la
reivindicación 7, en donde las eficiencias de amplificación se
determinan de acuerdo con los pasos a1) a a5) de la reivindicación
1.
9. Método como se ha reivindicado en las
reivindicaciones 7-8, empleando un estándar interno,
en donde la medición a tiempo real de la amplificación del ácido
nucleico diana y el estándar interno se efectúa con sondas de
hibridación con marcas diferentes.
10. Método como se ha reivindicado en las
reivindicaciones 1-9, en donde los ácidos nucleicos
amplificados son detectados con ayuda de por lo menos una sonda de
hibridación con marcado fluorescente.
\newpage
11. Método como se ha reivindicado en la
reivindicación 10, en donde los ácidos nucleicos amplificados son
detectados con ayuda de sondas de hibridación FRET, guías
moleculares o sondas TaqMan.
12. Método como se ha reivindicado en las
reivindicaciones 1-5 ó 7-8, en donde
los ácidos nucleicos amplificados son detectados con ayuda de un
colorante unido al ADN, de preferencia con verde Sybr I.
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