CN107119137B - 一种快速检测HER‑2/neu基因表达的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种快速检测HER‑2/neu基因表达的检测试剂盒。所述试剂盒包括HER‑2/neu基因引物，PCR反应液，Enhence Buffer，阳性对照和阴性对照。本发明试剂盒成本低，操作简单；本发明试剂盒及其检测方法对使用仪器设备、DNA模板要求低，而取得的扩增产物特异性高，同时提高了检测HER‑2/neu基因表达的速度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒。
背景技术
HER-2/neu基因又名c-erbB-2基因，属于表皮生长因子受体家族中的一员。该家族成员还包含HER-1(EGFR)、HER-3、HER-4，在酪氨酸激酶活性位点区域存在约80％的序列同源性。它们共同调节复杂的信号传导系统，促进肿瘤细胞的快速增殖、抑制凋亡，从而增加肿瘤的浸润及转移能力。HER-2/neu基因是一种原癌基因，1987年Slamon等首次报道HER-2/neu基因在乳腺癌细胞中过度表达与乳腺癌复发及生存率有关。HER-2/neu基因被确认为一种新的肿瘤标记物。 HER-2/neu基因定位于17q11—21，与拓扑异构酶Ⅱα基因相邻，编码的蛋白产物由1255个氨基酸组成，相对分子质量为185ku，具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，全长28515bp，属Ⅰ型跨膜受体酪氨酸激酶。HER-2/neu在调节肿瘤细胞生长、分化及存活起着重要的作用。与肿瘤的发生、转移、预后、治疗等密切相关。研究显示在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、大肠癌、肺癌、前列腺癌中均存在不同程度的HER-2过表达，因此对HER-2表达的高效检测对肿瘤诊断具有重要的意义。
中国专利(CN102798724B)公开了一种检测乳腺癌HER2基因表达量的方法及其试剂盒。其所述的试剂盒包括：(1)抗体稀释缓冲液；(2)孵育缓冲液；(3) 联吡啶钌标记的HER2单克隆抗体的溶液，浓度为1x10-6mol/L-2x10-6mol/L； (4)ZnSe/ZnS核/壳量子点的水溶液；所述的抗体稀释缓冲液为磷酸-NaCl缓冲液；所述的孵育缓冲液为磷酸-NaCl-胎牛血清缓冲液。
中国专利申请(CN104878076)公开了一种HER-2基因的cDNA原位杂交探针及其制备方法，所述探针的制备方法，包括：收集HER-2基因高表达的乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织，提取所述肿瘤组织的总mRNA，将所述总mRNA逆转录为cDNA，将所述cDNA与引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述扩增产物为长度987bp的HER-2基因片段，即为所述探针的片段，构建含有所述HER-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒；将所述质粒作为模板，并利用所述引物和罗氏的聚合酶链式反应地高辛探针合成试剂盒进行探针标记，得到所述探针。本发明使用的HER-2基因的cDNA原位杂交的探针序列，对HER-2基因DNA的显示有明确的特异性，实现了对HER-2基因DNA水平扩增情况的检测。
现有技术中对HER-2基因表达量检测技术往往对仪器有较高的要求，操作复杂，试剂盒生产成本高，同时还存在特异性低的问题。
临床医学和基础科学研究人们用基本的PCR程序已经成功扩增出了大量的基因片段，但是非特异性的结果和耗时的过程也开始渐渐无法满足更加广泛的需求。特别是面对具有特殊二级结构的高拷贝含量基因，人们往往束手无策。
世界各国的科学家对常规的PCR程序做了很多的改进，也尝试了很多可以提高产物特异性的方法，包括热启动、两步PCR和某些添加剂的应用等。热启动是用95℃先使具有复杂二级结构的模板DNA充分变性，再加入Taq酶，这样做可以避免操作过程中产生非特异性序列的扩增，并将DNA聚合酶与其他反应物隔绝，避免在未达到设定温度前就开始反应。
科学家们为了提高PCR效率和产物特异性，做了大量的研究，因此许多PCR 添加剂被发现，包括二甲亚砜、甲酰胺、甜菜碱、等。在这些添加剂中，虽然报道较多，但是效果不佳，其中，甲亚砜的作用是减弱模板DNA的二级结构的影响，便于DNA酶延伸，减少非特异性条带，同时改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，同时，二甲亚砜作为有机溶剂，能破坏DNA聚合酶结合的水化膜，使得DNA聚合酶变性。甘油为多羟基的醇，可以为DNA聚合酶提供羟基，使DNA聚合酶保持较高的活性保护DNA聚合酶。
三甲基甘氨酸，它可以通过与DNA大沟中的AT对结合而影响延伸反应，或者通过与DNA小沟结合，增加GC对的水化程度，降低双螺旋DNA的稳定，使二级结构易于打开，从而使得引物能与模板充分结合。
上述方法和手段的单独使用都获得了一定的效果，但是对于引物和模板的要求普遍过于苛刻，适用范围也较为局限。
发明内容
为克服上述问题，本发明提供了一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒。本发明试剂盒成本低，操作简单；本发明试剂盒及其检测方法对使用仪器设备、DNA模板要求低，而取得的扩增产物特异性极高，同时提高了检测 HER-2/neu基因表达的速度。本发明还提供了一种试剂盒的检测方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒，包括HER-2/neu基因引物，PCR反应液，Enhence Buffer，阳性对照和阴性对照；
所述Enhence Buffer由：明胶100-150μg/mL，甘露醇2-5uL/mL，二甲亚砜 0.5-1.5uL/mL和血清白蛋白100-150μg/mL组成；
所述HER-2/neu基因上游引物如SEQ ID NO：1所示；
所述HER-2/neu基因下游引物如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述Enhence Buffer由：明胶125μg/mL，甘露醇3.2uL/mL，二甲亚砜1.23uL/mL和血清白蛋白115μg/mL组成。
优选地，所述PCR反应液包括：5U/μLTaq DNA聚合酶，25mmol/L MgCl2， l0mmol/LdNTP和二次蒸馏水。
优选地，所述阴性对照为二次蒸馏水，阳性对照为含HER-2/neu DNA样品。
一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1 样品预处理，将收集到的样品进行脱脂处理后，加入10-15倍体积的缓冲液，上下颠倒进行混合后，静置15-20min后，5000g/min 4℃离心15-20min钟，得样品I；
S2 将上述样品I进行DNA提取，得DNA样品II；
S3 PCR扩增体系扩增；
S4 PCR扩增产物检测。
优选地，所述S1样品预处理中缓冲液由10mM Tris-HCl，1.5mMEDTA-2Na， 20mM钼酸钠，体积含量0.1％硫代甘油，1mM苯甲基磺酰氟，100μg/mL抑肽酶，1mM原钒酸钠和体积含量10％的甘油组成。
优选地，所述S2中PCR扩增体系为：DNA聚合酶0.2-0.5μL，MgCl2 2μL， l0mmol/LdNTP 0.5μL，HER-2/neu基因上游引物0.5μL，HER-2/neu基因下游引物0.5μL，DNA模板样品100ng，Enhence Buffer 2.5μL，用二次蒸馏水补足至 50μL。
优选地，所述S2中PCR扩增程序包括：
(1)热启动：95℃变性5min，加入DNA聚合酶；
(2)Slowdown PCR：95℃变性50s～lmin，在温度为70-65℃时退火45s～ lmin，72℃延伸50s～2min，共15-20个循环，使退火温度降至59-55温度，每个循环降低1℃，每5个循环后暂停重新加入DNA聚合酶；随后95℃变性45s ～50min，在58-55温度退火30s～lmin，72℃延伸50s～2min，共25-30个循环；
(3)延伸：72℃延伸5min；
(4)4℃保存。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下技术优势：
(1)本发明试剂盒成本低，操作简单。
(2)本发明试剂盒及其检测方法对使用仪器设备、DNA模板要求低，而取得的扩增产物特异性高，同时提高了检测HER-2/neu基因表达量的速度。
具体实施方式：
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1 一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒
所述的试剂盒包括：HER-2/neu基因引物，PCR反应液，Enhence Buffer，阳性对照和阴性对照；
所述Enhence Buffer由：明胶100μg/mL，甘露醇2uL/mL，二甲亚砜0.5uL/mL 和血清白蛋白100μg/mL组成；
所述HER-2/neu基因上游引物如SEQ ID NO：1所示；
所述HER-2/neu基因下游引物如SEQ ID NO：2所示。
所述PCR反应液包括：5U/μL Taq DNA聚合酶，25mmol/L MgCl2，l0mmol/L dNTP和二次蒸馏水。
所述试剂盒的使用方法：
S1 样品预处理：将从北京军区总医院采集到的乳腺癌细胞样品进行脱脂处理后，加入15倍体积的缓冲液，上下颠倒进行混合后，静置15min后，5000g/min 4℃离心15min钟，得样品I；
S2 将上述样品I进行DNA提取：每管加入0.5mL细胞裂解液，37℃水浴2 小时，加入I00uL 10％SDS溶液与25uL蛋白酶溶液(25mg/mL)后，56℃水浴 3小时；除蛋白：加入0.8mL5M NaCl后，加入等体积的氯仿，反复颠倒混匀 35min，12000rpm离心30min，小心吸取上清至另一管中，加入等体积的氯仿重复抽提两次；沉淀DNA：离心收集上清，加入1/10体积3MNaAC(pH5.5)和等体积的异丙醇，缠绕出DNA；纯化：分别用75％和无水乙醇洗涤DNA，待乙醇挥发后加入I x TEbuffer(RNaseA 10mg/mL)37℃水浴3小时，20℃保存备用。
S3 PCR扩增体系扩增：PCR扩增体系为：DNA聚合酶0.2μL，MgCl2 2μL， l0mmol/LdNTP 0.5μL，HER-2/neu基因上游引物0.5μL，HER-2/neu基因下游引物0.5μL，DNA模板样品100ng，Enhence Buffer 2.5μL，二次蒸馏水补足至50μL。
PCR扩增程序包括：
(1)热启动：95℃变性5min，加入DNA聚合酶；
(2)Slowdown PCR：95℃变性55s，在温度为70℃时退火50s，72℃延伸 1.5min，共18个循环，使退火温度降至56℃，每个循环降低1℃，每5个循环后暂停重新加入DNA聚合酶；随后95℃变性1.5min，在57温度退火45S，72℃延伸1.5min，共25个循环；
(3)延伸：72℃延伸5min；
(4)4℃保存。
使用PCR仪为：上海山富科学仪器有限公司RED-96G PCR仪。
S4 PCR扩增产物检测：
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
实施例2 一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒
一种快速检测HER-2/neu基因表达量的检测试剂盒，包括HER-2/neu基因引物，PCR反应液，Enhence Buffer，阳性对照和阴性对照；其中，所述Enhence Buffer 由：明胶125μg/mL，甘露醇3.2uL/mL，二甲亚砜1.23uL/mL和血清白蛋白 115μg/mL组成。
所述HER-2/neu基因上游引物如SEQ ID NO：1所示；
所述HER-2/neu基因下游引物为如SEQ ID NO：2所示；
所述PCR反应液包括：5U/μL Taq DNA聚合酶，25mmol/L MgCl2，l0mmol/L dNTP和二次蒸馏水。
所述试剂盒使用方法：
S1 样品预处理：将从北京军区总医院采集到的乳腺癌细胞样品进行脱脂处理后，加入10倍体积的缓冲液，上下颠倒进行混合后，静置15min后，5000g/min 4℃离心15min钟，得样品I；
S2 将上述样品I进行DNA提取：每管加入0.5mL细胞裂解液，37℃水浴2 小时，加入I00uL 10％SDS溶液与25uL蛋白酶溶液(25mg/mL)后，56℃水浴3 小时；除蛋白：加入0.8mL5M NaCl后，加入等体积的氯仿，反复颠倒混匀35min， 12000rpm离心30min，小心吸取上清至另一管中，加入等体积的氯仿重复抽提两次；沉淀DNA：离心收集上清，加入1/10体积3MNaAC(pH5.5)和等体积的异丙醇，缠绕出DNA；纯化：分别用75％和无水乙醇洗涤DNA，待乙醇挥发后加入IxTEbuffer(RNaseA 10mg/mL)37℃水浴3小时，20℃保存备用。
扩增体系扩增：PCR扩增体系为：DNA聚合酶0.2μL，MgCl2 2μL，l0mmol/L dNTP 0.5μL，HER-2/neu基因上游引物0.5μL，HER-2/neu基因下游引物0.5μL， DNA模板样品100ng，Enhence Buffer 2.5μL，二次蒸馏水补足至50μL。
PCR扩增程序包括：
(1)热启动：95℃变性5min，加入DNA聚合酶；
(2)Slowdown PCR：95℃变性50s，在温度为70℃时退火45s，72℃延伸 50smin，共15个循环，使退火温度降至59温度，每个循环降低1℃，每5个循环后暂停重新加入DNA聚合酶；随后95℃变性45s，在58温度退火30s，72℃延伸50s，共25个循环；
(3)延伸：72℃延伸5min；
(4)4℃保存。
使用PCR仪为：天津金思德生物科技有限公司Veriti 96孔PCR仪。
S4 PCR扩增产物检测：
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
实施例3 一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒
一种快速检测HER-2/neu基因表达量的检测试剂盒，包括HER-2/neu基因引物，PCR反应液，Enhence Buffer，阳性对照和阴性对照。
其中，所述Enhence Buffer由：明胶150μg/mL，甘露醇5uL/mL，二甲亚砜 1.5uL/mL和血清白蛋白150μg/mL组成。
所述HER-2/neu基因上游引物如SEQ ID NO：1所示。
所述HER-2/neu基因下游引物为如SEQ ID NO：2所示。
所述PCR反应液包括：5U/μL Taq DNA聚合酶，25mmol/L MgCl2，l0mmol/L dNTP和二次蒸馏水。
所述试剂盒使用方法：
S1 样品预处理：将从北京军区总医院采集到的乳腺癌细胞样品进行脱脂处理后，加入10倍体积的缓冲液，上下颠倒进行混合后，静置15min后，5000g/min 4℃离心15min钟，得样品I；
S2 将上述样品I进行DNA提取：每管加入0.5mL细胞裂解液，37℃水浴2 小时，加入I00uL 10％SDS溶液与25uL蛋白酶溶液(25mg/mL)后，56℃水浴3 小时；除蛋白：加入0.8mL5M NaCl后，加入等体积的氯仿，反复颠倒混匀35min， 12000rpm离心30min，小心吸取上清至另一管中，加入等体积的氯仿重复抽提两次；沉淀DNA：离心收集上清，加入1/10体积3MNaAC(pH5.5)和等体积的异丙醇，缠绕出DNA；纯化：分别用75％和无水乙醇洗涤DNA，待乙醇挥发后加入IxTEbuffer(RNaseA 10mg/mL)37℃水浴3小时，20℃保存备用。
S3 扩增体系扩增：PCR扩增体系为：DNA聚合酶0.2μL，MgCl2 2μL， l0mmol/L dNTP0.5μL，HER-2/neu基因上游引物0.5μL，HER-2/neu基因下游引物0.5μL，DNA模板样品100ng，Enhence Buffer 2.5μL，二次蒸馏水补足至50μL。
PCR扩增程序包括：
(1)热启动：95℃变性5min，加入DNA聚合酶；
(2)Slowdown PCR：95℃变性50s～lmin，在温度为70-65℃时退火l min， 72℃延伸2min，共15-20个循环，使退火温度降至55温度，每个循环降低1℃，每5个循环后暂停重新加入DNA聚合酶；随后95℃变性50min，在55温度退火lmin，72℃延伸2min，共30个循环；
(3)延伸：72℃延伸5min；
(4)4℃保存。
使用PCR仪为：南京守诺仪器有限公司，HR-PCR-96G PCR仪。
S4PCR扩增产物检测：
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
对比例1 一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒
一种快速检测HER-2/neu基因表达量的检测试剂盒，包括HER-2/neu基因引物，PCR反应液，Enhence Buffer，阳性对照和阴性对照。
所述Enhence Buffer由：明胶125μg/mL，二甲亚砜1.23uL/mL和血清白蛋白115μg/mL组成。
所述HER-2/neu基因上游引物如SEQ ID NO：1所示。
所述HER-2/neu基因下游引物如SEQ ID NO：2所示。
所述PCR反应液包括：5U/μL Taq DNA聚合酶，25mmol/L MgCl2，l0mmol/L dNTP和二次蒸馏水。
试剂盒使用方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，未添加甘露醇。
试验例1、不同试剂盒特异性检验
将从北京军区总医院采集到的不同乳腺癌细胞样品进行脱脂处理后，制成5 个不同样品，分别利用实施例1-3及对比例1制备的试剂盒及其检测方法进行特异性检验，所得结果如表1所示。
表1 不同试剂盒特异性检验
| 试剂盒 | 样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | 样品5 |
| 实施例1 | 条带单一 | 条带单一 | 条带单一 | 条带单一 | 条带单一 |
| 实施例2 | 条带单一 | 条带单一 | 条带单一 | 条带单一 | 条带单一 |
| 实施例3 | 条带单一 | 条带单一 | 条带单一 | 条带单一 | 条带单一 |
| 对比例1 | 有杂带 | 条带单一 | 有杂带 | 有杂带 | 有杂带 |
由表1可知，本发明实施例1、实施例2和实施例3试剂盒检测特异性明显高于对比例1试剂盒。
试验例2、快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒的稳定性
1、加速破坏稳定性
分别对放置4℃、37℃保存10天的整套实施例1试剂盒进行性能测试，测试试剂盒的性能指标。加速破坏稳定性结果如表2所示。
表2 试剂盒加速破坏稳定性结果
依据加速破坏试验推算试剂盒有效期的经验方法，37℃下加速破坏10天，相当于有效期1年半，可以满足试剂盒一年的有效期要求。由表2可以看出，本发明快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒在4℃、37℃保存10天后，试剂盒的灵敏度、准确性及精密性等均满足要求。
2、冻融稳定性
为模拟试剂盒在运输过程中，低温环境下试剂盒各组分反复冻融对试剂盒稳定性的影响，将整套实施例1试剂盒在-20℃的低温下冷冻过夜，然后在室温下复溶，然后再置于-20℃的低温下冷冻过夜，如此反复冻融5次。结果如表3所示。
表3 试剂盒冻融稳定性结果
由表3可以看出，本发明快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒经反复冻融5次后，试剂盒的灵敏度、准确性及精密性等均满足要求。这说明，本发明试剂盒具有较好的冻融稳定性。
3、模拟运输稳定性
为模拟试剂盒在运输过程中，车辆的颠簸以及高温环境对试剂盒稳定性的影响，将整套实施例1试剂盒固定在微量振荡器上，放置于37℃恒温箱振荡7天。结果如表4所示。
表4 试剂盒模拟运输稳定性结果
由表4可以看出，本发明快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒放置于 37℃恒温箱振荡7天后，试剂盒的灵敏度、准确性及精密性等均满足要求。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州华弘生物科技有限公司
<120> 一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒及检测方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctctgacgt ccatcgtctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggatcttct gctgccgtcg 20
Claims (3)
1.一种快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括HER-2/neu基因引物，PCR反应液，Enhence Buffer，阳性对照和阴性对照；
所述Enhence Buffer由明胶100-150μg/mL，甘露醇2-5uL/mL，二甲亚砜0.5-1.5uL/mL和血清白蛋白100-150μg/mL组成；
所述HER-2/neu基因上游引物如SEQ ID NO：1所示；
所述HER-2/neu基因下游引物如SEQ ID NO：2所示；
所述PCR反应液包括：5U/μL Taq DNA聚合酶，25mmol/L MgCl2，l0mmol/L dNTP和二次蒸馏水。
2.根据权利要求1所述快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒，其特征在于，所述Enhence Buffer由明胶125μg/mL，甘露醇3.2uL/mL，二甲亚砜1.23uL/mL和血清白蛋白115μg/mL组成。
3.根据权利要求1所述快速检测HER-2/neu基因表达的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为二次蒸馏水，阳性对照为含HER-2/neu DNA样品。
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